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CARACTERISTICAS BIOLOGICAS DE Penicillium digitatum, P. italicum Y P.

ulaiense EN POSTCOSECHA DE CITRUS
Thesis · January 1997

DOI: 10.13140/RG.2.1.3323.6082
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Ricardo Delgado
Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias INIAP
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UNIVERSIDAD DE LA REPUBLICA
FACULTAD DE AGRONOMIA
CARACTERISTICAS BIOLOGICAS DE Penicillium digitatum, P. italicum Y P. ulaiense

EN POSTCOSECHA DE CITRUS
por
Ricardo DELGADO ARCE

Gabriela PEREZ IARZA
TESIS presentada como uno de

los requisitos para obtener el
título de Ingeniero Agrónomo.
(Orientación Producción Vegetal
Intensiva)
MONTEVIDEO
URUGUAY
1997
INTRODUCCION
La citricultura es uno de los principales rubros agrícolas del Uruguay. El área

cultivada es aproximadamente de 21.000 ha, con una población estimada de 6 millones de
árboles. La producción está básicamente orientada a la exportación de fruta fresca, en
especial, hacia mercados del Hemisferio Norte (MGAP, 1992 y 1996).
Cerca del 51% de la producción total del país se exporta, en tanto que la industria
(principalmente de extracción de jugos) absorbe un 22% y el saldo se deriva al consumo
interno. El principal destino de las exportaciones de frutas cítricas son los países de la Unión
Europea (77,75%), de Europa Oriental (10,91%), del Medio Oriente (8,98%) y los países
Escandinavos (2,27%) (MGAP, 1992 y 1996).
De los volúmenes exportados, un 60% corresponde a naranjas, 15% a mandarinas,

21% a limones y el 15% restante a pomelos y, en conjunto, generan ingresos de divisas
estimados en unos US $ 30 millones anuales, con lo cual el subsector citrícola se ubica en el
tercer lugar entre las exportaciones agrícolas del Uruguay (MGAP, 1992 y 1996).
La aceptación de la fruta en los mercados importadores está supeditada a su calidad y

al estado fitosanitario al momento de su recepción en el lugar de destino. Dentro de las
causales sanitarias, las podredumbres causadas por patógenos de post-cosecha, constituyen
un importante factor de rechazo de las partidas. A nivel mundial y nacional se citan a
Penicillium digitatum y P. italicum, como los principales responsables de las pérdidas de este
tipo (Rebellato y Monteiro, 1984; Ceponis, Cappellini y Lightner, 1986; Tuset, 1987; Holmes,
Eckert y Pitt, 1994; Reyes et al, 1994 y 1997).
Para evitar tales pérdidas, las frutas son sometidas, en origen, a tratamientos
específicos desarrollados para este fin. Sin embargo, se dan casos en que tales tratamientos
acusan una pérdida de eficacia en la prevención de estas podredumbres, por la aparición de
biotipos de Penicillium spp. resistentes a los fungicidas comúnmente utilizados en
tratamientos de post-cosecha.
En Uruguay, este problema podría adquirir mayor importancia, por la detección de

P. ulaiense (Reyes et al, 1994), especie reportada como resistente o capaz de generar
rápidamente resistencia a Tiabendazol (TBZ), Ortofenilfenato de Sodio (SOPP) e Imazalil
(IMZ), los tres fungicidas de mayor uso para el tratamiento post-cosecha de frutas cítricas en
Uruguay y en el mundo (Holmes, Eckert y Pitt, 1993 y 1994).
El objetivo de este trabajo es el de inferir la potencial predominancia de estas tres

especies, en la población natural de Penicillium spp. que atacan a las frutas cítricas en
Uruguay, a través de:
a. la cuantificación de cepas resistentes a TBZ, SOPP e Imazalil, en una muestra

de la población de Penicillium spp. causantes de podredumbres de pos-
cosecha en frutas cítricas; y
b. la habilidad competitiva, in vitro e in vivo de cepas de Penicillium spp. resistentes a

los fungicidas usados en Uruguay en el tratamiento de post-cosecha de frutas cítricas.
REVISION BIBLIOGRAFICA
Descripción de las enfermedades causadas por Penicillium spp.
Síntomas
Los síntomas inducidos por el ataque de P. digitatum (moho verde) y P. italicum

(moho azul) en frutas cítricas son bastante similares. Inicialmente se aprecian en la
cáscara como un punto pequeño (pinhole stage) de 2-3 mm de diámetro, de aspecto
acuoso, blando, ligeramente deprimido y algo decolorado. A una temperatura ambiente
de 24 °C, la mancha se expande rápidamente en unas 24 a 36 horas, hasta alcanzar un
diámetro de 2-4 cm y comprometer las vesículas de jugo (Smoot, Houck y Johnson,
1971; Brown y Eckert, 1989).
En este estado, sobre la superficie de la cáscara se desarrolla, en forma radial, a

partir del centro de la lesión, un micelio blanco de aspecto más o menos compacto, el
cual comienza a esporular cuando la colonia alcanza, aproximadamente, un diámetro de
2,5 cm (Smoot, Houck y Johnson, 1971; Brown y Eckert, 1989).
En el caso de P. digitatum, el área esporulada es de color verde oliva y se

presenta rodeada por una amplia zona (1-2 cm) de micelio blanco y de una estrecha
banda de cáscara blanda de aspecto acuoso. En P. italicum, el área esporulada denota
una coloración azulada y se distingue por estar rodeada por una pequeña banda de
micelio blanco, seguida por una amplia zona de cáscara blanda de aspecto acuoso
(Smoot, Houck y Johnson ,1971; Holliday, 1980; Brown y Eckert, 1989; Eckert y Eaks,
1989; Snowdon, 1991).
Las pudriciones causadas por P. ulaiense (whisker mold = moho barbado),
muestran un margen delgado de micelio blanco y un borde de cáscara de ancho variable
(2-10 mm), con aspecto acuoso, consistencia blanda, a menudo de color rojo anaranjado,
especialmente en limones. En naranjas, el borde de cáscara circundante denota una
tonalidad más oscura y, eventualmente, parece delimitar el avance de las lesiones, las
cuales se aprecian, al inicio, como pequeñas lesiones deprimidas, de color negro, de
unos 2-5 mm de diámetro. Estas usualmente continúan su desarrollo, incrementando de
tamaño, hasta eventualmente esporular, pero en ocasiones no progresan (Holmes, Eckert
y Pitt, 1994).
Los hongos P. digitatum, P. italicum y P. ulaiense provocan podredumbres

acuosas en frutos de Citrus spp., por la producción de enzimas pectolíticas, que
ocasionan la degradación de la lámina media de las paredes celulares (Fernández Valiela,
1978; Barmore y Brown, 1980). Los frutos afectados finalmente se momifican.
Adicionalmente, P. digitatum produce etileno que incrementa la respiración de los frutos,
acelerando su maduración y reduciendo su vida de almacenamiento (Smoot, Houck y
Johnson, 1971).
Pérdidas
P. digitatum y P. italicum son considerados como responsables de la mayor parte

de las pérdidas de frutas cítricas que se registran en post-cosecha, las que a nivel mundial
se estiman en el orden del 90% del total de pérdidas (Holmes, Eckert y Pitt, 1994),
particularmente cuando ocurre resistencia a los fungicidas usados en tratamientos de
post-cosecha, como en el caso de la resistencia a fungicidas del grupo de los
benzimidazoles detectada en California , en 1979, que originó la pérdida de 10 millones
de cajones de fruta cítrica (Anónimo a, 1980; Eckert, 1990).
Consecuentemente, su ocurrencia en embarques (exportaciones de frutas) puede
causar el rechazo de partidas enteras, debido a que en el comercio internacional la
tolerancia generalmente admitida de podredumbres de este tipo es muy baja, no
excediendo del 3 % de fruta afectada, como lo establecen, por ejemplo, las normas de la
Comunidad Económica Europea y del USDA (Ceponis, Cappellini y Lightner, 1986;
Carraro y Mancuso, 1994; Reyes et al, 1997).
Factores predisponentes
Los principales factores que predisponen a los frutos a la podredumbre causada

por estos patógenos son: un avanzado estado de madurez (sobremaduración) de los
frutos y la presencia en la cáscara de heridas inducidas por un manejo inadecuado de los
frutos, durante la cosecha y ulterior manipuleo. Las roturas de la cutícula y primeras
capas de la epidermis, así como la cicatriz del pedúnculo constituyen las principales vías
de entrada para éstos hongos (Tuset, 1987).
Epidemiología
La epidemiología de las enfermedades ocasionadas por los tres patógenos es

bastante similar. Las esporas son diseminadas por corrientes de aire y pueden sobrevivir,
por períodos apreciablemente largos en el suelo, en el ambiente de las empacadoras y
locales de almacenamiento de las frutas. Estas germinan sobre la superficie de los frutos,
en presencia de agua libre. P. digitatum penetra únicamente a través de heridas en la
cáscara; en tanto que P. italicum puede también infestar los frutos en forma directa a
través de la cutícula (Brown y Eckert, 1988; Brandes, Cordero y Skiles, 1959; Galli,
1968; Smoot, Houck y Johnson, 1971; Snowdon, 1991). Usualmente, se registra una
mayor incidencia en frutos cosechados durante períodos lluviosos o de alta humedad
relativa (HR), citándose como niveles críticos el 80% de HR para P. digitatum y el 70%
de HR para P. italicum (Smoot, Houck y Johnson, 1971; Tuset 1987; Smith et al, 1992).
El rango de temperaturas adecuadas para el desarrollo de estos patógenos fluctúa

entre 17 y 27 °C, siendo 24°C el óptimo para las tres especies estudiadas en este trabajo
(Smoot, Houck y Johnson, 1971; Holliday,1980; Smith et al, 1992; Holmes, Eckert y
Pitt, 1994). A esta temperatura, en 48 horas, se establecen infecciones irreversibles y los
primeros síntomas aparecen a los tres días. A 15 °C y 10 °C, los primeros síntomas se
observan entre 5 - 6 y 10 -12 días, respectivamente; en tanto que a 5°C el desarrollo de
los síntomas es muy lento (Smoot, Houck y Johnson, 1971; Smith et al, 1992).
La contaminación de los frutos puede ocurrir en el campo (al momento de la

cosecha), durante el transporte, en las empacadoras, en las cámaras de refrigeración y
durante la distribución y venta en los mercados, bien sea por esporas acarreadas por el
viento, contenidas en embalajes usados (sacos, cajones, etc.) o procedentes de frutos
infectados adyacentes (Tuset, 1987).
Control
- Cultural
Se recomiendan diversas formas de manejo de la fruta, con el objeto de disminuir
las heridas u otros daños mecánicos en la cáscara, debidos a procesos bióticos y abióticos
que comprometan las primeras capas de la epidermis y las vesículas de jugo, así como
para evitar la penetración de estos patógenos por la cicatriz del pedúnculo. Esto se logra
con un cuidadoso y adecuado manipuleo de la fruta y limpieza de los embalajes y de los
lugares de depósito y/o almacenamiento, incluyendo las cámaras de frío (Smoot, Houck y
Johnson, 1971; Tuset, 1987; Brown y Eckert, 1989).
- Químico
Las prácticas sanitarias de naturaleza química se deben dirigir a: prevenir la

contaminación e infección de frutas sanas; evitar la esporulación de frutas enfermas y la
acumulación de inóculo (esporas), en la superficie de los equipos y en la atmósfera de las
empacadoras y de las cámaras de almacenaje (Tuset, 1987; Brown y Eckert, 1989).
Desinfectantes a base de cloro (hipoclorito de sodio o calcio), amonio

cuaternario, formaldehído y alcohol son muy útiles para prevenir el depósito y/o el
incremento de inóculo (Brown y Eckert, 1989).
Los fungicidas más usados en Uruguay en frutas cítricas, para el tratamiento

preventivo (protector) de post-cosecha son:
Ortofenilfenato de Sodio (Sodium o-phenyl phenate-SOPP)
El SOPP es un fungicida del grupo de los hidrocarburos aromáticos, que se

caracteriza por poseer un mayor espectro de acción, en comparación con cualquier otro
fungicida orgánico usado en las empacadoras de citrus (Eckert y Ogawa, 1985; Eckert y
Eaks, 1989). Su efectividad para reducir la podredumbre de frutas y la esporulación de
los hongos, fue reportada en los años treinta (Harding, 1962; Houck, 1977).
Induce, como otros hidrocarburos aromáticos, daños en la membrana de las

células fúngicas (Lyr, 1977; Burden et al, 1990), aparentemente debido al aumento de
peroxidación de los lípidos (Burden et al, 1990). Adicionalmente, según estudios
realizados con P. italicum, el efecto del SOPP está asociado con el ciclo del ácido
tricarboxílico. En este, las enzimas que controlan el proceso, más allá del paso del
isocitrato, son inhibidas por el SOPP. Además, la enzima adenosin desaminasa, que
controla la descomposición del ATP, para producir energía, también resulta fuertemente
inhibida por el SOPP (Wild, 1974).
Tiabendazol
El Tiabendazol es un fungicida sistémico perteneciente al grupo de los

benzimidazoles, que actúa contra un amplio espectro de hongos patógenos (Houck,
1977; Van Tuyl, 1977; Woodcock, 1977; Delp, 1987) y fue el primer benzimidazol en
ser usado en los citrus (Houck, 1977). Diversos trabajos realizados en los años
comprendidos entre fines de la década de los sesenta y principios de la década de los
setenta, demostraron que este fungicida protegía eficientemente las frutas de las
podredumbres causadas por Penicillium spp., además de inhibir la esporulación de estos
hongos en frutas afectadas (Brown, McCornack y Smoot, 1967; Harding, 1972; Houck,
1977 ; Eckert y Ogawa, 1985; Eckert, 1990).
En este caso, como en todos los benzimidazoles y tiofanatos, la molécula que

tiene actividad fungitóxica es el carbendazim (Van Tuyl, 1977; Delp, 1987), el cual
interfiere la mitosis al formar un complejo con las subunidades de los microtúbulos
(tubulinas), que impide la formación del huso mitótico (Georgopoulos, 1977; Sijpesteijn,
1977; Van Tuyl, 1977; Davidse, 1987). Adicionalmente, se cita que el Tiabendazol podría
también inhibir la respiración (Sijpesteijn, 1977; Van Tuyl, 1977) y la síntesis de proteínas
(Coll y Leal, 1972). Todo esto traería una reducción en la tasa de crecimiento lineal y
cambios en la forma de la célula (Sisler, 1994).
Imazalil
El imazalil es un fungicida sistémico perteneciente al grupo de los inhibidores de

la biosíntesis del ergosterol y, dentro de éstos, al de los imidazoles. Es considerado como
un producto eficiente en el control de podredumbres de postcosecha causadas por hongos
resistentes a los benzimidazoles (Harding, 1976; McCornack, Brown y Smoot, 1977;
Laville et al 1977; Sijpesteijn,1977; Siegel y Ragsdale 1978; Kaplan y Dave, 1979; Dave
y Petrie, 1981; Brown, 1982; Eckert y Ogawa, 1985; Tadeo et al, 1988).
Los efectos generales de los inhibidores de la biosíntesis del ergosterol son (Siegel
y Ragsdale, 1978; Siegel, 1981):
- fallan en inhibir la germinación de las esporas o el crecimiento inicial y aumento
de peso seco;
- alteran la morfología de la célula, causando patrones de crecimiento anormales,
hinchazón y/o excesiva ramificación de las hifas; y
- carecen de efectos inmediatos en el metabolismo respiratorio o en la síntesis de
macromoléculas, pero causan en las células la acumulación de ácidos grasos libres e
intermediarios del esterol.
El sitio de acción de este inhibidor ocurre en el ciclo de la biosíntesis de los

esteroles, que resulta en la inhibición de la síntesis del ergosterol y la acumulación de
compuestos intermediarios del esterol. La interferencia más importante, que ocurre en
esta vía, es la inhibición de la demetilación en la posición 14 del lanosterol, pero también
puede afectar otros pasos dentro del mismo ciclo (Siegel y Ragsdale, 1978; Siegel, 1981;
Buchenauer, 1987; Scheinpflug y Kuck, 1987; Scheinpflug y Kuck, 1987).
Se ha observado que las esporas de P. italicum tratadas con imazalil, se hinchan

anormalmente, producen tubos germinativos distorsionados y se tornan vacuoladas
(Siegel y Ragsdale, 1978). Este efecto, aparentemente, inhibe y/o previene la
esporulación de este patógeno en las frutas cítricas (Harding, 1976; McCornack, Brown
y Smoot, 1977; Laville et al, 1977; Van Gestel y Van Reempts, 1980; Kaplan y Dave,
1979; Dave y Petrie, 1981; Eckert y Ogawa, 1985).
Descripción de las especies de Penicillium
El género Penicillium pertenece a la Clase Deuteromycetes, Orden Moniliales,

grupo Phialosporae, Familia Moniliaceae, y se caracteriza por la formación de
conidióforos simples, largos y erectos, que se ramifican, simétrica o asimétricamente,
dando la apariencia de un pincel o brocha (estructura denominada penicilo). Cada
conidióforo termina en un grupo de fiálides que dan origen a largas cadenas de conidios
globosos u ovoides, usualmente hialinos que en masa adquieren, según la especie un color
verdoso, azulado o amarillento (Alexopoulos y Mims, 1979; Bollen, 1971 y Holliday,
1980).
P. digitatum Saccardo
En P. digitatum las estructuras hifales portadoras de los conidios, se caracterizan

por ser irregulares, tanto en número como en las dimensiones de las partes que componen
los “penicilos”. Estos normalmente son cortos (30-100 ), diverticilados y asimétricos,
formados por un número indefinido de ramas (métulas) que portan una limitada, pero
variable serie de fiálides (3 a 5), que determinan largas cadenas (130-160 ) de conidios
lisos, de color verde oscuro en masa, de forma variable (predominan los elípticos aunque
pueden ser cilíndricos y subglobosos) y de tamaño, igualmente variable, con dimensiones
que oscilan entre 3,5-12 x 3-8 , con una media de 5,8-7,6 x 4,1-6,2  (Holliday, 1980;
Tuset, 1987).
Este hongo crece bien en diferentes medios de cultivo, pero las características
morfológicas y crecimiento de las colonias difieren de un medio a otro. En Czapek crece
muy superficial y lentamente, con poca producción de micelio inmerso. En Agar Malta se
desarrolla y expande profusamente, formando colonias sueltas o aterciopeladas que dan
origen a masas de esporas amarillentas que se tornan grisoliváceas con la madurez.
Típicamente las colonias desarrolladas en Agar Malta, producen un olor semejante al de
las frutas cítricas podridas (Raper y Thom, 1949).
P. italicum Wehner
Los elementos que constituyen la parte esporígena de P. italicum son menores en

tamaño que los de P. digitatum. Los conidióforos son erectos, normalmente dispuestos
en pequeños manojos y repartidos formando zonas por toda la superficie que ocupa la
colonia del hongo en el fruto. En ocasiones forma coremios de poca longitud (1 mm).
Los penicilos son asimétricos, portan de 1 a 3 brazos simples o ramificados de 12-22  de
longitud, que terminan en métulas solitarias o en grupos de 2 a 4, de igual longitud que
los brazos y situadas a diferente nivel en los penicilos. Las fiálides, pocas en número y
cortas en tamaño (7-11 ), son portadoras de cadenas de conidios de longitud variable.
Los conidios son inicialmente de forma cilíndrica pero se tornan elípticos o subglobosos
en la madurez, miden de 4-10 x 2,5-7  (media 4-6 x 2,5-4 ), tienen paredes lisas y son
hialinos, con algunas pequeñas gútulas dispuestas en el contenido celular, pero denotan
un color ligeramente azulado cuando están agrupados en masa (Raper y Thom, 1949;
Onions, 1966; Holliday, 1980; Tuset, 1987).
Esta especie puede desarrollarse en diversos medios de cultivo, pero las

características morfológicas de las colonias varían según el sustrato. En Czapek las
colonias crecen en forma restringida pero, en Agar Malta desarrolla abundante micelio
con conidióforos muy fasciculados. Las áreas esporuladas adquieren un color grisverdoso
(Raper y Thom, 1949).
P. ulaiense Hsieh, Su & Tzean
Los conidióforos se originan a partir de hifas superficiales o subsuperficiales y de

los coremios. Los pedicelos de los coremios varían en su longitud (1-8 mm) y ancho (2,4-
3,7 m), siendo además, muy sinuosos y con paredes lisas. Los penicilios son de tamaño
variable (6-16 x 2,5-4 m), irregularmente ramificados (dos a tres ramificaciones por
penicilio), a menudo divergentes y mayormente terverticilados, y entrelazados dentro de
una densa capa himenial. Las métulas (10-22 x 2,5-4 m) se arreglan en verticilos (dos a
cuatro), de paredes lisas, frecuentemente hinchadas apicalmente. Las fiálides (tres a
cuatro por métula, dos a cinco según Carrillo,1995), son ampuliformes o cilindroides y
miden 10-17 x 2,5-4,0 m. Estas terminan abruptamente en una collula cilíndrica (2-3 x
2 m), que puede confundirse con los primeros conidios formados. Los conidios tienen
paredes lisas y son mayormente cilíndricos, pero pueden incluir una variedad de otras
formas, miden 1,5-5 x 3-13 m (2-4,5 x 4,5-9, según Carrillo, 1995), y se agrupan en
cadenas largas y desordenadas (Holmes, Eckert y Pitt, 1994).
Esta especie fue observada y descrita por primera vez, en 1987, por
investigadores taiwaneses (Holmes, Eckert y Pitt, 1993 y 1994); sin embargo, es posible
que haya sido aislada precedentemente, en 1974, por Muirhead en Queensland, Australia,
quien encontró “dos cepas atípicas de P. italicum, de crecimiento lento en PDA y casi
enteramente coremiales”, las cuales inoculadas en el cv. „Valencia Late‟ “provocaron una
lenta podredumbre interna de color parduzco”, pero no advirtió que pudieran tratarse de
una especie diferente.
En 1949, Raper y Thom, en su revisión del género Penicillium, hacen referencia a
P. aeruginosum Dierckx (1901) y P. ventruosum Westling (1911), considerados por
algunos taxónomos como miembros de la Serie P. italicum, pese a formar “coremios
prominentes”, de varios mm de longitud, característica bastante similar a la descrita
para P. ulaiense.
La distribución actual de P. ulaiense incluye Argentina, Australia, Estados Unidos

(Arizona, California, Florida y Texas), Italia, Nueva Zelanda, Sudáfrica, Taiwan y
Uruguay (Holmes, Eckert y Pitt, 1993 y 1994; Skaria, Eayre y Fucik, 1993; Reyes et al,
1994; Carrillo, 1995; Visintin et al, 1997), pero es posible que esté presente en todas las
áreas citrícolas del mundo (Holmes, Eckert y Pitt, 1994; Holmes, 1997, comunicación
personal). Su ocurrencia en Uruguay pasó inadvertida por mucho tiempo, ya que fue
confundida con P. italicum, pese a formar coremios (1-8 mm de alto) con pedicelos
blancos (Holmes, Eckert y Pitt, 1993 y 1994; Carrillo, 1995).
Este hongo puede ser cultivado en diferentes medios de cultivo, pero su

desarrollo y tasa de crecimiento es inferior (30-40% menor) a la de P. italicum (Holmes,
Eckert y Pitt, 1993; Carrillo, 1995). Por ejemplo, colonias de P. ulaiense sembradas en
Agar Czapek y mantenidas a 25 oC, a los 7 días de edad sólo alcanzan de 1 a 3 mm de
diámetro, con cordones miceliares subsuperficiales proyectándose de 1 a 2 mm del borde
de la colonia (Holmes, Eckert y Pitt, 1994). El lento crecimiento de P. ulaiense, es
considerada por algunos autores como una característica útil y práctica para su
diferenciación de P. italicum (Holmes, Eckert y Pitt, 1993 y 1994; Carrillo, 1995).
Resistencia de Penicillium spp. a los fungicidas
La resistencia a plaguicidas es un fenómeno bastante conocido, desde hace

muchos años, particularmente en insecticidas y en antibióticos (Houck, 1977). La
resistencia a fungicidas, si bien era infrecuente, también fue detectada hace varias
décadas, en algunos fungicidas a base de hidrocarburos aromáticos y compuestos
mercuriales, pero pasó a adquirir importancia recién con la aparición de los productos
sistémicos, a fines de los años sesenta, por la generación de resistencia poco tiempo
después de puesto en uso este tipo de fungicidas (Wild, 1974; Georgopoulos, 1977;
Houck, 1977; Van Tuyl, 1977; Wade, 1982; Staub y Sozzi, 1984; Kôller y Scheinpflug,
1987; Reis y Forcelini, 1994; Eckert, 1994). La resistencia a los fungicidas se define
como: “la adaptación de un hongo a un fungicida de manera estable y hereditaria,
resultando en una sensibilidad menor al principio activo” (Delp y Dekker, 1985 citados
por Kôller y Scheinpflug, 1987; Dekker, 1987).
Factores que afectan la aparición de resistencia
Los principales factores que podrían conducir a la selección de cepas resistentes a

fungicidas, dentro de la población de un patógeno son (Wade, 1982; Staub y Sozzi,
1984; Georgopoulos, 1994):
a. el modo de acción del fungicida:

Las propiedades bioquímicas del fungicida determinan que riesgo habrá de
generación de resistencia (Houck, 1977; Wade, 1982; Staub y Sozzi, 1984). A partir del
modo de acción se estableció el siguiente concepto: “los inhibidores convencionales
multisitio que interfieren con numerosos procesos metabólicos vitales del patógeno,
poseen una pequeña probabilidad de resistencia, porque para contrarrestar su acción, se
requiere de múltiples modificaciones en el genoma del patógeno. En cambio, en los
inhibidores sitio-específico, que actúan solamente en un determinado sitio metabólico, la
generación de resistencia es más común, porque una mutación en un solo gene puede ser
suficiente para inducir un cambio resultante en una disminución en la afinidad del
inhibidor” (Georgopoulos, 1969 citado por Houck 1977; Wild, 1974; Wade, 1982; Staub
y Sozzi, 1984; Eckert y Ogawa, 1985; Delp, 1980 citado por Kôller y Scheinpflug, 1987;
Dekker, 1987; Anónimo b, 1990; Reis y Forcelini, 1994).
b. el modo de uso:
Este influye en la presión de selección que ejercerá el fungicida sobre la población
del patógeno y determina que las cepas resistentes sean seleccionadas, por eliminación de
las más susceptibles, y pasen a ser dominantes en la población. Se ha demostrado,
además, que las esporas sensibles a un fungicida, pueden favorecer la infección por cepas
resistentes, mediante la emisión de enzimas durante su germinación (Wild y Eckert, 1982;
Wild, 1984). Los factores que coadyuvan a la presión de selección son: la dosis del
ingrediente activo, el número de aplicaciones por estación, la extensión del área tratada,
la eficiencia de la aplicación y la persistencia del químico. La presión de selección es
mayor si se utiliza un sólo fungicida y si se usa en áreas confinadas como invernáculos y
empacadoras de fruta (Dekker, 1977; Kaplan, Dave y Petrie, 1981; Wade, 1982; Dekker,
1987).
c. el patógeno:
La generación de resistencia por parte de un patógeno dependerá de su tasa de
variabilidad y de su comportamiento epidemiológico. La tasa de variabilidad será distinta
para cada organismo, dependiendo de su código genético y del ambiente en que estos se
desarrollan. En general, en individuos con reproducción sexual se da mayor posibilidad de
recombinación genética, con lo que aumenta la probabilidad de que surjan individuos
resistentes (Wild, 1974; Georgopoulos, 1994). Sin embargo, el fenómeno parasexual que
ocurre en muchos hongos imperfectos podría, igualmente, generar la aparición de
recombinantes resistentes (Finchan y Day, 1965; Alexopoulos y Mims, 1979).
Respecto a su comportamiento epidemiológico, si el patógeno es policíclico,

durante el período de susceptibilidad del hospedero se producirán varios ciclos de
infección y esporulación (Fry, 1982), como resultante de la sucesión de varias
generaciones del patógeno, con lo cual se incrementa la posibilidad de que los genotipos
resistentes al fungicida, en corto tiempo, se tornen predominantes en la población natural
del patógeno (Dekker, 1977; Wild y Eckert, 1982; Wild, 1984; Georgopoulos, 1994).
Otro factor a tener en cuenta es la “fitness” (adaptabilidad de las cepas

resistentes), término que se usa para describir la habilidad de un patógeno para persistir
en la naturaleza (Shaner et al, 1992), o para denotar su virulencia y/o habilidad
competitiva, características de las que dependen su capacidad para crecer, reproducirse y
sobrevivir (Wade, 1982). Si la mutación que confiere la resistencia, afecta adversamente a
la “fitness” (un efecto pleotrópico), es poco probable que dichas cepas lleguen a dominar
en la población (Dekker, 1977; Van Tuyl, 1977; Laville, 1981; Siegel, 1981; Wade, 1982;
Rebellato y Monteiro, 1984; Buchenauer, 1987; Dekker, 1987; Dave, Sales y Walia,
1989; De Waard y Van Nistelrooy, 1990; Eckert, 1990; Reyes et al, 1994; Holmes y
Eckert, 1995). En cambio, si la mutación que origina la resistencia no afecta seriamente la
“fitness”, entonces los biotipos resistentes pasarán a dominar en la población al ser
eliminados los biotipos susceptibles por el fungicida utilizado (Dekker, 1977; Laville,
1981; Wade, 1982; Smilanick y Eckert, 1986; Buchenauer, 1987; Dekker, 1987; Eckert,
1990; Reyes et al, 1994; Holmes, Eckert y Pitt, 1994; Holmes y Eckert, 1995).
Mecanismos de resistencia a los fungicidas
Según Dekker (1977) y Sisler (1994), la resistencia a los fungicidas puede

generarse por:
a. disminución de la permeabilidad de la membrana protoplasmática, impidiendo la

entrada del producto activo en la célula fungosa en suficiente cantidad, o mediante la
excreción de éste, luego de entrar a la célula, impidiendo su acumulación.
b. aumento de la detoxificación del producto que puede ocurrir por la modificación de la

molécula química o por la unión de ésta con constituyentes celulares, causando la pérdida
de su actividad fungicida después de entrar en la célula.
c. disminución de la “síntesis letal” o capacidad de un hongo para convertir un compuesto

inactivo en un producto fungitóxico.
d. disminución de la afinidad por el sitio de acción, particularmente en el caso de

fungicidas que actúan sobre un sitio específico.
e. evasión (en inglés: circumvention), fenómeno que ocurre cuando un fungicida actúa
bloqueando un paso metabólico en el hongo y éste puede cambiar su metabolismo, de
modo tal, que pueda continuar con sus funciones vitales sin necesidad del paso
bloqueado.
f. compensación, cuando el sitio de acción de un fungicida es una enzima, el patógeno

puede aumentar la producción de la enzima afectada.
Resistencia al Tiabendazol-TBZ
La resistencia a este fungicida está asociada al modo de acción sitio-específico de

éste. Por tanto, bastaría la mutación de un gene para adquirirla (Davidse, 1987; Eckert,
1990). Esta se debería a la alteración de la estructura de los microtúbulos o de su
funcionamiento, impidiendo que la molécula del fungicida se ligue con los componentes
de los microtúbulos (Davidse, 1987). Mutaciones en el gene -tubulin, que codifica los
componentes de los microtúbulos, resultarían en la pérdida de afinidad de la tubulina por
los benzimidazoles (Davidse, 1994; Sisler, 1994).
La resistencia al TBZ apareció en 1970, en empacadoras de California y Arizona,

después de tan sólo 15 meses de ser adoptado como tratamiento estándar (Harding,
1972; Eckert, 1990). Posteriormente, numerosos reportes han sido publicados acerca de
la ocurrencia de resistencia de cepas de P. digitatum y P. italicum, tanto en las zonas
citrícolas (Harding, 1972; Muirhead, 1974; Smoot y Brown, 1974; Dave, Kaplan y Petrie,
1980; El-Goorani et al, 1983 y 1984; Rebellato y Monteiro, 1984; Holmes y Eckert,
1992), como en los mercados de destino (McDonald, Risse y Hillebrand, 1979; Bus,
Bongers y Risse, 1991).
Estudios genéticos sobre la resistencia a este fungicida hechos en P. italicum,

indican que ésta resulta, probablemente, de la mutación de dos o tres genes ligados muy
estrechamente (Beraha y Garber, 1980). Otros trabajos expresan que la resistencia se
mantendría a través de varios ciclos de la enfermedad, es decir que sería de carácter
hereditario (Georgopoulos, 1977; Gutter et al, 1981; Seidel, Chitzanidis y Kranz, 1990).
Por otro lado, se ha notado que la “fitness” de las cepas resistentes no diferiría de las
sensibles (Wild y Rippon, 1975; Gutter et al, 1981; El-Goorani, 1983 y 1984; Eckert,
1990; Reyes et al, 1994), lo cual explicaría el hecho de que las poblaciones de cepas
resistentes no decrezcan en empacadoras en las que ningún benzimidazol fue usado por
más de cuatro años (Kaplan, Dave y Petrie, 1981), aunque se ha reportado que habrían
diferencias entre especies, siendo P. italicum menos sensible a los benzimidazoles que P.
digitatum (Gutter, 1975 y 1981; El-Goorani et al, 1983; Eckert y Ogawa, 1985). Esto
traería como consecuencia que P. italicum tenga mayor “fitness” que P. digitatum
(Eckert, 1994). Igualmente, se ha reportado la ocurrencia, en cepas resistentes, de
resistencia cruzada a otros fungicidas del mismo grupo, lo que confirma la existencia de
un sitio de acción en común (Bollen, 1971; Smoot y Brown, 1974; Georgopoulos, 1977;
Eckert, 1990; Sisler, 1994).
Resistencia al Ortofenilfenato de Sodio-SOPP
La resistencia al SOPP y al difenil (de parecida composición química), fueron los

primeros ejemplos de resistencia a los fungicidas modernos (Houck, 1977). El primer
reporte de resistencia en citrus se dio a partir de embarques provenientes de California
que llegaron a Europa con altos niveles de podredumbre por Penicillium spp. (Harding,
1962; Eckert, 1990).
La resistencia a este fungicida en P. italicum, sería de carácter monogénico y

dominante (Beraha y Garber, 1980). Esto explicaría el modo de acción del fungicida, que
actúa interfiriendo sólo unos pocos procesos metabólicos (Wild, 1974), y la “fitness” de
los mutantes resistentes que, en medio sin fungicida, esporulan abundantemente y
presentan una tasa diaria de crecimiento superior a la de las sensibles (Harding, 1962),
aun cuando otros investigadores sugieren, por el contrario, que la “fitness” sería menor
que la de las sensibles (Reyes et al, 1994).
Resistencia al Imazalil-IMZ
Cuando este fungicida fue lanzado al mercado, se lo consideró como de bajo

riesgo de generación de resistencia (Harding, 1976; Laville et al, 1977; Kaplan y Dave,
1979; Laville, 1981), dado que no se pudieron encontrar cepas de Penicillium spp.
resistentes al IMZ, tanto en pruebas de laboratorio, como en condiciones comerciales
(Harding, 1976; Laville et al, 1977; Kaplan y Dave, 1979; Dave, Kaplan y Petrie, 1980;
Laville, 1981).
A partir de 1982, se reportó por primera vez la obtención de cepas de P. italicum

resistentes al IMZ, obtenidas mediante tratamientos con luz ultravioleta (De Waard et al
citado por Eckert, 1990). Posteriormente, en 1984 se reportó tanto en Uruguay como en
Egipto la detección de cepas resistentes de P. digitatum y P. italicum, desarrolladas por
selección natural (Rebellato y Monteiro, 1984; El-Goorani et al, 1984). En 1991, se
señaló la ocurrencia de cepas de P. digitatum y P. italicum resistentes a IMZ, aisladas
en Rotterdam de frutas cítricas procedentes de diversas partes del mundo, incluyendo
Uruguay (Bus, Bongers y Risse, 1991).
La resistencia al IMZ sería poligénica, según lo observado en Aspergillus

nidulans, organismo en el que se identificaron 21 mutaciones monogénicas en 8 loci,
incluidos en 6 grupos de ligamiento (Van Tuyl, 1977; Kaplan y Dave, 1979; Eckert,
1990). En Penicillium italicum habría, al menos, cinco genes involucrados en la
adquisición de la resistencia (De Waard y Van Nistelroy, 1990). Esta tendría un carácter
estable, ya que se mantiene luego de varios ciclos sobre fruta y medio de cultivo (Eckert,
1990).
En lo que respecta a la “fitness” de las cepas de Penicillium resistentes, se cita

que las cepas resistentes a IMZ son menos competitivas frente a las sensibles (Rebellato y
Monteiro, 1984; Dave, Sales y Walia, 1989; De Waard y Van Nistelrooy, 1990; Eckert,
1990; Sisler, 1994; Holmes y Eckert, 1995). Sin embargo, se ha observado la ocurrencia
de algunas cepas resistentes con mayor habilidad competitiva (Holmes y Eckert, 1995),
capaces de producir esporulación media a alta en limones (Eckert, 1987).
El mecanismo de resistencia a los inhibidores de la demetilación (dentro del cual

está el IMZ) se basaría en un sistema de excreción del fungicida dependiente de energía
aportada por el ATP, a expensas de otros procesos celulares (Kôller, 1994; Sisler, 1994).
MATERIALES Y METODOS
1. Especies de Penicillium estudiadas
1.1 Procedencia de las colonias
Los aislamientos de Penicillium spp. que se usaron en este estudio, procedían

de la colección existente en la Micoteca del Departamento de Micología de la
Dirección del Servicio de Protección Agrícola - DSPA del Ministerio de
Ganadería, Agricultura y Pesca - MGAP del Uruguay.
Parte de ellos fueron obtenidos con el expreso propósito de evaluar su posible

resistencia a fungicidas y conforman una muestra representativa de una
prospección realizada que cubrió la mayoría de las empacadoras de frutas
cítricas del país. El resto, fueron colectados en distintas oportunidades en
trabajos rutinarios de diagnóstico clínico realizadas por el Departamento de
Micología de la DSPA.
Las cepas originales, debidamente rotuladas e identificadas a nivel de género

(Penicillium) y especie (digitatum, italicum, y ulaiense), fueron conservadas a
5C, en frascos con agua destilada, tal como lo describe Figueiredo (1987). Su
resistencia o susceptibilidad a los fungicidas usados en tratamientos de post-
cosecha, para el control de las podredumbres de frutas cítricas causadas por
especies de Penicillium, no había sido determinada.
1.2 Aislamiento, recuperación y selección de las colonias
Todas las cepas utilizadas fueron obtenidas a partir de frutas cítricas con
síntomas y/o signos característicos. Los aislamientos originales se hicieron por
métodos fitopatológicos convencionales (French y Hebert, 1982; Tuite, 1970
y Street, 1969), consistentes en la siembra de tejidos afectados en PDA (papa-
dextrosa-agar) al 2%, sin adición de fungicidas u otros químicos, con
excepción de ácido láctico para acidificar el medio y restringir el crecimiento
de bacterias contaminantes, las que usualmente inhiben el crecimiento de
Penicillium spp. (Gutter et al, 1981).
La recuperación y revitalización de las cepas se hizo en el Laboratorio de
Diagnóstico, del Departamento de Micología de la DSPA/MGAP, de la
siguiente manera:
a. transfiriendo inóculo (esporas/micelio) de las colonias conservadas en agua

destilada, a placas Petri conteniendo PDA acidificado a pH. 4.0, para
evitar contaminantes bacterianos (Gutter et al, 1981);
b. incubando las placas, por 3 a 4 días, a 25C y bajo un régimen de 12 horas

de luz y 12 horas de oscuridad (Gutter et al, 1981; El-Goorani et al, 1983
y 1984; Bus, Bongers y Risse, 1991; Holmes, Eckert y Pitt, 1994);
c. seleccionando y/o purificando las colonias para excluir cualquier clase de

contaminante fungoso o bacteriano;
d. inoculando cada cepa pura (sin contaminantes) en frutas maduras y sanas

de naranja (2 por c/cepa) por el "método de la ventana", para confirmar su
patogenicidad y pureza (Gutter et al, 1981).
La inoculación de los frutos se hizo cortando (en dos puntos de la zona

ecuatorial de los frutos), hasta la profundidad del albedo, secciones de
la cáscara (aproximadamente de 0,5 x 0,5 cm), debajo de las que se
colocó una porción de la correspondiente colonia crecida en PDA
(Gutter et al, 1981). Las heridas practicadas se cubrieron con cinta
adhesiva transparente y los frutos se colocaron en bolsas de polietileno,
para crear una cámara húmeda, e incubaron a temperatura ambiente,
en el laboratorio, por 4 a 5 días, hasta la aparición de síntomas y signos
(El-Goorani et al, 1983 y 1984; Reyes et al, 1994).
e. obteniendo, a partir de los frutos inoculados y esporulados y por el

método de dilusión de esporas (French y Hebert, 1982, Tuite, 1970 y
Street, 1969), cultivos monospóricos de cada una de las cepas
recuperadas, los que posteriormente se reprodujeron y mantuvieron en
PDA (Gutter et al, 1981).
2. Evaluación de la resistencia a fungicidas de Penicillium spp.
2.1 Fungicidas y dosis probadas
Se utilizaron Tiabendazol (TBZ), Ortofenilfenato de Sodio (SOPP) e Imazalil

(IMZ), en las concentraciones mínimas inhibitorias-CMI para especies de
Penicillium patogénicas en citrus en Uruguay, usadas en el Programa de
Monitoreo de Resistencia (Reyes et al, 1994), entendiéndose como
concentración mínima a "la concentración crítica de un fungicida que es
inhibitoria para el crecimiento de cepas sensibles, pero no para las resistentes"
(Harding, 1962). Como testigos, en ésta y en todas las restantes pruebas
realizadas en este trabajo, se incluyeron placas Petri con PDA sin fungicida (0
ppm) (Dekker, 1977; Wade, 1982; Georgopoulos y Dekker, 1982; Staub y
Sozzi, 1984).
Como fuentes de las sustancias activas se usaron los siguientes productos

comerciales:
Nombre Común Producto comercial Registrante
TBZ Tecto 60 (PM) Cibeles

SOPP Fungozur JFZ (CS) Enzur
IMZ Cimazalil 75 PS Cibeles
2.2 Variables del ensayo:
En la prueba se incluyeron las siguientes variables:
a. tres especies de Penicillium (P. digitatum, P. italicum y P. ulaianse);
b. veinte cepas elegidas al azar de cada una de las especies de Penicillium

anotadas (60 en total), y que demostraron ser patogénicas en frutas de Citrus
spp., en la prueba anterior.
e. tres tratamientos fungicidas, en sus correspondientes CMI para las

especies de Penicillium estudiadas;
1. TBZ 20 ppm
2. SOPP 20 ppm
3. Imz 10 ppm
2.3 Desarrollo del trabajo:
Se hicieron 20 tandas en las que siempre se incluyeron tres cepas de cada

especie de Penicillium, que se sometieron a los cuatro tratamientos
(fungicidas/dosis y testigo), usando dos repeticiones para cada tratamiento.
Cada una de estas cepas (60 en total) fueron transferidas a placas de Petri
que contenían PDA a pH 4,0, más los fungicidas/dosis antes indicados. La
inoculación de las placas se hizo estriando la superficie del medio de
cultivo, con la punta de una anza de platino impregnada con esporas
(Kaplan y Dave, 1979; Dave, Kaplan y Petrie, 1980).
2.4 Evaluación de la prueba
Las placas Petri inoculadas se incubaron por cuatro días a 25C, bajo un
régimen de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Después de este período,
las placas se examinaron para calificar, de la siguiente manera, el
comportamiento de las colonias respecto a los fungicidas y dosis usadas:
R = resistentes (aquellas que denotaron un crecimiento y desarrollo normal de

las colonias).
S = susceptibles (aquellas cuyo crecimiento micelial y esporulación fueron

inhibidas por los tratamientos).
3. Capacidad de crecimiento de las cepas resistentes
A objeto de determinar si existían diferencias en el comportamiento de las cepas de

Penicillium spp, que se encontraron como resistentes a los fungicidas en estudio, en
las dosis establecidas, se evaluó su capacidad y/o velocidad de crecimiento (habilidad
competitiva), tanto in vitro como in vivo.
3.1 Crecimiento in vitro
Para evaluar la capacidad de crecimiento in vitro de las cepas resistentes, se

procedió de la siguiente manera:
a. para cada especie de Penicillium se seleccionaron al azar, de entre las

cepas usadas en la prueba precedente, tres sensibles a todos los fungicidas
y tres resistentes (una cepa resistente por cada fungicida);
b. como fuente de inóculo se usaron colonias monospóricas puras de cada
cepa resistente seleccionada, siguiendo el criterio de Gutter et al (1981);
c. como inóculo se emplearon suspensiones acuosas calibradas, con el uso de

un espectrofotómetro (Morris y Nicholls, 1978; French y Hebert, 1982), a
una concentración de 106 esporas/ml (Harding, 1972; Holmes, Eckert y
Pitt, 1994).
d. la siembra o inoculación consistió en colocar, con una anza de platino, en

el centro de placas Petri que contenían el medio de cultivo (PDA), con o
sin fungicidas (testigo), una gota de la suspensión de esporas. Las placas
sembradas se incubaron en la forma descrita precedentemente.
e. el crecimiento de las colonias se apreció midiendo diariamente ("en cruz"),

por 10 días, el diámetro alcanzado (en mm). El promedio de las dos
lecturas/mediciones se tomó como índice de crecimiento de la colonia
(Harding, 1972).
f. la esporulación de las colonias se apreció diariamente, estimando el

porcentaje de superficie esporulada de cada colonia
Para el análisis estadístico se consideraron las variables: tasa de crecimiento (mm/día),

crecimiento a los 10 días, tasa de esporulación (% de superficie esporulada/día) y esporulación
a los 10 días (%). Los datos colectados se analizaron bajo un diseño de bloques incompletos
desbalanceado (ver Anexo), diferenciándolos en dos modelos que se aplicaron para el análisis
de las cepas resistentes y el otro para el análisis de todas las cepas ensayadas, sin estar bajo el
efecto de los fungicidas.
En el primer caso, el modelo estadístico utilizado fue el siguiente:
Yijklm =  + Bi + Ej + T(E)k(j) + C(E)l(i) +  ijklm
En donde:
Y = variable dependiente (crecimiento o esporulación)

 = media general
Bi = efecto de los bloques
Ej = efecto de la especie de Penicillium
T(E)k(j) = efecto del tratamiento anidado en especie
C(E)l(i) = efecto de cepa anidada en especie (efecto aleatorio)
ijklm = error experimental
Para comparar las medias de los tratamientos se usó la prueba de T ajustada por
Tukey.
En el segundo, se utilizó el siguiente modelo estadístico:
Yijklm =  + Bi + Ej + Rk + E*Rj*k + C(E*R)l(j*k) +  ijklm
En donde:
Yijklm = variable dependiente (crecimiento o esporulación)

 = media general
Bi = efecto de los bloques
Ej = efecto de la especie de Penicillium
Rk = efecto de la resistencia
E*Rj*k = efecto de la interacción especie por resistencia
C(E*R)l(j*k) = efecto de cepa anidada en especie y resistencia (efecto aleatorio)
ijklm = error experimental
Para la prueba de efectos aleatorios, se usó la prueba T de Student para medias

ajustadas.
En ambos casos los análisis se realizaron con el programa estadístico SAS (versión

1996).

SAS, v. 6.11. SAS Institute, N. C., USA. 1996.
3.2 Crecimiento in vivo
Para determinar posibles diferencias en la capacidad y/o velocidad de

crecimiento in vivo de las cepas de Penicillium resistentes, se procedió como
se describe a continuación:
a. se utilizaron las mismas cepas estudiadas in vitro; así como una similar
forma de preparar el inóculo.
b. como medio de desarrollo in vivo se usaron frutas sanas de limón (cv.

„Eureka‟), no tratadas con fungicidas;
c. la inoculación se realizó practicando una punción en la zona ecuatorial de

cada fruta, con una aguja de disección humedecida con la suspensión de
esporas de cada cepa en estudio (Wild y Rippon, 1975);
d. los frutos así inoculados se incubaron a 25 oC, en cajas plásticas

acondicionadas como cámaras húmedas (Holmes, Eckert y Pitt, 1994).
e. el crecimiento del patógeno se apreció midiendo el diámetro (vertical y

horizontal) de la zona infectada. Las lecturas se efectuaron durante 10 días
consecutivos, a partir del primer día después de practicadas las
inoculaciones.
Como zona infectada se consideró el área esporulada (parte central de la

lesión), más el área o margen micelial que la circunda y la parte marginal más
externa de la lesión que muestra la cáscara con un aspecto húmedo y blando
(Holmes, Eckert y Pitt, 1994).
También se evaluó la capacidad de esporulación de cada especie/cepa,

midiendo diariamente el porcentaje de la superficie de la lesión cubierta por
esporulación.
El análisis estadístico se realizó utilizando el mismo modelo empleado en

el análisis de las cepas sin efecto de fungicidas del ensayo in vitro y las pruebas de efectos
aleatorios.
RESULTADOS
1. Recuperación y selección de colonias de Penicillium spp.
Se recuperaron 30 cepas de P. digitatum, 26 de P. italicum y 28 de P. ulaiense.

De entre estas, al azar, se seleccionaron 20 cepas puras de cada especie y que mostraron
ser patogénicas (CUADRO 1), para evaluar in vitro su resistencia a fungicidas.
2. Evaluación de la resistencia a fungicidas
Las tres especies mostraron una alta frecuencia de individuos resistentes al TBZ
(65-70%). Para el SOPP se registró una frecuencia menor de individuos resistentes en las
tres especies, sin embargo la que presentó una mayor cantidad de individuos resistentes a
este fungicida fue P. ulaiense (25%). En el caso del fungicida IMZ, no hubo individuos
resistentes, excepto por una sola cepa de P. digitatum (CUADRO 2 y FIGURA 1).
CUADRO 1. Resultado de la prueba de patogenicidad realizada con cepas de
Penicillium spp. causantes de podredumbres en post-cosecha en frutas de Citrus spp.
P. digitatum P. italicum P. ulaiense

CEPA PATOGENICIDAD CEPA PATOGENICIDAD CEPA PATOGENICIDAD
19 +* 286 +* 80 +*
95 + 273 +* 2 +*
285 +* 342 +* 15 +*
188 + 21 +* 262 +*
247 +* 326 +* 86 +*
92 +* 277 +* 330 +
75 +* 351 +* 83 +
261 +* 138 +* 81 +
222 + 96 +* 231 +
143 + 12 + 328 +*
66 +* 199 +* 3 +*
61 +* 77 +* 271 +*
236 +* 305 +* 336 +*
198 +* 347 + 51 +*
191 +* 334 + 28 +*
18 +* 72 +* 85 +*
221 +* 35 + 335 +
244 +* 116 +* 233 +*
249 (+) 225 + 57 +
230 + 238 +* 93 +*
150 +* 45 (+) 148 +*
210 (+) 255 +* 232 +*
206 +* 204 +* 327 (+)
13 +* 257 +* 332 +*
172 +* 117 +* 82 (+)
17 +* 272 +* 333 +*
278 +* 56 +*
301 + 27 +*
7 (+)
235 (+)
+ = cepa patógena; (+) = cepa descartada; * = cepa seleccionada

CUADRO 2. Resistencia de P. digitatum, P. italicum y P. ulaiense a Imazalil, SOPP y
Tiabendazol.
Especie de Cepas Fungicidas*

Penicillium Evaluadas
Imazalil1 SOPP2 TBZ3
P.digitatum 20 5 5 65
P. italicum 20 0 5 70
P. ulaiense 20 0 25 65
TOTAL 60 1,62 11,7 66,7
* En porcentaje
1
10 ppm; 2 20 ppm; 3 20 ppm
Sobre la base de respuesta a los fungicidas/dosis utilizados, las cepas evaluadas se

agruparon en cinco diferentes fenotipos: SsIsTs, SrIsTs, SrIsTr, SsIrTs y SsIsTr. No se
detectaron los fenotipos SrIrTr, SsIrTr y SrIrTs (Cuadro 3).
De acuerdo con esta agrupación, el fenotipo predominante en la muestra de la

población evaluada fue SsIsTr (50% en P. ulaiense y 65% en P. digitatum y P. italicum),
seguida por el fenotipo SsIsTs, susceptible a todos los fungicidas usados (25% en P.
digitatum y P. ulaiense y 30% en P. italicum). En proporciones más bajas se detectaron
los fenotipos SrIsTr (6,67% del total de la población), SrIsTs (5% del total de la
población), siendo el menos frecuente el SsIrTs (1,67 % del total de la población) que sólo
se detectó en P. digitatum.
CUADRO 3. Fenotipos identificados en cepas de Penicillium spp. estudiadas en base a
su resistencia a los fungicidas SOPP, Imazalil y TBZ.
Especie No. de SsIsTs SrIsTs SrIsTr SsIrTs SsIsTr

Cepas
P. digitatum 20 25 5 0 5 65
P. italicum 20 30 0 5 0 65
P. ulaiense 20 25 10 15 0 50
Total 60 26,67 5 6,67 1,67 60
S= SOPP; T= Tiabendazol; I= Imazalil; r= indica resistencia al fungicida; s= indica

sensibilidad al fungicida
FIGURA 1. Frecuencia de individuos resistentes en la población de Penicillium spp.
FRECUENCIA DE LA RESISTENCIA EN LA POBLACION DE

Penicillium spp.
70
60
50
PORCENTAJE
40
30
20
10
0
Imazalil SOPP TBZ
FIGURA 2. Frecuencia de la resistencia en el total de la población de Penicillium spp.
RESISTENCIA EN LA POBLACION DE PENICILLIUM SPP.
27%
1
2
73%
1 = porcentaje de resistentes; 2 = porcentaje de sensibles.

FIGURA 3. Frecuencia de resistencia a TBZ por especie.
FRECUENCIA DE RESISTENCIA A TBZ POR ESPECIE
70
60
50
PORCENTAJE
40
30
20
10
0
FIGURA 4. Frecuencia de resistencia a IMZ por especie.
FRECUENCIA DE RESISTENCIA A IMZ POR ESPECIE
5
4,5
4
PORCENTAJE
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
FIGURA 5. Frecuencia de resistencia a SOPP por especie.
FRECUENCIA DE RESISTENCIA A SOPP POR ESPECIE
10
9
8
PORCENTAJE
7
6
5
4
3
2
1
0
P. digitatum P.italicum P. ulaiense
FIGURA 6. Frecuencia de resistencia multiple por especie.
FRECUENCIA DE RESISTENCIA MULTIPLE (SOPP + TBZ)
16
14
12
PORCENTAJE
10
0
P. digitatum P.italicum P. ulaiense
3. Capacidad de crecimiento de las cepas resistentes
Las cepas seleccionadas para las pruebas in vitro e in vivo se indican en el Cuadro
4. En el caso de P. italicum y P. ulaiense, por no haberse detectado resistencia a IMZ,
sólo fue posible seleccionar cepas resistentes a SOPP y TBZ. En la prueba se incluyeron,
para fines de comparación, cepas de las tres especies de Penicillium, sensibles a todos los
fungicidas usados.
3.1 Crecimiento in vitro
En el Cuadro 4 se indican los niveles de significancia obtenidos en los

correspondientes análisis de varianza a partir de los datos de las cepas resistentes, para
cada variable y sus interacciones. De acuerdo con éstos resultados, sólo se encontró
diferencia estadísticamente significativa ( = 0.05) para la interacción
tratamiento*especie.
CUADRO 4. Cepas de Penicillium spp. seleccionadas para evaluar la habilidad
competitiva in vitro de cepas resistentes y susceptibles a SOPP, IMZ y TBZ.
Especie Fenotipos Cepa

P. digitatum SsIsTs 13
19
278
SsIrTs 221
SrIsTs 285
SsIsTr 92
P. italicum SsIsTs 21
204
255
SrIsTr 351
SsIsTr 199
P. ulaiense SsIsTs 3
85
332
SrIsTs 15
SrIsTr 262
CUADRO 4. Niveles de significación para las distintas variables medidas para estimar in
vitro la habilidad competitiva de fenotipos resistentes de Penicillium bajo el efecto de los
fungicidas usados.
CEPAS TASA DE TASA DE CRECIMIENTO ESPORULACION

RESISTENTES CRECIMIENTO ESPORULACION AL DIA 10 AL DIA 10
BLO 0.1901 0.4891 0.0912 0.6629
CEPA(ESP) 0.1717 0.5243 0.1709 0.3277
ESP 0.8068 0.5919 0.7918 0.3486
TRA(ESP) 0.0001* 0.0001* 0.0001* 0.0001*
CME 2.395 12.6950 165.1132 804.3075
*Estadísticamente significativo ( = 0.05).
Conforme a los análisis para cada una de las variables consideradas, los
fungicidas, en general, provocaron reducción de la tasa de crecimiento y del crecimiento
final al décimo día en los fenotipos resistentes (Cuadro 6), en comparación con los
valores de sus testigos, siendo esta más pronunciada para el caso del SOPP en P.
digitatum y P. ulaiense (Cuadro 5 y 6).
CUADRO 5. Tasa de crecimiento (mm/día) de las tres especies bajo los distintos
tratamientos.*
TASA DE CRECIMIENTO
Especies Tratamientos Promedio
Imazalil SOPP TBZ Testigo
P. digitatum 4,26 b 2,34 c 3,55 bc 6,66 a 4,20 a
P. italicum ------ 3,87 b 4,32 b 6,12 a 4,76 a
P. ulaiense ------ 3,61 c 5,08 b 8,32 a 5,67 a
* Los valores con letras similares no difieren estadísticamente ( = 0.05).
CUADRO 6. Promedio de crecimiento final (en mm) de las tres especies bajo los
distintos tratamientos.*
CRECIMIENTO AL DIA 10
P. digitatum 39,31 b 22,58 c 34,74 bc 61,34 a 39,49 a
P. italicum ------ 35,89 b 42,59 b 60,06 a 46,18 a
P. ulaiense ------ 32,32 c 48,54 b 77,44 a 52,77 a
La tasa de esporulación y la esporulación a los 10 días fue prácticamente similar

en las tres especies de Penicillium para todos los tratamientos y no difirieron
significativamente de los testigos. Unicamente se registró una reducción estadísticamente
significativa para ambas variables, en P. digitatum y P. ulaiense cuando crecieron en
PDA + SOPP (Cuadro 7 y 8).
CUADRO 7. Tasa de esporulación (en porcentaje) de las tres especies bajo los distintos
tratamientos. *
TASA DE ESPORULACION
P. digitatum 11,67 a 4,22 b 9,45 a 10,13 a 8,87 a
P. italicum ------ 10,42 a 9,94 a 10,01 a 10,12 a
P. ulaiense ------ 6,95 b 11,22 a 9,61 a 9,26 a
CUADRO 8. Promedio de esporulación final (en porcentaje) de las tres especies bajo los
distintos tratamientos. *
ESPORULACION AL DIA 10
P. digitatum 100 a 27,73 b 89,72 a 92,18 a 77,46 a
P. italicum ------ 87,45 a 100 a 100 a 97,85 a
P. ulaiense ------ 56,46 b 100 a 93,75 a 85,29 a

En el Cuadro 9 se indican los niveles de significación obtenidos en los
correspondientes análisis, para las distintas variables consideradas y sus interacciones, a
partir de los datos de fenotipos de Penicillium resistentes y susceptibles, crecidos en
PDA sin fungicidas.
No se encontraron diferencias estadísticamente significativas ( 0.05) para

ninguna de las fuentes de variación, con la excepción de cepa anidada en especie y
resistencia, tanto para las variables tasa de crecimiento como para las de crecimiento
final de las colonias a los 10 días (Cuadro 9).
SIN FUNGICIDA TASA DE TASA DE CRECIMIENTO ESPORULACION

CRECIMIENTO ESPORULACION AL DIA 10 AL DIA 10
BLO 0.1108 0.1233 0.0792 0.2025
CEPA(ESP*RES) 0.0403* 0.7915 0.0408* 0.2328
ESP 0.3104 0.4236 0.2772 0.9102
RES 0.5767 0.8285 0.6856 0.9865
ESP*RES 0.8389 0.9804 0.9173 0.7372
CME 2.8867 13.2422 212.5758 925.6276
*Estadísticamente significativo ( = 0.05).
El análisis separado de cada una de las variables no reportó diferencias

estadísticamente significativas para las distintas especies, ni para el caso de la interacción
especie por resistencia. (Cuadro 10, 11, 12 y 13)
CUADRO 10. Tasa de crecimiento (mm/día) de las tres especies creciendo en medio sin
fungicida.*
TASA DE CRECIMIENTO
Sens. Resist. Prom. Sens. Resist. Prom. Sens. Resist. Prom.
6,02 a 6,80 a 6,41 a 6,27 a 6,01 a 6,14 a 7,36 a 8,41 a 7,88 a
Sensibles 6,55 a Resistentes 7,10 a
CUADRO 11. Tasa de esporulación (en porcentaje) de las tres especies creciendo en
medio sin fungicida.*
10,45 a 10,43 a 10,44 a 9,44 a 9,72 a 9,58 a 9,49 a 9,61 a 9,55 a

CUADRO 12. Crecimiento final (en mm) de las tres especies creciendo en medio sin
fungicida.*
59,29 a 62,42 a 60,86 a 60,45 a 59,60 a 60,02 a 71,20 a 78,64 a 74,92 a
CUADRO 13. Esporulación final (en porcentaje) de las tres especies creciendo en medio
sin fungicida.*
100 a 94,87 a 98,16 a 92,84 a 99,83 a 96,33 a 94,83 a 94,07 a 94,45 a
3.2 Crecimiento in vivo
Para todos los parámetros medidos (tasa de crecimiento, tasa de esporulación,

crecimiento final y esporulación final), no se encontraron diferencias significativas ( =
0,05) entre especies, entre cepas sensibles y resistentes, en la interacción entre especie y
resistencia, ni por el efecto anidado de cepa (especie*resistencia) (Cuadro 14, 15, 16, 17
y 18).
CUADRO 14. Niveles de significancia para las distintas variables consideradas para
estimar la habilidad competitiva in vivo.
TASA DE TASA DE CRECIMIENTO ESPORULACION

CRECIMIENTO ESPORULACION AL DIA 10 AL DIA 10
BLOQUE 0,7981 0,5066 0,6122 0,6418
CEPA(E*R) 0,0558 0,0576 0,0509 0,0527
ESPECIE 0,8684 0,4701 0,9163 0,7282
RESISTENCIA 0,6109 0,7996 0,6105 0,7329
E*R 0,8392 0,7935 0,8672 0,7796
CME 30,8153 0,0021 1946,620 0,1158
CUADRO 15. Tasa de crecimiento in vivo (mm/día) de las tres especies.
TASA DE CRECIMIENTO
P.digitatum P. italicum P. ulaiense
13,21 a 11,70 a 12,45 a 12,65 a 11,25 a 11,95 a 11,22 a 11,72 a 11,47 a
CUADRO 16. Tasa de esporulación in vivo (en porcentaje) de las tres especies.
8,55 a 8,17 a 8,36 a 7,44 a 6,37 a 6,91 a 6,91 a 7,64 a 7,27 a
CUADRO 17. Crecimiento final in vivo (en mm) de las tres especies.
103,95 a 93,34 a 98,64 a 100,74 a 87,46 a 94,10 a 90,66 a 93,91 a 92,30 a
CUADRO 18. Esporulación final in vivo (en porcentaje) de las tres especies.
61,01 a 60 a 60,50 a 58,87 a 48,24 a 53,56 a 52,48 a 55,80 a 54,14 a
DISCUSION
La alta frecuencia de cepas resistentes a TBZ (66,7%) en la población de Penicillium spp.

detectada en el ensayo de resistencia in vitro, confirmarían las observaciones realizadas
previamente en Uruguay por Monteiro et al (1997) y las efectuadas por otros autores en
varios países (McDonald, Risse y Hillebrand, 1979; Bus, Bongers y Risse, 1991).
Diversos factores podrían estar involucrados en la ocurrencia de este hecho. En primer

lugar, la forma de reproducción (policíclica) de las especies de este género y su alta
capacidad de esporulación, sumadas al modo de acción sitio-específico del TBZ
(Davidse, 1987), incrementan las probabilidades de aparición de nuevos recombinantes
que aseguren la sobrevivencia de las especies de Penicillium en presencia del fungicida.
Los recombinantes resistentes, posteriormente, se incrementarían y pasarían a predominar
en la población.
Otra posible causa tendría relación con el modo de uso, con particular referencia a las
dosis empleadas y su aplicación en áreas confinadas. En el caso de Uruguay se han
señalado problemas de subdosificación de TBZ en algunas empacadoras del país (Reyes
et al, 1994), lo cual, aunado al uso continuado de este producto, por varios años, habrían
inducido presión de selección a favor del desarrollo de cepas resistentes (Wade, 1982).
Por otro lado, está demostrado que las empacadoras, así como en cámaras de
almacenamiento, son los lugares en donde, con mayor frecuencias, se detectan
individuos resistentes a benzimidazoles (Gutter et al, 1981; Eckert, 1990 y 1994).
Analizando individualmente las diferentes especies de Penicillium, se encuentra una ligera

superioridad (70% vs 65%) en la frecuencia de la población de P. italicum resistente a
TBZ. Esta parecería ser la situación más común, conforme a lo reportado por varios
autores, quienes señalan que esta especie, regularmente, es menos sensible a
benzimidazoles en comparación con P. digitatum (Gutter 1975 y 1981; El-Goorani et al,
1983; Eckert y Ogawa, 1985), siendo posible que exista una relación muy similar con
respecto a P. ulaiense, según los resultados de este estudio.
La frecuencia de la resistencia a SOPP, detectada para las tres especies de Penicillium,

fue baja (11,7%), en comparación con la determinada para TBZ. Esta tendencia es
semejante a la observada en otros trabajos realizados en el Uruguay (Monteiro et al,
1997), pero en los que se registraron porcentajes de resistencia ostensiblemente inferiores
(2,8%).
Se estima prematuro aún para inferir, sobre la base de la diferencia anotada, que se estaría
frente a un fenómeno de degradación de la eficacia de SOPP, debida a un incremento en
el número de cepas resistentes. Sin embargo, el comportamiento registrado en especial en
el caso de P. ulaiense, que denota el más alto porcentaje de individuos resistentes,
debería servir como alerta y monitorearse, en el futuro, en forma rutinaria, para detectar
tempranamente si existe, efectivamente, un quiebre en el control que este fungicida ejerce
sobre las especies de Penicillium que causan podredumbres en frutas cítricas.
En general, en el caso de IMZ, la resistencia detectada en el conjunto de la población de

Penicillium spp. fue muy baja (1,62%), en concordancia con lo expresado por Reyes et
al (1994) y Monteiro et al (1997). Este valor fue influido por la resistencia encontrada en
P. digitatum, confirmando lo reportado por otros autores quienes señalaban que muy
raramente se encuentran cepas de P. italicum resistentes a este fungiicida (Bus, Bongers
y Risse, 1991; Eckert, 1987; Holmes y Eckert, 1992). Del mismo modo, en este trabajo,
al igual que en el de Reyes et al (1994), tampoco se encontraron cepas de P. ulaiense
resistentes a IMZ, incluso luego de probar las restantes cepas de esta especie conservadas
en la Micoteca de la DSPA (Delgado y Pérez, 1997, datos sin publicar). Este hecho
podría deberse a que la resistencia a este fungicida es poligénica, como lo señalaban Van
Tuyl, 1977; Kaplan y Dave,1979; De Waard y Van Nistelroy,1990; Eckert,1990 y
consecuentemente de más difícil generación a través de recombinación natural.
Respecto a P. ulaiense, los resultados de este estudio son contrarios a los de Holmes,
Eckert y Pitt (1994), quienes encontraron que todos los aislamientos de esta especie (un
total de 17), originarios de varias regiones de Estados Unidos, eran insensibles a todas las
concentraciones de IMZ ensayadas (0,2 a 1,4 g/ml), pero concuerdan con el
comportamiento (sensibles) que estos autores reportan, en el mismo trabajo, para el caso
de cepas originarias de Argentina, Nueva Zelandia y Taiwan.
La diferencia de comportamiento de las cepas norteamericanas de la especie P. ulaiense,

podría deberse efectivamente a la presencia de cepas resistentes generadas, seguramente,
por la alta presión de selección inducida, en ese país, por el uso intensivo de fungicidas
para el control de las podredumbres por Penicillium en frutas cítricas; en tanto que, en
otras áreas del mundo, como sería el caso de Uruguay, aún predominarían los biotipos
salvajes sensibles a IMZ.
Lo anotado debe ser tomado muy en cuenta en los programas de tratamiento de

postcosecha de frutas cítricas, a objeto de prevenir la eventual generación de resistencia
por un uso inadecuado de fungicidas, tanto para IMZ como para otros principios activos.
Los fungicidas usados no redujeron la tasa de esporulación, ni la esporulación final de las

cepas resistentes, excepto en el caso de P. digitatum y P. ulaiense bajo el efecto del
SOPP, que acusaron menores lecturas. Esto indicaría que la mayoría de las cepas
resistentes de las tres especies de Penicillium, en presencia de uno u otro de los
fungicidas utilizados no sufrirían una merma de consideración en su capacidad de
esporulación, y consecuentemente, en las posibilidades de producción de abundante
inóculo en las empacadoras, cámaras de almacenamiento y durante el transporte, en
especial si las frutas no son mantenidas en condiciones adecuadas de temperatura y
humedad.
Estos sí disminuyeron la tasa de crecimiento y crecimiento final de las cepas resistentes,

siendo más pronunciado el efecto en P. digitatum y P. ulaiense, en presencia de SOPP.
Esto indicaría que si bien son resistentes su crecimiento aún es inhibido por los
productos.
En PDA sin fungicida no se encontraron diferencias entre especies, ni entre cepas

sensibles y resistentes de la misma especie, ni entre cepas sensibles y resistentes, tanto en
tasa de crecimiento, crecimiento final, tasa de esporulación, como en esporulación final.
Esto permitiría suponer que en las cepas resistentes, la mutación de la cual adquirieron la
resistencia, no afecta adversamente su habilidad competitiva, lo cual incrementaría su
potencial para persistir en la población (Wade, 1982).
El no haber encontrado significación estadística, en ninguno de los parámetros usados

para determinar posibles diferencias en el crecimiento in vivo de cepas susceptibles y
resistentes a los fungicidas, confirmaría también que las tres especies y, en particular sus
individuos resistentes, tendrían una similar habilidad competitiva (Dekker, 1977; Laville,
1981; Wade, 1982; Smilanick y Eckert, 1986; Buchenauer, 1987; Dekker, 1987; Eckert,
1990; Reyes et al, 1994; Holmes, Eckert y Pitt, 1994; Holmes y Eckert, 1995).
Esta característica, si se tiene en cuenta la presión de selección que ocurre en el ambiente

de las empacadoras, podría favorecer que los genotipos resistentes de las tres especies,
pasaran a dominar dentro de la población de Penicillium spp. (Dekker, 1977; Kaplan,
Dave y Petrie, 1981; Wade, 1982; Dekker, 1987) y tornar más difícil su control.
Se ha establecido que P. ulaiense se encuentra en menor frecuencia en la población
natural de Penicillium spp. presente en Uruguay (Díaz y Sendra, 1997). Sin embargo,
siendo capaz de generar individuos resistentes a SOPP y/o TBZ, esta especie podría
llegar a tener una mayor relevancia en la población de Penicillium spp., a causa de su
habilidad competitiva, similar a las otras dos especies, tanto en crecimiento como en
esporulación.
Por el momento no se han encontrado cepas resistentes de esta especie al IMZ, pero dada
su capacidad de generar individuos con resistencia múltiple, si estuviese sometida a la
presión de selección que ejercería el propio IMZ, y si no se toman las debidas
previsiones, podrían aparecer individuos resistentes a este fungicida, como en el caso
observado en California, por Holmes, Eckert y Pitt (1994), e incluso, casos de
resistencia combinada a los otros fungicidas usados en tratamientos de postcosecha en el
Uruguay.
En este trabajo no se obtuvieron diferencias significativas en la tasa de crecimiento in

vitro, ni in vivo entre las tres especies, lo que estaría en oposición a lo expresado por
Holmes, Eckert y Pitt (1994), Carrillo (1995), Díaz y Sendra (1997) y Visintin et al
(1997), quienes señalaron que P. ulaiense presenta una menor tasa de crecimiento (30-
40% menor) que P. italicum y sugirieron usar esta característica para la diferenciación
entre estas especies. Los resultados obtenidos en este estudio sugieren, para el fin antes
indicado utilizar la longitud de los coremios, como la característica diferencial más
confiable.
CONCLUSIONES
-Existe una alta frecuencia de individuos resistentes a Tiabendazol en la población de

Penicillium spp. que atacan a las frutas cítricas en Uruguay.
-La presencia de individuos resistentes a Imazalil sería rara en la población natural de

Penicillium spp.
-El hongo P. ulaiense presenta mayor frecuencia de individuos resistentes a SOPP, así
como a SOPP y Tiabendazol simultáneamente.
-El crecimiento y esporulación de fenotipos resistentes y sensibles, tanto en PDA sin

fungicida, como en fruta sin tratar, no presentaron diferencias significativas. Esto también
se dio entre especies, por lo que no diferirían en su habilidad competitiva.
-Las tres especies crecieron a tasas similares en medio sin fungicida, a diferencia de lo
reportado por otros autores que sostienen que P. ulaiense puede diferenciarse de P.
italicum por su menor tasa de crecimiento (30-40% menor).
-Los resultados de estos estudios sugieren que para la identificación de P. ulaiense

debería priorizarse la longitud de los coremios característicos de esta especie.
RESUMEN
Se probaron cepas de Penicillium digitatum, P. italicum y P. ulaiense, por su

sensibilidad in vitro a IMZ (10 ppm), SOPP (20 ppm) y TBZ (20 ppm), dosis usadas en
el Programa de Monitoreo de Resistencia en Uruguay. Se obtuvo un alto porcentaje de
individuos resistentes a TBZ (65-70%). Para SOPP se dio un 5% de resistentes en P.
digitatum y P.italicum, mientras que en P. ulaiense la frecuencia fue de 25%. Para IMZ
no se detectó resistencia, excepto en P. digitatum (5%). Posteriormente, de la prueba
anterior se seleccionaron al azar 16 cepas en total, incluyendo cepas sensibles y
resistentes de las tres especies. Diariamente, durante 10 días, se midió el crecimiento y
esporulación de estas cepas en PDA con y sin fungicida. Ninguna de las tres especies, se
diferenció significativamente ( = 0,05) tanto en su tasa de crecimiento y esporulación,
así como por su crecimiento y esporulación final, en medio sin fungicida. Tampoco se
dieron diferencias entre cepas sensibles y resistentes, ni entre sensibles y resistentes
dentro de una misma especie. Se observaron diferencias significativas entre tratamientos
(IMZ, SOPP, TBZ y Testigo) por especie. En éstos hubo reducción en la tasa de
crecimiento y crecimiento final. Las más afectadas fueron las cepas resistentes de P.
digitatum y P. ulaiense, en presencia de SOPP. Para tasa de esporulación y esporulación
final, no se dio reducción en las cepas resistentes, con excepción de las cepas de P.
digitatum y P. ulaiense creciendo en medio con SOPP. Las mismas 16 cepas se
inocularon individualmente, en limones (cv. „Eureka‟) sin fungicida, no presentándose
diferencias significativas en tasa de crecimiento y crecimiento final, así como en la tasa
de esporulación y esporulación final. Este trabajo confirma la alta frecuencia de
individuos de Penicillium spp. resistentes a TBZ en la población de las empacadoras del
país, así como la rara ocurrencia de cepas resistentes a IMZ. Se destaca la mayor
frecuencia en P. ulaiense de individuos resistentes a SOPP y a SOPP y TBZ
simultáneamente. Las cepas sensibles y resistentes de las tres especies, no diferieron en su
habilidad competitiva en medio sin fungicida, ni en limones sin tratar. En este trabajo P.
ulaiense creció a tasas similares a las de las otras dos especies, por lo que para su
identificación debería priorizarse la longitud de los coremios característicos de esta
especie.
SUMMARY
Isolates of P. digitatum, P. italicum and P. ulaiense were tested for their in vitro
sensibility to the dosages of IMZ (10 ppm), SOPP (20 ppm) and TBZ (20 ppm) usually
utilized in Uruguay in the Resistance Monitoring Program. A high percentage of TBZ
resistant strains (65-70%) was detected in all three species. Five percent of the P.
digitatum and P. italicum isolates showed resistance to SOPP, while the frecuency in P.
ulaiense was higher (25%). No resistance was detected for IMZ, except in P. digitatum
(5%). Sixteen isolates randomly selected from the previous test, including sensitive and
resistant strains of these three species, were grown in PDA with and without the
fungicides utilized. The growth and sporulation rate as well as the final growth and
sporulation (at 10 days) of the three species were not significatively different ( = 0,05).
None difference was also obtained when sensitive and resistant isolates were compared,
even between sensitive and resistant isolates within the same species. Significative
differences were found within fungicide treatments/species particularly in the growth rate
and final growth. The most affected were the resistant isolates of P. digitatum and P.
ulaiense grown in PDA + SOPP. The same sixteen cultures when inoculated in lemon
fruits (cv. „Eureka‟) not treated with these fungicides, no differences were observed in the
growth rate and final growth, as well as in the sporulation rate and final sporulation (at 10
days). This work confirms the high frecuency of TBZ-resistant strains of Penicillium spp.
in the uruguayan packinghouse populations, as well as the rare ocurrence of IMZ-
resistant strains. It was notorius the higher frecuency in P. ulaiense of SOPP-resistant
strains and SOPP/TBZ-resistant strains. The fitness of the sensitive and resistant isolates
of the three species was not different when grown in PDA and lemon fruits free of
fungicides. According to the results of this work, P. ulaiense is able to grow at similar
rates than the other two Penicillium spp. Therefore for the differenciation of this species,
particularly from P. italicum the lenght of the coremia should be utilized instead of any
other character.
APENDICE
Bloque Tratamiento
1 1 2 11 12 15 16
2 3 4 7 8 17 18
3 5 6 9 10 13 14
4 1 2 3 4 5 6
5 7 8 9 10 11 12
6 13 14 15 16 17 18
7 1 6 8 9 16 17
8 4 5 7 12 14 15
9 2 3 10 11 13 18
10 1 3 10 12 14 17
11 2 5 7 9 16 18
12 4 6 8 11 13 15
Diseño de Bloques Incompletos Desbalanceado.

Tratamiento Especie Resistencia Cepa
1 1 0 Pd 19
2 1 0 Pd 13
3 1 0 Pd 278
4 1 1 (IMZ) Pd 221
5 1 1 (SOPP) Pd 285
6 1 1 (TBZ) Pd 92
7 2 0 Pi 204
8 2 0 Pi 21
9 2 0 Pi 255
10 2 1 (IMZ)
11 2 1 (SOPP) Pi 351
12 2 1 (TBZ) Pi 199
13 3 0 Pu 332
14 3 0 Pu 3
15 3 0 Pu 85
16 3 1 (IMZ)
17 3 1 (SOPP) Pu 15
18 3 1 (TBZ) Pu 262
0 = sensible; 1 = resistente.
1 = P. digitatum; 2 = P. italicum; 3 = P. ulaiense.
P. ulaiense CEPA IMAZALIL SOPP TBZ
80 S R S
232 S R R
93 S R R
262 S R R
15 S R S
P. digitatum CEPA IMAZALIL SOPP TBZ
285 S R S
221 R S S
P. italicum CEPA IMAZALIL SOPP TBZ
351 S R R
CUADRO Cepas resistentes a imazalil y SOPP de las tres especies de

Penicillium.
S= sensible al fungicida
R= resistente al fungicida
P. digitatum: 17, 75, 247, 66, 150, 244, 236, 172, 206, 198, 261, 92, 61
P. italicum: 342, 77, 326, 257, 305, 351, 286, 72, 117, 277, 96, 116, 199, 238
P. ulaiense: 233, 148, 51, 333, 27, 328, 56, 2, 336, 262, 86, 93, 232
CUADRO Cepas resistentes al tiabendazol.

P. digitatum: 19, 13, 278, 18, 191
P. italicum: 204, 21, 255, 138, 272, 273
P. ulaiense: 332, 3, 85, 28, 271
CUADRO Cepas sensibles a todos los fungicidas.

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CARACTERISTICAS BIOLOGICAS DE Penicillium digitatum, P. italicum Y P.

Thesis · January 1997

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CARACTERISTICAS BIOLOGICAS DE Penicillium digitatum, P. italicum Y P. ulaiense

Ricardo DELGADO ARCE

TESIS presentada como uno de

La citricultura es uno de los principales rubros agrícolas del Uruguay. El área

De los volúmenes exportados, un 60% corresponde a naranjas, 15% a mandarinas,

La aceptación de la fruta en los mercados importadores está supeditada a su calidad y

En Uruguay, este problema podría adquirir mayor importancia, por la detección de

El objetivo de este trabajo es el de inferir la potencial predominancia de estas tres

a. la cuantificación de cepas resistentes a TBZ, SOPP e Imazalil, en una muestra

b. la habilidad competitiva, in vitro e in vivo de cepas de Penicillium spp. resistentes a

Descripción de las enfermedades causadas por Penicillium spp.

Los síntomas inducidos por el ataque de P. digitatum (moho verde) y P. italicum

En este estado, sobre la superficie de la cáscara se desarrolla, en forma radial, a

En el caso de P. digitatum, el área esporulada es de color verde oliva y se

Los hongos P. digitatum, P. italicum y P. ulaiense provocan podredumbres

P. digitatum y P. italicum son considerados como responsables de la mayor parte

Los principales factores que predisponen a los frutos a la podredumbre causada

La epidemiología de las enfermedades ocasionadas por los tres patógenos es

El rango de temperaturas adecuadas para el desarrollo de estos patógenos fluctúa

La contaminación de los frutos puede ocurrir en el campo (al momento de la

Las prácticas sanitarias de naturaleza química se deben dirigir a: prevenir la

Desinfectantes a base de cloro (hipoclorito de sodio o calcio), amonio

Los fungicidas más usados en Uruguay en frutas cítricas, para el tratamiento

Ortofenilfenato de Sodio (Sodium o-phenyl phenate-SOPP)

El SOPP es un fungicida del grupo de los hidrocarburos aromáticos, que se

Induce, como otros hidrocarburos aromáticos, daños en la membrana de las

El Tiabendazol es un fungicida sistémico perteneciente al grupo de los

En este caso, como en todos los benzimidazoles y tiofanatos, la molécula que

El imazalil es un fungicida sistémico perteneciente al grupo de los inhibidores de

El sitio de acción de este inhibidor ocurre en el ciclo de la biosíntesis de los

Se ha observado que las esporas de P. italicum tratadas con imazalil, se hinchan

Descripción de las especies de Penicillium

El género Penicillium pertenece a la Clase Deuteromycetes, Orden Moniliales,

En P. digitatum las estructuras hifales portadoras de los conidios, se caracterizan

Los elementos que constituyen la parte esporígena de P. italicum son menores en

Esta especie puede desarrollarse en diversos medios de cultivo, pero las

P. ulaiense Hsieh, Su & Tzean

Los conidióforos se originan a partir de hifas superficiales o subsuperficiales y de

La distribución actual de P. ulaiense incluye Argentina, Australia, Estados Unidos

Este hongo puede ser cultivado en diferentes medios de cultivo, pero su

La resistencia a plaguicidas es un fenómeno bastante conocido, desde hace

Factores que afectan la aparición de resistencia

Los principales factores que podrían conducir a la selección de cepas resistentes a

a. el modo de acción del fungicida:

Respecto a su comportamiento epidemiológico, si el patógeno es policíclico,

Otro factor a tener en cuenta es la “fitness” (adaptabilidad de las cepas

Según Dekker (1977) y Sisler (1994), la resistencia a los fungicidas puede

a. disminución de la permeabilidad de la membrana protoplasmática, impidiendo la

b. aumento de la detoxificación del producto que puede ocurrir por la modificación de la

c. disminución de la “síntesis letal” o capacidad de un hongo para convertir un compuesto

d. disminución de la afinidad por el sitio de acción, particularmente en el caso de

f. compensación, cuando el sitio de acción de un fungicida es una enzima, el patógeno

La resistencia a este fungicida está asociada al modo de acción sitio-específico de

La resistencia al TBZ apareció en 1970, en empacadoras de California y Arizona,

Estudios genéticos sobre la resistencia a este fungicida hechos en P. italicum,

Resistencia al Ortofenilfenato de Sodio-SOPP

La resistencia al SOPP y al difenil (de parecida composición química), fueron los

La resistencia a este fungicida en P. italicum, sería de carácter monogénico y

Cuando este fungicida fue lanzado al mercado, se lo consideró como de bajo

Yijklm =  + Bi + Ej + Rk + ERjk + C(ER)l(jk) +  ijklm