FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

TECNOLOGÍA MÉDICA
MORFOFISIOPATOLOGÍA Y CITODIAGNÓSTICO
ANÁLISIS TISULAR I

BASES DE LA COLORACIÓN
TM Isabel Gómez
30-04-2019
 INTRODUCCIÓN
 En general, los tejidos son incoloros.

 Pueden adquirir el color de un pigmento si es que

están asociados a este (melanina, hemoglobina,
bilirrubina)

 Anton Van Leeuwenhoek utilizó azafrán disuelto en

vino para teñir fibras musculares (1714).

 Felice Fontana, uso de soluciones ácido-base unidas

a colorantes, logró la visualización de los núcleos y
nucléolos (1781).
 INTRODUCCIÓN
El fundamento de cualquier método de coloración tiene como base la propiedad que
poseen los tejidos para incorporar y fijar de modo variable diversas sustancias
coloreadas llamadas colorantes.
 INTRODUCCIÓN
Una tinción es un procedimiento para visualizar un tejido que puede implicar el uso de
uno o varios colorantes de modo simultáneo o sucesivo.

PAP H-E Masson Verhoeff-VG

 PERCEPCIÓN VISUAL
La retina humana es capaz de percibir las longitudes de onda presentes en el espectro
de luz visible (400 a 750 nm de longitud de onda).
 PERCEPCIÓN VISUAL
Un compuesto químico es coloreado porque sus moléculas absorben cuantos de
radiación electromagnética en la parte visible del espectro.
 COLORANTES
Sustancia que puesta en contacto con un soporte adecuado, se une a él de forma
perdurable “transmitiéndole” su color.

Red And White Blood Cells, Sem

Human red and white blood cells, coloured
scanning electron micrograph (SEM).
Magnification x5290 at an image size of 10
cm wide.
 COLORANTES: Clasificación
Se pueden clasificar bajo diversos criterios según:

1) Origen: Naturales (Carmín, Hematoxilina); Artificiales, derivados de las

anilinas.

2) pH: ácidos, básicos, neutros.

3) Afinidad de tinción: nucleares y citoplasmáticos.

4) Naturaleza química: Anillos aromáticos derivados del benceno.

 COLORANTES

El soporte químico fundamental de la

mayor parte de los colorantes
naturales y de la totalidad de los
colorantes artificiales son los anillos
aromáticos derivados del benceno.
Los dobles enlaces reordenables
permiten la gran gama de colores.
 BENCENO
Molécula de hidrocarburo aromático.
Incoloro
Puede absorber radiación del espectro UV
En las moléculas orgánicas, los dobles
enlaces se alternan con enlaces sencillos
provocando que los electrones del enlace
se muevan de un átomo al otro cambiando
las posiciones de estos.
 BENCENO
Si los dobles enlaces se fijan en una posición puede producirse una reacción química
sobre éste.
El derivado bencénico puede absorber radiación luminosa y mostrar color.
Los radicales químicos responsables de esta modificación molecular se denominan
GRUPOS CROMÓFOROS.
 BENCENO

Cromóforo + = CROMÓGENO

No todos los cromógenos son colorantes.

En determinadas condiciones un colorante puede perder la capacidad
de absorber cuantos.
Lo anterior ocurre cuando el cromóforo es reducido hasta un
leucoderivado.
El color puede reaparecer al re-oxidar la molécula.
PRINCIPALES GRUPOS CROMÓFOROS
 CAPACIDAD DE UNIÓN
Para que el colorante pueda teñir un tejido debe ser capaz de unirse a las estructuras
celulares.
El elemento químico que le confiere esta capacidad se denomina grupo Auxocromo.
 CAPACIDAD DE UNIÓN
La transformación del cromógeno en colorante está relacionada con la adición sobre la
molécula aromática de otros grupos atómicos que le entreguen la capacidad de
disociarse electrolíticamente o de formar sales con los tejidos.
 ALGUNOS GRUPOS AUXOCROMOS DE RELEVANCIA

HIDROXILO CARBONILO AMINO SULFHIDRILO IONES

-OH -COOH -NH2 -SH Cr, Al, Mb

COOH

NaO3S N=N OH
 CLASIFICACIÓN SEGÚN GRUPO CROMÓGENO
CLASIFICACIÓN CROMÓGENO ASOCIADO EJEMPLO
Nitrocolorante NO2 Nitro; N=O Nitroso 2,4,6 trinitrofenol (?)
Colorante Azoico N=N Azoico Monoazoicos, diazoicos.
Antraquinona C=O Carbonilo Fast Red, Alizarin Red
Acridina C=N Imino Naranja de Acridina
Derivado de Iminas C=N Imino; C=O Carbonilo; C=S Oxacínico: Galocianina y Azul de
Tiazólico Nilo.
Tiacínico: Tionina y Azul de
Anilina.
Acínico: Rojo Neutro
Derivado de Xanteno C=O Carbonilo Eosina Y, Eosina B, Rodamina B,
Pironina B.
Derivado de Difenilmetano C=C Etileno Pararosanilina
Derivado de Ftalocianinas de C=N Imino + Cu Luxol Fast Blue
Cobre
 CLASIFICACIÓN SEGÚN GRUPO CROMÓGENO
Clasificación según Colour Index o CI: Sistema alfanumérico universal.
Abreviaturas de utilidad:

B: Azulado L: Insensible a la luz M: Mezcla R: Rojizo

Y: Amarillento G: Verdoso S: Soluble

W: Soluble en agua

Revisar Kiernan, capítulo 5.9, página 91

 CLASIFICACIÓN SEGÚN GRUPO AUXOCROMO

Los grupos auxocromos son capaces de entregar la carga eléctrica a la

molécula de colorante. Lo anterior, además, depende del pH de la solución
y concentración del colorante.

HIDROXILO CARBONILO AMINO SULFHIDRILO IONES

-OH -COOH -NH2 -SH Cr, Al, Mb
Carga (-) Carga (-) Carga (+) Carga (-) Al (+)
Cr (+)
 CLASIFICACIÓN SEGÚN GRUPO AUXOCROMO
COLORANTES BÁSICOS O CATIÓNICOS (+):
Cromógeno de baja intensidad y débilmente ácido + grupos
auxocromos catiónicos fuertemente básicos.
Responsables de la carga global.
Útiles para teñir estructuras ácidas.
Núcleos y carbohidratos ácidos.
Soluciones ácidas favorecerán la formación de cationes.
Azul de Toluidina, azul de metileno, safranina, tionina.
CLASIFICACIÓN SEGÚN GRUPO AUXOCROMO

TIMO, con azul de toluidina.

 CLASIFICACIÓN SEGÚN GRUPO AUXOCROMO

COLORANTES ÁCIDOS O ANIÓNICOS (-):

Cromógeno de baja intensidad y débilmente básico + grupos
auxocromos fuertemente ácidos.
Responsables de la carga global.
Útiles para teñir estructuras básicas.
Citoplasma.
Eosina Y, Eosina B, Pironina.
CLASIFICACIÓN SEGÚN GRUPO AUXOCROMO
 CLASIFICACIÓN SEGÚN GRUPO AUXOCROMO
COLORANTES NEUTROS:
Se producen por la unión de carácter salino entre colorantes ácidos y básicos para
formar un precipitado.
Comúnmente insolubles en agua, solubles en alcoholes.
Propiedad para colorear conjunta o separadamente diversas estructuras.
Lo anterior depende de su capacidad de atrapar alguno de los iones generados a
partir de la disociación de la sal tras ser inestabilizada en solución acuosa.
Las estructuras adquieren una tonalidad policroma.
Giemsa.
CLASIFICACIÓN SEGÚN GRUPO AUXOCROMO
 CLASIFICACIÓN SEGÚN APETENCIA TISULAR
COLORANTES INDIFERENTES (HIDROFÓBICOS):
Son aquellos que no poseen ninguna de las características
anteriormente descritas.

Colorean los tejidos a través de un mecanismo por impregnación física.


No se unen por afinidad, más bien se disuelven en los elementos del
tejido.

Colorantes para lípidos (LISOCROMOS).

CLASIFICACIÓN SEGÚN APETENCIA TISULAR
 CLASIFICACIÓN SEGÚN APETENCIA TISULAR
COLORANTES METACROMÁTICOS:

ORTOCROMASIA: Capacidad de un colorante de teñir del mismo color.

 A veces, algunas estructuras se tiñen de un color completamente
distinto al esperado.
Ej. Azul de toluidina, tiñe los gránulos de los mastocitos rojos.
El efecto se denomina METACROMASIA, y las sustratos que se tiñen de
esta manera se denominan CROMOTROPOS.
 CLASIFICACIÓN SEGÚN APETENCIA TISULAR
COLORANTES METACROMÁTICOS:

Colorantes sumamente puros.

Son, por lo general, catiónicos, teniendo afinidad por
estructuras sulfatadas.
Fenómeno producido por la polimerización entre las moléculas
del colorante adyacentes a la estructura a teñir (polianiones).
En la mayoría de los casos, el color observado en la
metacromasia, es de una longitud de onda superior a la propia
del color ortocromático del colorante.
CLASIFICACIÓN SEGÚN APETENCIA TISULAR
 CLASIFICACIÓN SEGÚN APETENCIA TISULAR
COLORANTES METACROMÁTICOS:

Los fijadores oxidantes son

incompatibles con la metacromasia.
Técnicas útiles para observar sustancias
sulfatadas, heparina, y proteoglicanos de
la matriz del cartílago y tejidos
conjuntivos.
Colorantes con moléculas planares.
Metacromasia γ y β: Rojo y púrpura
respectivamente.
CLASIFICACIÓN SEGÚN APETENCIA TISULAR
 MÉTODOS DE COLORACIÓN
• La placa se sumerge en el colorante
• Se deja actuar hasta que la coloración alcanza la intensidad adecuada.
PROGRESIVA • Control del tiempo de tinción.
• Lavados para evitar la sobretinción.

• La placa histológica se SOBRETIÑE.

• Posteriormente, se elimina el exceso de colorante utilizando
REGRESIVA diferenciadores.
• Tiempo de tinción más largo que la coloración progresiva.

• Proceso mediante el cual se extrae un colorante de una placa, posterior a

una tinción.
DIFERENCIACIÓN • Puede realizarse en agua, alcohol, ácidos, bases, soluciones metálicas y
combinaciones de estas, dependiendo del colorante utilizado.
MÉTODOS DE COLORACIÓN
 MECANISMOS GENERALES DE COLORACIÓN
Según la naturaleza de la unión molecular entre colorantes y tejidos,
existen tres mecanismos generales de coloración, los que a su vez se
pueden combinar entre si.
1. MECANISMO FÍSICO

2. MECANISMO FISICOQUÍMICO

3. MECANISMO HISTOQUÍMICO
 MECANISMOS GENERALES DE COLORACIÓN
MECANISMO FÍSICO:
Propiedades de disolución e impregnación en el tejido.
El colorante es más soluble en el tejido que en el disolvente.
Impregnaciones: Precipitación selectiva forma agregados insolubles
sobre el tejido.
 MECANISMOS GENERALES DE COLORACIÓN

MECANISMO FÍSICO-QUÍMICO:

Formación de uniones intermoleculares por atracción electrostática

(cargas).
Fuerza de acercamiento que experimentan dos elementos cargados de signo contrario cuando se
encuentran a una distancia determinada. Uniones electrostáticas, fuerzas de Van der Waals,
“enlaces puente de hidrógeno”.

O por fuerzas de tensión superficial, debido a las fuerzas de gravitación

generadas al disponerse las moléculas muy próximas entre si.
MECANISMOS GENERALES DE COLORACIÓN
 MECANISMOS GENERALES DE COLORACIÓN
MECANISMO HISTOQUÍMICO:
Basado en el desarrollo de una
reacción química entre el colorante y
una biomolécula de interés.

Al interaccionar ambas moléculas, se

produce un nuevo cromógeno
responsable del color obtenido.
MECANISMOS GENERALES DE COLORACIÓN
 INTERACCIONES ENTRE COLORANTES Y TEJIDO

CONSIDERACIONES GENERALES:

1. Tamaño de las partículas del colorante:

Dada por el peso molecular. Los colorantes tienden a formar agregados.
La agregación es reversible.
Es más común en moléculas más grandes, en soluciones concentradas y
a bajas temperaturas.
Las moléculas de mayor tamaño difundirán en un componente tisular
mucho más lento que aquellas de menor tamaño.
INTERACCIONES ENTRE COLORANTES Y TEJIDO

VAN GIESON MASSON

 INTERACCIONES ENTRE COLORANTES Y TEJIDO
CONSIDERACIONES GENERALES:

2. Porosidad del sustrato:

El sustrato (tejido) consta de poros por los cuales va a difundir el

colorante.
Estos no pueden ser observados de forma directa por medio de
microscopía óptica.
Su comportamiento se ha estudiado a través del análisis de las tasas de
permeabilidad de moléculas de tamaño conocido.
 INTERACCIONES ENTRE COLORANTES Y TEJIDO
CONSIDERACIONES GENERALES:

3. Efecto interfacial:

 Consecuencia de la disminución de la tensión superficial del

agua por los solutos, incluyendo la mayoría de los colorantes.
Cuando el colorante pasa por los poros del sustrato, el
colorante se concentra en la interfaz entre las paredes del poro
y la solución.