Evaluaci6n preliminar in vitro de citotoxicidad de

extractos vegetales, empleando rnetodos colorlrnetrlcos

In vitro preliminary cytotoxicity testing of vegetal

extracts, using colorimetric methods
Claudia Patricia Cordero Camacho', Fabio Ancizar Aristizeibal Gutierrez:

RESUMEN
Para avanzar en el estudio de la biodiversidad vegetal colornbiana, considerada como fuente potencial de pro-
ductos farmacol6gicamente activos, es necesario establecer sistemas de evaluaci6n de actividad biol6gica que
permitan detectar productos activos en patologfas de alto impacto social y economico, como es el cancer. Este
trabajo describe la implementaci6n de una metodologfa preliminar in vitro para determinar la potencial activi-
dad anticancer de extractos vegetales, evaluando su citotoxicidad sobre lineas celulares derivadas de tumores
human os, midiendo indirectamente la masa celular mediante los ensayos colorimetricos de reducci6n del MTT
(metil tiazol tetrazolio) y tinci6n con SRB (Sulforodamina B). Se adaptaron los cultivos de las lineas celulares HT-
29, MCF-7, SiHa y HEp-2; igualmente se seleccionaron los para metros para la valoraci6n de citotoxicidad: con-
centraci6n de MTT, densidad celular y periodo de tratamiento; se comprob61a sensibilidad de las lineas celula-
res al agente quirnioterapeutico Doxorubicina-HCl y se evalu61a citotoxicidad de extractos de especies vegetales
colombianas, evidenciando la utilidad de la valoraci6n como herramienta para bioguiar la busqueda de extrac-
tos activos.

Palabras clave: anticancer, citotoxicidad , MTT, SRB, lineas celulares

ABSTRACT
To advance in the study of the Colombian vegetal biodiversity, considered as a potential source of
pharmacologically active products, the establishment of biological activity evaluation systems is necessary, which
allow the detection of active products against pathologies with high social and economical impact, such as
cancer. This work describes the implementation of a preliminary in vitro methodology for the determination of
potential anticancer activity in vegetal extracts, by cytotoxicity testing upon human tumor cell lines, measuring
the cellular mass indirectly with the colorimetric assays of MTT (methyl tetrazolium tiazole) reduction and SRB
(sulforhodamine B) staining. HT-29, MCF-7, SiHa and HEp-2 cell lines cultures were adapted, MTT concentration,
cellular density and treatment period parameters for the cytotoxicity assay were selected. Cell lines sensitivity to
the chemotherapeutic agent Doxorubicin HCl was determined. Colombian vegetal species extracts cytotoxicity
was tested and usefulness of the assay as a tool to bioguide the search of active products was evidenced.

Key words: anticancer, cytotoxicity, MTT, SRB, cell lines.

INTRODUCCION

Los recursos bioloqicos existentes en Colombia
son considerados como una fuente potencial de
productos con actividad tarrnacoloqica. Por lar-
go tiempo han sido el objeto de estudio de va-
rios grupos de investiqacion, que han abordado
de forma amplia los primeros pasos del proceso
de investiqacion y desarrollo de nuevos princi-
pios activos extrafdos de plantas, incluyendo la
selecclon de especies con base en informacion
etnornedica, el anahsls qufmico preliminar para

• Quimicos tarrnaceutlcos, Departamento de Farmacia, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, sede
Bogota. Edificio 450, Ciudad Universitaria, Carrera 30-Calle 45, Bogota D.C., Colombia, Sudamerica, AA 14490. Fax: 3165060.
Correo electr6nico: fabioaris@ibun.unal.edu.co

100

identificar el tipo de compuestos presentes y la eva-
luaci6n de la actividad biol6gica general a traves de
bioensayos de toxicidad en Artemia salina, Daphnia
magna y otros modelos biol6gicos (Sanabria, 1997).
Para seguir avanzando se hace necesario estable-
cer sistemas de evaluaci6n preliminar de actividad
enfocada a patologfas especfficas, en especial aque-
lias de alto impacto social y econ6mico (Pinzon,
1997), aumentando asf la participaci6n del pais en el
proceso y en los beneficios derivados de su
biodiversidad, impulsando el fortalecimiento de la
capacidad tecnica y cientffica, y promoviendo la con-
servaci6n y utilizaci6n sostenible de los recursos bio-
16gicos (Soejarto, 1997).
Para responder a esta necesidad se ha centra-
do el interes en las metodologfas alternativas in vitro,
modelos que pueden generar resultados con validez
internacional, relativamente econ6micos, rapidos y
sencillos, adernas de que contribuyen a la reducci6n
del empleo de animales de laboratorio y abren la po-
sibilidad de realizar estudios a nivel molecular
(Johnson, 1990). En el tamizaje preliminar de agen-
tes con actividad anticancer se han empleado gru-
pos de Ifneas celulares derivadas de tumores huma-
nos que son expuestas a la sustancia en estudio por
un periodo determinado, al cabo del cual se evalua
la viabilidad celular; la capacidad citot6xica de los
agentes estudiados es interpretada como un indica-
tivo de potencial actividad anticancer in vivo (Monks
et al., 1991; Lieberman et al., 2001; Fricker y Buckey,
1996; Skehan et al., 1990).
Aquf se describe el establecimiento de las condi-
ciones para el desarrollo de la valoraci6n preliminar in
vitro de la potencial actividad anticancer de extractos
vegetales, evaluando su citotoxicidad sobre cuatro If-
neas celulares derivadas de tumores s61idos huma-
nos; empleando los rnetodos colorirnetricos de reduc-
ci6n del MIT (metil tiazol tetrazolio) y fijaci6n de la
SRB (Sulforodamina B) para la determinaci6n indirec-
ta de la masa celular.
METODOLOGIA
Lfneas celulares: se emplearon las Ifneas celulares
derivadas de tumores s6!idos humanos: HT-29
(adenocarcinoma colorrectal), MCF-7 (adenocarcinoma
de mama), incluidas en el panel dellnstituto Nacional
de Cancer de los Estados Unidos y recomendadas como
modelos de valaraci6n preliminar por su sensibilidad
EVALUACION IN VITRO DE CITOTOXICIDAD
(L6pez, 2000); SiHa (carcinoma de cervix), HEp-2 (epi-
dermis de laringe contaminado con HeLa), obtenidas
todas del banco de celulas del Laboratorio de
Inmunologfa del Instituto Nacional de Cancerologfa de
Colombia, sede Bogota. Las cuatro Ifneas celulares se
mantuvieron en medio mfnimo esencial (MEM), sup le-
mentado con 10% de suero fetal bovino (FBS), penicili-
na 100 U/ml y estreptomicina 100 llg/ml, en frascos de
cultivo celular de 75 ern" , a 3rC, en atm6sfera con 5%
de CO2 en aire y 100% de humedad relativa.
Valoraciones de citotoxicidad: las celulas con
90% de confluencia fueron tripsinizadas, contadas en
carnara de Neubauer, transferidas a placas de
microtitulaci6n de 96 pozos con fonda plano. Despues
de un perfodo de preincubaci6n de 24 h fueron trata-
das por perfodos de 24 h Y 48 h con la sustancia de
prueba, adicionada en cinco diluciones seriadas. La
sustancia de tratamiento fue retirada y la masa celular
fue determinada por reducci6n del MIT 0 par tinci6n
con SRB. Se calcularon los porcentajes relativos de
supervivencia de las celulas tratadas usando como
referencia las celulas control no tratadas; se obtuvie-
ron curvas concentraci6n-porcentaje de superviven-
cia y se calcularon las concentraciones letales 50 (LCso)
empleando el programa POLO PC (Cordero, 2002).
Tratamientos: se emple6 como patr6n de acti-
vidad citot6xica Doxorubicina HCI (Pharmacia &
Uphjon) en soluci6n, frente a los extractos etan61icos
totales de Acnistus arborescens y Calea peruviana y
el compuesto X, purificado a partir del extracto
etan61ico total de Acnistus arborescens, suministra-
dos por el grupo de investigaci6n en productos natu-
rales bioactivos del Departamento de Farmacia de la
Universidad Nacional de Colombia. Las concentra-
ciones rnaximas empleadas fueron de 10-4 M para
compuestos puros y 250 llg/ml para los extractos ve-
getales; las relaciones de diluci6n fueron de 1:10 Y
1:3, respectivamente.
Determinacion de la masa celular: se siguie-
ron los procedimientos establecidos por Skehan et
a/. (1990) para la tinci6n con SRB y por Mosmann
(1993) para la reducci6n con MTT, adaptados por
Cordero (2002).
Establecimiento de las condiciones de desa-
rrollo de las valoraciones: Inicialmente para cada una
de las Ifneas celulares se establecieron los rangos de
101
 REVISTA COLOMBIANA DE BIOTECNOLOGIA VOL. IV No.1
linealidad de la relacion nurnero de celulas-
absorbancia, por los dos metodos colorirnetricos, se
evaluo su sensibilidad frente al agente quimiotera-
peutico Doxorubicina Hel y se seleccionaron los
parametres: concentracion de MIT, nurnero de celu-
las por pozo y perfodo de tratamiento.
RESULTADOS Y DISCUSION
Adaptaci6n de los cultivos celulares: En la tabla 1
aparecen las relaciones de subcultivo establecidas
para cad a linea celular, de forma tal que se dispusie-
ra de una cantidad suficiente de estas realizando
unicarnente un proceso de tripslnizacion semanal.
Tabla 1 Relaciones de subcultivo*
LInea celular Relaclon de subcultivo
HEp-2 1*105 ± 1.5*10'
SiHa 3*105 ± 6*10'
HT-29 1.2*106 ± 3*105
MCF-7 1.1*106 ± 2*105
La relacion de subcultivo esta expresada como nurnero de ce-
lulas dispuestas en el frasco de cultivo.
Condiciones de desarrollo de las valoracio-
nes de citotoxicidad: la valoracion in vitro de
citotoxicidad se introdujo hacia 1950 con el objetivo
de predecir la actividad in vivo de un agente neoplasico.
EI ensayo clonoqenico fue el primer rnetodo emplea-
do para tal fin; con el paso del tiempo, este ha side
complementado con metodologias alternativas basa-
das en la rnedicion de la viabilidad celular (tincion se-
lectiva, tincion de proteinas) y del metabolismo celular
(inclusion de timidina, bioluminiscencia ATP, reduccion
de MIT). Estos modelos presentan baja correlacion
con la respuesta in vivo frenre a un tratamiento
quimioterapeutico, perc han demostrado ser de gran
utilidad como rnetodos de screening 0 tamizaje de
nuevos agentes antineoplasicos (Bellamy, 1992).
Los rnetodos de tincion con SRB y reducci6n
del MIT han side ampliamente empleados para la
determinacion indirecta de la masa celular y, aunque
los dos son coiorimetricos, sus fundamentos son di-
ferentes. EI rnetodo de reduccion del MIT (bromuro
de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) es una
medida del metabolismo celular, basad a en la reduc-
cion de esta sal por accion de las succinato-
102
deshidrogenasas-mitocondriales con la consecuen-
te tormacion del colorante azul-violeta forrnazan, cuya
concentracion es proporcional al numero de celulas
presentes (Mosmann, 1983). La tincion con SRB es
una determinacion del contenido proteico total por co-
loraci6n con SRB (sulforodamina B), que es un co-
lorante de aminoxantano, rosado brillante, con dos
grupos sulfonicos S03', que en condiciones media-
namente acidas aumentan su afinidad por los
aminoacidos basicos de las protefnas, fijandose
electrostatica y selectivamente a estes (Skehan et
el., 1990).
Para emplear estos dos rnetodos en la determi-
nacion de la masa celular que permanece viable des-
pues de la exposicion a un xenobiotico era necesario
verificar la linealidad de la relacion entre absorbancia
y nurnero de celulas, y establecer el range de densi-
dad celular (nurnero de celulas / pozo) en que esto
se cumplia para cad a linea. Se evalu61a relacion para
los dos metodos colorirnetricos en las cuatro lineas
celulares, encontrando un comportamiento lineal tanto
en valoraciones realizadas con un periodo de
°
incubacion de h, como en las realizadas tras 48 h
de incuoacion, (rz 0,95 a tiempo cera y r2 0,916 tras
48 h) para la tinci6n con SRB y la reduccion del MIT
(vease qrafico 1).
Se evidenci6 una perdida de la linealidad a al-
tas densidades celulares despues de la incubacion
por 48 h, causante de la reduccion del range de
linealidad. Para las cuatro lineas celulares, el range
2.4
•
cu
.~ 1.6
cu
.0
oen
~08
10000 20000 30000 40000 50000
Celulas I pozo
Grafico 1. Determinacion del rango de linealidad de la relacion
numero de celulas-absorbancia; se muestran los resultados para
MCF-7, can 0 h de incubaci6n (s610 preincubacion): o SRB 0,4%,
t; MIT 0.25 mg/mL, _ MIT 0.5 mg/ml; can 48 h de incubaci6n: •
SRB 0.4%, ... MIT 0,25 mg/ml, 0 MIT 0,5 mg/ml.
 EVALUACION IN VITRO DE CITOTOXICIDAD

1.5 .,..------------......, 90%

.~....'! - - - ••• - _. - £3- . - -

.!l1
o
c
(1J
.0
(;
(/)

~05
. "
(1J
'(3
c
OJ
.;:,
>
(jj
0..
::J
.. ~~:-,
.'.,
"
.... ,

"<,'•. -. ~"
...... '
60%

30%
(/)
~
.•.. ..

0%
4000 8000 12000 ·6.2 ·57 ·5.2 -4.7 ·4.2
Celulas / pozo Logaritmo de concentracion (M)

Grafico 2. Selecci6n de concentraci6n de MTI. Se muestran los Grafico 3. Valoraci6n de sensibilidad a Doxorubicina He!. Se
resultados para dos Ifneas celulares tras 48 h de incubaci6n. HEp- muestran los resultados para HEp-2, 7.500 cslulas/pozo.e- 12 h,
2: _ MTI 0.5 mg/ml, ... MTI 0,25 mg/ml; SiHa: • MTI 0,5 mg/ml, <> <> 24 h Y '" 48 h de tratamiento; 104 celulas/pozo, 0 12 h, _ 24 h Y
MTIO,25. • 48 h de tratamiento.

de linealidad incluyo la menor densidad empleada linea celular. Estas fueron, respectivamente, 7.500
(5X102 celulas), indicando que, en las condiciones de celulas/ pozo para HEp-2, 10.000 celulas/pozo para
trabajo, los dos rnetodos colorirnetricos permiten de- SiHa, 15.000 celulas /pozo para MCF-7 y 20.000
tectar bajas densidades celulares y por tanto no pre- celulas/pozo para HT-29.
sentan diferencias de sensibilidad notables.
Para seleccionar el perfodo de tratamiento se
Para establecer el efecto de la concentracion inl- emplearon 24 h Y 48 h, con cinco diluciones seriadas
cial de MTT en los valores de absorbancia obtenidos, de Doxorubicina HCI, en relacion 1:1a y una concentra-
durante la determinacion de los rangos de linealidad cion maxima de 10.5 M; las celulas fueron inoculadas
de la relacion entre absorbancia y nurnero de celulas en las densidades seleccionadas en el ensayo prelimi-
se realizaron tratamientos paralelos de placas serne- nar. EI tratamiento de 24 h rnostro ser insuficiente para
jantes con las concentraciones de 0,25 y 0,5 mg/ml de determinar la concentracion letal 50 (LC5o) del agente,
MTT, frecuentemente empleadas en valoraciones de esto es, la concentracion 10·5M presento un porcentaje
citotoxicidad (Fricker y Buckey, 1996; Ezpeleta, 1998; de supervivencia mayor al 50%; mientras en el trata-
Kepers et aI., 1991; Scudiero et aI., 1988). Las res- miento de 48 h los porcentajes de supervivencia para
puestas obtenidas con las dos concentraciones de
MTT no difirieron significativamente; en los dos casos
120%
se observe un aumento de la absorbancia al au men-
tar el nurnero de celulas y la correlacion fue similar;
par tanto se decidio emplear la concentracion mas baja
(0,25 mg/ml). (veanse qraficos 1 y 2). .!l1 80%
o
c
OJ
.z
Se evaluo la sensibilidad de las cuatro Ifneas >
(jj
celulares a la Doxorubicina HCI, empleando en cada 0-
::J
(/) 40%
caso tres densidades celulares contenidas en el ran-
go de linealidad preestablecido y perfodos de trata-
>R
o
1-.,-:6.
miento de 12 h, 24 h Y 48 h. Las cuatro Ifneas celu- 'n
lares mostraron ser sensibles a la accion de la 0%
Doxorubicina HCI en concentracion 10·4M e inferio- -9.5 -8.5 -7.5 -6.5 -5.5 -4.5
res, con perfodos de tratamiento de 24 h Y 48 h, Logaritrro de concentraci6n (M)
mientras que con 12 h no se detectaron cambios
Gratico 4. Selecci6n del perfodo de tratamiento. Se presentan los
(vease qrafico 3); con base en estos resultados se resultados para HT·29: 24 h: _ MTI 0,25 mg/ml, 0 SRB 0,4%; 48
selecciono la densidad celular por emplear para cad a h:... MTI 0,25 mg/ml y'" SRB 0,4%.

103
 REVISTA COLOMBIANA DE BIOTECNOLOGIA VOL. IV No.1

las cuatro Ifneas celulares, con la con- Tabla 2 Valores de i.c;

centracion 10-5 M, fueron inferiores a
Metodo Doxorubicina HCI A.a C.p X
40%, 10 que indica que con este perfodo
*10-7M Ilg/ml Ilg/ml 1l9/ml *10-7M
de tratamiento es posible determinar la
concentracion letal50 de la Doxorubicina HEp-2
HCI en cada caso (vease qrafico 4). Los MTT 4,44 0,26 21,7 94,4 49,32
valores de absorbancia obtenidos tanto SRB 1,62 0,09 18,8 107,4 38,57
por el metoda de reduccion del MTI SiHa
como por la tincion con SRB estuvieron MTT 4,44 0,26 29,1 103,1 24,65
dentro de los rangos de linealidad
SRB 5,79 0,34 16,0 100,7 13,92
preestablecidos para cada caso.
MCF-7

Para las cuatro lineas celulares MTT 2,90 0,17 20,9 122,4 14,77

se observe una respuesta similar al tra- SRB 3,59 0,21 15.2 125,4 9,25
tamiento por 48 h con Doxorubicina HT-29
HCI, indicando que su sensibilidad al MTT 12,5 0,72 32,9 >250 11,9
citotoxi-co es semejante. Estas relacio- SRB 9,73 0,56 26,7 >250 13,69
nes mostraron una tendencia lineal en
Valores promedio calculados para las cuatro Ifneas celulares. Las LCsopara Doxorubicin"
la zona central. Se realize un ensayo HCI se expresan en dos unidades para electos de comparaci6n. A.a: extracto etan6licc
confirmatorio empleando diez concen- total de A. arborescens. C.p: extracto etan61ico total de C. peruviene, X: compuesto X
traciones de Doxorubicina HCI conte-
nidas en el rango correspondiente
(1*10-8 M a 1*10-5 M), en el que se encontro que la 2000). Se calculo la concentracion de Doxorubicina
relacion Log concentracion-porcentaje de superviven- HCI causante de la muerte del 50% de las celulas
cia mantenfa el comportamiento lineal (r ~ 0.96) en (LC5o)' para cada linea celular, empleando los valores
el rango 2,5*10'8 M a 1*10-6 para las cuatro lineas ce- obtenidos en el ensayo preliminar y en el confirmato-
lulares (vease qrafico 5). rio; los resultados para cada linea celular en los dos
ensayos estuvieron en el mismo orden de magnitud,
Con los porcentajes de supervivencia calculados indicando que la evaluacion preliminar de citotoxicidad
se determine la proporcion de celulas que, inmediata- permite obtener un estimativo de la actividad anticancer
mente despues del tratamiento, se mantuvieron intac- de una sustancia (vease tabla 2).
tas. No se incluyo perfodo de recuperacion posterior
al tratamiento; por tanto la citotoxicidad se expresa en Comparaci6n entre los rnetodos colori-
terminos de concentraciones letales (LC) (Freshney, rnetricos: los resultados obtenidos por los rneto-
dos colorimetricos para cada linea celular presen-
taron comportamientos simi lares, mostrando ser
100%
paralelos entre sf (P ~ 0,172, =
a 0,05). AI realizar
co
<3
... "< . una prueba de correlacion, se observe una alta co-
rrespondencia entre los porcentajes de superviven-

....
c -,..0 80%
Q)
cia obtenidos por los dos rnetodos ( r ~ 0,89 ) (vea-
.?
> ,~. se gratico 6); indicando que los dos rnetodos
Ci>
a. '.~ 60%
::J

'"
'~'" o
proveen resultados com parables.
:12.
o
''"- ... 40% Una vez establecidas las condiciones y los pro-
tocolos de trabajo para la valoracion preliminar de la
20% actividad citotoxica, se procedio a estudiar los extrac-
-7.80 -6.80 -5.80 tos etanolicos totales de Acnistus arborescensy Galea
Log concentraci6n (M)
peru viana, plantas que actual mente son estudiadas
Grafico 5. Valoraci6n de citotoxicidad de Doxorubicina HCI sobre por el grupo de mvestiqacion en productos naturales
dos Ifneas celulares, 48 h de tratamiento. HT-29: • SRB, 0 MD, bioactivos del Departamento de Farmacia de la Uni-
MCF-7: _ SRB y t; MD. versidad Nacional de Colombia.

104
 EVALUACION IN VITRO DE CITOTOXICIDAD

CONCLUSIONES
100.0%
CD
IY Las evaluaciones realizadas mostraron que las If-
(f)
ro 800%
. neas celulares SiHa, MCF-7, HEp-2 Y HT-29 pre-
'u
c
(j)
sentan sensibilidad similar frente a la Doxorubicina
.2: 60.0% HCI, y son sensibles a la acci6n de extractos vege-
>
(v tales. La citotoxicidad evidenciada en estos mode-
0-
~ 400% los puede ser un indicativo de una potencial activi-
oR dad anticancer (Monks, et et., 1991; Freshney, 2000)
200% por 10que resulta uti I para guiar el fraccionamiento
20.0% 40.0% 60.0% 800% 100.0% de los extractos vegetales con miras a detectar la
% supervivencia MIT presencia de fracciones y compuestos potencial-
mente activos. Es evidente que S8 debe evaluar la
Gratico 6. Correlaci6n entre MTT y SRB en la valoraci6n de sensibilidad de estas Ifneas celulares a otros com-
citotoxicidad de Doxorubicina HCI. 0 HT-29, ... HEp-2, <> MCF-7 puestos con conocida actividad citot6xica, para com-
y_ SiHa.
pletar su patr6n de sensibilidad, que permita definir
si la actividad citot6xica evidenciada sobre una de
EI extracto de A. arborescens present6 mayor elias indica actividad diferencial sobre la clase de
actividad que el de G. Peruviana. Las concentracio- cancer que representa.
nes letales 50 calculadas estuvieron en relaci6n
aproximada de 10: 1 con los valores calculados para AGRADECIMIENTOS
la Doxorubicina HCI, mientras que esta relaci6n fue
de 100: 1 para el extracto de Galea peruviana. Esto Este trabajo cont6 con la financiaci6n del proyecto de
sugiri6 que el extracto de A. arborescens presenta- Colciencia " Evaluaci6n de actividad anticancer y anti-
ba mayor posibilidad de contener compuestos de HIV en extractos de productos naturales, nurnero 1101-
interes farmacol6gico que el extracto de G. 05-10067, Y del proyecto de la Direcci6n de Investiga-
Peruviana; por tanto, se evalu6 un compuesto puri- ci6n de la sede Bogota, de la Universidad Nacional de
ficado a partir de este, las LCso calculadas para el Colombia, Evaluaci6n de la actividad anticancer de
compuesto estuvieron en relaci6n 10: 1 con los va- extractos de plantas, c6digo No. 803625.
lores calculados para la Doxorubicina HCI, por 10.
que se considera que este puede ser el responsa- EI trabajo se desarroll6 en los laboratorios del
ble de la actividad mostrada par el extracto etan61ico grupo de investigaci6n en productos naturales
total (vease qrafico 7). bioactivos del Departamento de Farmacia de la Uni-
versidad Nacional de Colombia, sede Bogota.

120% ,....--------------, BIBLIOGRAFIA

Bellamy, W. 1992. Prediction of response to drug

.~ 80% therapy of cancer, a review of in vitro assays .
o
c
(j)
Drugs. 44 (5), 690-708.
.2:
>
(v Cordero, C. 2002. Implementaci6n de un metoda in
g- 40%
l/) vitro de evaluaci6n preliminar de actividad
oR
anticancer de extractos vegetales, empleando
Ifneas celulares derivadas de tumores humanos.
Trabajo de grado. Departamento de Farmacia,
0.3 0.8 1.3 1.8 2.3 Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de
Log de concentraci6n (Jlglml)
Colombia, sede Bogota, Colombia.
Grafico 7. Valoraci6n de citotoxicidad de dos extractos etan61icos
totales. Se presentan los resultados para MCF-7. Acnistus Ezpeleta, O. 1998. Gurso te6rico prectico sobre culti-
arborescens: ... SRB, " MIT; Calea peruviana: _ SRB, <> MIT. vo celular y ensayos de citotoxicidad. Universi-
dad de Navarra, Facultad de Farmacia, Espana.

105
 REVISTA COLOMBIANA DE BIOTECNOLOGIA VOL. IV No.1
Freshney, I. 2000. Cytotoxicity. En: Culture of animal
cells: a manual of basic technique. Freshney, I.
John Wiley and Sons Inc., Reino Unido, 329-343.
Fricker, S., Buckley, R. 1996. Comparison of two
colorimetric assays as cytotoxicity endpoints for
an in vitro screen for antitumour agents.
Anticancer Res. 16 (6B): 3755-3760.
Johnson, R. 1990. Screening methods in antineoplasic
drug discovery. J. Nat!. Cancer Inst. 82(13): 1082-
1083.
Keepers, Y, Pizao, P., Peters, G., Ark-Otte, J.,
Winograd, B., Pinedo, H. 1991. Comparision of
the sulforhodamine B protein and tetrazolium
(MTT) assays for in vitro chemosensitivity
testing. Eur. J. Cancer. 27 (7) : 897-900.
Lieberman, M., Patterson, G., Moore, R. 2001. In
vitro bioassays for anticancer drug screening:
effects of cell concentration and other
parameters on growth inhibitory activity.
Cancer Lett. 173: 21-29.
Lopez, A. 2000. Departamento de Toxicologfa C.I.FA
Universidad de Navarra, Pamplona, Espana.
Cornunicacion personal.
Monks, A., Scudiero, D., Skehan, P., Shoemaker,
R., Paull, K., Vistica, D., Hose, C., Langley,
J., Cronise, P., Vaigro-Wolff, A., Gray-
Goodrich, M., Campbell, H., Mayo, J., Boyd,
M. 1991. Feasibility of a high-flux anticancer
drug screen using a diverse panel of cultured
human tumor cells lines. J. Nat/. Cancer Inst.
83(11): 757-766.
106
Mosmann, T. 1983. Rapid colorimetric assay for
cellular growth and survival: application to
proliferation and citotoxicity assays. J. Immunol.
Meth. 65: 55-63.
Pinzon, R. 1997. Propuesta de un programa colom-
biano de bioprospeccion (Procolbio). En: T6pi-
cos en productos naturales: la biodiversidad
como fuente de moiecutes activas. Echeverri,
F., Quiri6nez, W. Universidad de Antioquia, Co-
lombia, 259-266.
Sanabria, A. 1997. De la especie vegetal al medica-
mento: mito y realidad. En: T6picos en produc-
tos naturales: la biodiversidad como fuente de
molecules activas. Echeverri, F, Quinonez, W.
Universidad de Antioquia, Colombia, 231-257.
Scudiero, D., Shoemaker, R., Paull, K., Monks, A.,
Tierney, S., Nofziger, T., Currens, M., Sen iff, D.,
Boyd, M. 1988. Evaluation of a soluble tetrazoliuml
formazan assay for cell growth and drug sensitivity
in culture using human and other tumor cell lines.
Cancer Res. 48: 4827-4833.
Skehan, P, Storeng, R., Scudiero, D., Monks, A.,
McMahon, J., Vistica, D., Wa~ren, J., Bokesch,
H., Kenney, S., Boyd, M. 1990. New colorimetric
cytotoxicity assay for anticancer-drug screening.
J. Nat!. Cencer lnst. 82(13): 1107-1112.
Soejarto, D. 1997. La biodiversidad de los bosques tro-
picales y la busqueda de nuevos tarmacos. En:
T6picos en productos naturales: la biodiversidad
como fuente de motecues activas. Echeverri, F,
Quiri6nez, W. Universidad de Antioquia, Colom-
bia, 133-149.