Mat. y Métodos

Biodegradación de crudo de petróleo en terrarios.
Escalante
Guzmán, Rocío Miluska.
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 MATERIALES
§ Medios de cultivo (Ver anexos 8.1, Pág 39)

§ Suelo contaminado con crudo de petróleo, procedente de Trompeteros, Iquitos.
§ Suelo de cultivo, procedente de una zona aledaña a la huaca San Marcos.
§ Petróleo crudo procedente de la refinería “La Pampilla”.
3.2 MÉTODOS
3.2.1 MUESTREO
a) Muestreo de suelos para el aislamiento de microorganismos con capacidad degradativa.

Se obtuvieron seis muestras de aproximadamente 1 kg de suelo contaminado con crudo de
petróleo, procedentes de la zona de Trompeteros, Iquitos y fueron llevadas al laboratorio en
bolsas de polietileno etiquetadas, para realizar el aislamiento de microorganismos oleofílicos.
b)Muestreo de suelos para evaluar la biodegradación de crudo en terrarios.

Se obtuvieron tres muestras de 30 kg de suelo de cultivo de alfalfa procedente de una zona
aledaña a la huaca San Marcos, para determinar la biodegradación en terrarios. Cada muestra de
30 kg fue introducida en un terrario y una vez contaminada con crudo de petróleo
intencionalmente, de cada terrario se tomaron muestras de aproximadamente 1 kg en el tiempo
inicial y cada treinta días durante noventa días, para determinar: hidrocarburos totales, humedad,
pH, número de microorganismos aerobios mesófilos, número de microorganismos oleofílicos,
temperatura y tiempo.
Elaboración y diseño en formato PDF, por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y
Biblioteca Central UNMSM
Biodegradación de crudo de petróleo en terrarios. Escalante
3.2.2 PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
3.2.2.1 AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN DE BACTERIAS DEGRADADORAS DE

HIDROCARBUROS.
Se obtuvieron muestras de suelo de 1kg de una zona contaminada con crudo de petróleo de
Trompeteros, Iquitos, para aislar cepas bacterianas por el Método de aislamiento de bacterias
degradadoras y emulsificantes de petróleo utilizado por Merino en 1998. Para lo cual se
suspendieron cinco gramos de suelo en 25 mL de solución salina estéril al 0.85% y a partir de la
suspensión se sembró en 25 mL de medios de pre-enriquecimiento: Caldo Palleroni y Caldo
Acetato Mineral, ambos medios se incubaron a 30º C con agitación constante a cientocincuenta
revoluciones por minuto durante setentaidos horas. Al cabo de ese tiempo, se sembró por estría
en agar King-B a partir de caldo Palleroni y en agar Cerebro Corazón (BHI) a partir de caldo
Acetato Mineral, se incubó a 30 ºC por venticuatro a cuarentaiocho horas, posteriormente se
aislaron colonias de las diferentes placas, tomando en cuenta su morfología de crecimiento y la
procedencia de la muestra. Las colonias seleccionadas se resembraron para su purificación en
tubos que contenían 2 mL de caldo nutritivo. Cada colonia fue rotulada. Transcurridas las
cuarentaiocho horas de incubación, para verificar la pureza de las cepas bacterianas se procedió
a sembrar por estría en Agar nutritivo, incubando a 30ºC por 48 horas.
Después se seleccionaron las colonias aisladas y se sembraron en viales por triplicado
conteniendo agar nutritivo en plano inclinado, se volvió a incubar a 30 ºC por 48 horas. Una vez
observada la pureza de las cepas bacterianas, se procedió a taponar los viales con tapones de
goma estériles y a sellar con parafina. El cepario fue mantenido en refrigeración a 4º C hasta que
se realizaron las pruebas de capacidad degradativa.
3.2.2.2 ACTIVIDAD EMULSIFICANTE DE LAS BACTERIAS DEGRADADORAS DE

PETRÓLEO.
Se realizó según la metodología propuesta por Goldman y col. (1982) Se procesaron ciento
veintinueve cepas bacterianas aisladas de seis muestreos, para evaluar la capacidad que tienen de
producir emulsificantes de petróleo en agua. Se empleó el Medio Mínimo de Goldman.
(Ver anexos, Pág 41 ), al cual se le adicionó extracto de levadura al 3% P/V (peso sobre
volumen) Se utilizó petróleo crudo, proporcionado por la refinería “La Pampilla”. Se esterilizó
el medio a 121 ºC por quince minutos, excepto el etanol, el cual fue agregado posteriormente en
condiciones de esterilidad.
Las cepas bacterianas se reactivaron en 2 mL de caldo Nutricio y se les incubó a 37 ºC por

venticuatro horas. Luego se repartió en matraces de 100 mL, 18 mL de medio Mínimo con
Extracto de Levaduras al 3 %. Se adicionó después los 2 mL de cultivo. Los matraces se
incubaron a 30 ºC por setentaidos horas en agitación constante. Transcurrido el tiempo de
incubación, se procedió a centrifugar el cultivo a 5000 r.p.m por treinta minutos.
Se obtuvieron 10 mL del sobrenadante en tubos de prueba de 16 x 150 mm, previa decantación,

luego se le agregó a cada tubo con sobrenadante 0.2 mL de petróleo crudo y se agitó
manualmente por cinco minutos (esto facilitó la posible producción de una emulsión) Se
trasvasaron 5 mL, de la preparación anterior a tubos de Spectronic de 13 x 100 mm. para la
lectura de la absorbancia a 540 nm. de longitud de onda en el Espectrofotómetro "Spectronic
20D" Milton-Roy.
El blanco fue un tubo conteniendo el medio de cultivo sin inoculación, y se procedió de la

misma manera que con las otras muestras.
La absorbancia leída se convirtió en unidades de actividad emulsificante por mililitro
(UAE/mL), siendo 0.816 de absorbancia equivalente a una unidad de actividad emulsificante por
mililitro.
3.2.2.3 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DEGRADATIVA DE LAS CEPAS

BACTERIANAS.
La actividad degradativa sobre el petróleo se evaluó según la metodología de Mills y col.

(1978).
El análisis semicuantitativo se aplicó a las cepas bacterianas con actividad emulsificante. Las
cepas bacterianas se reactivaron en Caldo Nutricio y se les incubó a 30 ºC por doce horas. Se
utilizó el Medio Mineral propuesto por Mills y col. (1978).(Ver anexos página 40), al cual se le
añadió petróleo crudo como única fuente de carbono.
Se repartieron 9 mL del medio en tubos de 16 x 150 mm. y se le añadió 1 mL de cultivo,

incubando por treinta días a temperatura ambiente. El crecimiento se midió por la turbidez
visible en el medio de cultivo. Se consideró como blanco negativo un tubo conteniendo los
componentes del medio descrito sin inoculación. Las lecturas se hicieron tomando en cuenta que
8
una turbidez de (2+) , equivalente a una población superior a 6 x 10 m.o/mL ,en la escala
Turbidimétrica de Mc. Farland, corresponde a un crecimiento regular, una turbidez de tres (3+)
8
con una población superior a 9x 10 m.o/mL, equivale a un crecimiento bueno, y una turbidez
8
de cinco (5+) con una población superior a 15 x 10 m.o/mL, igual a un crecimiento muy
bueno.
3.2.2.4 IDENTIFICACIÓN TAXONÓMICA
Para la identificación taxonómica, primero se efectuó la coloración de Gram de todas las cepas
bacterianas seleccionadas, y según esto se les agrupó en bastones y cocobacilos gramnegativos,
bastones y cocobacilos grampositivos, cocos gramnegativos y cocos grampositivos. Para
diferenciar entre bastones grampositivos y cocos grampositivos, se realizó la prueba de catalasa,
mientras que la prueba de oxidasa fue aplicada a todas las cepas bacterianas grampositivas y
gramnegativas. (Manual de Bacteriología Determinativa de Bergey´s, 1997). Los bastones y
cocobacilos gramnegativos oxidasa negativos, fueron identificados mediante pruebas
bioquímicas según Bergey, 1997 y para la identificación taxonómica de los bastones y
cocobacilos gramnegativos, positivos a la prueba de oxidasa, se utilizó el Sistema API 20 NE 1
(9), el cual es un sistema estandarizado que combina ocho pruebas bioquímicas y doce pruebas
de asimilación, además de la prueba de oxidasa. Este sistema se aplica a cepas bacterianas que
no pertenecen a la Familia de las Enterobacterias. La galería API 20 NE está compuesta de
veinte microtubos que contienen medios y/o substratos en forma deshidratada. Ver flujograma
Nº 01. Pág 17.
Analytab Products, Division of Sherwood Medical 200 Express Street Plainview, New York 11803
PREPARACIÓN DE LA GALERÍA API 20 NE.
Se depositó aproximadamente 5 mL, de agua destilada en los alvéolos de la cámara, para

proporcionar una atmósfera húmeda a la cámara de incubación.
Se rotuló la cámara con la clave de la cepa respectiva. Luego , la galería de la bolsa hermética
estéril fue incubada.
Preparación del inóculo.

En un tubo conteniendo 2 mL de cloruro de sodio al 0.85%, se realizó una suspensión
bacteriana, la turbidez debía ser igual al patrón 0.5 de la Escala Mc. Farland.
Las colonias fueron obtenidas del cultivo puro en agar nutritivo.
Inoculación de la Galería
Se llenaron los microtubos, (no las cúpulas) de las pruebas Nitrato de Potasio o NO3 a P-nitro-
fenil-BD galactopiranosido o PNPG, con la suspensión bacteriana utilizando una pipeta Pasteur,
evitando que se formen burbujas. Luego se transfirió cuatro a ocho gotas de la suspensión
bacteriana a una ampolla de medio Auxiliar (AUX Medium). Se homogenizó con la pipeta
evitando la formación de burbujas. Después se llenaron los microtubos y las cúpulas de las
pruebas Glucosa (GLU) a Fenil-acetato (PAC) , de tal manera que el nivel del líquido quedaba
horizontal o ligeramente convexo en la cúpula, nunca cóncavo.
Se llenó luego con aceite de parafina estéril las cúpulas de las tres pruebas subrayadas (GLU;
Arginina (ADH); Urea (URE), de tal manera que se formó un menisco convexo. Luego se
cubrió la cámara y se incubó a 30 ºC durante veinticuatro horas.
Lectura de la Galería
Después de veinticuatro horas de incubación, la lectura se llevó a cabo utilizando la tabla de
lectura del API 20 NE. Se anotaron todas las reacciones espontáneas: GLU, ADH, URE,
Esculina ( ESC), Gelatina (GEL), PNPG y se registraron en las fichas respectivas según el
catálogo analítico. Las pruebas de NO 3 y Triptófano (TRP) se realizaron protegiéndolas de la
contaminación.
Prueba de reducción de Nitratos a Nitritos

Se añadió una gota del reactivo Nitrato uno NIT1 y Nitrato dos NIT2 en la cúpula de NO 3 . El
viraje al color rojo, después de cinco minutos, indicó una reacción positiva.
Prueba de producción de indol.(TRP).

Se añadió una gota del reactivo para Indol. La presencia de un color rosa en la cúpula indicaba
una reacción positiva.
Prueba de asimilación.
Se observó el crecimiento bacteriano, el cual se evidencia por la turbidez de la cúpula. En
algunos casos, fue necesario una reincubación por veinticuatro horas más, excepto las pruebas
de NO3 , TRP, y GLU que debían ser leídas únicamente a las veinticuatro horas. Ver Flujograma
Nº 01.
FLUJOGRAMA Nº 01
IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS OLEOFÍLICAS.
Reactivación de las
cepas bacterianas
Coloración de Gram
Cocos Bastones y Cocos Bastones y

grampositiv Cocobacilos gramnegativo cocobacilos
os grampositivos s gramnegativos
Catalasa
Oxidasa
Pruebas Bioquimicas
Oxidasa Oxidasa
positivos negativos
Sistema Pruebas
API 20 NE Bioquímicas
3.2.2.5 SELECCIÓN DEL CONSORCIO BACTERIANO EXÓGENO
Se seleccionaron como miembros del consorcio bacteriano exógeno a las cepas bacterianas que
presentaron mayor actividad emulsificante y degradativa.
3.2.2.6 PREPARACIÒN DEL INÓCULO.
Las cepas integrantes del consorcio bacteriano exógeno fueron reactivadas y a las veinticuatro
horas fueron inoculadas cada una por separado en 3.5 mL de caldo nutritivo, al cabo de
veinticuatro horas, nuevamente fueron inoculadas en 35 mL de medio mineral el cual contenía,
como única fuente de carbono, extracto etéreo de crudo de petróleo, n-hexadecano o crudo de
petróleo al 5 % . Finalmente, después de un día fueron inoculadas en 350 mL de medio mineral
con las fuentes de carbono mencionadas.
Este procedimiento se realizó por triplicado para cada cepa hasta alcanzar un volumen
aproximado de tres litros, cantidad adecuada por ser el 10% del volumen del terrario.
El recuento de la población bacteriana de cada cepa se realizó, utilizando cámara Neubauer.
3.2.2.7 DETERMINACIÓN DE LA COMPOSICIÓN QUÍMICA DEL CRUDO DE

PETRÓLEO.
Se determinó la composición química porcentual del destilado de crudo de petróleo procedente

de la refinería “La Pampilla” a 200 ºC mediante cromatografía de gases, determinando las
diferentes clases de hidrocarburos: saturados acíclicos, saturados cíclicos, insaturados olefínicos.
El análisis fue realizado en la Unidad de Servicios de Análisis Químicos (USAQ) de la Facultad
de Química e Ingeniería Química de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos.(Ver anexos
Pág 42)
3.2.2.8 CARACTERIZACIÓN DEL SUELO DE CULTIVO.
Se determinaron las principales características fisicoquímicas del suelo de cultivo, entre ellas:
textura, salinidad, materia orgánica, Carbono, Nitrógeno, Fósforo, Potasio y pH, mediante
diversos análisis efectuados en el Laboratorio de Agua y Suelo de la Facultad de Ingeniería
Agrícola de la Universidad Nacional Agraria La Molina. (Ver Pág 45 ).
3.2.2.9 ESTERILIZACIÓN DEL SUELO CON LUZ ULTRAVIOLETA.
Los treinta kilogramos de suelo fueron separados en porciones de aproximadamente 5 kg y se

extendieron sobre bandejas de 60 cm de largo por 38 cm de ancho, recubiertas con bolsas de
polietileno de boca ancha, el suelo no debía tener una profundidad mayor a cinco centímetros, la
esterilización con luz ultravioleta (intensidad de 253-260 nm) se realizó a una distancia de
20 cm. Durante treinta minutos, removiendo el suelo cada quince minutos. La esterilidad del
suelo se comprobó mediante una prueba de esterilidad, en la cual 5 g de suelo fueron
suspendidos en solución salina estéril al 0.85% y a partir de la suspensión se sembró en 25 mL
de caldo nutritivo y a su vez en agar nutritivo, al cabo de venticuatro horas de incubación, no
hubo crecimiento mic robiano, por tanto, después de la esterilización con luz ultravioleta, el
suelo fue inoculado inmediatamente para evitar cualquier contaminación.
3.2.2.10 BIODEGRADACIÓN DE CRUDO DE PETRÓLEO EN TERRARIOS.
Se evaluó con la tecnología Landfarming, utilizada por Belloso y col.,1998. Se acondicionaron

tres terrarios o recipientes metálicos de aproximadamente 50 kg de capacidad, los cuales fueron
cubiertos interiormente con una capa gruesa de pintura epóxica no biodegradable para evitar el
contacto del suelo de cultivo con el metal. Posteriormente, las tres muestras de suelo de cultivo
de 30 kg fueron introducidas en cada terrario y se adicionó intencionalmente crudo de petróleo
a estas muestras hasta una profundidad aproximada de 5 cm., el crudo de petróle o se mantuvo en
la superficie del suelo. Cuadro Nº 01. Se determinó al comienzo del ensayo y cada treinta días
en cada suelo contenido en los terrarios los siguientes parámetros: temperatura, pH, humedad,
contenido de hidrocarburos, recuento de microorganismos aerobios totales y microorganismos
degradadores de hidrocarburos hasta los noventa días.
Los terrarios fueron:
TERRARIO Nº 01.- Denominado control abiótico, este primer terrario fue tratado con un litro
de hipoclorito de sodio al 5.25 %, para inhibir el crecimiento microbiano y poder evaluar
únicamente la influencia de los factores ambientales en la degradación de hidrocarburos.
TERRARIO Nº 02.- En este terrario el suelo se mantuvo en condiciones normales, y se

observó únicamente la influencia de los microorganismos nativos del suelo en la
biodegradación.
TERRARIO Nº 03.- En el tercer terrario se introdujo suelo previamente esterilizado con luz
ultravioleta, ver esterilización del suelo con luz U.V. (3.2.2.9 Pág 19 ). Posteriormente se
inoculó en el suelo el consorcio bacteriano exógeno seleccionado.
Los tres terrarios se mantuvieron a la intemperie durante noventa días aireándose semanalmente
mediante mezclado de todo el contenido. Cuadro Nº 01. (Ver foto Nº 01, anexos Pág 47 ).
CUADRO Nº 01
REMEDIACIÓN POR TECNOLOGÍA LANDFARMING*
TERRARIO SUELO CONCENTRACIÓN HIPOCLORITO *CONSORCIO AGUA

kg DE CRUDO DE AL 5.25% BACTERIANO DESTILADA
PETROLEO 5 % Litros
kg/kg
1.Control 30 5 1 litro -- 5
abiótico
2 . Consorcio 30 5 -- -- 5
bacteriano
nativo
3. Consorcio 30 5 -- Exógeno 2
bacteriano (3 litros de
exógeno. cultivo)
3.2.2.11 CUANTIFICACIÓN DE HIDROCARBUROS TOTALES
Los hidrocarburos de cada muestra se extrajeron mediante soxhlet por el método 3540 EPA
(Agencia de Protección Ambiental de Estados Unidos) que consiste en mezclar 25 g de muestra
con 25 g de sulfato de sodio anhidro y proceder a la extracción de hidrocarburos por soxhlet
utilizando como solvente éter etílico a una temperatura constante de 60 ºC durante doce horas,
luego de ese tiempo reducir el volumen del solvente en un rota vapor hasta obtener un volumen
menor a 10 mL Secar el extracto adicionando 0.1 g de sulfato de sodio anhidro y transferir
mediante enjuagues a un vial previamente pesado. Después de la evaporación del solvente a 25
ºC, cuantificar gravimétricamente el hidrocarburo extractable.
3.2.2.12 RECUENTO DE BACTERIAS AEROBIAS MESÓFILAS Y OLEOFILÍCAS

POR DISEMINACIÓN.
De cada muestra de suelo se pesó 10 gramos que se suspendieron en 90 mL de solución salina

–1
estéril al 0.85%, esta fue la dilución 1:10 o 10 , de la dilución 1:10 se obtuvo 1 mL y se llevó a
–6
un tubo con 9 mL de dilución, y así sucesivamente hasta la dilución 10 . Las diluciones podían
continuar dependiendo del experimento. Par a hacer el recuento de bacterias aerobias mesófilas,
de cada tubo de dilución se transfirió 0.1 mL a cada placa petri que contenía agar Plate Count,
este procedimiento se hizo por duplicado y para el recuento de las bacterias oleofílicas también
se obtuvo 0.1 mL de cada dilución y se inoculó a cada placa petri que contenía agar Cetrimide
más petróleo al 1 % por duplicado.
El inóculo fue depositado en un margen del agar y con la varilla horizontal de la espátula
Drigalsky, se distribuyó por toda la superficie del agar evitando pasar dos veces por el mismo
plano. La tapa de la placa se levantó sólo lo necesario para evitar contaminación. Las placas
fueron incubadas en posición invertida de veinticuatro a cuarenta y ocho horas.
Al cabo de ese tiempo se escogieron las placas que contenían de treinta a trescientas colonias
para el recuento. Para expresar el resultado final, el número total de microorganismos se
multiplicó por la inversa del volumen de inóculo y por la inversa de la dilución y se reportó
como unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/mL)
3.2.2.13 MEDICIÓN DEL pH DEL SUELO
Para determinar el pH se obtuvo una muestra de 1 kg de suelo, el pH se determinó en

suspensiones del suelo al 40% peso sobre volumen (P/V) en una solución de bicloruro de Calcio
al 0.01 molar ( CaCl2 0.01 M), utilizando potenciómetro.
3.2.2.14 DETERMINACIÓN DE LA HUMEDAD DEL SUELO
Antes de determinar la humedad se obtuvo una muestra de 1 kg de suelo, la humedad se

determinó gravimétricamente por secado de 25 g de suelo a 105 ºC hasta obtener peso constante.
3.2.2.15 MEDICIÓN DE LA TEMPERATURA
La temperatura se determinó utilizando un termómetro digital en el suelo contenido en cada

terrario.
3.2.2.16 ANÁLISIS ESTADÍSTICO POR REGRESIÓN MÚLTIPLE
En el presente estudio, la biodegradación de crudo en terrarios cuantificada en concentración de

hidrocarburos (variable Y), puede depender del tiempo, temperatura, pH, humedad, bacterias
oleofílicas, tipo de suelo 1: suelo del control abiótico, tipo de suelo 2: suelo del consorcio
bacteriano nativo, tipo de suelo 3: suelo del consorcio bacteriano exógeno y bacterias aerobias
mesófilas. (X1,X2,X3 ,X4 ,X5 ,X6, X7,X8 ,X9 ). Por tanto la ecuación de regresión múltiple es:
Y = B1 X1 + B2 X2 + B3 X3 +B4 X4 + B5X5+ B6 X6 + B7X7+ B8 X8 + B9 X9.
Donde:
Y= Concentración de hidrocarburos (HIDROCARBUROS)
X1 = Tiempo
X2 = Temperatura
X3 = pH
X4 = Humedad
X5 = Microorganismos oleofílicos (MICROORGANISMOS)
X6 = Suelo 1
X7 = Suelo 2
X8 = Suelo 3
X9 = Bacterias aerobias mesófilas.
B1 , B2, B3, B4 , B5 , B6 B7 , B8, B9. Coeficientes de regresión neta
Para obtener el modelo final, se utilizó el programa SPSS 9.0 Windows con análisis de
Regresión Múltiple por Pasos o Stepwise, (ver anexos Pág 48) con selección de variables, el
cual permitió seleccionar las variables independientes de influencia significativa en el proceso
de degradación, mediante la regresión por pasos, se puede manejar un gran número de variables
en ejecución y calcular una secuencia de ecuaciones de regresión, incorporando o eliminando en
cada paso una variable independiente, el programa de cómputo SPSS registra las variables en
pasos individuales de la mejor a la peor, siempre que cumplan con el criterio estadístico
establecido.
En el programa, se registra primero la variable independiente que explica la mayor cantidad de

varianza en la variable dependiente. La siguiente variable por registrar, explica la mayor
cantidad de varianza en conjunción con la primera y así sucesivamente. En cada paso, se registra
en la ecuación la variable que explica la mayor cantidad de varianza no explicada por la variable
que ya está incluida en el modelo. En la validación del modelo, la hipótesis nula se rechaza
cuando el coeficiente de regresión es diferente de cero en forma significativa, el valor F es
elevado y el nivel de significación es menor que 0.10, 0.05 y 0.01. La hipótesis nula indica que
los coeficientes que acompañan a las variables seleccionadas son iguales a cero en forma
simultánea.
Si se rechaza la hipótesis nula, se afirmaría que las variables elegidas son importantes en el
proceso de biodegradación. Entonces se tiene:
H0 : B1= B2 = 0
Ha: B1 B2 0
Donde:
H0 : hipótesis nula.
Ha: hipótesis alterna.
B1 : coeficiente de la primera variable seleccionada.
B2 : coeficiente de la segunda variable seleccionada.

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Biodegradación de crudo de petróleo en terrarios.

§ Medios de cultivo (Ver anexos 8.1, Pág 39)

a) Muestreo de suelos para el aislamiento de microorganismos con capacidad degradativa.

b)Muestreo de suelos para evaluar la biodegradación de crudo en terrarios.

3.2.2 PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS

3.2.2.1 AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN DE BACTERIAS DEGRADADORAS DE

3.2.2.2 ACTIVIDAD EMULSIFICANTE DE LAS BACTERIAS DEGRADADORAS DE

Las cepas bacterianas se reactivaron en 2 mL de caldo Nutricio y se les incubó a 37 ºC por

Se obtuvieron 10 mL del sobrenadante en tubos de prueba de 16 x 150 mm, previa decantación,

El blanco fue un tubo conteniendo el medio de cultivo sin inoculación, y se procedió de la

3.2.2.3 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DEGRADATIVA DE LAS CEPAS

La actividad degradativa sobre el petróleo se evaluó según la metodología de Mills y col.

Se repartieron 9 mL del medio en tubos de 16 x 150 mm. y se le añadió 1 mL de cultivo,

3.2.2.4 IDENTIFICACIÓN TAXONÓMICA

PREPARACIÓN DE LA GALERÍA API 20 NE.

Se depositó aproximadamente 5 mL, de agua destilada en los alvéolos de la cámara, para

Preparación del inóculo.

Prueba de reducción de Nitratos a Nitritos

Prueba de producción de indol.(TRP).

IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS OLEOFÍLICAS.

Cocos Bastones y Cocos Bastones y

3.2.2.5 SELECCIÓN DEL CONSORCIO BACTERIANO EXÓGENO

3.2.2.6 PREPARACIÒN DEL INÓCULO.

3.2.2.7 DETERMINACIÓN DE LA COMPOSICIÓN QUÍMICA DEL CRUDO DE

Se determinó la composición química porcentual del destilado de crudo de petróleo procedente

3.2.2.8 CARACTERIZACIÓN DEL SUELO DE CULTIVO.

Agrícola de la Universidad Nacional Agraria La Molina. (Ver Pág 45 ).

3.2.2.9 ESTERILIZACIÓN DEL SUELO CON LUZ ULTRAVIOLETA.

Los treinta kilogramos de suelo fueron separados en porciones de aproximadamente 5 kg y se

3.2.2.10 BIODEGRADACIÓN DE CRUDO DE PETRÓLEO EN TERRARIOS.

Se evaluó con la tecnología Landfarming, utilizada por Belloso y col.,1998. Se acondicionaron

Los terrarios fueron:

únicamente la influencia de los factores ambientales en la degradación de hidrocarburos.

TERRARIO Nº 02.- En este terrario el suelo se mantuvo en condiciones normales, y se

TERRARIO SUELO CONCENTRACIÓN HIPOCLORITO *CONSORCIO AGUA

3.2.2.11 CUANTIFICACIÓN DE HIDROCARBUROS TOTALES

3.2.2.12 RECUENTO DE BACTERIAS AEROBIAS MESÓFILAS Y OLEOFILÍCAS

De cada muestra de suelo se pesó 10 gramos que se suspendieron en 90 mL de solución salina

3.2.2.13 MEDICIÓN DEL pH DEL SUELO

Para determinar el pH se obtuvo una muestra de 1 kg de suelo, el pH se determinó en

3.2.2.14 DETERMINACIÓN DE LA HUMEDAD DEL SUELO

Antes de determinar la humedad se obtuvo una muestra de 1 kg de suelo, la humedad se

3.2.2.15 MEDICIÓN DE LA TEMPERATURA

La temperatura se determinó utilizando un termómetro digital en el suelo contenido en cada

3.2.2.16 ANÁLISIS ESTADÍSTICO POR REGRESIÓN MÚLTIPLE

En el presente estudio, la biodegradación de crudo en terrarios cuantificada en concentración de

Y = B1 X1 + B2 X2 + B3 X3 +B4 X4 + B5X5+ B6 X6 + B7X7+ B8 X8 + B9 X9.

Y= Concentración de hidrocarburos (HIDROCARBUROS)

X5 = Microorganismos oleofílicos (MICROORGANISMOS)

X9 = Bacterias aerobias mesófilas.

B1 , B2, B3, B4 , B5 , B6 B7 , B8, B9. Coeficientes de regresión neta

En el programa, se registra primero la variable independiente que explica la mayor cantidad de

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