MACROMOLECULAS DE LA LEVADURA

Sandra Lorena Realpe1, Ingrid Alejandra Briñez2, Ana María Lasso.3

Facultad de Ciencias Básicas, Departamento de Química, Universidad Santiago de Cali
Laboratorio de Bioquímica
Lorena.realpe@gmail.com, Ibrinez23@gmail.com. analasso82@hotmail.com
Febrero 2015

RESUMEN:
Con el fin de separar las macromoléculas (proteínas, ácidos nucleicos y el glucógeno)
presentes en la levadura Saccharomyces cerevisiae se trituro la levadura con arena y se
centrifugó. Se determinó la presencia de cada una de las macromoléculas mediante
diferentes pruebas cualitativas.
Se utilizó la prueba de Lugol para identificar el glucógeno el cual mostró un color marrón
rojizo, para los ácidos nucleicos se añadió orcinol el cual produjo un color verdoso,
mientras que para la determinación de la presencia de proteínas, se llevó a cabo la prueba
de Biuret dando un color violeta; todos estos colores obtenidos son positivos para
demostrar la presencia de estas macromoléculas en la levadura.

PALABRAS CLAVE: levaduras, macromoléculas, centrifugación, pruebas cualitativas

ABSTRACT:
In order to separate the macromolecules (proteins, nucleic acids and glycogen) in the yeast
Saccharomyces cerevisiae was triturated with sand and centrifuged. The presence of each
of the macromolecules by different qualitative tests was determined.
Test iodine was used to identify glycogen which showed a reddish brown color, for nucleic
acids was added orcinol which was a greenish color, while for determination of the
presence of proteins, was performed testing biuret giving a violet color; all these colors
obtained are positive to demonstrate the presence of these macromolecules in yeast.

KEYWORDS: yeast, macromolecules, centrifugation, qualitative tests

________________________________________________________________________
INTRODUCCION
En la naturaleza existen moléculas de
gran tamaño, altamente organizadas que
contienen de docenas a millones de
átomos de cualquier célula. (Tapia, 2006)
de carbono llamadas macromoléculas.
Estas moléculas gigantes constituyen una
parte importante de la masa
Estas macromoléculas en su estructura
van formando polímeros originados en
reacciones repetitivas de pequeñas
unidades moleculares más simples
(monómeros). El proceso por el cual un
monómero se convierte en polímero se
llama polimerización. (Ege, Quimica
Organica, 1998)
Entre las moléculas de gran tamaño con
funciones biológicas se encuentran las
proteínas, la celulosa, la lignina, los
ácidos nucleicos, el ADN y el ARN.
Una de las macromoléculas más
importantes de la vida es la del ácido
nucleico, son biomoléculas portadoras de
la información genética y tienen una
estructura polimérica, cuyas unidades
monoméricas que se repiten no son
todas iguales. El ADN y el ARN también
constan de nucleótidos con estructuras
distintas dispuestos en la cadena en
distintos órdenes. (Ege, Quimica
Organica, 1998)
Los ácidos nucleicos tienen al menos dos
funciones: trasmitir las características
hereditarias de una generación a la
siguiente y dirigir la síntesis de proteínas
específicas.
Los polimeros tienen una gran
importancia en la sociedad industrial
moderna y se usan para hacer
practicamente cualquier cosa, desde
utencilios domesticos hasta protesis del
cuerpo humano.
Las levaduras están agrupadas en unas
350 especies, lo que muestra que dentro
de los hongos constituyen un pequeño
grupo. Las levaduras son bastantes
heterogéneas en su morfología y
fisiología; sin embargo, la forma habitual
en que se les encuentra es la unicelular.
Desde el punto de vista industrial son
muy importantes porque muchas de las
especies pueden convertir los azucares
en alcohol etílico y CO2, como también
debido a su alto contenido de proteínas
es utilizada en la industria de la
panificación. (Peñaranda, 2003)
Hoy en día con los múltiples avances
científicos se pueden aprovechar las
diferentes propiedades físicas y químicas
de las macromoléculas como el tamaño
molecular, la solubilidad, la densidad, las
cuales pueden ser modificadas o
alteradas mediante el cambio de pH, la
carga eléctrica o la adición de agentes
quelatantes los cuales son utilizados en
las técnicas de separación y
centrifugación. La decantación es una
técnica de separación que aprovecha la
diferencia de densidades, (mezcla solido-
líquido y líquidos no miscibles)
generalmente el sólido es más denso que
el líquido por lo cual se deposita en el
fondo del recipiente. (Giraldo, 2009)
La centrifugación es una técnica de
separación que se utiliza para aislar o
concentrar partículas suspendidas en un
líquido aprovechando la diferente
velocidad de desplazamiento según su
forma, tamaño o peso al ser sometidas a
una fuerza centrífuga. La fuerza
centrífuga es la que se ejerce sobre un
cuerpo cuando éste gira alrededor de un
eje. (otros, 2015)
La separación por centrifugación y las El resultado obtenido constaba de un
pruebas cualitativas de macromoléculas sobrenadante que contenía
son técnicas útiles y rápidas para la glucógeno y un precipitado
identificación de las mismas. Estas contenida ácidos nucleicos, estos se
técnicas son básicas para cuando se conservaron en el tubo de centrifuga
desea un resultado rápido para un y se dejaron en hielo.
posterior estudio más detallado o la El sobrenadante se depositó en un
cuantificación de algunas de estas tubo de ensayo al cual se le
macromoléculas. agregaron 2 volúmenes de alcohol
etílico para que se precipitara, se
Se utilizó la levadura Saccharomyces ssp agito y se enfrió en un baño de hielo.
con el fin de cualificar las El contenido de este se centrifugó a
macromoléculas presentes en ella, para 3000 rpm.
esto se utilizó las técnicas de separación El sobrenadante se descartó y el
de centrifugación y decantación. precipitado se la adiciono 1ml de
agua destilada. A este se le agrego
1ml de reactivo lugol, y a otro tubo
PARTE EXPERIMENTAL que contenía 1ml de agua destilada
el cual fue utilizado como control
1.1 Obtención de ácidos nucleicos también se le agrego el reactivo.
(precipitado) y glucógeno
(sobrenadante).
1.3 Identificación cualitativa de ácidos
En un mortero se colocó una nucleicos (ARN)
cantidad equivalente a una Al precipitado obtenido en la primera
cucharadita de levadura de centrifugación que contenía ácidos
panadería (Saccharomyces nucleicos y proteínas se le agrego 15
Cereviciae) a esto se le agregó una ml de cloruro de sodio al 10% y se
cucharadita de arena lavada y seca. agito, posteriormente se puso en un
Se trituró por 5 minutos baño de agua hirviendo durante 10
cuidadosamente, se le adicionó 15 minutos; se dejó enfriar y se llevó a
ml de ácido tricloroacetico al 5% y se la centrifuga a 3000rpm durante 3
continuó con la maceración por tres minutos.
minutos más. El sobrenadante que contenía ácidos
Se dejo asentar la arena y se decantó nucleicos se pasó a un tubo de
la solución lechosa en un tubo, el ensayo y el precipitado se dejó en un
cual fue llevado a la centrifuga a baño de hielo, a este sobrenadante
3000 revoluciones por 5 minutos se le adiciono dos volúmenes de
etanol frio lentamente, se agito
sobre un baño de hielo durante 3
minutos, posteriormente se
1.2 Identificación cualitativa del centrifugo a 3000rpm durante 3
Glucógeno. minutos, el sobrenadante obtenido
se descartó y el precipitado se
 disolvió en 2ml de amortiguador levadura produce un rozamiento
salino. suficiente entre las paredes de la célula
Este tubo y otro que contenía logrando la desintegración de la misma.
amortiguador salino (control) se les Este método se utilizó en 1897 en la
agrego reactivo orcinol y se llevaron preparación de un jugo de levaduras.
a un baño de agua hirviendo durante (Tapia, Bioquimica de los procesos
algunos minutos. metabolicos, 2006)
A la mezcla anterior se le adicionó cierta
cantidad de ácido tricloroacetico y con
1.4 Identificación cualitativa de ayuda de maceración se formó una
proteínas. suspensión lechosa y viscosa (ver
ilustración 1)
Se tomó el tubo de ensayo que fue
puesto en hielo anteriormente y que
contenía proteínas coaguladas y se le
agrego 2ml de solución salina 0.15
M, en otro tubo de ensayo se agregó
2 ml de solución salina 0.15M
(control) y se les agrego a cada tubo
1ml de sulfato de cobre y 2ml de
hidróxido de sodio 10M (reactivo de
biuret), se mezcló y observó el
cambio de color.
Ilustración 1. Maceración de la levadura
DATOS Y RESULTADOS:

Tabla 1 Resultados obtenidos

Debido a que el ácido tricloroacético
Macromolécula Prueba Observación Interpretación juega un papel importante en la
Positivo precipitación de macromoléculas tales
Color pardo
Glucógeno Lugol presencia de como proteínas, DNA y RNA (Maribel De
rojizo
glucógeno
Gouveia, 2013), este se utilizó para
Positivo permitir la separacion del glucógeno de
Ácidos nucleicos Orcinol Color verde presencia de
ácidos nucleicos
los ácidos nucleicos y proteínas. Gracias a
su parte apolar el ácido tricloroacético se
Positivo
Proteínas Biuret Color violeta presencia de
convierte un buen solvente para el
proteínas glucógeno puesto que solubiliza de dicho
carbohidrato las cadenas carbonadas.
ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS: Por otro lado su parte carboxílica forma
puentes de hidrogeno con los grupos OH-
Para separar e identificar las de la macromolécula aumentado su
macromoléculas presentes en la solubilidad.
levadura, estas se deben liberar primero
de las células que las contienen, para ello Una vez realizada la lisis celular,
se utilizó arena la cual al frotar con la mediante centrifugación se obtuvo en la
fase líquida las sustancias solubles en el
ácido tricloroacético (glucógeno) y en la
fase sólida las proteínas y ácidos
nucleicos precipitados por su elevado
peso molecular. Ver ilustración 2.
Ilustración 2. Separación de fases primera
centrifugación
El sobrenadante que fue decantado y
llevado a otro tubo de ensayo es el
glucógeno el cual es un polímero grande
de la glucosa, ramificado de
glucopiranosas unidas mediante enlaces
O-glicosídicos α-1,4 que, cada 10
residuos aproximadamente, tiene una
ramificación -1,6. Las ramificaciones
sirven para aumentar la solubilidad del
glucógeno y hacer más accesibles al agua
las unidades del azúcar.
Es la forma principal de glucosa en los
animales. (Balears, 2013)
Ilustración 3. Esquema de la estructura de la
Glucógeno (Balears, 2013)
Al glucógeno aislado se le adicionó etanol
en frio, el cual se utilizó para eliminar el
exceso de agua y los monosacáridos que
por su menor peso molecular son
solubles en agua, obteniendo así, un
precipitado con un alto grado de pureza.
El etanol posee un Hidroxilo OH- que le
confiere propiedades intermoleculares
para formar puentes de hidrógeno con
los O del glucógeno, llevándolo a
solubilizarse. Para evitar estas
interacciones se trabajó a bajas
temperaturas. Además también se quiere
evitar que la constante dieléctrica
aumente con el aumento de la
temperatura y a temperaturas bajas la
energía cinética es menor.
Después de centrifugar y decantar
nuevamente la solución que contenía el
glucógeno, el sólido obtenido se disolvió
en medio acuoso en un tubo de ensayo y
se procedió a realizar la identificación
mediante la prueba de Lugol, esta prueba
también se realizó a un blanco con el fin
de comparar los colores obtenidos.
El tubo con la solución problema tomo
una coloración pardo oscura diferente a
la coloración oscura de la solución de
referencia; indicando que el precipitado
obtenido es el glucógeno. Debido a que
el Lugol da con el almidón color azul y
con el glucógeno color rojo caoba
(Ver Ilustración 4)
Ilustración 4. Prueba de yodo
La molécula de yodo, I2, está formada por
dos átomos de yodo unidos con enlace
covalente y como consecuencia de su
carácter apolar, el yodo es prácticamente
insoluble en agua. Después de añadir
agua sobre el yodo y comprobar que no
se disuelve se le añade yoduro potásico
que se une con el yodo formando el
compuesto KI3 que ya es soluble en agua
porque tiene carácter iónico (formado
por el catión potasio y el anión
triyoduro), y dando una disolución de
coloración rojiza que es lo que se conoce
como reactivo de Lugol o “disolución
yodurada de yodo” (Manuela Martin
Sanchez, 2012)
Ilustración 5.Estructura de Lewis para las
especies de yodo (Manuela Martin Sanchez,
2012)
El color que dan los polisacáridos con el
Lugol se debe a que el I2 ocupa espacios
vacíos en las hélices de la cadena de
unidades de glucosa, formando un
compuesto de inclusión que altera las
propiedades físicas del polisacárido,
especialmente la absorción lumínica.
Esta unión del I2 a la cadena es
reversible, y por calentamiento
desaparece el color, que al enfriarse
reaparece.
La formación de estos complejos
coloreados depende de la estructura del
polisacárido. Es por esto que con el
almidón, de estructura lineal, el
compuesto obtenido es de color azul
mientras para el glucógeno que tiene
estructura ramificada el color es rojizo.
(Manuela Martin Sanchez, 2012)
Identificación cualitativa de ácidos
nucleicos (ARN)
Los ácidos nucleicos son compuestos
nitrogenados de elevado peso molecular
que se encuentran en las células
asociados con proteínas. Los complejos
ácido nucleico-proteína se conocen con
el nombre de núcleo-proteínas, que
pueden separarse en sus componentes
(proteínas y ácidos nucleicos) al ser
tratados con ácidos o con
concentraciones altas de sales.
(Bioquimica, 2015)
Al precipitado de proteínas y ácidos
nucleicos obtenidos en el paso 1.2 se le
adicionó una solución polar de cloruro de
sodio, con el fin de eliminar las fuerzas
electrostáticas y hacer más insoluble las
proteínas para sepáralas de los ácidos
nucleicos.
En disolución acuosa, los residuos
hidrofóbicos de las proteínas se
acumulan en el interior de la estructura,
mientras que en la superficie aparecen
diversos grupos con carga eléctrica, en
función del pH del medio. Los dipolos del
agua se orientan conforme a la carga
eléctrica de cada grupo, de tal manera
que la proteína presenta una capa de
solvatación formada por el agua de
hidratación, que es el agua retenida por
las cargas eléctricas de la superficie de
las proteínas. (Propiedades de las
proteinas)
Al añadir una sal muy soluble se
disminuye la concentración efectiva del
agua modificando la interacción de la
proteína con el disolvente produciendo
así, la neutralización de las cargas
eléctricas de tipo de repulsivo o la
ruptura de los puentes de hidrogeno,
facilitando de esta manera la agregación
intermolecular y produciendo la
precipitación de la proteína.
Además de la adición de fuerzas iónicas
se calentó para desnaturalizarla proteína,
es decir, perder su estructura de orden
superior (secundaria, terciaria y
cuaternaria) conservando intacta la
primaria. El calor incrementa la cinética
de las moléculas individuales, los enlaces
de su estructura se rompen, aumenta la
viscosidad y disminuye el coeficiente de
difusión.
Por otro lado los ácidos nucleicos tienen
dentro su estructura grupos fosfatos que
reaccionan para formar fosfatos de sodio
confiriéndole a la molécula polaridad y
mayor solubilidad en la solución. En
complemento el Nitrógeno de las bases
nitrogenadas del ácido nucleico
presentan electrones de no enlace los
cuales interaccionan con los iones Na+
aumentando de esta forma su
solubilidad.
Los ácidos nucleicos no se sedimenta,
porque al desnaturalizarse no se rompen
los enlaces covalentes entre el azúcar y la
base nitrogenada, pero si se abre la
estructura duplohelicoidal.
(Macromoleculas, 2015)
Se dejó enfriar a temperatura ambiente,
medio en el cual aumento la interacción
entre las proteínas desnaturalizadas,
gracias a su estructura primaria que
contiene la información necesaria y
suficiente para adoptar niveles
superiores de estructuración, a esta
temperatura comenzó a ocurrir la
formación de coloides que aumentaron
su tamaño en cuanto entraron en
contacto entre si y por último se
sedimentaron.
Se procedió a centrifugar, con el fin de
obtener una solución heterogénea, es
decir la separación de los ácidos
nucleicos y las proteínas. Se decantó el
sobrenadante que contenía los ácidos
nucleicos a otro tubo de ensayo y el
precipitado que contenía las proteínas se inicial, tal como se muestra en la
dejó en baño de hielo con el fin de ilustración 7.
garantizar una mayor precipitación de
estas moléculas.

Los ácidos nucleicos se precipitaron con

la adición de dos volúmenes de etanol
frio, debido a que el alcohol presenta
grupos OH- estos solubilizan ciertos
grupos de fosfatos y bases nitrogenadas,
el proceso de solubilización se ve
favorecido por la disminución de
temperatura en la que se realiza el
procedimiento.
Ilustración 7. Prueba de Orcinol
Después de unos minutos se procedió a
realizar una última centrifugación,
sedimentando un compuesto de color
amarillo el cual corresponde a los ácidos Mediante esta prueba se evidencio la
nucleicos. (Ilustración 6) presencia de la pentosa del DNA y RNA
en la levadura. El ácido sulfúrico hidroliza
las uniones fosfodiester y N-glicosídicas,
liberando ribosa, bases púricas,
pirimidínicas y ácido fosfórico.
La pentosa en medio ácido se deshidrata
originando furfural que reacciona con el
orcinol dando un producto verde que
demuestra la presencia de DNA y RNA.

Ilustración 6. Separación de ácidos nucleicos

El precipitado se disolvió en
amortiguador salino para regular el pH y
mantener un estado iónico óptimo de las
moléculas. Con la ayuda de un blanco se
adicionó el reactivo de orcinol y se
procedió a calentar en baño de agua
hasta la evidencia de un color, la muestra
mostro un color verde y para el blanco Ilustración 8. Reacción del Orcinol
no se presentó mayor cambio en el color

Por último se realizó el análisis cualitativo
al precipitado que contenía las proteínas
coaguladas, utilizando el reactivo de
Biuret.
Sé agregó 2 ml de solución salina al
0.15M para redisolverlas, Posteriormente
se adicionó 1ml de solución de sulfato de
cobre y 2 ml de hidróxido de sodio 10 M,
este procedimiento también se realizó a
un blanco. Se observó que la muestra
presento un color violeta
comparación con el blanco que no
presento cambio de color, lo que nos
indica la presencia del enlace peptídico
de las proteínas por lo tanto se dice que
la prueba fue positiva, ver Ilustración 9.
KOH). La reacción se basa en la
formación de un compuesto de color
violeta, debido a la formación de un
complejo de coordinación entre los iones
Cu2+ y los pares de electrones no
compartidos del nitrógeno que forma
parte de los enlaces peptídicos, el
hidróxido de sodio no participa en la
reacción, sino que proporciona el medio
alcalino para que se forme el complejo.
en

Ilustración 10 Reacción del reactivo de Biuret

Ilustración 9. Prueba de Biuret

En las proteínas, los aminoácidos están

unidos uno seguido de otro, sin
ramificaciones, por medio del enlace
peptídico, la prueba de Biuret detecta la Ilustración 11. Complejo formado
presencia de estos enlaces peptídicos y
es positiva cuando están presentes dos o
más, por lo cual la presencia de proteínas PREGUNTAS:
en una mezcla se puede determinar 1. Cuáles son los fundamentos de las
mediante esta prueba. (Macromoleculas, técnicas de extracción (Cuál es la utilidad
2015) (Catedras quimica, 2015) de cada uno de los pasos que se sigue y
de cada uno de los reactivos que se
El reactivo de Biuret contiene CuSO4 en utiliza para purificar las macromoléculas
solución acuosa alcalina (de NaOH o
y de las pruebas de identificación
empleadas en esta práctica.
La extracción con disolventes es la
técnica de separación de un compuesto a
partir de una mezcla sólida o líquida,
aprovechando las diferencias de
solubilidad de los componentes de la
mezcla en un disolvente adecuado.
Constituye una de las técnicas de
separación de compuestos más utilizada
en el laboratorio químico; La separación
de un compuesto por extracción se basa
en la transferencia selectiva del
compuesto desde una mezcla sólida o
líquida con otros compuestos hacia una
fase líquida (normalmente un disolvente
orgánico). El éxito de la técnica depende
básicamente de la diferencia de
solubilidad en el disolvente de extracción
entre el compuesto deseado y los otros
compuestos presentes en la mezcla
inicial. (operaciones basicas de
laboratorio de quimica)
núcleo y así dejar expuestos los ácidos
nucleicos ya que el sodio ayuda a
precipitar proteínas, lípidos y restos de
membranas; el etanol frio es agregado
con el fin de precipitar los ácidos
nucleicos, ya que estos son insolubles en
alcohol. El reactivo orcinol da positivo en
identificación de ARN ya que las
condiciones acidas de este hidrolizan el
ácido nucleico y las ribosas libres, darán
positivo;
El reactivo biuret da positivo para
proteínas, esto se debe a que este
identifica enlaces peptídicos y no
aminoácidos.
2. Escriba las reacciones químicas
correspondientes de las diferentes pruebas
de identificación utilizadas.
REACCIÓN DE BIURET

La maceración es la forma mecánica en la

que se rompen las paredes celulares, el
ácido tricloroacético se utiliza para
precipitar proteínas y ácidos nucleicos,
de esta manera al centrifugar obtenemos
una separación entre el glucógeno
(sobrenadante) y las proteínas y ácidos
nucleicos (precipitado). El alcohol etílico REACCIÓN CON ORCINOL
se utiliza para separar el glucógeno de los
monosacáridos y otros compuestos
hidrosolubles, por precipitación, ya que
los polisacáridos son menos solubles en
alcohol acuoso que los monosacáridos,
de esta manera después de centrifugar
obtendremos los polisacáridos en el
precipitado.
El cloruro de sodio y el calor son
utilizados para romper la membrana del

CONCLUSIONES:
 La centrifugación es una técnica
efectiva para separar
macromoléculas que por su
densidad tienden a sedimentarse.
 Debido a las propiedades físicas y
químicas que presenta las
macromoléculas presentes en la
levadura se pudo realizar la
técnica de separación por
decantación y centrifugación.
 La temperatura y el pH juegan un
papel muy importante en las
diferentes reacciones de
extracción de las macromoléculas
de la levadura debido a que
modifican el medio de reacción
afectando de esta manera el
proceso.
 Mediante las pruebas cualitativas
se identificó las diferentes
macromoléculas (glucógeno,
ácidos nucleicos, proteína)
presentes en la levadura
Saccharomyces cerevisiae.
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