Introducción

La inseminación artificial (IA), una de las biotecnologías de gran relevancia

que se viene desarrollando desde hace varios años y que permite un rápido
avance genético, con el mejor aprovechamiento de los sementales de
características productivas superiores. El éxito de la IA depende en gran
medida del desarrollo de diluyentes satisfactorios para el semen, el cual
debe incrementar el volumen de un eyaculado, proteger a los
espermatozoides durante el enfriamiento y prolongar su vida con un mínimo
efecto sobre la fertilidad.

La IA en caprinos es limitado en comparación con otras especies, debido

entre otros factores a la dificultad para congelar y descongelar el semen, ya
que algunos diluyentes pueden resultar tóxicos para los espermatozoides.

Actualmente en el mercado existe un número variable de diluyentes

comerciales, como; el Illini variable temperatura (IVT), Laiciphos, caprogen,
entre otros, pero dentro de los más aplicables y efectivos, considerados así
por diversos autores, tenemos a los dilutores citrato-yerna y leche
descremada-yema.

Los dilutores conteniendo yema de huevo son beneficiosos en la

preservación de la fertilidad de espermatozoides, en la protección contra el
shock por frío y variaciones de temperatura de conservación, por las
lipoproteinas y lecitinas contenidas en la yema de huevo. La leche
descremada usada como dilutor también protege del shock por frío a los
espermatozoides manteniendo su fertilidad, debido a la caseína presente en
la leche.
Marco teorico

Son preparados que ayuda a la sobrevivencia de largos periodos al esperma

eyaculado. Es la solución acuosa que permite aumentar el volumen del
eyaculado hasta conseguir las dosis necesarias, preservar las características
funcionales de las células espermáticas y mantener el nivel de fertilidad
adecuado.
Propiedades
Proveer nutrientes
Dar protección contra los efectos dañinos del enfriamiento
Acción buffer
Mantener la presión osmótica y balance electrolítico
Inhibir el crecimiento bacterial
Aumentar el volumen del semen
Proteger las células espermáticas en el congelamiento

Componentes

Azúcares

son componentes importantes en los diluyentes, ya que pueden actuar como

fuente de energía para los espermatozoides durante su almacenamiento,
como es el caso de la glucosa y de la fructuosa, o bien como críoprotector ya
que también actúan manteniendo o incrementando la presión osmótica de
manera extracelular en el espermatozoide, lo que permite mantener la
integridad de la membrana espermática al almacenamiento por un largo
período.

Sustancias buffer o amortiguadores

Actúan dando estabilidad a la membrana, ya que mantienen la tonicidad total

del diluyente, lo cual es importante cuando el semen es almacenado por
largos periodos de tiempo. El Trisaminomethane es usado como el principal
componente en el diluyente para la congelación de semen de toro, siendo
predominante una buena capacidad buffer, diurética y actividad osmótica;
así como una baja toxicidad a una alta concentración.

Sustancias orgánicas

Son las que previenen el choque por enfriamiento, por ejemplo la yema de
huevo por medio de sus lipoproteínas, fosfolípidos y lecitinas.

Yema de huevo

La yema de huevo es un ingrediente comúnmente utilizado para la

congelación ya que preserva la motilidad e integridad de las membranas del
acrosoma y mitocondrias del espermatozoide, además es un buffer
osmótico. También se ha notado que la yema de huevo protege durante la
congelación; ya que se adhiere a la membrana y la recubre, esta facultad de
protección se adjudica a la gran densidad de la fracción de lipoproteínas.

Las propiedades protectoras de la yema de huevo sobre los

espermatozoides durante la congelación fueron descubiertas por primera vez
por Philips en 1939. Posteriormente se encontró que la yema de huevo tenía
al menos dos factores activos, proteger contra el daño al enfriamiento y
ayuda manteniendo la viabilidad.

Leche descremada

Las micelas de las caseínas y la lactosa presente en la leche descremada,

son las principales responsables de disminuir los daños por enfriamiento y
congelación ya que secuestran proteínas presentes en el plasma seminal
que tras la eyaculación inducen la pérdida de colesterol y fosfolípidos de las
membranas plasmáticas

Crioprotectores

Los agentes criprotectores son los que tienen la finalidad de proteger a los
espermatozoides durante la fase de cristalización debido a las bajas
temperaturas, el glicerol es la sustancia más empleada debido a los
resultados obtenidos.

La eficiencia protectora del glicerol ha sido atribuida a su capacidad de

atrapar el agua y ayuda a que solo se lleguen a formar pequeños cristales de
hielo.

Función de los crioprotectores en los diluyentes

La función de los crioprotectores es la de proteger a las células de las

lesiones producidas por la congelación.

En la actualidad existen muchos tipos de protectores que se agrupan según

las posibilidades de penetración o no en las membranas celulares. Se cree
que los crio protectores actúan reduciendo la cantidad de hielo presente a
cualquier temperatura durante la congelación, moderando así los cambios en
la concentración de solutos.

Efectos dañinos de la crioconservación sobre el espermatozoide

La reducción de la capacidad fecundante está relacionada a dos razones

puntuales, una baja viabilidad post descongelamiento y un trastorno subletal
en una proporción de espermatozoides sobrevivientes. La baja viabilidad se
debe a factores como: cambio de temperatura, estrés osmótico, la formación
de hielo intracelular y la toxicidad. El estrés osmótico y la formación de hielo
intracelular producen una disminución de la viabilidad espermática. Esto se
 ve reflejado en la motilidad, capacitación espermática e integridad
acrosomal. Una de las principales características de los espermatozoides
crio preservados es la disminución de la proporción de células mótiles. La
motilidad post descongelamiento se reduce a valores entre 40 a 50%.

Concentrados comerciales para la elaboración de diluyentes

TRILADYL

Triladyl® es un concentrado estéril para la preparación de un diluyente con

yema de huevo para la congelación de semen bovino en un solo paso.

Triladyl® se presta también para la congelación de semen de otros

rumiantes por ejemplo ovino, caprino, ciervo etc. Su contenido en
antibióticos corresponde al estándar de la UE: EC norma 88/407.

Composición: TRIS, Ácido cítrico, Azúcar, Tampones, Glicerina, Antibióticos,

Agua de extrema pureza. 100 ml del diluyente preparado contienen
(unidades activas) Tilosina 5,7 mg, Gentamicina 28,6 mg, Espectinomicina
34,3 mg, Lincomicina 17,2 mg.

Objetivos

- Aprender ha manejar los diferentes métodos de dilución del semen.

Materiales

- Micropipeta
- Cámara de newbauer
- Calentador
- Semen de ovino
- Microscopio
- Tinción de nigrosina
- Laminas portaobjetos

Procedimiento

a. Se coloca las laminas y los cubreobjetos en el calentador, una vez que

esta a una temperatura adecuada se procede a colocar 20ug de semen
de ovino previamente colectado y 20ug de agua, se tapa con un
cubreobjeto y se lleva al microscopio

b. Se coloca 20ug de semen colectado de ovino en la cámara de newbauer se tapa con un

cubreobjeto y se lleva a microscopio.
 c. Se coloca 20ug de semen colectado de ovino, luego se coloca agua para diluir y se
mezcla, una vez realizado este procedimiento se coloca la tinción de nigrosina,
finalmente se hace un extendido de la lamina y se lleva a microscopio

Resultados

- Los resultados no fueron los esperados debido que al momento de

observar al microscopio no hubo la motilidad deseada; esto puede
deberse a que tal vez no hubo una buena conservación del semen.
Cuestionario

1. Averiguar los dilutores comerciales usados para la refrigeración o

congelación de semen en toros, caballos, carneros, verracos,
alpacas, gallos y perros. De mínimo 2 ejemplos para cada especie.

Nombre Laboratorio Uso Especie

comercial
Andromed Minutube Congelación Toro
Triladyl Minitube Congelación Toro
Duragen Magapor Refrigerado Verraco
Equex-Paste Minitube Congelación Verraco
Spectrum Violet Minitube Congelación Equino
EquiPRO MOFA Global Refrigerado Equino
CoolGuard
CaniPlus Chill Minitube Refrigerado Canino
CANIXCell IMV Refrigerado Canino
Technologies
Andromed Minitube Congelación Camelidos
OviPlus Minitube Fresco Carneros
Steridyl Minitube Congelado Carneros
Extendyl IMV Refrigerado Aves
Technologies
Magapor_1 Magapor Refrigerado Aves

2. Describa las diferentes técnicas de criopreservacion (de acuerdo

con la velocidad del congelamiento) de semen que se han
desarrollado.

Existen dos métodos:

a. En equilibrio :

 Tradicional
Los crioprotectores utilizados en esta técnica son normalmente
permeables. Los mas utilizados son glicerol y etilenglicol.
- Estándar : exposición de los embriones al medio de congelación (PBS +
G) debe realizarse a temperatura ambiente (20 – 22 ºC), en un solo
paso, de 10 a 30 minutos de duración. Este periodo incluye el envasado
de los embriones en pajuelas plásticas de 0.25cc. lo que permite realizar
rápidamente y con mayor precisión la inducción de la cristalización o
“sedding”. Las pajuelas deben ser colocadas en un equipo de
congelación a -7ºC durante 5 minutos para equilibrar la temperatura de
las pajuelas con la del equipo; el sedding se realiza poniendo en
contacto la superficie de la pajuela con una placa metalica o hisopo
enfriado con nitrógeno liquido; el agente refrigereante del equipo puede
 ser nitrógeno liquido, alcohol, etanol o metanol enfriado por medio de un
compresor.
- De un paso: se basa en el uso de un crioprotector no permeable, como
la sacarosa, que permite la moción de un crioprotector permeable, como
el glicerol. Con esta técnica, se pueden transferir los embriones
directamente a la hembra receptora sin la necesidad de una evaluación
microscópica previa a la transferencia y sin el repetido shock osmótico
que sufren las células cuando se usa el método en etapas; de esta
manera se erradica el procedimiento de dilución o extracción del
crioprotector.
- Transferencia directa: se emplean crioprotectores altamente permeables
tales como el etilenglicol o el 1,2 propilenglicol. Las pajuelas son
descongeladas y el embrión es transferido directamente al utero de las
receptoras.

b. En no equilibrio: se usa para describir la criopreservacion por

procedimeintos en los cuales las células y los tejidos mo están en
equilibrio con las altas concentraciones de crioprotectores permeables y
no permeables, antes de un enfriamiento rápido.
 Rápida: criopreservacion de células que han sido parcialmente
deshidratadas antes de ser sometidas a una tasa de enfriamiento
rápido de 1250ºC/min.
 Vitrificación: proceso físico de solidificación utilizado para conservar
órganos, tejidos y embriones

3. Mencione como actúa cada uno de los dilutores y crioprotectores

que se han mencionado en clase (guiarse del ppt)

Por diluyente entendemos la solución acuosa que permite aumentar el

volumen del eyaculado hasta conseguir las dosis necesarias, preservar
las características fundamentales de las células espermáticas y
mantener el nivel de fertilidad adecuada.
El diluyente que se añade para la congelación generalmente es del tipo
TRIS (buffer). El dilúyete debe contener sustancias ionicas o no ionicas
que mantengan la osmolalidad del medio (TRIS), una fuente lioproteina
de alto peso molecular (yema de huevo, leche descremada), una
energía como fructuosa o glucosa y un crioprotector.
Los componetes de los diluyentes:
- Azucares: actúan como fuente de energía para los espermatozoides
durante su almacenamiento, como es el caso de la glucosa y
fructuosa, o bien como crioprotector ya que también actúan
manteniendo o incrementando la presión osmótica de manera
extracelular en el espermatozoide, permite mantener la integridad de
la membrana espermática al almacenamiento por un largo periodo.
 - Sustancias buffer o amortiguadoras: actúan dando estabilidad a la
membrana, mantienen la tonicidad total del diluyente.
- Sustancias organicas: previenen el choque por enfriamiento.

Los crioprotectores son los que tienen la finalidad de proteger a los

espermatozoides, durante la fase de cristalización debido a las bajas
temperaturas, el glicerol es la sustancia mas empleada debido a los resultados
obtenidos. La eficiencia protectora del glicerol ha sido atribuida a su capacidad
de “atrapar” el agua y ayuda a que solo se lleguen a formar pequeños cristales
de hielo.

La función de los crioprotectores es la de proteger a las células de las lesiones

producidas por la congelación.