Verano 2019

Manual de laboratorio de análisis

instrumental
Políticas de laboratorio de análisis instrumental

INTRODUCCIÓN

En la parte de laboratorio de Análisis instrumental, estará expuesto a varios tipos diferentes de

técnicas instrumentales. En la mayoría de los experimentos, investigará las características de
rendimiento del instrumento además de usarlo para realizar una medición. Sin embargo, sigue
siendo importante que continúe utilizando su mejor técnica analítica al preparar estándares y
muestras. ¡La mala técnica siempre producirá malos resultados!

MÓDULOS DE LABORATORIO

El curso de laboratorio se divide en tres módulos, cada uno de los cuales enfatiza un aspecto
diferente del análisis instrumental. Cada módulo consta de 2-4 experimentos que se relacionan
con el tema del módulo. Trabajará como parte de un grupo de 2 personas, pero debido a la
disponibilidad limitada de instrumentos, existe la posibilidad de que tenga que programar un
tiempo de análisis fuera de la clase.

PREPARACIÓN DE LABORATORIO

La clave para la eficiencia en el laboratorio es la preparación. Se espera que lea el laboratorio y

se comunique con el instructor antes del período de laboratorio para preguntas y / o
aclaraciones. Es muy recomendable que consulte con los miembros de su grupo antes del
período de laboratorio para dividir las responsabilidades de modo que su tiempo de laboratorio
se utilice de la manera más eficiente. También es importante que sea considerado con sus
compañeros de laboratorio y llegue a tiempo al laboratorio.

CUADERNO DE LABORATORIO

Debe mantener un cuaderno de laboratorio a partir del primer día de experimentos. Todos los
datos deben registrarse en el cuaderno de laboratorio, no en hojas sueltas de papel o en el
manual de laboratorio. Para evitar abusos (es decir, completar el cuaderno al final del semestre),
debe obtener la firma del instructor de laboratorio cada semana.

El propósito principal de la computadora portátil de laboratorio es registrar datos y detalles

experimentales que no están incluidos en el manual de laboratorio. No necesita reescribir los
procedimientos que ya están en el manual del laboratorio, y no necesita incluir cálculos.

El cuaderno se calificará según las siguientes pautas:

1. Las primeras páginas del cuaderno deben reservarse para una tabla de contenido. Esta tabla
de contenido debe mantenerse actualizada.

2. Cada página debe tener un número de página y estar fechada.

3. El cuaderno debe estar rígido.

4. No se deben eliminar páginas por ningún motivo.

5. Todas las entradas de datos deben estar en tinta indeleble (es decir, no borrable).

6. Los errores y errores deben tacharse con una sola línea. El blanqueamiento no está permitido.

7. Intente mantener el cuaderno razonablemente ordenado: debería poder entender cada

entrada. A menudo es útil construir tablas antes del laboratorio y completarlas a medida que
recopila datos.
8. Mantenga su cuaderno actualizado. No es ético (por no mencionar ilegal en muchas
circunstancias) regresar y completar su cuaderno con los datos que escribió en hojas sueltas de
papel. También está prohibido retroceder (es decir, retroceder y escribir la fecha en que cree
que se registraron los datos).

INFORMES

Debe escribir un informe (informe de laboratorio completo, corto o póster) para cada
experimento. Estos informes deben presentarse una semana después de completar el
laboratorio.

IMPORTANTE

• Los informes deben presentarse al comienzo del período de laboratorio. NO PUEDE TRABAJAR
EN SUS INFORMES DE LABORATORIO DURANTE EL PERÍODO DE LABORATORIO.

• Se le recomienda que trabaje con sus socios para analizar sus datos. Sin embargo, todo el
trabajo escrito debe ser un esfuerzo individual. Su informe debe estar escrito con sus propias
palabras y contener sus propios cálculos e interpretaciones. Los informes copiados resultarán
en una falla en el curso.

• No se aceptarán informes de laboratorio de ninguna persona que se haya perdido un

experimento. No puede simplemente copiar los datos de sus socios y presentar un informe;
debes hacer los arreglos para hacer el experimento (preferiblemente durante otro período de
laboratorio).

FORMATO DE INFORME GENERAL

• Los informes deben imprimirse con una impresora de alta calidad.

• Responda todas las preguntas completamente y en forma de párrafo. No responda

simplemente "sí" o "no", sino que siempre justifique su respuesta.

Aquí hay un ejemplo de una respuesta que recibiría crédito completo:

¿Cuál es la altura óptima de observación de llama para Zr? Los datos de la Figura 3, un gráfico
de la absorbancia de Zr en función de la altura de observación en la llama, muestran que la
absorbancia máxima se produce a una altura de 2,25 cm. Por lo tanto, la mejor sensibilidad para
la absorción atómica de Zr se produce a una altura de observación de 2,25 cm.

• Asegúrese de incluir cálculos de muestra. Los cálculos escritos a mano son aceptables.

• Los cálculos de muestra deben ser fáciles de seguir.

• Al ajustar datos a una línea (p. Ej., Una curva de calibración), utilice siempre la regresión lineal.
Informe la ecuación para la línea y el coeficiente de correlación (r or r2).

• Para todas las determinaciones repetidas, se debe informar el promedio, la desviación

estándar y el% de desviación estándar relativa.
• Los siguientes son ejemplos de presentación aceptable de datos. Tenga en cuenta que las
tablas incluyen subtítulos descriptivos y que las columnas incluyen unidades.

El siguiente es un ejemplo de una tabla mal construida. Esta tabla no tiene un título descriptivo,
carece de unidades, tiene un etiquetado deficiente de las muestras, ha ignorado totalmente las
cifras significativas, está mal alineada y no tiene columna para% RSD.

GRÁFICOS

Una buena presentación gráfica de los datos es crítica para el análisis de resultados
experimentales.

A continuación se enumeran pautas generales para trazar y anotar correctamente un gráfico.

1. Elija una escala que muestre mejor las dimensiones completas de los datos y también dé como
resultado divisiones de escala que permitan una fácil interpretación de los datos. En otras
palabras, no agrupe los datos en una esquina del gráfico. La mayoría de las hojas de cálculo
escalan los gráficos automáticamente, pero generalmente puede volver a escalar el gráfico
manualmente. El origen no necesita ser incluido en el gráfico a menos que esté mostrando datos
cerca del origen.

2. Trace la variable dependiente (la que es función de la otra, como la absorbancia en función
de la concentración) en el eje vertical. Por lo tanto, la variable independiente debe trazarse en
el eje horizontal. Siempre etiquete ambos ejes e incluya las unidades entre paréntesis.

3. Cada punto debe ubicarse con un pequeño punto de datos distinto. Use diferentes símbolos
(por ejemplo, círculos, cuadrados, etc.) para distinguir un conjunto de datos de otro.

4. Las líneas a través de conjuntos de datos no deben "conectar los puntos". El mejor método (si
se supone que los datos son lineales) es usar la regresión lineal para determinar la línea de mejor
ajuste para sus datos.

5. Nunca permita que Excel dibuje una línea suave a través de sus datos. ¡En casi todos los casos,
estas curvas no tienen sentido!

6. Cuando traza datos en varios órdenes de magnitud, es aconsejable construir un diagrama de

registro para que los datos en concentraciones bajas y altas sean visibles. Aunque puede hacerlo
estableciendo las propiedades del eje en Excel en "logarítmico", generalmente es mejor calcular
el logaritmo de los datos antes de graficar (especialmente cuando desea hacer un ajuste lineal
a los datos de registro-registro).
[COPIA DEL INSTRUCTOR]

Contrato de instrumentación de laboratorio CHL 311

Experimento 1: RADIACIÓN DE CUERPO NEGRO o ¿Cuál es la diferencia entre una bombilla, un

LED y el sol?

El color de la luz producida por un objeto caliente depende de su temperatura. Esto tiene que
ver con el hecho de que una mayor cantidad de luz energética produce una longitud de onda de
luz diferente. La longitud de onda, la frecuencia y la energía de la luz están relacionadas por

La cantidad de radiación emitida por un objeto caliente depende de dos cosas, qué tan caliente
está y qué longitud de onda está observando. La siguiente ecuación describe este
comportamiento.

I es la intensidad o densidad espectral

donde h es la constante de Planck, c es la velocidad de la luz, k es la constante de Boltzmann

(1.38 x 10-23 J K-1) T es la temperatura Kelvin y está en nm.

Procedimiento.

1. Usando un espectrómetro Ocean Optics, registre el espectro visible del sol, una bombilla
incandescente (bombilla de tungsteno) y un LED blanco.

2. Guarde los puntos de datos del espectro y abra los archivos de datos con Excel.

3. Haz un diagrama (I vs. ) de la función de radiación de cuerpo negro. Trace la densidad

espectral para 4000, 5000, 6000 K en el mismo gráfico. ¿Qué cambios se pueden ver a medida
que aumenta la temperatura?

4. Abra los archivos de datos (del sol, la lámpara de tungsteno y el LED) con Excel. Ahora trace
la función de radiación de cuerpo negro en el mismo gráfico. [NOTA, tendrá que colocar un
multiplicador en la ecuación, de modo que tanto la función como el conjunto de datos estén en
la misma escala.]

5. Trace la función de radiación de cuerpo negro en el mismo gráfico que sus datos. [NOTA,
tendrá que colocar un multiplicador en la ecuación, de modo que tanto la función como el
conjunto de datos estén en la misma escala.]

(a) Etiquete las celdas a lo largo de la parte superior de la hoja con A y luego coloque un valor
"adivinar" para la TEMPERATURA en la celda. (B y C están reservados para las otras fuentes)
(b) Coloque los datos para "ajustarlos manualmente" en las dos primeras columnas. En la tercera
columna, ingrese la ecuación del cuerpo negro, haciendo referencia a los valores A, B y C en la
parte superior de la hoja

6) ¿Qué temperatura da el mejor ajuste en cada caso? Busque valores para la temperatura del
sol, la lámpara de tungsteno y el LED, ¿cómo se comparan sus valores experimentales?

7 ¿Cuál de los dos "emite" más luz visible? ¿Cuál es el rango de luz que nuestros ojos pueden
ver? ¿Cómo se superpone esto con la lámpara de tungsteno, el LED y los espectros solares? ¿Esto
proporciona evidencia de por qué nuestros ojos evolucionaron para ver longitudes de onda
particulares?

Experimento 2.

NORMAS COMERCIALES DE ESPECTROSCOPIA:

Señal a ruido, resolución, promedio de conjunto, suavizado digital

Introducción

Usar instrumentación de todo tipo implica compromisos. Este laboratorio está diseñado para
ilustrar algunos de los compromisos involucrados en la realización de mediciones con
instrumentación espectroscópica: para demostrar algunas de las "reglas comerciales". Antes de
realizar tareas que ilustren estos conceptos, analicemos brevemente estos términos, sobre los
cuales puede leer más en el texto.

RESOLUCIÓN: La definición más directa de resolución es en términos de la diferencia en

frecuencia (número de onda, cm-1) o longitud de onda (nm) entre dos picos de absorbancia que
pueden ser separados por el instrumento. Todos los demás factores son iguales, cuanto mayor
sea la resolución, mejor será detectar absorbancias (picos) lo más cerca posible.

SEÑAL A RUIDO: En el texto, S / N se define como 1 / RSD de una señal grabada.

Esto puede considerarse como la relación señal / ruido del "cuadrado medio raíz". Determinará
el rms S / N del espectrómetro infrarrojo de transformada de Fourier bajo una variedad de
condiciones instrumentales. Todos los demás factores son iguales, cuanto mayor sea el S / N,
mejor detectar las absorbancias más débiles, o absorbancias a niveles de concentración más
bajos.

PROMEDIO DE SEÑAL: También llamado promedio de conjunto, es una forma de mejorar la

relación S / N mediante la adquisición de múltiples espectros y obtener el promedio del
resultado. La señal aumenta a la primera potencia del número de espectros promediados pero
el ruido, al ser aleatorio, aumenta a la raíz cuadrada del número de espectros promediados. Por
lo tanto, la señal aumenta más rápido que el ruido a medida que se promedian múltiples
espectros, lo que da como resultado una mayor relación señal / ruido.

Suavizado: también conocido como filtrado digital (que es una forma de suavizar los datos que
se utilizarán en este laboratorio). Esta es otra forma de mejorar la relación S / N del espectro.

Como verá, hay compensaciones que deben considerarse al obtener cualquier espectro.
Siempre desea una S / N alta, pero necesita una resolución suficiente para obtener un espectro
representativo para sus necesidades en un período de tiempo razonable. Debe elegir las
condiciones adecuadas que mejor satisfagan sus necesidades, y la única forma de lograr esto es
comprender cómo S / N, la resolución espectral, el suavizado y el promedio de la señal
interactúan para cambiar el tiempo de adquisición de datos y el resultado espectral.

Una breve introducción a la espectroscopia

La absorción de radiación electromagnética por iones y moléculas sirve como base para
numerosos métodos analíticos de análisis, tanto cualitativos como cuantitativos. Los estudios
de espectros de absorción proporcionan conocimiento sobre la fórmula, estructura y estabilidad
de muchas especies químicas, y establecen las condiciones más favorables para el análisis.
Debido a que la energía de una molécula es la suma de muchos tipos individuales de energía,

E Molécula = E electrónica + E vibracional + E rotacional + E trasnacional + otros

La absorción de un fotón puede aumentar la energía molecular de varias maneras. En la

espectroscopía UV-Visible, la energía del fotón corresponde con las transiciones electrónicas de
energía de moléculas e iones. Por lo tanto, la espectroscopía UV-Visible es un tipo de
espectroscopía de absorción electrónica. En la espectroscopía infrarroja, la energía del fotón
corresponde con los niveles de energía vibracional de las moléculas. Por lo tanto, la
espectroscopía infrarroja es un tipo de espectroscopia vibracional. Por lo general, es seguro
decir que se puede derivar información estructural más detallada de la espectroscopía vibratoria
que de la espectroscopía electrónica.

En la espectroscopía de absorción electrónica UV-Vis en líquidos, los picos de absorción son muy
amplios. Los picos amplios son el resultado de un fenómeno llamado "ampliación de colisión".
En el estado líquido, las moléculas están colisionando constantemente e interactuando entre sí.
Esto causa un continuo cercano de niveles de energía vibracional y rotacional superpuestos
sobre los niveles de energía electrónicos; dando como resultado amplias bandas de absorción
en un rango de longitudes de onda.

Estas colisiones son mucho menos frecuentes en la fase gaseosa, por lo que uno puede ver los
picos vibratorios individuales superpuestos en la parte superior de los picos electrónicos en la
espectroscopía UV-Vis de la fase gaseosa (suponiendo que las condiciones instrumentales para
obtener el espectro de la fase gaseosa proporcionen suficiente resolución). Fenómenos similares
ocurren en la región infrarroja, que es la parte del espectro electromagnético en el que trabajará
en este laboratorio. Se observan picos relativamente amplios en los espectros infrarrojos de los
líquidos, porque un continuo cercano de energías rotacionales se superpone a los niveles de
energía vibracional. El ensanchamiento por colisión en la fase líquida hace que sea imposible
detectar las transiciones rotacionales individuales. En la fase gaseosa, verá que las transiciones
vibracionales y rotacionales ocurren como una serie de picos agudos. Verá esto para la fase
gaseosa de CO2 en la atmósfera, y verá cambios en estos espectros de fase gaseosa a medida
que cambia la resolución espectral. Debe comprender conceptualmente cuáles son las
implicaciones de la resolución espectral en la obtención de los espectros de fase gaseosa, y cómo
las otras variables de promedio de conjunto, suavizado digital y resolución interactúan entre sí
para formar algunas de las reglas comerciales espectroscópicas. Aunque estamos utilizando el
espectrómetro FTIR para ilustrar las reglas comerciales de la espectroscopía, debe enfatizarse
que cualquier instrumentación espectroscópica mostrará los mismos tipos de tendencias. Sin
embargo, dado que se está utilizando el FTIR, se deben discutir algunos puntos que de otra
manera podrían causar confusión. El FTIR es un instrumento de un solo haz. El laboratorio de
componentes del instrumento está diseñado para mostrar claramente la diferencia entre los
instrumentos de un solo haz y de doble haz. Una medición del% de transmitancia (a partir de la
cual se puede calcular la absorbancia) en realidad requiere 2 mediciones.
%T = (I/Io) x 100
donde I = intensidad de luz a una longitud de onda dada que el detector detecta cuando la
muestra está en el haz fuente, e Io = intensidad de luz a la misma longitud de onda que el
detector detecta cuando hay un "blanco" en el haz fuente. En un instrumento de un solo haz, se
obtiene una absorbancia o% de espectro de transmitancia haciendo primero mediciones en un
blanco para obtener Io en función de la longitud de onda o la frecuencia. Este es un espectro de
haz único. Luego se coloca una muestra en el haz fuente y se obtienen las mediciones para
obtener I en función de la longitud de onda o la frecuencia. Este también es un espectro de haz
único. Al tomar la relación de I / Io en función de la longitud de onda o la frecuencia, se obtiene
un espectro de transmitancia.

Con el FTIR, cuando recopila un espectro de fondo, obtiene un gráfico de Io en función de la

frecuencia. Si observa este espectro, verá que el eje y no es% T o absorbancia, sino emitancia.
Esto es simplemente un espectro de intensidad de señal del instrumento en función de la
frecuencia. Cuando obtiene un espectro de muestra, obtiene una gráfica de I en función de la
frecuencia. Obtiene un espectro de transmitancia o absorbancia realizando las matemáticas
apropiadas tanto para I como para Io. En este laboratorio, se recolectan los espectros I y Io de
haz único bajo condiciones idénticas, es decir, no hay muestra en el haz fuente en ninguno de
los casos. En el espectro de transmitancia resultante, la desviación del 100% T es una medición
directa del error aleatorio o ruido de la medición.

En los pasos 6 y 7 del procedimiento, está trazando espectros de CO2 de un solo haz, que es un
diagrama de Io en función de la frecuencia. Puede hacer esto debido al CO2 en el aire. Como lo
que está viendo aquí son espectros de un solo haz, esto no es una medición de ruido (aunque el
ruido siempre existe en la medición). Las diferencias que observa en los pasos 6 y 7 son
principalmente el resultado de diferencias que el instrumento detecta para la señal de CO2. No
interprete los resultados en los pasos 6 y 7 como provenientes de diferencias en la cantidad de
ruido en los espectros.

PROCEDIMIENTO

1. Su instructor pondrá en marcha el espectrómetro Nicolet FTIR y revisará brevemente el

funcionamiento del instrumento y el uso del software con usted. No debería tener que hacer
nada con el instrumento, excepto escribir en el teclado y trazar espectros. Cualquier duda o
problema ver al instructor.

2. Con 1 escaneo, recoja un espectro de fondo con una resolución de 0,5 cm-1. Con 1
exploración, recolecte un espectro de muestra a una resolución de 0,5 cm-1. Encuentre la
relación S / N de este espectro entre 2200 - 2000 cm-1. El software Nicolet encontrará el ruido
RMS dentro del rango mostrado por usted. La relación S / N es 100% de ruido T / RMS. Guarde
este espectro (línea 100% T) en el disco. (Nota: si el software de su espectrómetro no realiza
este cálculo, los estudiantes pueden obtener manualmente la relación S / N pico a pico tomando
100 dividido por la diferencia entre los puntos alto y bajo en el espectro.

3. Ahora tome este espectro para el que acaba de calcular la S / N y realice una rutina de
suavizado digital. Primero realice un suavizado de 5 puntos y calcule la S / N de este espectro
suavizado de 2200 a 2000 cm-1. Recuerde el espectro sin suavizar y repita el proceso de
suavizado utilizando rutinas de suavizado de 9, 13, 17, 21 y 25 puntos. Después de cada rutina
de suavizado, calcule la nueva relación S / N y recupere el espectro sin suavizar. Tabule sus datos
y haga un diagrama de la relación S / N versus el número de puntos suavizados. En su escrito,
comente sobre el efecto del suavizado en el S / N de este espectro.

4. Con un promedio de 8 escaneos de fondo y muestra, realice experimentos con las siguientes
resoluciones: 0.5 cm-1, 1 cm-1, 2 cm-1, 4 cm-1, 8 cm-1, 16 cm-1 y 32 cm-1. Deberá ejecutar un
espectro de fondo en cada resolución para que esto funcione. Sin embargo, no es necesario
suavizar ninguno de estos, solo calcule la S / N de estos espectros. El S / N debe calcularse en
tres regiones separadas: entre 3000 2800 cm-1; 2200-2000 cm-1; y 600-400 cm-1. Haga un
gráfico de la resolución espectral (eje x) frente a la relación S / N (eje y) para las tres regiones
espectrales. Compare la relación S / N no solo en función de la resolución, sino también en
función de la región espectral. ¿Por qué crees que el S / N varía de una región a otra?
(Sugerencia: compare las intensidades de señal de un solo haz en estas tres regiones y vea si
puede idear una explicación razonable). Discuta los resultados y también cómo el tiempo de
adquisición espectral varía con la resolución.

5. Ya tiene los datos de S / N para 8 escaneos con una resolución de 4 cm-1 de la parte 4. Escanee
tanto el espectro de fondo como el de muestra con esta misma resolución utilizando el siguiente
número de escaneos en archivos de muestra y de fondo:

Trace el promedio del número de escaneos de señal (eje x) frente a la relación S / N (eje y).
Ajuste estos datos a una función de potencia. Esto se hace en Excel agregando una línea de
tendencia y eligiendo un ajuste de potencia. Anota tu trama con la ecuación. Discuta la forma
funcional de esta relación y cómo se compara su resultado con el resultado que esperaría de la
teoría. Discuta cómo varía el tiempo de adquisición espectral con el promedio de la señal y los
efectos finales en S / N.

Ahora por el efecto de la resolución y el suavizado en un espectro de CO2 de fase gaseosa de un

solo haz. Esto está separado de la parte S / N del laboratorio anterior, pero está relacionado en
términos de las reglas comerciales de espectroscopía.

6. Obtenga un espectro de fondo añadiendo 16 escaneos a una resolución de 0,5 cm-1. Muestre
este espectro entre 2400 - 2200 cm-1. Lo que está viendo es una serie de transiciones
vibracionales / rotacionales para CO2 en fase gaseosa en el espectrómetro que está en la
atmósfera. Si mira a su alrededor en otras regiones del espectro, también verá muchos picos
agudos para el agua en fase gaseosa alrededor de 3500 y 1600 cm-1. Guarde este espectro de
fase gaseosa (esto no es un espectro de absorbancia o transmitancia porque es un espectro de
haz único) entre 2400 y 2200 cm-1 al disco. Ahora repita las rutinas de suavizado que se
realizaron para la línea T del 100% en el Paso 3. No calcule S / N de los espectros suavizados
como antes, pero observe lo que el suavizado hace a sus espectros de CO2. En la redacción de
su laboratorio, analice el efecto del suavizado digital en el espectro de CO2 en fase gaseosa. A
la luz de sus resultados sobre el suavizado anterior (Paso 3) en términos de S / N, discuta las
compensaciones y compromisos involucrados en el uso del suavizado digital. Trace espectros
apropiados que ilustren lo que observa.

7. Obtenga dos espectros más de CO2 en fase gaseosa a una resolución de 8 y 32 cm-1,
respectivamente. Trazar espectros para ilustrar cómo la resolución afecta el espectro de CO2 en
fase gaseosa. En su informe de laboratorio, discuta el efecto de la resolución en el espectro de
fase gaseosa de CO2. A la luz de sus resultados sobre la resolución con respecto a S / N y el
tiempo de adquisición espectral, discuta las diversas consideraciones que uno debe tener en
cuenta al elegir una resolución adecuada para adquirir un espectro.

Para su informe

Se han proporcionado sugerencias sobre lo que debe incluirse en el informe durante todo el
procedimiento. Recuerde siempre hacer referencias cruzadas de figuras y diagramas en su
redacción.

Preguntas

Aquí hay algunos problemas que probablemente deberían abordarse directamente en su

redacción. Muchos de estos ya se han mencionado en la sección de procedimientos en cursiva.
Esta lista no es del todo inclusiva.

1. ¿Cuál es la relación entre S / N y el número de escaneos agregados conjuntamente para

obtener espectro? ¿Por qué ocurre esto? ¿Hay alguna desventaja en la suma adicional?

2. ¿Cuál es el efecto del suavizado y el número de puntos suavizados en la relación S / N?

3. ¿Cuál es el efecto del alisamiento en el espectro de fase gaseosa de CO2?

4. ¿Cuál es el efecto de la resolución en el espectro de fase gaseosa de CO2?

Lo más importante es que responder esta pregunta cuidadosamente podría llegar a una buena
conclusión para la redacción del laboratorio.

5. EXPLIQUE LAS VARIAS COMERCIALES Y CONSIDERACIONES QUE DEBE HACER EN EL

EQUILIBRIO S / N, RESOLUCIÓN, PROMEDIO ENSAMBLE Y ALISADO DIGITAL CUANDO SE
CONSIDERA CONDICIONES INSTRUMENTALES PARA OBTENER UN ESPECTRO.

Experimento 3.

Determinación de clorofila en aceite de oliva mediante espectroscopias de fluorescencia y UV

visible

El aceite de oliva se hace presionando o extrayendo el rico aceite de la fruta de oliva. Parece una
cuestión simple presionar las aceitunas y recoger el aceite, pero existen muchos procesos de
extracción de aceite para los diferentes tipos de aceitunas que se cultivan en todo el mundo.
Para complicar aún más las cosas, también hay varios grados de aceite de oliva, y grupos de
funcionarios cuidadosamente seleccionados se reúnen para definir y redefinir la clasificación del
aceite de oliva. Para ayudar a que nuestro experimento sea un ejercicio más científico y menos
político, reduciremos nuestra investigación del aceite de oliva a unas pocas variables
manejables. Después del procesamiento, el aceite de oliva viene en tres grados comunes: virgen
extra, regular y ligero. El aceite de oliva virgen extra se considera de la más alta calidad. Es el
primer prensado de aceitunas recién preparadas. Tiene un tinte amarillo verdoso y un aroma
claramente afrutado debido a los altos niveles de materiales volátiles extraídos de la fruta. El
aceite de oliva regular se recoge con la ayuda de una lechada de agua tibia para aumentar el
rendimiento, exprimiendo hasta la última gota de aceite de las aceitunas. Es de color amarillo
pálido, con un ligero aroma, ya que contiene menos compuestos volátiles. El aceite de oliva claro
es de color muy claro y prácticamente no tiene aroma porque ha sido procesado bajo presión.
Esto elimina la mayor parte de la clorofila y los compuestos volátiles. El aceite de oliva ligero se
usa comúnmente para freír porque no afecta el sabor de los alimentos fritos y es relativamente
económico. El espectro de absorbancia de la luz visible de la clorofila da resultados interesantes.
La química de la clorofila (algunos sitios de referencia de cuatro tipos: a, b, cyd) crea picos de
absorbancia en el rango de 400 a 500 nm y en el rango de 600 a 700 nm. La combinación de luz
visible que no se absorbe parece verde para el ojo humano, pero las diferentes fuentes de
clorofilas tendrán diferentes proporciones de estos picos, que crean varios tonos de verde. La
capacidad de la clorofila para absorber la energía de la luz en una amplia franja del rango visible
ayuda a potenciar la fotosíntesis cEn este experimento, tendrás dos objetivos principales.
Primero, analizará los diversos grados de aceite de oliva para determinar los picos de
absorbancia que están presentes y la cantidad relativa de clorofila que se encuentra en cada
grado. Utilizará un espectrómetro para medir la absorbancia de las muestras de aceite de oliva
sobre el espectro de luz visible. Luego, analizará una muestra desconocida de aceite de oliva y
la calificará como virgen extra, regular o ligera.on una eficiencia óptima en las plantas.

OBJETIVOS

En este experimento, usted:

Mida y analice los espectros de absorbancia de luz visible de tres aceites de oliva estándar:
virgen extra, regular y ligero.

Mida el espectro de absorbancia de una muestra de aceite de oliva "desconocida".

Identifique el aceite de oliva desconocido como uno de los tres tipos estándar.

Comparar los resultados con los obtenidos mediante espectroscopía de fluorescencia.

PROCEDIMIENTO

1. Conecte el espectrómetro al puerto USB de su computadora.

2. Inicie Logger Pro. Si ya se está ejecutando, elija Nuevo en el menú Archivo.

3. Obtenga pequeños volúmenes de los tres aceites de oliva estándar y uno desconocido.
Transfiera suficiente cantidad de una muestra de aceite de oliva para llenar una cubeta de 3/4.
Coloque una tapa en la cubeta y marque la tapa. Prepare todas sus muestras de esta manera
para que tenga cuatro cubetas de aceite de oliva con tapas etiquetadas.

4. Calibre el espectrómetro.

a. Prepare un blanco llenando una cubeta vacía de 3/4 con agua destilada.

b. Elija Calibrar ► Espectrómetro en el menú Experimento.

c. Cuando se complete el período de calentamiento, coloque el blanco en el espectrómetro.
Asegúrese de alinear la cubeta de modo que los lados claros estén orientados hacia la fuente de
luz del espectrómetro.

d. Haga clic en Finalizar calibración y luego haga clic en Aceptar.

Parte I Comparación de tres grados de aceite de oliva e identificación de un desconocido Para la

Parte I de este experimento, calibrará el espectrómetro con agua destilada. Sus objetivos son:
(1) comparar los espectros de absorbancia de los diferentes grados de aceite de oliva; y (2)
identificar el grado de una muestra desconocida de aceite de oliva.

5. Realizar un análisis de espectro completo de una muestra de aceite de oliva.

a. Coloque una de las muestras de aceite de oliva en el espectrómetro.

b. Haz clic en RECOGER. Se mostrará un gráfico de espectro completo del aceite de oliva. Revise
el gráfico para identificar los valores de absorbancia máxima. Haga clic en DETENER para
completar el análisis.

6. Para guardar sus datos, elija Almacenar última ejecución en el menú Experimento.

7. Repita los pasos 5–6 con las muestras estándar de aceite de oliva restantes.

8. Repita el paso 5 con lo desconocido. Nota: No almacene la última ejecución.

9. Examine las parcelas de las muestras de aceite de oliva. Guarda tu archivo de experimento.

10. Enjuague y limpie las cubetas y otros recipientes con aceite con alcohol isopropílico.

Parte II Comparación de la concentración de clorofila del aceite de oliva virgen regular y extra
En la Parte II, utilizará el aceite de oliva de grado ligero para calibrar el espectrómetro y
presumirá que el aceite de oliva ligero no contiene clorofila. A continuación, comparará el
contenido de clorofila del grado regular con el grado virgen extra.

11. Configure un nuevo archivo y calibre el espectrómetro con aceite de oliva ligero.

a. Elija Nuevo en el menú Archivo.

b. Prepare un espacio en blanco llenando una cubeta vacía de 3/4 con aceite de oliva ligero.

c. Elija Calibrar ►Espectrómetro en el menú Experimento.

d. Cuando se complete el período de calentamiento, coloque el aceite de oliva ligero en blanco

en el espectrómetro. Asegúrese de alinear la cubeta de modo que los lados transparentes estén
orientados hacia la fuente de luz del espectrómetro.

e. Haga clic en "Finalizar calibración" y luego haga clic en Aceptar.

12. Mida el espectro de absorbancia del aceite de oliva virgen regular y extra.

a. Retire la cubeta de aceite de oliva ligero del espectrómetro y reemplácela con la cubeta de
aceite de oliva normal.

b. Haz clic en RECOGER. Se mostrará un gráfico de espectro completo del aceite de oliva regular.
Tenga en cuenta la ligera diferencia en la gráfica como resultado del uso del aceite de oliva ligero
como el blanco de calibración. Haz clic en STOP.
c. Para guardar sus datos, elija Almacenar última ejecución en el menú Experimento.

d. Mida el espectro de absorbancia del grado virgen extra de la misma manera.

13. Guarde sus archivos de experimento.

Parte III Espectroscopía de fluorescencia de clorofila en aceite de oliva

La clorofila es una molécula fluorescente. Las moléculas fluorescentes pueden absorber la luz
de una longitud de onda y luego reemitir la luz a una longitud de onda nueva y más larga. Como
ya ha visto en este experimento, la clorofila absorbe la luz en las regiones violeta y azul de los
espectros. Si tuviera que brillar una luz violeta o azul a través de una muestra de aceite de oliva
virgen extra, vería que el aceite se vuelve rojo. La intensidad del color rojo es una indicación de
cuánta clorofila hay en el aceite de oliva.

14. Brille la luz de una linterna UV a través de una cubeta que contenga aceite de oliva virgen
extra. ¿La muestra que es golpeada por la luz se vuelve de color rojo? Repita esta prueba para
el aceite de oliva regular, aceite de oliva ligero y su desconocido. ¿Podría usar este método para
determinar si una muestra de aceite de oliva es realmente aceite de oliva virgen extra? ¿Podría
usar este método para determinar el grado de cualquier muestra de aceite de oliva?

La espectroscopía de fluorescencia es otro método que puede usarse para determinar la calidad
del aceite de oliva. En la espectroscopía de fluorescencia, una muestra puede ser "excitada" con
una longitud de onda de luz elegida y la fluorescencia resultante de la muestra se puede medir
y cuantificar. El SpectroVis Plus de Vernier Software & Technology se puede utilizar para este
propósito.

15. Siga las instrucciones a continuación para medir la fluorescencia de todas sus muestras de
aceite de oliva con SpectroVis Plus.

a. Use un cable USB para conectar el espectrómetro a su computadora. Elija Nuevo en el menú
Archivo.

b. Coloque la cubeta que contiene el aceite de oliva virgen extra en la ranura de la cubeta del
espectrómetro.

C. Elija Cambiar unidades ► Espectrómetro en el menú Experimento y seleccione Fluorescencia

405 nm.

d. Elija Configurar sensores ► Espectrómetro en el menú Experimento y cambie el tiempo de

muestra a 150 ms.

e. Haz clic en RECOGER. Se mostrará un gráfico de espectro completo de la fluorescencia del

aceite. Tenga en cuenta que un área del gráfico contiene un pico a aproximadamente 675 nm.
Este pico es de clorofila. Haz clic en STOP.

16. Ajuste el tiempo de muestra para aumentar o disminuir el tamaño del pico fluorescente.
Si el pico

la intensidad es superior a 1, disminuya el tiempo de muestreo en 10 ms y recoja un nuevo

espectro fluorescente. Continúe disminuyendo el tiempo de muestreo hasta que el pico sea
completamente visible. Si el pico fluorescente es inferior a 0,3, aumente el tiempo de muestra
en 10 ms y recoja un nuevo espectro fluorescente. Continúe aumentando el tiempo de la
muestra hasta que la amplitud fluorescente máxima para la clorofila sea superior a 0,8.

17. Una vez que tenga un buen pico, almacene sus datos seleccionando Almacenar última
ejecución en el menú Experimento.

18. Recolecte espectros completos de las muestras de aceite de oliva restantes. No ajuste el
tiempo de muestra.

19. Guarde sus archivos de experimento.

ANÁLISIS DE LOS DATOS

Parte I Comparación de tres grados de aceite de oliva e identificación de un desconocido

1. Describa el gráfico de cada una de las soluciones estándar de aceite de oliva. Enfatice las
diferencias entre cada grado de aceite de oliva, identificando los picos de absorbancia y otras
características distintivas.

2. Compare los espectros de absorbancia de los tres grados de aceite de oliva con el gráfico de
muestra en la Figura 1. ¿Qué evidencia hay de que el aceite de oliva virgen regular y extra
contiene clorofila mientras que el grado de aceite ligero no?

3. Identifique su aceite de oliva desconocido como virgen extra, regular o ligero. Explica tu
elección.

Parte II Comparación de la concentración de clorofila del aceite de oliva virgen regular y extra

4. ¿Qué grado de aceite de oliva, regular o extra virgen, contiene la mayor cantidad de
clorofila?

Use sus gráficos de espectro de absorbancia para especular la cantidad de clorofila que
contiene un grado en comparación con el otro.

Parte III Espectroscopía de fluorescencia de clorofila en aceite de oliva

5. Compare los espectros fluorescentes de los tres grados de aceite de oliva. El pico que es
visible a aproximadamente 675 nm es de clorofila. ¿Qué muestra tiene el pico más grande en
esta región?

6. Usando la fluorescencia de las muestras conocidas de aceite de oliva como sus estándares,
determine la calidad de su muestra desconocida de aceite de oliva.

7. Compare sus resultados usando espectroscopía fluorescente con sus resultados usando
espectroscopía tradicional. ¿Es un método mejor que el otro?

Experimento 4

CARACTERÍSTICAS DE RENDIMIENTO DE UN ESPECTROFOTÓMETRO o

Objetivo: Investigar varias características de un espectrofotómetro comercial y comparar

diferentes materiales de cubetas.
Introducción: espectroscopía En este experimento, se familiarizará con las diferentes
características de los espectrofotómetros comerciales ultravioleta-visibles (UV / vis). Los
prefijos ultra e infra significan arriba y abajo, respectivamente. Por lo tanto, la energía de la
radiación ultravioleta se encuentra justo por encima de la luz violeta visible (es decir,
ultravioleta significa por encima de la luz violeta visible en energía). Del mismo modo,
infrarrojo significa debajo de la luz roja visible en energía. Debido a que el rango de energía
para un análisis UV típico está justo al lado del rango de energía de la luz visible, muchos
instrumentos, incluido el nuestro, funcionan tanto en las regiones UV como visibles. En este
período de laboratorio, aprenderá cómo preparar muestras para el análisis y cómo obtener
datos del instrumento UV-Vis. Las muestras son compuestos que pueden encontrarse en
explosivos. Son nitroaromáticos o compuestos que contienen grupos nitro (-NO2) unidos a un
anillo aromático. En este caso, el anillo aromático es tolueno. Examinará la salida del
instrumento en la región de longitud de onda entre 200 y 900 nm (nanómetros). Un
nanómetro es 1 x 10-9 metros. Antecedentes de la teoría de la absorción UV13 En términos
de energía, la región IR se encuentra debajo de la región visible, que se encuentra debajo de
la región UV. Por lo tanto, el IR es lo suficientemente fuerte como para hacer que los átomos
dentro de una molécula vibren, pero no lo suficientemente fuerte como para hacer que los
electrones cambien las ubicaciones orbitales. La radiación UV entre 200 y 400 nm es lo
suficientemente fuerte como para hacer que los electrones sueltos cambien de ubicación.
Estos electrones pueden ser electrones que no se unen (n-electrones) de aldehídos o cetonas,
o pueden ser los electrones of de los sistemas conjugados . La Figura 1 muestra estructuras
típicas de compuestos que contienen n-electrones.

La Figura 2 muestra compuestos que contienen sistemas conjugados.π

La espectroscopía ultravioleta es una de varias formas de espectroscopía que estudiaremos
este semestre. En consecuencia, es importante que comprenda las capacidades y limitaciones
de cada una de estas formas de espectroscopía. Las palabras espectroscopía y espectrometría
tienen diferentes significados. Un espectroscopio es un instrumento, y la espectroscopía es el
uso de un espectroscopio. La espectrometría significa la medición de un espectro.
Generalmente se miden longitudes de onda o frecuencias, o un espectro de ellas. Utilizaremos
el espectro electromagnético para obtener información sobre las moléculas orgánicas.

El modificador ultravioleta significa que la información provendrá de una región específica del
espectro electromagnético llamada región ultravioleta. El espectro electromagnético incluye
toda la radiación que viaja a la velocidad de la luz c (3 x 1010 cm / seg). El espectro
electromagnético incluye ondas de radio, que tienen longitudes de onda largas, rayos X, que
tienen longitudes de onda cortas y luz visible, que tiene longitudes de onda entre las ondas de
radio y los rayos X. Todas estas ondas viajan a la velocidad de la luz. Normalmente describimos
estas ondas en términos de su energía. De los tres tipos mencionados, los rayos X son más
energéticos, luego la luz visible y las ondas de radio menos energéticas. Por lo tanto, cuanto
más corta es la longitud de onda, mayor es la energía de una onda electromagnética.

La radiación electromagnética (EMR) tiene una naturaleza dual; Tiene las características de
ondas y partículas. Ambas formas de EMR son importantes. De la naturaleza ondulatoria de
las olas obtenemos la longitud de onda ( ) o la distancia entre dos crestas. La longitud de onda
está relacionada con la frecuencia ( ), cuántas longitudes de onda pasan un punto dado en un
tiempo dado, por la velocidad de la onda c. De la naturaleza particulada de EMR, obtenemos
la energía E de una onda dada, que es proporcional a su frecuencia. La constante h de Plank
convierte la proporcionalidad en una ecuación. Las relaciones matemáticas entre estas
variables se muestran a continuación.