Universidad de Cundinamarca
Sede Fusagasugá
Facultad de Ciencias Agropecuarias
CUANTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN MICROBIANA EN
SUSTRATO (SUELO NEGRO) BAJO TRATAMIENTO
CONTROL Y TRATAMIENTO SÁBILA EN ESQUEJES DE
CIDRON (Aloysia citriodora)
Autores: Javier Eduardo Cristancho Agudelo, Heidy Michelle Gutiérrez Guerrero, Debbie Jaidy
Leal Forero.
Presentado a: Pilar Rojas Gracia
Resumen
Cuando se requiere investigar el
contenido de microorganismos viables
en el suelo, la técnica comúnmente
utilizada es la cuenta en placa. Esta
técnica no pretende detectar a todos
los microorganismos presentes, pero
el medio de cultivo, las condiciones de
temperatura y la presencia de
oxígeno, permiten seleccionar grupos
de bacterias cuya presencia es
importante.
Para realizar la cuantificación y characterization of the bacteria, a
caracterización de la bacteria se
realizó una debida preparación de
medios de cultivo simplesy de esta
manera observar el desarrollo de los
microorganismos tomando en cuenta
los factores y condiciones que están
presentados en cada medio.
Finalmente se reconoce una bacterias
como Bacilos Gram negativos y
Actinomicetes los cuales son
benéficas para el suelo.
Palabras clave: crecimiento vegetal,
actinomicetes, bacilos,
microorganismos, caracterización,
cuantificación.
Abstract
When it is required to investigate the
content of viable microorganisms in
the soil, the popular technique is used
in the plate count. This technique does
not pretend to detect all the
microorganisms present, but the
culture medium, the temperature
conditions and the presence of
oxygen, allows to select groups of
bacteria, whose presence is important.
To carry out the quantification and
simple culture media discharge was
made in this way, the development of
the microorganisms was observed
taking into account the factors and
conditions that exist in each medium.
Finally, a bacterium is recognized as
Gram-negative bacilli and
Actinomycetes which are beneficial for
the soil.
Keywords: plant growth,
actinomycetes, bacilli,
microorganisms, characterization,
quantification.
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Introducción
La cuantificación es un elemento
significativo en los estudios de la
ecología microbiana, ya que es
importante conocer al responsable de
un efecto benéfico o identificar al
microorganismo potencial de causar
algunas enfermedades, sino también
es importante saber el número de
microorganismos implicados, para
establecer si éstos serán capaces de
desarrollar una función benéfica o
perjudicial. (Nacional, 2012)
La importancia de los actinomicetes
en la agricultura es la aplicación de
estas bacterias para mejorar cultivos
con el fin de establecer un nuevo tipo
de Agricultura Sostenible. (Sheila
Blanco Barrientos, 2010). Una de las
cualidades que se observan en estas
bacterias es su presencia en la
rizosfera (zona del suelo afectada por
el desarrollo de las raíces), por ello se
les denominan rizobacterias. Debido a
esta particular localización, los
diferentes géneros resultan muy
beneficiosos para las plantas, ya que
favorecen su crecimiento, controlan la
aparición de hongos no deseables y
ayudan a la asimilación de hierro,
fósforo y nitrógeno. (Sheila Blanco
Barrientos, 2010)
Se puede hablar de simbiosis planta-
bacteria o incluso, de “helper bacteria”
(bacteria ayudante). La
Biofertilización, por tanto, consiste en
el aumento del número de
microorganismos en un suelo para
acelerar los procesos microbianos y
aumentar la cantidad de nutrientes
asimilables por la planta.
Este tipo de tratamiento de la planta
con actinomicetos presenta
numerosas ventajas: disminuye el uso
intensivo de fertilizantes, disminuye
los costes de producción de muchos
alimentos, y aumenta la
competitividad en el mercado. En
resumen, una buena biofertilización
reduce el uso de energía de la planta
a la hora de absorber los distintos
nutrientes, disminuye la degradación
del agro-ecosistema y reduce la
pérdida de nutrientes del suelo por
lixiviados, sobre todo de nitrógeno.
(Sheila Blanco Barrientos, 2010).
Entre los microorganismos
beneficiosos más importantes se han
descrito las diferentes especies de
bacterias del género Pseudomonas
capaces de favorecer activamente el
crecimiento de las plantas aun en
presencia de suelos infectados de
hongos y bacterias patógenos
responsables de numerosas
enfermedades radiculares. (Carrasco,
2016). La eficacia de estas bacterias
depende muy directamente de la cepa
por lo que durante las dos últimas
décadas se están aislando y
produciendo para la agricultura
aquellas que mejor y más rápidamente
se asocian al sistema radicular y
manifiestan un mejor comportamiento
antagonista frente a al amplio rango de
hongos patógenos del suelo.
(Carrasco, 2016).
Las Pseudomonas actúan de una
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doble manera sobre el cultivo: Otros materiales:

promueven el crecimiento vegetal y
 Cajas de Petri
suprimen a los microorganismos
patógenos. Hay quien ha sugerido que  Tubos tapa rosca
estimulan el establecimiento de otros  Erlenmeyer
microorganismos beneficiosos  Cinta de enmascarar
asociados a las raíces como las  Agua destilada
micorrizas. Las Pseudomonas  Agua Peptonada
producen un incremento de la  Tween 20
disponibilidad de Fósforo y nitrógeno  Sustrato Testigo y Tratamiento
en forma asimilable para la planta más eficiente.
debido a la producción de  Reactivos para la Tinción de
fitohormonas estimuladoras de la Gram: Cristal violeta, lugol,
actividad vegetativa, así como la decolorante, fucsina.
degradación de precursores del
Procedimiento:
etileno. (Carrasco, 2016). Una de las
técnicas más comunes e importantes 1. Preparación de los diferentes
para la identificación de medios de cultivo y 90 ml de
microorganismos es observar su agua peptonada 0,1% + 50 µl
crecimiento en medios de cultivos que de tween 20.
le brinden algunos conjuntos
nutrientes necesarios para su 2. Siembra en superficie de
crecimiento y desarrollo; con el dilución 10−5 y 10−6 de
objetivo de cuantificar tratamiento control y
microorganismos y proceder a su tratamiento sábila en medios de
caracterización y verificación con uno cultivo PDA y AN.
de los estudios complementarios
como lo es la Tinción de Gram. 3. Caracterización de las
Metodología bacterias por medio de la
Tinción de Gram.
Materiales y métodos
 Se identificaron
Se realizó la preparación de los
bacterias Bacilos Gram
diferentes medios de cultivo (Figura
negativos en las
1.) simples, selectivos y diferenciales −5
los cuales fueron: diluciones 10 y 10−6
del en el medio del
 AN (Agar Nutritivo): Medio Tratamiento control o
simple testigo. Imagen 1.
 PDA (Agar papa dextrosa). Imagen 2.
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 Se identificaron Imagen 2. Bacterias identificadas en

bacterias Actinomicetes el microscopio: Bacilos, Gram
(filamentosas), Gram negativos.
positivas en la dilución
10−6 en el medio del
Tratamiento 2: Sábila.
Imagen 3.

Imagen 3. Bacterias identificadas en

el microscopio: Actinomicetes,
(Filamentosos) Gram positivas.
Resultados y Discusión
En el medio AN evidentemente se
obtuvo un crecimiento microbiano en
donde se lograron identificar Bacilos
Gram negativas posiblemente
Imagen 1. Bacterias identificadas en Pseudomonas para el T0: Control y
el microscopio: Bacilos, Gram Filamentos Gram positivas como lo
negativos. son los Actinomicetes para el T2:
Sábila.
Entre los microorganismos del suelo,
que logran desempeñar un papel
importante en todos los aspectos
nombrados, son los Actinomicetos,
bacterias filamentosas, abundantes en
la rizósfera; entre las actividades
fundamentales desempeñadas por
estos se encuentran: la
descomposición de la materia
orgánica, la degradación de
compuestos recalcitrantes, la
degradación de los productos
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químicos agrícolas control biológico
en plantas y animales, fijación de
nitrógeno y promoción de crecimiento
vegetal. (Loaiza et al., 2014).
Los actinomicetos representan un
grupo de microorganismos
ampliamente distribuido
ecosistemas naturales y tienen gran
importancia en la participación de la
degradación de la materia orgánica,
además de ciertas propiedades
fisiológicas que los hacen particulares
(Ghanem et al., 2000).
Los actinomicetos constituyen un
grupo heterogéneo de
microorganismos, son bacterias Gram
positivas que se caracterizan por su
capacidad de formar filamentos
ramificados. El orden de los
Actinomycetales comprende 63
género, constituyendo
aproximadamente del 20 – 60% de la
población microbiana del suelo
(Ezziyyani et al., 2004)
Los bacilos gramnegativos no
fermentadores incluyen una serie de
microorganismos de entre los cuales
el género Pseudomonas (Hernandez
et. al., 2014).
Está generalmente aceptado que uno
de los mecanismos más importantes,
por el que las pseudomonas
promueven el crecimiento vegetal, es
mediante la supresión de
microorganismos patógenos más o
menos importantes. También se ha
sugerido que las pseudomonas
pueden manifestar sus efectos
promotores del crecimiento
indirectamente, estimulando la acción
beneficiosa de otros microorganismos
asociados a las raíces, como las
micorrizas. Cuando la estimulación del
crecimiento vegetal se produce en
ausencia de otros microorganismos,
en
ésta se ha atribuido al incremento de
la disponibilidad de nutrientes
minerales, como el fosfato o el
nitrógeno, debido a la producción de
fitohormonas estimuladoras del
crecimiento vegetal o a la degradación
de precursores del etileno en la raíz
por parte de estas bacterias (Glick,
1995)
Existen diferentes mecanismos
posibles por los que las pseudomonas
del suelo suprimen la enfermedad. Los
mecanismos propuestos más
importantes incluyen la inhibición de
los patógenos por compuestos
antimicrobianos, la competencia por el
hierro, la competición por sitios de
colonización y por los nutrientes
exudados por la raíz, así como la
inducción de mecanismos de defensa
en las plantas (Van Weels et al. 1997)
La inhibición del patógeno por la
producción de metabolitos
antimicrobianos o queladores de
hierro son los que están considerados
como los principales mecanismos de
biocontrol. Otros factores importantes
son la degradación de factores de
virulencia del patógeno, como toxinas,
por parte de las pseudomonas
(Toyoda et al., 1988) la inactivación de
factores de germinación del patógeno,
presentes en los exudados radiculares
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(Nelson, 1992) y la producción de Unidades formadoras de colonias

enzimas extracelulares, como encontradas:
quitinasas, laminarasas y glucanasas,
T0: Control
que pueden degradar las paredes de
las células fúngicas (Fridlender et al.,  UFC/gr de suelo =
1993) 9 𝑥 1000000 𝑥 5
=
12𝑔𝑟
La colonización de la raíz es un 𝟑. 𝟕𝟓𝟎. 𝟎𝟎𝟎 UFC/gr de suelo
prerrequisito para el funcionamiento
de cualquier otro mecanismo de  UFC/gr de suelo =
biocontrol exhibidos por las 9 𝑥 100000 𝑥 1
= 𝟓𝟎. 𝟎𝟎𝟎 UFC/gr
pseudomonas. Una colonización 12𝑔𝑟

efectiva está ligada directamente con de suelo

una competición efectiva con otros
microorganismos por la colonización
de nichos y por los nutrientes
disponibles procedentes de los T2: Sábila
exudados radiculares (Kluepfel, 1993)
 UFC/gr de suelo =
Para exhibir efectos supresivos sobre 15 𝑥 1000000 𝑥 5
una enfermedad en una planta, un =
12𝑔𝑟
agente biocontrol necesita distribuirse 𝟔. 𝟐𝟓𝟎. 𝟎𝟎𝟎 UFC/gr de suelo
por toda la raíz, multiplicarse y
sobrevivir durante varias semanas en  UFC/gr de suelo =
competición con otros 3 𝑥 1000000 𝑥 1
= 𝟐𝟓. 𝟎𝟎𝟎 UFC/gr
12𝑔𝑟
microorganismos procedentes de la
microbiota indígena. Además de la de suelo
microbiota indígena, otros factores
pueden influir en la colonización de la La viabilidad se define como la
raíz (O’Sullivan y O’Gara, 1992) las habilidad de multiplicarse por fisión
características del antagonista binaria en condiciones controladas.
introducido, como las propiedades de Por lo tanto, en el recuento de UFC de
su superficie celular, producción de un cultivo de microorganismos solo se
sideróforos o antibióticos, pilis, consideran las células viables,
flagelos o quimiotaxis por los mientras que en el examen
exudados radiculares; ii) la especie, microscópico se considerarán tanto
cultivar y fase del crecimiento de la células vivas como muertas. Dentro de
planta hospedadora; y iii) las un cultivo de células, una colonia debe
características físicas y químicas del presentar un crecimiento significativo,
suelo, como humedad, temperatura, aunque en el recuento de colonias no
pH, textura del suelo y nutrientes es posible saber si una colonia surgió
minerales. de una o varias células.
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Las UFC son el número mínimo de
células separables sobre la superficie
o dentro de un medio de agar
semisólido, que da lugar al desarrollo
de una colonia visible del orden de
decenas de millones de células
descendientes. Muchas bacterias
crecen en pares (diplococos), cadena
(estreptococos) o racimos
(estafilococos), así como células
individuales. La estimación del
número de microbios por UFC es
inferior al número de células vivas
presentes en una muestra por esta
razón, porque el recuento de UFC
supone que cada colonia está
separada y fundada por una única
célula microbiana viable.
El método se utiliza para enumerar las
poblaciones de microorganismos,
consiste en la realización diluciones
seriadas 1/10 (10 gramos de suelo en
90 mL del disolvente), las diluciones
siembran en medios de cultivos cuya
composición depende del
microorganismo que se quiera
enumerar. Se cuenta el número de
unidades formadoras de colonias
(UFC) que aparece en los platos. El
término UFC se deriva del hecho de
que en el momento en que una
bacteria entra en contacto con el
media de cultivo empieza a
multiplicarse formando una colonia de
bacterias que pueden verse y
contarse, se supone entonces que una
de estas colonias corresponde a una
bacteria presente en la muestra inicial.
Como en algunas casas una sola
colonia puede haber sido formada par
más de una bacteria, se adopta el
término unidad formadora de colonias.
Esta medida es un estimado del
número de bacterias 0 bongos
presentes en la muestra. Los
recuentas pueden ser una
herramienta importante para comparar
sistemas de manejo agrícola, la
aplicación de enmiendas 0 el usa de
plaguicidas (Parkinson y Coleman,
1991; Wollum, 1995).
Esta metodología presenta la
desventaja de que las bacterias
aisladas en medios de cultivo en el
laboratorio constituyen una menor
proporción de la diversidad total del
suelo, de hecho, se estima que menos
del % de la poblaci6n total puede ser
cultivada. Sin embargo permite la
determinación de grupos funcionales
de microorganismos que proporcionan
información importante del sistema
bajo estudio y que pueden ser
utilizados como indicadores de
manejo (ej. presencia de patógenos,
fijadores de nitrógeno, etc.). Otra
ventaja que presenta su uso es que los
aislamientos bacterianos pueden
conservarse en el laboratorio,
identificarse y utilizarse para otros
estudios. Permite además, utilizando
log medias de cultivo adecuados, el
seguimiento de microorganismos
introducidos al ambiente
(biofertilizantes, agentes de control
biológico, etc.) (Parkinson y Coleman,
1991; Tiedje, 1995).
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En cuanto al medio PDA no se combinación de los microorganismos

encontró crecimiento de hongos, por (Vázquez et al. 2000).
lo que se puede decir que no hay una
Conclusiones
interacción con la rizosfera.
 En este laboratorio se puede
La interacción de microorganismos
concluir que el potencializador
rizosféricos, como los hongos
de enraizamiento tuvo una
formadores de micorrizas
óptima interacción con el
arbusculares (AMF), hongos del
sustrato ya que se presentaron
género Trichoderma y bacterias del
microorganismo benéficos que
género Pseudomonas, usualmente
catalogados como agentes de control ayudaron al buen desarrollo de
los esquejes, ayudando así que
biológico (BCA) y microorganismos
la interacción planta suelo sea
promotores del crecimiento vegetal
favorable.
(PGPM), dependen de este tipo de
factores para expresar sus potenciales  Otra característica que
efectos benéficos; sin embargo, las podemos analizar es que el
interacciones entre los sustrato por si solo sin
microorganismos son complejas y se interactuar con ningún
pueden presentar efectos sinérgicos potencializador también
que potencialicen los beneficios para presenta microorganismos
la planta o, por el contrario, efectos benéficos que ayudan al
antagónicos o, simplemente, que no desarrollo de los esquejes,
ocurra ningún efecto (Cano, 2011). aunque al aplicarle un promotor
de crecimiento como la sábila
Es difícil predecir el resultado de las ayudamos a que esta
interacciones entre plantas y interacción sea un poco más
microorganismos benéficos del suelo efectiva y rápida.
y, más aún, entre las especies de
microorganismos; no obstante, las
comunidades microbianas asociadas Bibliografía
con el sistema de raíces, se considera  BACTERIAS FILAMENTOSAS
que desempeñan un papel clave en el DEL SUELO, POTENCIALES
desarrollo de prácticas agrícolas APLICACIONES. (n.d.).
sostenibles. La respuesta de las [ebook] pp.1-4. Recuperado de:
plantas a la inoculación depende de http://www.colmayor.edu.co/ar
las compatibilidades funcionales en la chivos/11_bacterias_filamento
fisiología y en la bioquímica de la sas_del__ncuq1.pdf
interacción, entre los componentes  Rico Gallegos, M. (2009).
microbianos; así arroja diferentes Capacidad promotora de
respuestas, dependiendo de la crecimiento vegetal por
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bacterias del género BENÉFICOS EN PLANTAS:

Azotobacter y Actinomicetos Micorrizas, Trichoderma spp. y
aislados de cultivos de Pseudomonas spp. UNA
Solanum tuberosum Linnaeus, REVISIÓN. Revista U.D.C.A
1753 (Papa) cultivados en Actualidad & Divulgación
zonas altoandinas del Perú. Científica, 14(2), 15-31.
Profesional. Universidad Retrieved May 15, 2018, from
Nacional Mayor de San http://www.scielo.org.co/scielo.
Marcos. php?script=sci_arttext&pid=S0
 Bueno Lopez, L. (2014). 123-
Actinomicetos aislados del 42262011000200003&lng=en&
suelo del Jardín botánico de la tlng.
Universidad Tecnológica de  Cazorla, F. Pseudomonas por
Pereira. Scientia et technica, los suelos: biocontrol en la
19(2), 223-229. rizosfera. Retrieved from
doi:http://dx.doi.org/10.22517/2 http://www.encuentros.uma.es/
3447214.8397 encuentros61/pseudomonas.ht
 42262011000200003&lng=en& ml
nrm=iso>. ISSN 0123-4226.  Camacho, A., M.Giles,
 Electronic Document A.Ortegón, M.Palao, B.Serrano
Format(ABNT) y O.Velázquez. 2009. Técnicas
 CANO, Mario Alejandro. para el Análisis Microbiológico
INTERACCIÓN DE de Alimentos. 2ª ed. Facultad
MICROORGANISMOS de Química, UNAM. México.
BENÉFICOS EN PLANTAS:  Hernández Torres, A., García
Micorrizas, Trichoderma spp. y Vázquez, E., Herrero Martínez,
Pseudomonas spp. UNA J., & Gómez Gómez, J. (2014).
REVISIÓN. Infecciones por bacilos
rev.udcaactual.divulg.cient., gramnegativos no
Bogotá, v. 14, n. 2, p. 15-31, fermentadores: Pseudomonas
Dec. 2011. Available from aeruginosa, Acinetobacter sp. y
<http://www.scielo.org.co/sciel Stenotrophomonas maltophilia.
o.php?script=sci_arttext&pid=S Medicine - Programa De
0123- Formación Médica Continuada
42262011000200003&lng=en& Acreditado, 11(56), 3311-3316.
nrm=iso>. access on 15 May doi: 10.1016/s0304-
2018. 5412(14)70775-9
 Cano, Mario Alejandro. (2011).  acumedia. AGAR PAPA
INTERACCIÓN DE DEXTROSA – POTATO
MICROORGANISMOS DEXTROSE AGAR (7149)
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[Ebook] (pp. 1-3). Retrieved Sheila Blanco Barrientos, C. G. (18 de

from junio de 2010). LOS
http://foodsafety.neogen.com/p ACTINOMICETOS COMO FUENTE
df/acumedia_pi/7149_sp_pi.pdf DE PRODUCTOS DE INTERÉS
 BIOTECNOLÓGICO. Obtenido de los
actinomicetos.