Introducción

Para que una especie bacteriana subsista debe mantener estable su ADN. La estabilidad del
ADN se puede ver afectada por errores en la replicación o, ya que el ADN es un químico, por reacciones
químicas (calor, UV, etc.)

El ADN dañado puede ser deletéreo para las células porque su ADN no puede ser capaz de
replicarse sobre el área dañada y por lo tanto las células no pueden multiplicarse. Aun si el daño no bloquea la
replicación, replicar sobre el daño puede producir mutaciones, las cuales pueden ser deletéreas o incluso
letales. Obviamente, las células necesitan de mecanismos de reparación del ADN.

Para describir el daño del ADN y su reparación, se deben definir algunos términos. El daño
químico en el ADN se denomina ​lesión​. Los compuestos químicos o los tratamientos químicos que producen
lesiones en el ADN pueden matar a la célula o pueden aumentar la frecuencia de mutaciones en el ADN. Tales
tratamientos que generan mutaciones se denominan ​tratamientos mutagénicos ​o ​mutágenos​. Algunos
mutágenos pueden ser ​mutágenos in vitro ​porque se usan para dañar el ADN en el tubo de ensayo y luego
producir mutaciones cuando el ADN se introduce en las células. Otros mutágenos pueden ser ​mutágenos in
vivo ​porque dañan el ADN dentro de la célula, por ejemplo interfiriendo con el apareamiento de bases durante
la replicación.

En este capítulo vamos a ver los tipos de daños del ADN, cómo cada tipo de daño podría
producir mutaciones, y cómo las bacterias reparan estos daños. Muchos de estos mecanismos parecen ser
universales, y parecen ser compartidos por organismos superiores, incluso en humanos.

EVIDENCIA DE LA REPARACIÓN DEL ADN

¿Cómo sabemos que las células reparan el daño del ADN? Una manera es medir la muerte
celular a través de un químico o por irradiación. Los agentes químicos y la radiación que dañan el ADN
normalmente también lo hacen sobre otros componentes celulares: ARN, proteínas. Sin embargo, el daño en el
ADN es más perjudicial porque normalmente las células tienen varias copias de un ARN o de una proteína por
lo que las moléculas que no son dañadas pueden reemplazar a las dañadas.

Para medir la muerte celular podemos comparar las células que sobreviven al ser expuestas de
manera intermitente a pequeñas dosis del agente que daña el ADN con las células que sobreviven al ser
expuestas de manera continua al agente que daña el ADN.

1. Si las células tienen sistemas de reparación del ADN, una mayor cantidad de células van a sobrevivir
durante el tratamiento intermitente porque entre cada tratamiento pueden reparar el daño

2. Si las células no tienen sistemas de reparación, no habría diferencia entre los tratamientos

Una representación gráfica de este experimento es construir una curva de muerte. Esta curva se
obtiene al graficar el número de células que sobreviven en función del tiempo de tratamiento con un agente que
daña el ADN. Las dos curvas que se obtienen se muestran en la Figura 1.11.
Ya sabemos a través del experimento anterior que las células reparar el daño del ADN. Para ello, tienen ciertos
mecanismos que le permiten hacerlo. Pero... ​¿Cómo reconocen el daño estos mecanismos?​:

1. Algunos mecanismos reconoces daños específicos. Por lo tanto se denominan mecanismos

específicos de reparación.

2. Otros mecanismos reconocen alteraciones en la estructura del ADN. Por lo tanto se denominan
mecanismos generales de reparación

Ahora bien, existen distintos mecanismos de reparación. Pero... ​¿Cómo reparan el daño del ADN?​:

1. Algunos mecanismos ​revierten el daño​. Ejemplos:

a. Fotoliasa

b. Metiltransferasas

2. Otros mecanismos ​remueven el daño ​y colocan la(s) base(s) adecuadas en el lugar del daño.
Ejemplos:

a. B.E.R

b. N.E.R

c. Sistema de reparación metil-dirigido

MECANISMOS DE REPARACIÓN ESPECÍFICOS

DESAMINACIÓN DE BASES

Uno de los tipos más comunes de daño del ADN es la ​desaminación de bases​. Algunos de los
grupos amino en adenina (A), citosina (C) y guanina (G) son vulnerables y pueden ser removidos
espontáneamente o por muchos agentes químicos (Figura 11.2). Cuando la adenina se desamina, se convierte
en ​hipoxantina​. Cuando la guanina se desamina, se convierte en ​xantina​. Cuando la citosina se desamina, se
convierte en ​uracilo​.
 La desaminación de bases es mutagénica porque da lugar a ​mispairing d ​ e bases. Como se
muestra en la Figura 11.2, la hipoxantina derivada de la desaminación de la adenina se aparea con citosina en
vez de timina, y el uracilo derivado de la desaminación de la citosina se aparea con adenina en lugar de
guanina.

El tipo de mutación provocada por la desaminación depende de qué base se altere. Por
ejemplo, la hipoxantina se aparea con citosina durante la replicación, incorporando C en lugar de T en esa
posición. En la siguiente replicación, la C se va a aparear con la G, provocando una transición AT-a-GC en el
ADN. De manera similar, un uracilo que resulta de la desaminación de citosina se aparea con una adenina
durante la replicación, provocando una transición GC-a-AT.

Agentes desaminantes

Aunque la desaminación frecuentemente ocurre de manera espontánea, especialmente a altar

temperaturas, algunos tipos de químicos reaccionan con el ADN y remueven grupos amino de las bases. El
tratamiento del ADN con estos químicos, llamados ​agentes desaminantes​, puede aumentar la tasa de
mutaciones.

1. Hidroxilamina​: Específicamente remueve el grupo amino de la citosina y como consecuencia produce

sólo transiciones GC-a-AT en el ADN. Sin embargo, la hidroxilamina es un mutágeno in vitro, por lo que
no puede ingresar a la célula y sólo puede ser usado para mutagenizar ADN purificado o virus. La
mutagénesis a través de hidroxilamina es particularmente eficiente cuando el ADN tratado se introduce en
células que son deficientes en la reparación del ADN a través de enzima uracil-​N​-glicosilasa (se discute a
continuación) ​2. Bisulfito​: Al igual que la hidroxilamina, desamina sólo citosina pero estas citosinas deben
estar en
un ADN simple hebra. Esta propiedad del bisulfito lo hizo útil en la ​mutagénesis sitio-dirigida 3.
Ácido nitroso​: No solo desamina citosinas sino que también remueve los grupos amino de adenina y
guanina (Figura 11.2). Ya que es menos específico, produce tanto transiciones GC-a-AT como AT-a-GC
así como también deleciones. El ácido nitroso es capaz de ingresar en algunas células pero no en otras,
por lo que puede ser usado como un mutágeno in vivo e in vitro
 Reparación de las bases desaminadas.
Reparación por escisión de base

Las ​ADN glicosilasas ​rompen el enlace

glucosídico entre la base dañada (base desaminada) y el azúcar.
Existe una única ADN glicosilasa para cada tipo de base
desaminada y remueve sólo esa base en particular.

Cuando una base sufre desaminación, la ADN

glicosilasa reconoce la base dañada y rompe el enlace
glucosídico. En este momento se genera un ​sitio AP ​(sitio
apirimidínico o apurínico, dependiendo de qué base sea). Una
5’-AP endonucleasa ​rompe el enlace fosfodiéster del lado 5’-P​i
de la base dañada, dejando un grupo 3’-OH. La ​ADN
desoxirribosa fosfodiesterasa ​(​dRPasa​) remueve la
5’-desoxirribosa fosfato que perdió la base dañada. Luego, la
ADN polimerasa ​(ADN polimerasa I en ​E. coli​) y la ​ADN ligasa
rellenan el hueco.

Very-short-patch repair de 5-metilcitosina desaminada

 La mayoría de los organismos tienen algunas bases llamadas 5-metilcitosina en lugar de
citosinas en sitios específicos de su ADN. Estas bases son citosinas con un grupo metilo en la posición 5 sobre
el anillo de pirimidina en lugar del hidrógeno (Figura 11.2B). Enzimas específicas llamadas ​metiltransferasas
transfieren el grupo metilo hacia esta posición después de que el ADN se sintetizó. La función de la
5-metilcitosina no se sabe con exactitud, pero se sabe que a veces ayuda a proteger el ADN de las enzimas de
restricción y pueden ayudar a regular la expresión génica.

Los sitios donde hay 5-metilcitosina en el ADN son frecuentemente “​hot spots”​ para la
mutagénesis, porque la desaminación de la 5-metilcitosina produce timina en lugar de uracilo (a diferencia de la
citosina
que produce uracilo cuando se desamina). Esta timina en el ADN no es reconocida por la uracil-​N​-glicosilasa ya
que es una base normal en el ADN. Estas timinas están apareadas con G y pueden ser reparadas por el
sistema de reparación de mismatch metil-dirigido​. Sin embargo, en un mismatch GT creado por un error en
la replicación, la base incorporada por error puede ser identificada porque está en la hebra recientemente
replicada, mientras que los mismatch GT creados por la desaminación de la 5-metilcitosina no se encuentran
generalmente en la hebra recientemente sintetizada. Reparar la hebra equivocada produce transiciones
GC-a-AT en el ADN.

En ​E. coli l​ a mayoría de las 5-metilcitosina en el ADN se forma por metilación de la segunda
citosina de la siguiente secuencia: 5​u​CCWGG3​u​/3​u​GGWCC5​′ ​donde el par de base del medio (W)
generalmente es AT o TA. Como dijimos, la segunda citosina de esta secuencia se metila por la enzima ​ADN
citosina metilasa ​(​Dcm metilasa​). Debido a la potencial mutación que puede ocurrir, ​E. coli t​ iene un
mecanismo de reparación especial para las 5-metilcitosina desaminadas en esta secuencia. Este sistema
remueve específicamente la timina que aparezca en un mismatch TG en esta secuencia. Debido a que una
pequeña región, o un “parche”, de la hebra de ADN que contiene la T se remueve y se re-sintetiza durante el
proceso de reparación, el mecanismo se denomina ​reparación de un parche muy corto ​(​very-short-patch
repair)​ . En este mecanismo, la ​Vsr endonucleasa​, el producto del gen ​vsr​, se une al mismatch TG en la
secuencia C​m​CWGG/GGWTC y hace un corte al lado de la T. Luego se remueve la T y la hebra es
re-sintetizada por una ADN polimerasa de reparación, la cual inserta la C correcta.

El sistema de reparación Vsr es muy específico y normalmente sólo repara los mismatches TG
en la secuencia que se mostró arriba. El gen ​vsr ​se encuentra inmediatamente corriente abajo del gen de la
Dcm metilasa, asegurando que las células que heredan el gen para metilar la C en la secuencia que vimos
arriba también hereden la habilidad de reparar el mismatch si la C-metilada (5-metilcitosina) es desaminada.

DAÑO DEBIDO A ESPECIES REACTIVAS DEL OXÍGENO

Aunque el oxígeno molecular (O​2​) no es muy dañino para el ADN y las demás macromoléculas,
las especies reactivas del oxígeno en las que el oxígeno adquirió un electrón extra, son muy dañinas. Estas
especies reactivas incluyen el ​radical superóxido​, ​peróxido de hidrógeno ​y ​radical hidroxilo​, los cuales se
producen por reacciones celulares normales. También pueden formarse como resultado de factores
ambientales, incluyendo la radiación UV y químicos como el herbicida paraquat.

Por lo tanto, los organismos desarrollaron sistemas que eliminan las especies reactivas del
oxígeno. En bacterias, algunos de estos sistemas se inducen por la presencia de las especies reactivas del
oxígeno, y estos genes codifican enzimas como la superóxido dismutasa, catalasa, peróxido reductasa, entre
otras, que destruyen las especies reactivas del oxígeno. Estos sistemas también incluyen genes que codifican
enzimas de reparación que ayudan a reparar el daño oxidativo del ADN producido por las formas reactivas del
oxígeno. La acumulación de este tipo de daño puede ser responsable de aumentar la tasa de cáncer con la
edad y muchas enfermedades degenerativas asociadas a la edad.

8-oxoG

Una de las lesiones más mutagénicas en el ADN producidas por las especies reactivas del
oxígeno es la base oxidada ​7,8-dihidro-8-oxoguanina ​(​8-oxoG ​o ​GO​) (Figura 11.4). Esta base aparece
frecuentemente en el ADN debido al daño producido por las especies reactivas del oxígeno que se producen
internamente, y, a menos que los sistemas de reparación actúen sobre el daño, la ADN polimerasa III
mal-aparea esta base con

adenina, provocando mutaciones espontáneas. Debido al potencial mutagénico que tiene la 8-oxoguanina, ​E.
coli ​desarrolló muchos mecanismos para evitar estas mutaciones.

MutM, MutY y MutT

Los productos de los genes ​mut ​de un organismo reducen las tasas normales de mutaciones
espontáneas; por lo tanto, los organismos con una mutación que inactive un gen ​mut s​ ufrirán tasas de
mutaciones más altas que las normales (más adelante se discute el aislamiento de mutaciones ​mut​). Los genes
mut d​ e ​E. coli q
​ ue incluyen ​mutM,​ ​mutY ​y ​mutT​, son genes exclusivos para prevenir las mutaciones debido a
8-oxoG. Las funciones de estos tres genes ​mut ​son aditivas a reducir las mutaciones espontáneas, ya que la
tasa de mutaciones espontáneas es más alta si dos o los tres genes ​mut ​se mutan que si sólo uno de ellos se
muta.
MutM

La enzima MutM es una ​N-​ glicosilasa que específicamente remueve la base 8-oxoG del azúcar
desoxirribosa en el ADN (Figura 11.4). La ruta de reparación funciona como cualquiera otra ruta de reparación
que involucre ​N​-glicosilasa excepto que la hebra depurada se corta a través de la actividad AP endonucleasa
de la propia MutM, degradada por la exonucleasa y re-sintetizada por la ADN polimerasa I (Figura 11.3). El gen
mutM e ​ s parte de un regulón inducido en respuesta a estrés oxidativo (ver apunte de Regulación
transcripcional).

MutY

La enzima MutY también es una ​N-​ glicosilasa específica que en vez de remover 8-oxoG
directamente, remueve las bases adenina que se aparearon con 8-oxoG erróneamente (Figura 11.4). La ADN
polimerasa de reparación introduce la C en lugar de la A para prevenir la mutación. Esta enzima también
​ n donde una A se apareó con una G y remueve la A.
aparentemente reconoce ​mismatch e

MutT

La enzima MutT funciona por un mecanismo diferente (Figura 11.4): previene que entre 8- oxoG
al ADN. Las especies reactivas del oxígeno no sólo pueden oxidar guanina en el ADN sino que también la base
en el dGTP para formar 8-oxodGTP. Sin la enzima MutT, el 8-oxodGTP se incorpora en el ADN a través de la
ADN polimerasa III, la cual no puede distinguir entre 8-oxodGTP y dGTP. La enzima MutT es una fosfatasa
específica que degrada el 8-oxodGTP a 8-oxodGMP para que no pueda ser usado en la síntesis de ADN.

Genética de la mutagénesis de 8-oxoG ​La evidencia que se obtiene con las mutantes
​ en
mutM​, ​mutY ​y ​mutT ​es consistente con los productos de estos genes. Primero, se explicó por qué los efectos de
las mutaciones en estos genes son aditivos. Si ​mutT s​ e muta, más cantidad de 8-oxodGTP se incorpora al
ADN, aumentando la tasa de mutaciones espontáneas. Si MutM no remueve 8-oxoG del ADN, la tasa de
mutaciones espontáneas aumenta aun más. Si MutY no remueve algunas de las A’s que se aparearon por error
con 8-oxoG, la tasa de mutaciones espontáneas será más alta aún. Las mutaciones en los genes ​mutM,​ ​mutY ​y
mutT ​también aumentan la frecuencia de sólo algunos tipos de mutaciones. Por ejemplo, en las mutantes en
mutM ​y ​mutY ​aumenta la frecuencia de mutaciones por transversión GC-a-TA. El hecho de que estas
mutaciones aumenten la frecuencia del mismo tipo de mutación sugirió que ambos genes (​mutM ​y ​mutY)​
funcionan en la misma ruta. Si MutM no remueve 8-oxoG del ADN, el apareamiento erróneo de 8-oxoG con A
puede conducir a transversiones GC-a-TA. Además, las transversiones GC-a-TA ocurren si MutY no remueve
las A’s mal apareadas con 8-oxoG en el ADN. Por contraste, mientras las mutaciones en ​mutT ​pueden
aumentar la frecuencia de mutaciones por transversión GC-a-TA, también aumentan la frecuencia de
transversiones TA-a-GC. Esto es posible porque una molécula de 8-oxodGTP puede producir mutaciones de
dos maneras: puede incorporarse en el ADN al aparearse con una A y luego, una vez en el ADN, se aparea
correctamente con una C resultando en una transversión de AT-a-CG; o puede entrar en el ADN correctamente
como una G apareándose con una C y luego, una vez en el ADN, aparearse incorrectamente con una A dando
como resultado transversiones GC-a-TA.
DAÑO DEBIDO A AGENTES ALQUILANTES

La ​alquilación ​es otro tipo de daño del ADN. Tanto las bases como los fosfatos en el ADN
pueden ser alquilados. Los químicos responsables, conocidos como ​agentes alquilantes​, usualmente
adicionan grupos alquilo (CH​3​, CH​3​CH​2​, etc.) a las bases o fosfatos en el ADN. Ejemplos de agentes alquilantes:
etil metanosulfonato (​EMS​), metil metanosulfonato (​MMS​) y el ​N​-metil-​N’​-nitro-​N-​ nitrosoguanidina (​NTG​).
Algunos de estos agentes alquilantes actúan directamente sobre el ADN, mientras que otros reaccionan con
constituyentes celulares que se supone deben inactivarlos pero en su lugar los convierten en agentes
alquilantes. Las células necesitan sistemas de reparación para evitar el daño del ADN por alquilación.

Muchos grupos reactivos de las bases pueden ser atacados por los agentes alquilantes. Los
más reactivos son el N​7 ​de la guanina y el N​3 ​de la adenina. Estos nitrógenos pueden ser atacados por EMS o
MMS para producir bases metiladas o etiladas tales como N​7​- metilguanina y N​3​-metiladenina, respectivamente.
La alquilación de las bases en estas posiciones altera el apareamiento con otras bases, provocando
principalmente distorsiones en la hélice.

Otros agentes alquilantes, como la nitrosoguanidina (NTG), pueden atacar otros átomos en los
anillos, incluyendo el O​6 ​de la guanina y el O​4 ​de la timina. La adición de un grupo metilo a estos átomos
produce O​6​-metilguanina (Figura 11.5) y O​4​-metilguanina, respectivamente. Las bases alteradas con un grupo
alquilo en estas posiciones son mutagénicas porque la hélice no se distorsiona significativamente por lo que no
puede ser reparada por los sistemas de reparación más generales.

N​-glicosilasas específicas

Algunos tipos de bases alquiladas pueden ser removidas por ​N​-glicosilasas específicas. La ruta
es similar a como actúan otras ​N-​ glicosilasas. Primero se remueve la base alquilada por la ​N​-glicosilasa
específica y luego la hebra de ADN apurínico o apurimidínico se corta por una AP endonucleasa. Las
exonucleasas degradan la hebra cortada que luego es re-sintetizada por la ADN polimerasa I. En ​E. coli s​ e
identificaron dos ​N-​ glicosilasas que remueven bases metiladas y etiladas del ADN. Una de ellas, ​TagA
remueve la base 3-metiladenina y algunas bases metiladas y etiladas relacionadas. La otra, ​AlkA​, es menos
específica. No sólo remueve 3-metiladenina sino que también remueve otras bases incluyendo 3-metilguanina y
7-metilguanina.

Metiltransferasas

Otro sistema de reparación para bases alquiladas repara la base dañada en lugar de removerla
y re-sintetizar el ADN. Estas proteínas, llamadas ​metiltransferasas​, directamente remueven el grupo alquilo
desde la base alterada en el ADN hacia ellas mismas. Cuando transfieren el grupo alquilo a ellas mismas se
inactivan y eventualmente son degradadas. Las dos principales metiltransferasas en ​E. coli s​ on ​Ada ​y ​Ogt​, a
veces llamadas alquil-transfersas I y II, respectivamente. Ambas proteínas reparan bases dañadas por
alquilación del carbono O​6 ​de la guanina y el carbono O​4 ​de la timina. Ogt cumple el rol principal cuando las
células están creciendo activamente, pero cuando las células llegan a la fase estacionaria se induce Ada como
parte de la respuesta adaptativa y se convierte en la principal metiltransferasa (ver a continuación). El hecho de
que la célula sacrifique proteínas para reparar este tipo de lesiones se debe al potencial mutagénico de estas
lesiones.

La respuesta adaptativa

Muchos de los genes que codifican ​N-​ glicosilasas y metiltransferasas que reparan el daño por
alquilación en ​E. coli ​son parte de la ​respuesta adaptativa​. Los productos de estos genes se sintetizan
normalmente en pequeñas cantidades, pero se producen en cantidades mucho más grandes si las células se
exponen a un agente alquilante. El nombre “respuesta adaptativa” viene de la evidencia de que ​E. coli s​ e
“adaptaba” al daño producido por los agentes alquilantes. Si las células de ​E. coli ​se tratan brevemente con
un agente alquilante como la NTG, serán más capaces de sobrevivir siguientes tratamientos con este agente
alquilante y otros agentes alquilantes.

Regulación de la respuesta adaptativa

El tratamiento de células de ​E. coli ​con un agente alquilante produce el

aumento en la concentración de algunas de las proteínas involucradas en la reparación del
daño por alquilación. Los genes inducidos como parte de la respuesta adaptativa incluyen ​ada,​
aidB,​ ​alkA ​y ​alkB.​ La regulación se logra a través del estado de metilación de una de estas
proteínas, la proteína Ada (Figura 11.6). El gen ​ada e ​ s parte de un operón junto con ​alkB,​
mientras que ​aidB ​y ​alkA s​ e transcriben de forma separada. La proteína Ada puede regular su
propia transcripción porque además de actuar como reparadora del daño por alquilación es un
activador transcripcional. Sin embargo, la proteína Ada actúa como activador transcripcional
sólo si el daño por alquilación es bastante extenso. Esta proteína puede detectar el nivel de
daño en el ADN porque tiene dos aminoácidos que reciben los grupos metilo: Cys​321 ​(el
aminoácido 321 desde el N-terminal) y Cys​38 ​(el aminoácido 38 desde el N-terminal). Después
de que haya ocurrido un daño leve por alquilación, la mayoría de la metilación se encuentra en
las bases; estos grupos metilos pueden ser transferidos hacia el O​6​-metilguanina o el
O​4​-metiltimina de la Cys​321​, cercano al C- terminal. Este proceso remueve los grupos metilo de
las bases dañadas pero inactiva la proteína Ada. A niveles de agente alquilante más altos,
algunos de los fosfatos del esqueleto de ADN se pueden metilar. Estos grupos metilo se
transfieren a la Cys​38​, cercana al N-terminal. La presencia de un grupo metilo en la Cys​38
convierte a la proteína Ada en un activador transcripcional que activa su propia transcripción
así como también la de otros genes bajo su control.

Algunos de los genes de la respuesta adaptativa también se

prenden durante la fase estacionaria. La transcripción de genes
durante la fase estacionaria requiere de σ​8 ​en lugar de σ​70​, y la
proteína Ada metilada puede también activar la transcripción a
través de una ARN polimerasa que contiene σ​8 ​en estos
promotores. Sin embargo, sólo la transcripción del operón ​ada​-​alkB
y del gen ​aidB s​ e activa por metilación en la fase estacionaria; la
transcripción del gen ​alkA n ​ o se activa sino que en realidad es
reprimida por la proteína Ada metilada en este estadio. Es posible
que estos genes se induzcan en la fase estacionaria para prevenir
el daño del ADN debido a la acumulación natural de nitrosaminas,
las cuales se acumulan cuando las células se quedan sin oxígeno.
Lo siguiente también puede explicar por qué el gen ​alkA s​ e reprime
en fase estacionaria: la

proteína AlkA es una ​N​-glicosilasa específica que corta el ADN que

está alquilado pero después requiere de la replicación del ADN para
terminar el trabajo. Muy poca replicación ocurre en células en fase
estacionaria.
 DAÑO DEBIDO A RADIACIÓN UV

Una de las principales fuentes de daño natural del ADN es la radiación

UV debido a la exposición al sol. La estructura de anillo conjugado de las bases en el
ADN produce que absorban luz UV. Los fotones absorbidos energizan las bases,
provocando que sus dobles enlaces reaccionen con átomos cercanos y por lo tanto
formar enlaces químicos adicionales. Estos enlaces químicos adicionales se unen de
forma anormal a bases del ADN o entre los azúcares y las bases de los nucleótidos.
Un daño común de la radiación UV es la formación de
dímeros de timina​, en donde dos anillos adyacentes de pirimidina se
fusionan (Figura 11.7). En uno de los dos posibles dímeros, los átomos
de carbono en posición 5 y 6 de dos pirimidinas adyacentes se unen
para formar un ​anillo de ciclobutano​. En el otro tipo de dímero, el
carbono en posición 6 de una pirimidina se une al carbono en posición 4
de una pirimidina adyacente para formar una ​lesión 6-4​.

Fotorreactivación

Ya que es muy común el dímero de pirimidina de tipo

ciclobutano debido a radiación UV, existe un tipo especial de sistema de
reparación denominado ​fotorreactivación​. Se llama fotorreactivación porque
sólo ocurre en presencia de luz. Este sistema separa las bases fusionadas del
dímero de pirimidina de tipo ciclobutano.

La fotorreactivación fue el primer sistema de reparación del

ADN que se descubrió. En 1940s, se observó que la bacteria ​Streptomyces
griseus ​sobrevivía más cuando era irradiada con UV en presencia de luz que
cuando era irradiada de noche. La fotorreactivación existe en la mayoría de los
organismos sobre la Tierra, con la excepción de los animales placentarios
como los humanos. Es un error pensar que cuando tomamos sol los efectos se
están reparando porque en realidad no tenemos este mecanismo de
reparación.

El mecanismo de acción de la fotorreactivación se muestra en

la Figura 11.8. La enzima responsable de la reparación es la ​fotoliasa​. Esta
enzima contiene el grupo FAD reducido (FADH​2​) en su sitio activo, el cual
absorbe luz UV. La absorción de luz le da la energía suficiente para separar las
bases fusionadas. Una enzima diferente pero relacionada actúa en la
reparación de lesiones 6-4 en eucariotas.

N​-glicosilasas específicas para los dímeros de pirimidina

También hay ​N-​ glicosilasas específicas que reconocen y remueven dímeros de pirimidina. Este
sistema de reparación es similar al que la célula usa para las bases desaminadas y alquiladas, como discutimos
anteriormente. Involucra AP endonucleasas y la remoción y re-síntesis de las hebras del ADN que contienen los
dímeros.

MECANISMOS DE REPARACIÓN GENERALES

En las células, no todos los mecanismos de reparación son específicos para un cierto tipo de
daño del ADN. Algunos tipos de sistemas de reparación pueden reparar muchos tipos diferentes de daños.
Estos sistemas reconocen distorsiones en la estructura del ADN producidas por el apareamiento inadecuado de
bases y las reparan, independientemente del tipo de daño que causó la mutación.
EL SISTEMA DE REPARACIÓN DE MISMATCH METIL-DIRIGIDO

Este sistema de reparación no es específico y puede reparar cualquier daño que provoque una
ligera distorsión en la hélice del ADN, incluyendo mismatches, cambios en el marco, incorporación de análogos
de bases, 8-oxoG, algunos tipos de alquilación que provoquen distorsiones menores en la hélice de ADN. Los
tipos de alquilación que provoquen distorsiones mayores son reparados por otros sistemas, incluyendo el
sistema de reparación por escisión de nucleótido (ver a continuación). ​En general, el ADN dañado que
produce sólo distorsiones menores en la hélice se repara con el sistema de reparación de mismatch
metil-dirigido, mientras que el ADN dañado que produce distorsiones mayores se repara por otras vías​.

Análogos de base

Los análogos de base son químicos que se parecen a las

bases normales en el ADN. Por lo tanto, estos análogos pueden convertirse
en desoxinucleósidos trifosfato y entrar en el ADN. La incorporación de un
análogo de base puede ser mutagénico porque frecuentemente el análogo
se aparea incorrectamente, conduciendo a cambios en los pares de bases
en el ADN. La Figura 11.9 muestra dos análogos de base: ​2-aminopurina
(​2-AP​) y ​5-bromouracilo ​(​5-BU​). La 2-AP se parece a la adenina, mientras
que el 5-BU se parece a la timina.

La Figura 11.10 muestra cómo el mispairing por un análogo de base podría

producir una mutación. En la figura, el análogo de base 2-AP entra en la
célula y se convierte en el nucleósido trifosfato. Luego, la desoxirribosa
2-aminopurina trifosfato se incorpora durante la síntesis del ADN apareándose
incorrectamente con una citosina. El tipo de mutación que ocurre depende de
cuando la 2-AP se aparea incorrectamente con citosina. ​1. ​Cuando la 2-AP

entra en el ADN por error y se aparea con C

​ en lugar de T, en las siguientes
replicaciones usualmente se aparea correctamente con T. Esto produce
mutaciones por transiciones GC-a-AT (Figura 11.10A). ​2. ​Sin embargo, si la
2-AP se incorpora apropiadamente por
apareamiento con T pero se aparea incorrectamente con C durante
las siguientes replicaciones, ocurre una mutación por transición
AT-a-GC (Figura 11.10B) Lo mismo ocurre con 5-BU nada más que
a veces se aparea incorrectamente con C en lugar de A.

Mutágenos que cambian el marco

Otro tipo de daño que repara el sistema de reparación por mismatch

metil-dirigido es la incorporación de mutágenos que cambian el marco. Estos
químicos son moléculas planas que actúan como mutagénicos porque se
intercalan entre las bases en la misma hebra del ADN, aumentando la distancia
entre las mismas y por lo tanto previniendo que se puedan alinear
correctamente con las bases en la otra hebra. Estos mutágenos incluyen los
colorantes de acridina tales como 9-aminoacridina, proflavina, bromuro de
etidio, etc.

La Figura 11.11 muestra un modelo de mutagénesis debido a este tipo de mutágenos.

 Mecanismo de reparación de mismatch metil-dirigido

Este mecanismo de reparación requiere los productos de los

genes ​mutS,​ ​mutL y​ ​mutH​. Al igual que los genes ​mut i​ nvolucrados en evitar
la mutagénesis debido a 8-oxoG, estos genes ​mut s​ e encontraron en
investigaciones de mutaciones que aumentaban la tasa de mutaciones
espontáneas. Otro gen que participa en este mecanismo es el producto del gen
dam.​ Este gen codifica para la ​Dam metilasa​, una enzima que metila la
adenina en la secuencia GATC/CTAG. Esta enzima metila al ADN en esta
secuencia sólo después que el ADN se sintetizó, por lo que la hebra nueva de
ADN temporariamente está des- metilada. Al tener genes ​mut ​que reparen sólo
la hebra recién sintetizada, la célula evita las mutaciones porque la mayoría se
producen durante la síntesis de las hebras nuevas. Si se degradara la hebra
vieja y se usaría la hebra nueva como templado, el daño se fijaría como una
mutación y pasará a generaciones futuras.

¿Cómo puede el sistema de reparación por mismatch usar el

estado de metilación de la secuencia GATC/CTAG para dirigirse hacia la hebra
recién sintetizada aunque la secuencia GATC/CTAG más cerca esté algo
alejada de la alteración? La Figura 11.12 muestra un modelo. Primero, un
dímero de la proteína MutS se une a la alteración en el ADN que produce una
distorsión menor en la hélice (se marca con una X en la figura). Una secuencia
GATC cercana sigue sin estar metilada sobre la hebra recién sintetizada.
Luego, dos copias de la proteína MutL y una copia de la proteína MutH se unen
al dímero de MutS. Esta unión activa la nucleasa MutH que corta la secuencia
GATC hemi-metilada más cercana en la hebra no metilada recién sintetizada y
las exonucleasas degradan el ADN pasando el sitio del mismatch original.
Luego, la ADN polimerasa III rellena el hueco y liga los extremos. ​Este modelo
es apoyado por experimentos que muestran que el sistema de reparación
por mismatch metil-dirigido repara los mismatches sobre la hebra
hemi-metilada al corregir la secuencia sobre la hebra no metilada del ADN​.
En qué dirección (3’-5’ o 5’-3’) se degrada el ADN, va a depender del lado de la
secuencia GATC más cercana donde ocurrió el mismatch. De acuerdo a este
modelo, ​E. coli ​resuelve este problema al usar cuatro exonucleasas
diferentes: ​ExoVII ​y ​RecJ ​que degradan sólo en dirección 5’-3’; ​ExoI ​y
ExoX ​que degradan sólo en dirección 3’-5’. Además, estas exonucleasas
pueden degradar sólo ADN simple hebra y requieren una helicasa que
separe las hebras. Este es el trabajo de la ​helicasa UvrD ​que también
se usa en el sistema de reparación por escisión de nucleótido (ver más
adelante).

Reparación VSP

Además de su rol en el sistema de reparación por mismatch, las proteínas MutS y MutL
participan en la reparación a través de un parche muy corto (​very-short-patch repair​) que ocurre en sitios donde
hay 5-metilcitosina. La proteína MutS puede unirse a la T en el mismatch T-G creado por desaminación de la C
metilada en esta posición, y por lo tanto atraer la atención de la endonucleasa Vsr hacia el mismatch. La
proteína MutL puede luego reclutar a la helicasa UvrD y las exonucleasas para degradar la hebra que produce
el mismatch.

Evidencia genética para el sistema de reparación de mismatch metil-dirigido

El resultado de los experimentos que se plantean a continuación apoya la conclusión de que el

estado de metilación de las secuencias GATC del ADN ayuda a direccionar el sistema de reparación de
mismatch hacia la hebra recién sintetizada del ADN.
 Aislamiento de mutantes ​mut

Los genes ​mut ​fueron encontrados en ​E. coli p

​ orque las mutaciones
en estos genes aumentaban la tasa de mutaciones espontáneas. Nos referimos al
fenotipo mutante como “fenotipo mutador”.

Un método común para detectar mutantes con altas tasas de

mutaciones espontáneas es la ​papilación de colonias​. Este método se basa en que
todos los descendientes de una bacteria con una mutación particular son mutantes
del mismo tipo (clones). Por lo tanto, si ocurre una mutación en una colonia en
crecimiento, las bacterias mutantes de la mutante original se mantienen juntas y
forman una ​papila ​a medida que se forma la colonia. Una colonia en crecimiento
puede contener muchas papilas compuestas por mutantes de diferentes tipos. ​Una
mutación ​mut ​aumenta la frecuencia de papilación para muchos tipos de
mutantes​.
​
Las revertantes Lac​+ de ​ n ​E. coli s​ on una opción para los ensayos de
mutaciones ​lac e
papilación, porque las revertantes forman papilas azules en placas que contienen X-Gal. La Figura 11.13
muestra un ensayo de papilación que usa la reversión de una mutación ​lac c​ omo indicador. Si las bacterias que
forman una colonia son mutantes ​mut ​con alta tasa de mutaciones espontáneas que lo normal, la colonia va a
tener más papilas que lo normal. Así es como se detectaron los
genes ​mut​.

Una vez que se detectaron los genes ​mut​, se clasificaron dentro de grupos de
complementación y se nombraron arbitrariamente. Por ejemplo, se predijo que los productos de tres genes ​mut
(​mutS​, ​mutL y​ ​mutH)​ participan en la misma ruta de reparación debido a la observación de que las doble
mutantes no exhibían tasas de mutación espontánea más grande que las células con mutaciones en uno de los
genes. En otras palabras, inactivar dos de estos genes no tiene un efecto aditivo.

Otros experimentos establecieron el rol de la Dam metilasa en el sistema de reparación de

mismatch. En estos experimentos usaron heterodúplex’s del ADN λ. Se prepararon heterodúplex’s de ADN’s λ
en donde las dos hebras vienen de fagos con diferentes mutaciones. Los llamamos ​fago mutante 1 ​(o ​fago a​) y
fago mutante 2 ​(o ​fago b​). El ADN del fago mutante 2 estaba desmetilado porque se propagó sobre ​E. coli c​ on
una mutación ​dam.​ Después de que el ADN de ambos fagos se purificó, las hebras de ADN se separaron por
calor y se purificaron las hebras complementarias. Las hebras complementarias purificadas de cada uno de los
fagos se mezclaron y rehibridizaron para crear mismatch en el sitio de la mutación, con una hebra no metilada
en sus secuencias GATC y la otra hebra metilada. Luego, estos ADN’s heteroduplex se transfectaron dentro de
las células, se plaqueó la progenie fágica y se ensayaron sus genotipos para ver qué mutación habían heredado
y cuál de las dos hebras había sido preferencialmente reparada. La progenie del fago exhibió
predominantemente el genotipo mutante 1. En el experimento reverso, el fago mutante 1 se propagó sobre una
mutante ​dam p ​ or lo que tendría ADN no-metilado. En este caso, la progenie del fago que dio lugar a los ADN
heteroduplex tenía el genotipo de la mutante 2; por lo tanto, una vez más, la secuencia de ADN metilado se
preservó preferencialmente. Estos resultados indican que la secuencia de la hebra no-metilada es la que se
repara para coincidir con la secuencia de la hebra metilada.
 SISTEMA DE REPARACIÓN POR ESCISIÓN DE NUCLEÓTIDO

Uno de los sistemas de reparación generales más importantes es el ​sistema de reparación

por escisión de nucleótido​, llamado así porque los nucleótidos dañados se quitan del ADN y se reemplazan.

Este sistema es relativamente poco específico porque, al igual que el sistema de reparación de
mismatch, reconoce distorsiones en la hélice del ADN que resultan del daño y no de la estructura química del
daño en sí. Esto lo hace capaz de reconocer y reparar daños como la alquilación, daños causados por la
radiación UV (dímeros de ciclobutano, lesiones 6-4, etc.), etc.

Sin embargo, este sistema reconoce ​distorsiones mayores en la hélice del ADN ​y no puede
reconocer distorsiones menores como los mismatch de bases.

Además, este sistema de reparación se diferencia de la mayoría de los otros porque el ADN
que contiene el daño se escinde y termina fuera de la célula. Por ejemplo, después que las células son
irradiadas con luz UV, aparecen en el medio celular pequeñas piezas de ADN que contienen dímeros de
pirimidina y otros tipos de daños inducidos por UV, debido al sistema de reparación por escisión de nucleótido.

Mecanismo de reparación por escisión de nucleótido

La Tabla 11.1 enumera los genes de ​E. coli ​requeridos para la reparación por escisión de
nucleótidos. Los productos de algunos de estos genes, tales como ​uvrA​, ​uvrB ​y ​uvrC ​están involucrados sólo
en la reparación por escisión, mientras que los productos de los otros, incluyendo ​polA y​ ​uvrD,​ también son
requeridos por otros tipos de reparaciones.

En la Figura 11.14 se muestra cómo participan estos genes en la reparación por escisión. Los
productos de los genes ​uvrA​, ​uvrB y​ ​uvrC ​interaccionan para formar la ​endonucleasa UvrABC​. Dos copias de
la proteína UvrA y una copia de la proteína UvrB forman un complejo que se une de manera no específica al
ADN, aún si no está dañado. Luego, este complejo migra a través del ADN hasta que encuentre un lugar donde
la hélice está distorsionada debido al daño del ADN. El complejo se frena, la proteína UvrB se une al daño, y la
proteína UvrA se va, siendo reemplazada por UvrC. La unión de UvrC a UvrB produce que UvrB corte el ADN
aproximadamente a 4 nucleótidos en dirección 3’ del daño. Luego, corta a 7 nucleótidos en dirección 5’ del
daño. Una vez que se corta el ADN, la helicasa UvrD remueve el oligonucleótido que contiene el daño y la ADN
polimerasa I
re-sintetiza la hebra que se removió, usando la hebra complementaria como templado.
 Inducción de la reparación por escisión de nucleótido

Aunque los genes de este sistema casi siempre se expresan en bajos niveles, ​uvrA​, ​uvrB ​y
uvrD s​ e expresan en niveles mucho más altos después de que el ADN fue dañado. Debido a que son genes
inducibles por el daño del ADN, los genes ​uvr ​caen dentro de la clasificación de ​genes ​din (​ por “​damage
inducible​”), los cuales incluyen ​recA​, ​umuC y​ ​umuD.​ Muchos genes ​din,​ incluyendo ​uvrA​, ​uvrB ​y ​uvrD,​ se
inducen porque son parte de la respuesta SOS (ver más abajo).

El daño en algunas regiones del ADN presenta un problema más inmediato para la célula que
el daño en otras regiones. Por ejemplo, los dímeros de pirimidina en regiones de transcripción del ADN no sólo
bloquean la replicación sino también la transcripción del ARN, cuando la ARN polimerasa alcanza el daño. Esto
hace que la célula repare primero el daño que ocurre en genes que se transcriben para que puedan ser
transcriptos y traducidos a proteína.

MECANISMOS DE TOLERANCIA AL DAÑO DEL ADN

En todos los sistemas de reparación que se discutieron anteriormente, la célula remueve el

daño del daño, normalmente usando la información de la hebra complementaria para recuperar la secuencia de
ADN correcta. Con mucha suerte, el daño se repara antes de que el aparato de la replicación llegue al sitio e
intente replicar sobre el daño. Las células tienen mecanismos para retrasar la replicación y prevenir que esto
ocurra. Pero... ¿Qué pasa si el daño no se repara antes de que la horquilla de replicación llegue? La célula no
tiene otra opción que tolerar el daño y continuar con la replicación. Los mecanismos que le permiten a la célula
tolerar el daño del ADN sin repararlo se denominan ​mecanismos de tolerancia al daño del ADN​.

REPARACIÓN POR RECOMBINACIÓN DE HORQUILLAS DE REPLICACIÓN DAÑADAS

Este tipo de reparación usa la recombinación para permitir que la horquilla de replicación
sobrepase el daño del ADN en lugar de repararlo. Después de que la horquilla de replicación se movió, el daño
sigue estando; puede ser reparado por otros sistemas o seguir siendo un problema para otras horquillas que
lleguen más tarde.

Ese daño puede involucrar cortes simple o doble hebra en el ADN o bases dañadas que no
pueden aparearse correctamente. También puede involucrar la ARN polimerasa frenada en el ADN. Cuando la
horquilla de replicación llega y se encuentra con esta situación, se frena. La recombinación le permite a las
hebras adelantada y retrasada intercambiar información para que el aparato de la replicación pueda
re-ensamblarse en otra región del ADN no dañada y continuar con la replicación.

Cuando se descubrió la recombinación en bacterias, se asumió que su único propósito era

intercambiar genes entre las bacterias y aumentar la diversidad. Ahora, se asume que el principal rol de la
recombinación es reiniciar las horquillas de replicación después que se hayan frenado. Se demostró que las
mutaciones en los genes ​rec d​ e ​E. coli ​(vía RecBCD o vía RecFOR) vuelven a las células más sensibles a los
agentes que dañan el ADN​.

Hebra retrasada dañada

La hebra retrasada es la hebra que se sintetiza en dirección contraria a la horquilla de

replicación. Si el daño se encuentra en la hebra retrasada, la horquilla de replicación podría ser capaz de pasar
sobre el daño, siempre que la ADN helicasa (DnaB), la cual rodea la hebra retrasada, pueda proceder sobre el
daño. Ya que la hebra retrasada se replica discontinuamente, lo peor que podría pasar es que quede un hueco
en oposición al daño. Este hueco puede ser movido hacia una hebra buena del ADN por la ruta RecFOR, y el
hueco puede ser rellenado, después de que la horquilla de replicación se movió.

Hebra adelantada dañada

Las consecuencias de encontrar un daño durante la síntesis de la hebra adelantada pueden ser
mucho más severas. Por ejemplo, en la Figura 11.15, la polimerasa se frena porque encuentra un dímero de
timina. La polimerasa se frena pero la helicasa continúa, separando las hebras durante una distancia corta, y la
polimerasa de la hebra retrasada continúa replicando la hebra retrasada. Esto deja a la hebra adelantada de
ADN simple hebra que contiene el daño. Las proteínas RecFOR pueden cargar el ADN simple hebra con la
proteína RecA y el filamento que se forma puede invadir la hebra retrasada de ADN doble hebra. Ahora el
dímero de timina está en oposición a una hebra retrasada buena y el hueco está en oposición a una hebra
adelantada buena, por lo que puede ser reparado (el dímero de timina) por las funciones de reparación.
Otro modelo plantea que la horquilla de replicación puede retroceder (Figura 11.16). El modelo
comienza de manera similar al planteado anteriormente, en donde se forma ADN simple hebra cuando la
replicación de la hebra adelantada se frena en el daño.
 Reparación de uniones entre hebras del ADN

Muchos compuestos químicos (mitomicina, cisplatina, EMS, etc.) pueden formar enlaces entre las hebras del
ADN, en donde dos bases en hebras opuestas del ADN se unen covalentemente. Este tipo de uniones no
pueden ser reparadas ni por el sistema de reparación por escisión ni por recombinación.

Sin embargo, a pesar de que estos enlaces no pueden ser separados ni por escisión de nucleótido ni por
recombinación por separado, se pueden reparar a través de una combinación de ambos mecanismos (Figura
11.17). En el primer paso, la UvrABC endonucleasa hace cortes en una hebra a ambos lados del
enlace entre hebras. Esto deja un hueco en oposición al ADN dañado. En el segundo paso, el hueco se
ensancha a través de la actividad 5’-exonucleasa de la ADN polimerasa I. En el tercer paso, la reparación por
recombinación reemplaza el hueco con una hebra nueva a partir de otra molécula de ADN hija en la célula.
Ahora, el ADN dañado está confinado solo a una hebra y es opuesta a una hebra buena; por lo tanto, puede ser
reparada por la ruta de reparación por escisión de nucleótido.

RESPUESTA SOS

La primera prueba de que los sistemas de reparación se inducen debido al daño por UV vino
del trabajo de Jean Weigle al estudiar la reactivación de los fagos λ irradiados con UV. En el experimento,
Weigle irradió el fago λ y su hospedador y ensayó la sobrevida del fago por su capacidad de formar placas
cuando se plaquea sobre ​E. coli.​ Observó que sobrevivían más fagos irradiados cuando se plaqueaban sobre
​ ue habían sido irradiadas que cuando se plaqueaban sobre células de ​E. coli q
células de ​E. coli q ​ ue no habían
sido irradiadas. Ya que los fagos recuperaron su viabilidad, o se reactivaron, este fenómeno se denominó
W-reactivación​. Aparentemente, esto ocurrió porque un sistema de reparación se indujo en las células
irradiadas y pudo reparar también el daño en el ADN del fago λ cuando este ADN entró en la célula.

La respuesta SOS

Muchos genes ​din ​son regulados por la ​respuesta SOS​, llamada

de esta manera porque este mecanismo rescata a las células que sufrieron un daño
severo en el ADN. Los genes involucrados en este mecanismo se denominan
genes SOS​.

La Figura 11.18 muestra cómo se inducen los genes SOS. Los

genes SOS normalmente están reprimidos por una proteína denominada ​LexA ​que
actúa como un represor. Este represor se une a secuencias llamadas ​cajas SOS
que se encuentran corriente arriba de los genes SOS y previene su transcripción. El
represor permanece unido a estas cajas hasta que el ADN sea dañado
extensivamente por radiación UV u otros agentes que dañan el ADN. Esto produce
que LexA se autoclive y por lo tanto se inactiva. De esta manera comienza la
transcripción de los genes SOS.

La razón por la cual el represor LexA no se une más al ADN

después de que se autoclivó se conoce muy bien. Cada polipéptido LexA tiene dos
dominios separables. Uno, el ​dominio de dimerización​, se une a otro polipéptido
de LexA para formar un dímero, y el otro, el ​dominio de unión al ADN​, se une a
las regiones operadoras del ADN corriente arriba de los genes SOS (en las cajas
SOS) y bloquea la transcripción de estos genes. La proteína LexA se une al ADN
sólo si está en su forma de dímero. El autoclivaje produce que se separen los dos
dominios del polipéptido y LexA se inactiva.

Pero... ¿Por qué el represor LexA se autocliva sólo después

dañarse el ADN? Después de dañarse el ADN, aparece ADN simple hebra en la
célula, probablemente debido al bloqueo de la horquilla de replicación en el
ADN dañado. Este ADN simple hebra se une a la ​proteína RecA ​para formar
los filamentos del núcleo-proteína de RecA, que luego se unen a LexA y
producen su autoclivaje. Esta característica del modelo (que LexA se autoclive
en respuesta a la unión de RecA en lugar de que RecA clive a LexA) es
apoyada por evidencia experimental. Cuando calentamos bajo
ciertas circunstancias, aun en ausencia de RecA, LexA se autocliva. Este resultado indica que RecA actúa
como ​coproteasa ​para facilitar el autoclivaje de LexA.

La regulación de la respuesta SOS a través del clivaje del represor LexA es similar a la
inducción del fago λ a través del autoclivaje del represor CI. El autoclivaje del represor λ, estimulado por los
filamentos de núcleo-proteínas de RecA, también separa el dominio de dimerización del dominio de unión al
ADN, evitando que la unión del represor λ las regiones operadores y permitir la transcripción de los genes líticos
de λ.

Genética de la mutagénesis SOS inducible

Muchos tipos de daños del ADN, incluyendo la radiación UV, son mutagénicos e incrementan el
número de mutaciones en la célula. Esto implica el uso de uno o más mecanismos de reparación. Cierta
evidencia propone que al menos uno de los sistemas de reparación codificado por los genes SOS, la ​síntesis
translesión ​(​TLS​), permite que la horquilla de replicación avance sobre el ADN dañado para que la molécula de
ADN pueda ser replicada y la célula pueda sobrevivir.

Existen evidencias de que este mecanismo propenso a errores para la reparación del daño por
UV es inducible en ​E. coli​. Además de medir la sobrevida de fagos λ irradiados con UV plaqueados sobre ​E. coli
irradiados con UV, Weigle contó el número de mutantes placas claras entre los fagos que sobrevivieron.
(Recordar que los lisógenos se forman en el centro de las placas de un fago λ WT, haciendo que las placas
sean turbias, pero las mutantes que no pueden lisogenizar forman placas claras). Observaron que había más
mutantes de placas claras entre los fagos que sobrevivieron si las bacterias habían sido irradiadas con UV
antes de ser infectadas que si no habían sido irradiadas con UV. Por lo tanto, el incremento en la mutagénesis
se debía a la inducción de un sistema de reparación mutagénico después del daño del ADN. La mutagénesis
inducible se denominó ​W-mutagénesis​. (Tabla 11.1). Estudios más tarde demostraron que la mutagénesis
inducible resulta de la inducción de uno o más genes SOS; esto no ocurre sin RecA y sin el clivaje del represor
LexA.

Determinación de qué ruta de reparación es mutagénica

Aunque los experimentos de Weigle mostraron que uno de los sistemas de reparación por daño
​ s propenso a error y produce mutaciones, no indicador cuál era el sistema. Para
UV inducible en ​E. coli e
detectar mutaciones inducidas por UV, los investigadores usaron la reversión de la mutación ​his.​ Su enfoque
fue construir dobles mutantes tanto con una mutación en ​his c​ omo en uno o más de los genes de cada una de
las rutas de reparación. Luego, las mutantes deficientes en la reparación se irradiaron con luz UV y se
plaquearon en un medio sin histidina, por lo que sólo las revertantes His​+​podían formar colonias. Bajo estas
condiciones, cada reversión a ​his+​ ​resulta en sólo una colonia, por lo que es posible medir directamente el
número de reversiones ​his+​ ​que ocurrieron. Este número, dividido por el total de bacterias que sobrevivieron, da
una estimación de la susceptibilidad de las células a la mutagénesis debido a luz UV.

Los resultados de estos experimentos condujeron a la conclusión de que la reparación por

recombinación de las horquillas de replicación frenadas no parece ser propensa a error. Mientras que las
mutaciones en ​recB ​y ​recF ​redujeron la sobrevida de células expuestas a luz UV, el número de reversiones ​his+​
por célula que sobrevivió no fue diferente de aquel en donde las células no tenían las mutaciones en los genes
rec.​ Entonces, la reparación por escisión de nucleótido no parece ser propensa a error. La adición de una
mutación ​uvrB a​ las mutaciones ​recB y​ ​recF v​ olvió a las células aún más susceptibles a la luz UV pero no
redujo el número de reversiones ​his​+ ​por célula sobreviviente.

Sin embargo, las mutaciones en ​recA m​ ostraron prevenir la mutagénesis por UV (Tabla 11.1)
Aunque estas mutaciones vuelven a las células extremadamente sensibles a la luz UV, las pocas sobrevivientes
no contienen mutaciones adicionales. Ahora sabemos que dos genes, ​umuC y​ ​umuD​, deben ser inducidos para
la reparación mutagénica y que las mutaciones en ​recA p ​ revienen su inducción. Por lo tanto, las proteínas
UmuC y UmuD, en lugar de reparar el daño producen los errores ellas mismas.
Aislamiento de mutantes ​umuC y ​ ​umuD

Una vez que se estableció que en su mayoría la mutagénesis después de la irradiación UV se

puede atribuir a los productos de los genes SOS inducibles, el siguiente paso fue determinar cuáles eran esos
genes. Es importante notar que los productos de estos genes trabajan de manera opuesta a la mayoría de los
genes de las rutas de reparación:

1. ​Las mutaciones que inactivan un gen ​mut u ​ otro gen de una ruta de reparación aumenta la tasa de
mutaciones espontáneas porque normalmente los productos de estos genes reparan el daño antes que
produzca errores en la replicación. ​2. ​Las mutaciones que inactivan un gen de una ruta de reparación
mutagénica o una ruta de reparación propensa a error, tienen un efecto opuesto: disminuyen la tasa de
algunas mutaciones. Ya que la ruta de reparación es mutagénica en sí, las mutaciones deberían ser menos
frecuentes si esta ruta no existe.

Las mutaciones que reducen la frecuencia de mutantes después de la irradiación UV cayeron

dentro de dos genes, llamados ​umuC ​y ​umuD (​ por “mutaciones C y D inducidas por UV”). Las primeras
mutantes en estos genes se aislaron con el mismo método: reversión de una mutación ​his ​que hace que las
células requieran histidina para poder medir tasas de mutaciones. La estrategia básica fue tratar la mutante ​his
con un mutágeno que induce daño en el ADN similar al que produce la radiación UV e identificar bacterias
mutantes que sean revertantes ​his​+​. Estas mutantes tendrán una segunda mutación que inactivó la ruta de
reparación mutagénica y redujo la tasa de reversión de la mutación ​his.​

La Figura 11.19 muestra la selección en mayor detalle. La mutante en ​his d ​ e ​E. coli ​se
mutagenizó, por lo que algunas de las bacterias tendrán mutaciones en los genes de reparación mutagénicos.
Las colonias se replicaron en una placa que contenía histidina. Luego, cada colonia formada en esta placa se
replicó en otra placa que tenia 4NQO (produce daño en el ADN similar al que produce la radiación UV) e
histidina. Luego de incubar esta placa (Placa 2), se replicaron las colonias en una tercera placa (Placa 3) que no
contenía histidina. La mayoría de las colonias que tenían regiones con revertantes His​+​, indicando que fueron
mutagenizadas por 4NQO.

El siguiente paso fue mapear las mutaciones en algunas de

las mutantes. Algunas de las mutaciones mapeadas que prevenían la
mutagénesis por radiación UV fueron mutaciones en ​recA ​o ​lexA​. Las
mutaciones en ​recA ​probablemente inactivan la actividad coproteasa de la
proteína RecA, evitando que provoque el autoclivaje del represor LexA y por
lo tanto prevenir la inducción de los genes SOS. Las mutaciones en ​lexA
probablemente cambian el represor por lo que no puede clivarse,
seguramente porque fue alterado algún aminoácido cercano al sitio de
clivaje. Este tipo de mutación ​lexA s​ e denominó mutación Ind​- ​(​lexA ​(Ind​-​)).

Algunas de las mutaciones que prevenían la mutagénesis

por UV se mapearon en un locus distinto de donde estaban ​recA ​y ​lexA.​ Los
ensayos de complementación entre mutaciones en estos locus revelaron
dos genes que se denominaron ​umuC ​y ​umuD​. Experimentos más tarde
mostraron que estos genes son parte de un operón (​umuDC)​ y que por lo
tanto se transcriben ambos genes en un único ARNm y que además ​umuD
se transcribe primero. Los experimentos con fusiones ​lacZ ​demostraron que
el operón ​umuDC s​ e induce por luz UV y es un operón SOS porque está
bajo el control de LexA.

Experimentos que muestran que sólo los genes ​umuC ​y

​ eben ser inducidos para la mutagénesis SOS
umuD d

El hecho de que ​umuC ​y ​umuD ​son inducibles por el daño del ADN y se requieren para la
mutagénesis SOS no significa que eran los únicos genes requeridos para esta vía. En los experimentos que
realizaron para poder determinar esto usaron mutantes ​lexA (​ Ind​-​) que, como mencionamos, deberían
permanentemente reprimir todos los genes SOS. También mutaron el sitio
operador del operón ​umuDC ​para que estos genes se expresen constitutivamente y no estén más bajo el
control del represor LexA. Bajo estas condiciones, los únicos productos de los genes SOS que deberían estar
presentes son los de los genes ​umuD ​y ​umuC​, ya que todos los otros están reprimidos por el represor LexA
(Ind​-​). Además, se usó una forma más corta del gen ​umuD.​ Este gen alterado sintetiza sólo el carboxilo terminal
de la proteína UmuD (fragmento UmuD’) que es la forma activa para la mutagénesis SOS (ver a continuación).

Los experimentos mostraron que la radiación UV es mutagénica si UmuC y UmuD’ se expresan

constitutivamente, aún si las células son mutantes ​lexA ​(Ind​-​), indicando que los genes ​umuC ​y ​umuD s​ on los
únicos genes que necesitan ser inducidos por la radiación UV para la mutagénesis SOS. Sin embargo, este
resultado no elimina en su totalidad la posibilidad de que otros genes SOS estén involucrados. Como
discutiremos a continuación, la proteína RecA se requiere para la mutagénesis por UV. Las proteínas GroEL y
GroES también son requeridas para la mutagénesis por UV probablemente porque ayudan a plegar las
proteínas de la reparación mutagénica, pero los genes ​groEL ​y ​groES n
​ o están bajo el control del represor
LexA.

Experimentos que muestran que RecA tiene un rol en la mutagénesis por UV además de
su rol como coproteasa

Experimentos similares mostraron que RecA se requiere en la mutagénesis por UV además de

su rol como coproteasa en el autoclivaje de LexA y UmuD (a UmuD’) (ver a continuación). Las mutantes que
expresan UmuC y UmuD’ constitutivamente podrían responder esta cuestión. Si sólo se requiere la actividad
coproteasa de RecA en el TLS, las mutaciones en ​recA n ​ o deberían afectar la mutagénesis por UV. Sin
embargo, se encontró que las mutaciones ​recA ​previenen la mutagénesis por UV. Esto inspiró el modelo de que
la polimerasa mutagénica UmuD’​2​C sólo puede replicar sobre el ADN que estaba en un filamento de
núcleo-proteína de RecA (ver a continuación y Figura 11.21).

MECANISMO DE INDUCCIÓN DE LA MUTAGÉNESIS SOS

Como vimos, las proteínas UmuC y UmuD promueven la mutagénesis y le permiten a ​E. coli
tolerar el daño en su ADN. La proteína UmuC es una ADN polimerasa que, en contraste con la ADN polimerasa
normal, puede replicar sobre algunos tipos de daño del ADN, incluyendo los dímeros de timina y los dímeros
6-4 citosina-timina provocados por radiación UV. También puede replicar sobre sitios en donde la/s base/s han
sido removidas por una glicosilasa (ver a continuación); por lo tanto, no requiere un apareamiento correcto de
bases antes de moverse. Es por eso que recibe el nombre de ​ADN polimerasa V ​y es capaz de replicar sobre
el ADN dañado o lesiones. Esto responde la pregunta de por qué UmuC es tan mutagénica: ya que los dímeros
de timina y otros tipos de bases dañadas no se aparean apropiadamente, la ADN polimerasa V debe incorporar
bases al azar en oposición a las bases dañadas, provocando mutaciones.

La Figura 11.20 muestra por qué la mutagénesis SOS ocurre sólo después de un daño muy extenso del ADN.
Después de que el ADN ha sido muy dañado y el represor LexA se autoclivó y el operón ​umuDC s​ e indujo, junto
con los otros genes SOS, las proteínas UmuC y UmuD se juntan para formar un complejo heterotrimérico con
dos copias de la proteína UmuD y una copia de la proteína UmuC (UmuD​2​C). Al mismo tiempo, se acumulan
filamentos de núcleo-proteínas de RecA unidos a ADN simple hebra y producen el clivaje de UmuD (para formar
UmuD’). Una vez que se formó UmuD’, la proteína UmuC en el complejo UmuD’​2​C es activa como una ADN
polimerasa translesión y replica por sobre el daño en el ADN. Esto permite que la replicación avance por sobre
el daño y que la célula sobreviva, pero con el precio de que se aumente la frecuencia de mutaciones entre las
células sobrevivientes.

El complejo UmuD​2​C que contiene la proteína UmuD no clivada, también cumple un rol antes de que UmuD sea
clivada. La superproducción de estas proteínas inhibe la replicación a bajas temperaturas, aun en ausencia de
ADN dañado. Esto ha sido interpretado como que las proteínas UmuC y UmuD podrían inhibir la replicación
después de que se induzcan, creando un punto de chequeo (​checkpoint​) y darle más tiempo a los otros
sistemas de reparación para que funcionen antes de que la replicación continúe.

MECANISMO DE SÍNTESIS TRANSLESIÓN A TRAVES DEL COMPLEJO UmuD’​2​C

 Rol de la reparación mutagénica

Durante toda la explicación de la respuesta SOS asumimos que este mecanismo de reparación
mutagénico era el último intento de la célula para poder sobrevivir a un daño en el ADN muy importante. Sin
embargo, la función real de este mecanismo sigue siendo un misterio. Si esta explicación fuese correcta, las
mutantes en ​umuC ​y ​umuD ​que carecen de la reparación mutagénica deberían ser mucho más sensibles que
las bacterias WT frente a los agentes que dañan extensivamente el ADN. Sin embargo, las mutaciones que
inactivan estos genes vuelven a ​E. coli ​sólo ligeramente más sensibles a ser eliminadas por radiación UV y
otros agentes que dañan el ADN. Una manera de explicar esto es que UmuC y UmuD protegen contra tipos de
agentes que dañan el ADN distintos de los que se probaron. Otra posibilidad es que UmuC y UmuD ofrecen
mayor protección contra el daño del ADN bajo condiciones distintas de las que existen en el laboratorio.

RESUMEN DE LAS RUTAS DE

REPARACIÓN EN ​E. coli

La Tabla 11.2 muestra las

rutas de reparación que se discutieron y
algunos de los genes que participan en cada
ruta.