Guia de Laboratorio 2014

GUÍAS DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL
CÓDIGO DE CURSO: 358010

DIRECTORA DE CURSO: DIANA GARCÍA VARGAS
UNAD
UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD Escuela de Ciencias
Agrícolas, Pecuarias y del Medio Ambiente Protocolo de prácticas de la Escuela –
Pág.
4 PRACTICA No.1. NORMAS BIOSEGURIDAD/ ELEMENTOS DE LABORATORIO

10 PRACTICA No. 2. METODOS DE SIEMBRA
18 PRACTICA No. 3. TÉCNICAS DE TINCIÓN.
25 PRACTICA No. 4. OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE HONGOS

28 PRACTICA No. 5. MEDIOS DE CULTIVO DIFERENCIALES Y SELECTIVOS
30 PRACTICA No. 6. PRUEBAS DE REACCIONES BIOQUIMICAS
32 PRACTICA No. 7. CONTROL DEL CRECIMIENTO BACTERIANO
37 PRACTICA No. 8. OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE CIANOBACTERIAS
41 PRACTICA No. 9. RECUENTO DE UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS
48 PRACTICA No. 10. PRUEBAS DE ANTAGONISMO
3
UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD
Escuela de Ciencias Agrícolas, Pecuarias y del Medio Ambiente
Protocolo de prácticas de la Escuela – versión 2011
TEORÍA PRACTICA No.1 BIOSEGURIDAD EN EL

LABORATORIO
Los laboratorios de microbiología están regidos por normas de seguridad e higiene que deben
cumplirse a cabalidad para garantizar la protección contra infecciones de los estudiantes u otro
personal que labora en estas instalaciones, así como garantizar la calidad de las técnicas y la
confiabilidad de los resultados.
1.1. Las siguientes medidas son de obligado cumplimiento en cualquier área del
laboratorio:
1.1.1. El acceso al laboratorio estará limitado al personal autorizado.

1.1.2. El personal del laboratorio debe implicarse en el cumplimiento de las normas de
seguridad.
1.1.3. Todas las áreas estarán debidamente marcadas con la señal de riesgo biológico y su nivel
de contención.
1.1.4. Las puertas y ventanas deben permanecer cerradas para mantener la adecuada contención
biológica.
1.1.5. Todas las superficies de trabajo se limpiarán y desinfectarán diariamente y siempre que
se produzca un derrame.
1.1.6. Los residuos y muestras peligrosas que van a ser incinerados fuera del laboratorio deben
ser transportados en contenedores cerrados, resistentes e impermeables siguiendo las normas
específicas para cada tipo de residuo.
1.1.7. El laboratorio debe permanecer limpio y ordenado y no es aconsejable utilizar los
pasillos como almacén. Siempre debe quedar un espacio libre no inferior a 120 cm para poder
evacuar el laboratorio en caso de emergencia.
1.1.8. El transporte de las muestras dentro o entre laboratorios se realizará de tal manera que, en
caso de caída, no se produzcan salpicaduras. Lo recomendable es hacerlo en cajas herméticas o
neveras transportables. Estas cajas o neveras deberán ser rígidas y resistentes a los golpes,
contar con materiales absorbentes en su interior y de fácil desinfección. Se etiquetarán o
identificarán de forma oportuna y no podrán ser utilizadas para otros fines. Bajo ningún
concepto se deben transportar las muestras a mano.
1.1.9. La ropa protectora, fácilmente ajustable y confortable, así como guantes, gafas, etc.; debe
estar disponible en todo momento. La ropa protectora de las áreas con nivel de contención 3 (batas)
nunca debe ser usada fuera del área de trabajo y si se quita debe de ser desechada automáticamente
en una bolsa de material contaminado. Jamás debe volver a ser usada.
1.1.10. Todo el personal debe poner especial cuidado en evitar el contacto de la piel con
materiales potencialmente infecciosos. Con este fin deben usarse guantes cuando se manipulen
muestras o cultivos que contengan posibles patógenos. Los guantes siempre serán desechados
antes de salir del área de trabajo. Jamás se saldrá de la misma con los guantes puestos, ni con
ellos se cogerá el teléfono, se tocarán las hojas de examen, maniguetas de las puertas, etc.
1.1.11. Tras quitarse los guantes, se realizará un lavado de manos.
1.1.12. Se usarán gafas protectoras y mascarillas faciales si existe riesgo de salpicaduras y/o
aerosoles.
1.1.13. Se pondrá extremo cuidado en minimizar el riesgo de auto-inoculación y de generación
de aerosoles.
1.1.14. Los derrames y accidentes deben ser informados inmediatamente al Supervisor y al Jefe
del Laboratorio y hacerse constar por escrito.
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Protocolo de prácticas de la Escuela –
1.1.15. Está rigurosamente prohibido pipetear con la boca. Se realizará pipeteo automático con
material adecuado y cada trabajador será instruido para manejarlo debidamente.
1.1.16. En la zona de trabajo no debe colocarse material de escritorio ni libros ya que el papel
contaminado es de muy difícil esterilización.
1.1.17. No deberán usarse lentes de contacto.
1.1.18. El personal con el cabello largo debe llevarlo recogido.
1.1.19. Comer, beber, fumar y aplicarse cosméticos esta formalmente prohibido en el área de
trabajo del laboratorio, así como el almacenamiento de comida o bebida.
1.1.20. El personal debe lavarse las manos frecuentemente durante las actividades rutinarias,
tras acabar la jornada laboral y siempre antes de abandonar el laboratorio (almorzar). Se usará
un jabón antiséptico y el secado se realizará con papel.
1.1.21. Las heridas y cortes en las manos, si se han producido en el Laboratorio, serán comunicados
al responsable de la Sección correspondiente, así como al Supervisor de Bioseguridad que lo
registrará haciendo constar todas las circunstancias. Las heridas y cortes deben ser
convenientemente vendados y después es imprescindible ponerse guantes.
1.2. Clasificación de los microorganismos infecciosos por grupo de riesgo
1.2.1. Grupo de riesgo 1 (riego individual o poblacional escaso o nulo)

1.2.2. Microorganismos que tienen pocas probabilidades de provocar enfermedades en el ser
humano o los animales
1.2.3. Grupo de riesgo 2 (riego individual moderado, riesgo poblacional bajo)
1.2.4. Agentes patógenos que pueden provocar enfermedades humanas o animales pero que
tienen pocas probabilidades de entrañar un riesgo grave para el personal de laboratorio, la
población, el ganado o el medio ambiente. La exposición en el laboratorio puede provocar una
infección grave, pero existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces y el riesgo de
propagación es limitado.
1.2.5. Grupo de riesgo 3 (riego individual elevado, riesgo poblacional bajo)
1.2.6. Agentes patógenos que suelen provocar enfermedades humanas o animales graves, pero
que de ordinario no se propagan de un individuo a otro. Existen medidas preventivas y terapéuticas
eficaces.
1.2.7. Grupo de riesgo 4 (riesgo individual y poblacional elevado)
Agentes patógenos que suele provocar enfermedades graves en el ser humano o los animales y
que se transmiten fácilmente de un individuo a otro, dicta o indirectamente. Normalmente no
existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces.
Tipos de laboratorios:
Nivel de bioseguridad 1 Laboratorio básico

Nivel de bioseguridad 2 Laboratorio básico
Nivel de bioseguridad 3 Laboratorio de contención
Nivel de bioseguridad 4 Laboratorio de contención
máxima
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1.3. Código de prácticas en laboratorios básicos

1.3.1. Acceso: el símbolo y signo internacional de peligro biológico (Figura 1) debe colocarse
en las puertas de loa locales donde se manipulen microorganismos del grupo de riesgo 2 o
superior.
1.3.2. Protección personal: se debe usar todo el tiempo batas o uniformes especiales para el
trabajo en el laboratorio. Usar guantes protectores apropiados con materiales potencialmente
infecciosos.
1.3.3. Procedimientos: es estrictamente prohibido pipetear con la boca. Colocarse material y/o
etiquetas en la boca. Se mantendrá un registro de accidente e incidentes que ocurren en el
laboratorio. Se elaborará y seguirá un procedimiento escrito para la limpieza de todos los
derrames. Los líquidos contaminados deberán descontaminarse antes de ser descartados.
1.3.4. Zona de trabajo del laboratorio: se mantendrá ordenado, limpio y libre de materiales
no relacionados con el trabajo. Las superficies de trabajo deben permanecer descontaminadas.
Las ventanas que puedan abrirse deben estar equipadas de rejillas para evitar el ingreso de
artrópodos.
1.3.5. Diseño e instalaciones del laboratorio: inicialmente se debe prestar especial atención a
los problemas que puedan causar problemas en la bioseguridad, Entre ellos están: la formación
de aerosoles, el trabajo con grandes cantidades o altas concentraciones de microorganismos, el
exceso de personal o material, la infestación por roedores o artrópodos, la entrada de personas
no autorizadas y el circuito de trabajo.
1.4. Normas de trabajo en el laboratorio de microbiología
1.4.1. Desinfectar el área de trabajo
1.4.2. Prender el mechero antes de comenzar a trabajar
1.4.3. Al utilizar el asa bacteriológica, debe calentarse en toda su extensión el alambre a la
llama del mechero hasta que se ponga roja. Este proceso debe hacerse antes y después del uso.
1.4.4. Durante las siembras, el tubo debe mantenerse en la mano izquierda y el tapón en la
mano derecha sostenido entre el dedo meñique y la palma de la mano, cerca de la llama del
mechero, con esta misma mano debe cogerse el asa entre el dedo índice y el pulgar. El correcto
manejo de los tubos evitara contaminaciones cruzadas en los cultivos.
1.4.5. Flamear la boca de los tubos después de quitarles el tapón y antes de volverlo a colocar
para evitar la formación de aerosoles o la contaminación del contenido del tubo.
1.4.6. Destapar las cajas de petri manteniendo la base y la tapa simultáneamente en la mano
izquierda, abriendo la caja parcialmente y cerca de la llama del mechero.
1.4.7. Los escobillones o baja lenguas deben quemarse en la llama del mechero, se deja enfriar
y se descarta.
1.4.8. Todo el material que se use en microbiología de estar estéril.

1.4.9. El material se debe marcar con cinta de enmascarar antes de llevarlo a la incubadora. Las
cajas de Petri se marcan en el borde de la base para evitar que tapen las superficies de los
cultivos.
6
FIGURA 1. Señal de advertencia de peligro biológico para las puertas del laboratorio.
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
BENSON, HAROLD J. Microbiological applications: Laboratory Manual in General
Microbiology. McGraw – Hill. U.S.A. 1998.
COLLINS, C. H. and M LYNE, PATRICIA. Traducción del ingles por José María Tarazona
Vilas. Métodos microbiológicos. Editorial ACRIBIA, S. A. ZARAGOZA (España). 1989.
OMS – Organización Mundial de la Salud. Manual de bioseguridad en el laboratorio.
Ginebra. 2005.
7
PRÁCTICA No. 1
DE RECONOCIMIENTO DEL LABORATORIO Y MATERIALES DE
MICROBIOLOGIA
1. ¿Qué características debe reunir el vidrio utilizado para la fabricación del material de
cristalería para los laboratorios y por qué?
2. Explique brevemente las ventajas y desventajas del uso de materiales de vidrio y de plástico,
respectivamente, en los laboratorios de microbiología.
3. Describa, ilustre y clasifique los siguientes materiales, indicando el uso que se les da en el
laboratorio de microbiología (Sea breve, se le sugiere elaborar un cuadro):
a) Portaobjetos
b) Cubreobjetos
c) Cajas de Petri
d) Pipetas graduadas (terminales y no terminales)
e) Pipetas Pasteur
f) Tubos de ensayo (tipos)
g) Matraces (tipos)
h) Probetas (tipos)
i) Tubos de Durham
j) Asas de inoculación (tipos)
k) Mecheros (tipos)
l) Estufas bacteriológicas (tipos)
m) Baño bacteriológico
n) Horno Pasteur
o) Autoclave
p) Jarra de anaerobiosis
q) Centrífuga
r) Nefelómetro de Mac Farland
s) Membranas Millipore
t) Cuenta colonias
4. Ilustre un Microscopio óptico de campo claro con los nombres de todas sus partes.
5. Enliste detalladamente todas las medidas que se requiere tomar en cuenta para el manejo
correcto y cuidados del microscopio compuesto.
6. Enliste detalladamente todos los pasos que se requiere seguir para enfocar imágenes en un
microscopio compuesto.
7. Defina los siguientes términos en microscopía: Límite de resolución, poder de resolución y
poder de amplificación, indicando la fórmula mediante la que se calculan cada uno.
8. Mencione los tipos de microscopio electrónico que existen actualmente y cuáles son las
diferencias y ventajas que usted considera más importantes entre estos y el microscopio óptico
cuando se trabaja en un laboratorio de microbiología.
9. ¿Cuál es la utilidad del asa recta y redonda?
10. ¿Qué se entiende por resiembra o pase bacteriano?
8
QUIZ No. 01.

1. ¿Qué se entiende por resiembra o pase bacteriano?
2. ¿Cuál es la utilidad del asa recta y del asa curva?
3. ¿Cómo se esteriliza un medio de cultivo en microbiología?
4. ¿Cuáles son las condiciones de esterilización en seco, que equipo se usa y para qué
materiales está destinada?
5. ¿Cómo se esterilizan elementos con filo como cuchillas, tijeras, entre otros?
6. ¿Qué utilidad tiene la esterilización en frío?
7. ¿Qué es la tindalización?
9
PRACTICA No.2. MÉTODOS DE SIEMBRA –

PARTE A
La inoculación de medios de cultivo para la recuperación, mantenimiento y/o aislamiento de

microorganismos, es un procedimiento fundamental e importante. Debe tenerse cuidado con las
técnicas de siembra microbiana para evitar en lo posible la contaminación por otros
microorganismos diferentes al deseado.
MATERIALES
1. Muestra contaminada con microorganismos

2. Agua peptonada al 0,1% estéril
3. Agar nutritivo en caja de Petri
4. Asa redonda
5. Gradilla
6. Mechero
7. Incubadora
8. Vinipel
9. Marcador de vidrio
PROCEDIMIENTO
1. Desinfectar el área de trabajo, prender el mechero y preparar el material de trabajo.

2. Coger parte de la muestra y colocarla en el tubo de ensayo que contiene el agua peptonada.
Homogenizar.
3. Dejar 20 – 30 minutos en incubación los tubos.
4. Realizar un diagrama de aislamiento de colonias, en un circulo de papel (8 cm) para ponerlo
debajo de la caja de Petri (Figura 1)
5. Finalizado el tiempo de incubación tomar el asa redonda y esterilizarla por calor hasta que
está esté roja, dejar enfriar cerca al mechero.
6. Abrir el tubo con la muestra y tomar una asada.
7. Cerrar el tubo y colocarlo en la gradilla. Teniendo cuidado de que el asa no toque nada y de
no pasarla por encima del mechero, pero siempre estar cerca de este
8. Abrir la caja de Petri y seguir el esquema para el aislamiento.
9. Terminado la siembra, marcar las cajas en el borde de la base de la caja y envolverla en papel
vinipel.
10. Colocar el tubo y la caja a incubar a 37°C. La caja debe estar boca abajo siempre.
11. Desinfectar el área de trabajo, apagar el mechero y entregar el material
10
Figura 1. Técnica de aislamiento de colonias
Este procedimiento se denomina aislamiento de bacterias, debido a que las bacterias

presentes en una muestra se distribuyen sobre la superficie de un agar, y cada célula se
reproduce independientemente hasta formar un conglomerado de bacterias observables a
simple vista (colonia bacteriana). De esta manera es posible observar sobre la superficie del
medio, colonias de diferentes características en cuanto a forma, superficie, borde, forma,
color, aspecto y elevación, lo que indica microscópicamente presencia de diferentes tipos
microbianos en la muestra. Así se puede estudiar e identificar independientemente cada
especie.
11
RESULTADOS – PARTE A
Fecha:
12
PRACTICA No.2. MÉTODOS DE SIEMBRA – Parte B
Figura 2. Técnica de aislamiento de colonias por el método de rejilla.
Figura 3. Técnica de aislamiento de colonias por el método francés.
13
Figura 4. Morfología macroscópica (UFC)
Figura 5. Siembra en medio líquido
14
Figura 6. Siembra en medio semisólido con superficie plana
Figura 7. Siembra en medio sólido con superficie inclinada
Similar a la obtención de Unidades Formadoras de Colonias (UFC) en una caja de Petri se puede
evaluar el crecimiento en un medio líquido o en un medio sólido.
Figura 8. Crecimiento en medio líquido
15
Figura 9. Patrón de crecimiento en medio sólido
REFERENCIAS
ESCOBAR de RICO, M. Fundamentos de microbiología. Editorial CEJA. 1999.

CARMONA P, G. L. Manual de laboratorio microbiología general. Corporación universitaria
LaSallista. 2001.
16
RESULTADOS – PARTE B
Fecha:
17
CUESTIONARIO – PRACTICA No.3.

1. ¿Qué se entiende por maduración de un colorante?
2. ¿En qué momento se deben filtrar los colorantes y por qué?
3. ¿Por qué razón los colorantes deben guardarse en frascos de color ambar?
4. ¿Cuáles son los colorantes más utilizados en microbiología y por qué?
5. ¿Describa una coloración para teñir el núcleo bacteriano?
6. ¿Qué utilidad tiene la tinción con sudan III?
7. ¿Mencione 5 razones de la selectividad de las bacterias por los colorantes de Gram?
18
PRÁCTICA No.3. TÉCNICAS DE TINCIÓN.

MATERIALES
1. Láminas
2. Laminillas
3. Agua destilada estéril
4. Asas bacteriológicas redonda y asa recta
5. Mechero
6. Azul de metileno
7. Cristal violeta
8. Lugol
9. Alcohol cetona
10. Fucsina básica o safranina
11. Tinta china
12. Microscopio óptico
13. Colonias aisladas de bacterias para observación de bacterias
14. Guantes de látex
PROCEDIMIENTO
1. Coloración simple
a. En una lámina portaobjetos limpia, colocar una gota del agua destilada estéril (trabajo con
muestra sólida) o una gota del cultivo bacteriano (trabajo con muestra liquida) sobre la misma y
con ayuda del asa redonda estéril extender la gota de suspensión a un área no superior a dos
centímetros cuadrados.
b. Dejar que la preparación se seque al aire. Fijar con calor, pasando tres veces seguidas a
través de la llama del mechero.
c. Dejar enfriar la lámina. Lo anterior se conoce como la realización de un frotis y se hace para
coloraciones donde la muestra debe ser fijada y luego si iniciar las coloraciones respectivas.
d. Colocar la preparación sobre una rejilla encima del vertedero.
e. Cubrir la suspensión con algún colorante dado por el profesor, así:
i. Cristal violeta: 1 minuto
ii. Azul de metileno: 5 minutos
iii. Fucsina: 1 minuto
f. Terminado el tiempo de coloración según el colorante empleado, eliminar el colorante
lavando con agua suavemente.
g. Dejar secar y colocar la preparación en la platina del microscopio y observar con el objetivo
de menor aumento inicialmente hasta llegar al objetivo de 100X (ver figura 1).
19
Figura 1. Observación de imágenes en el microscopio óptico.
20
2. Coloración compuesta
a. Realizar un frotis de la muestra seleccionada

b. Colocar en la rejilla para coloración y cubrir el frotis con cristal violeta esperando que
transcurra 1 minuto. Lavar con agua el colorante.
c. El segundo colorante es el lugol, el cual se deja por 1 minuto sobre el frotis
d. Realizar la decoloración con la mezcla alcohol-acetona, por 25 segundos. Lavar
inmediatamente con agua.
e. Finalmente adicionar el colorante de contraste, fucsina o safranina, por 30 segundos. Lavar
con agua.
f. Escurrir el exceso de agua, dejar secar y montar al microscopio para hacer las observaciones
respectivas.
Figura 2. Tinción de Gram
21
Figura 3. Morfología Microscópica bacteriana.
22
3. Coloraciones especiales.
a. Coloración de Glicocálix con Rojo Congo
Emulsionar la muestra con una (1) gota de rojo congo y dejar secar la lámina a temperatura
ambiente. Al estar seca la lámina sumergirla en HCl 1N con ayuda de una pinza y teniendo cuidado
de no tocar o salpicar el ácido sobre la piel. Luego lavar con agua teniendo cuidado de no hacerlo
sobre la tinción. Poner azul de metileno sobre la tinción inicial por tres (3) minutos y terminado
este tiempo lavar la lámina con agua. Montar al microscopio la lámina cuando esté seca y hacer
las observaciones respectivas.
b. Coloración de Glicocálix con Tinta China
En el centro de un portaobjetos se coloca una gota de agua, otra de tinta china y un poco del
cultivo bacteriano a estudiar. Todo se debe mesclar suavemente y sin extender. Seguidamente
colocar un cubreobjetos sobre la suspensión y presionar suavemente evitando la formación de
burbujas. Observar inmediatamente al microscopio y desechar el material en un recipiente
con antiséptico.
23
RESULTADOS
Fecha:
24
PRACTICA No. 4. OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE HONGOS

La célula fúngica es similar a cualquier organismo eucarionte, aunque existen diferencias
subcelulares entre la célula de un hongo inferior a la de uno superior. Cuando se estudian los
hongos se pueden observan dos grandes grupos: los algodonosos, que se conocen con el
nombre de mohos y otros que forman colonias húmedas y se conocen como levaduras.
MATERIALES
1. Cultivo de hongos
2. Láminas portaobjetos
3. Laminillas
4. Azul de lactofenol
5. Microscópio
PROCEDIMIENTO
Colocar en el centro de la lámina portaobjeto una gota de azul de lactofenol, luego tomar con el
asa micológica previamente esteril parte del hongo y resuspenderlo en la gota del colorante.
Colocar luego una laminilla encima de esta preparación y esperar 3 minutos. Finalizado este
tiempo montar al microscópio y observar en 10X y 40X.
CUESTIONARIO PRÁCTICA No.4
1. Dibuje:
Hifa septada Hifacenocítica
Artroconidios Conidios
25
Esporangiosforo Blastoconidia
Cuerpo fructífero de un Aspergillus y nombre sus partes
Cuerpo fructífero de un Penicillium y nombre sus partes
Cuerpo fructífero y macroconidias de un Fusarium y nombre sus partes
Cuerpo fructífero y nacroconidias de una Alternaria y nombre sus partes
Cuerpo fructífero de un Rhizopus y de un Mucor y nombre sus partes
26
RESULTADOS PRÁCTICA No.4 OBSERVACIONES HECHAS EN EL

LABORATORIO
27
CUESTIONARIO – PRACTICA No. 05.
1. ¿Cuál es la diferencia entre adaptación evolutiva y adaptación fisiológica de los

microorganismos, con respecto a la ubicuidad?
Escriba que significan los siguientes términos.
Aptación:
Abaptación:
Exaptación:
2. ¿Cuál medio de cultivo se usa para coliformes totales CT y Coliformes fecales CF como
bioindicadores de aguas?
28
3. ¿Cuál es la utilidad microbiológica de los medios de cultivo simples; enriquecidos;

diferenciales; de prueba; para recuento; bioquímico y de mantenimiento?
29
PRACTICA No. 6. MEDIOS DE CULTIVO DIFERENCIALES Y

SELECTIVOS
Los medios de cultivo permiten estudiar los microorganismos en un ambiente artificial el cual
debe ser semejante a su medio natural, que incluya nutrientes (proteínas, péptidos y
aminoácidos), energía (carbohidratos), metales y minerales esenciales (Ca, Mg, Fe, trazas de
metales: PO3, SO4), agentes tampón (fosfatos, acetatos), indicadores de pH (rojo de fenol,
púrpura de bromocresol, rojo neutro), agentes selectivos (productos químicos, antibacterianos)
y agentes gelificantes (normalmente agar pero algunas veces se usa gelatina, carragenatos,
alginatos, silica gel).
De acuerdo a la composición y a la combinación de los anteriores ingredientes mencionados los

medios de cultivo se pueden clasificar en: líquidos, semisólidos, sólidos, simples enriquecidos,
selectivos, diferenciales, bioquímicos y de mantenimiento.
MATERIALES
1. Agar EMB (selectivo para enterobacterias patógenas)

2. Agar Baird Parker (selectivo para estafilococos)
3. Agar Salmonella – Shigella
4. Agar selectivo de Bacillus cereus
5. Muestra de lixiviados de basura
PROCEDIMIENTO
Sembrar la muestra en cada caja de Petri por medio del método ecométrico y determinar el
índice de crecimiento absoluto (ICA).
30
RESULTADOS
Fecha:
31
PRACTICA No.7.REACCIONES BIOQUIMICAS

Las pruebas bioquímicas consisten en distintos test químicos aplicados a medios biológicos, los
cuales, conocida su reacción, nos permiten identificar distintos microorganismos presentes. Su
sistema de funcionamiento generalmente consiste en determinar la actividad de una vía
metabólica a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al
crecer incorpora o no. Para realizar las pruebas bioquímicas se dispone de múltiples medios, los
cuales se deben aplicar de acuerdo a las exigencias del microorganismo en estudio.
CUESTIONARIO PRÁCTICA No.7

COLOREAR LOS TUBOS
PRUEBA DEL CITRATO
ANTES DESPUÉS
PRUEBA DEL TRIPLE AZUCAR HIERRO
ANTES DESPUÉS
32
PRUEBA DE SULFUROS-INDOL-MOTILIDAD
ANTES DESPUÉS
PRUEBA DE OXIDACION
ANTES DESPUES
33
PRUEBA DE FERMENTACIÓN
ANTES DESPUÉS
PRUEBA DE UREA
ANTES DESPUÉS
34
PRUEBA DE ROJO DE METILO
ANTES DESPUÉS
PRUEBA DE VOGUES PROSKAWER
ANTES DESPUÉS
35
COLORACION DE GRAM
GRAM NEGATIVA
GRAM POSITIVA
IDENTIFICACION CON TABLA DE PRUEBAS BIOQUIMICAS:
Escriba el género y especie (Posible microorganismo identificado):
ANEXO
El estudiante debe llevar al laboratorio la tabla de lectura de pruebas bioquímicas para
bacterias (+ -)
36
CUESTIONARIO – PRACTICA 08.
1. Defina:
Neutrófilo:
Acidófilos:
Alcalinófilo:
Sacarófilos:
Halófilo:
osmosis:
presión
osmótica:
plasmólisis:
lisis:
2. ¿Todos los microorganismos osmófilos son halófilos?
37
3. ¿Los microorganismos xerófilos pueden ser simultáneamente sacarolíticos?
4. ¿Cómo actúa la luz ultra violeta sobre las bacterias para inhibir o eliminar su desarrollo,
explique desde el punto molecular y metabólico?
5. ¿Qué tiene de especial H. salinarium?
38
PRACTICA No.8. CONTROL DEL CRECIMIENTO

BACTERIANO
Los factores físicos y químicos tienen un efecto notable sobre la vida de los microorganismos
en su medio ambiente natural. Algunos estimulan su desarrollo en tanto que otros lo retardan o
lo impiden. El conocimiento del efecto de esos parámetros medio ambientales no solo permitió
estudiar los microorganismos bajo condiciones controladas de laboratorio para favorecer su
crecimiento sino que posibilitó aprender la forma de controlarlos.
MATERIALES
Cultivo de un microorganismo Gram - positivo

Cultivo de un microorganismo Gram - negativo.
Medio de cultivo nutritivo en cajas de Petri con diferentes pH’s.
Medio de cultivo nutritivo en cajas de Petri con diferentes concentraciones de NaCl.
Medio de cultivo nutritivo en cajas de Petri
Caldo nutritivo
Pipetas estériles de 1 y 2 mL
Estufa
Vaso de precipitado de 500 mL
Incubadora
PROCEDIMIENTO
1. ACCIÓN DE LA TEMPERATURA
Suspender una colonia del microorganismo seleccionado en el caldo nutritivo y dejarlo por
media hora para un desarrollo de los microorganismos en el medio de cultivo. Luego tomar
0.1 mL del medio y sembrarlo sobre el medio sólido del agar nutritivo. Llevar el caldo nutritivo
donde se inoculo el microorganismo a la estufa y ponerlo a ebullición por el tiempo dado por
el profesor y sembrar como al inicio. Llevar las dos cajas de Petri e incubarlas a 37oC.
2. ACCION DEL pH
Dividir la base de las cajas en dos cuadrantes con el marcador de vidrio y con el asa redonda
sembrar por estrías en un cuadrante el microorganismo Gram-negativo y en el otro el Gram-
positivo. Realizar este procedimiento con todas los medios de diferentes pH.
3. ACCIÓN DE LA PRESIÓN OSMÓTICA
positivo.
39
4. ACCIÓN DE LA LUZ ULTRAVIOLETA
positivo. Seguidamente tapar la mitad de la caja con papel de aluminio y colocar sobre la otra
parte de la caja la luz ultravioleta por 5 y/o 10 minutos, tapar la caja y llevar a incubar.
RESULTADOS
Fecha:
40
PRACTICA No9. OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE

CIANOBACTERIAS
Cyanobacteria (del griego ciano = azul) es el nombre de un filo del reino Bacteria (único del
dominio del mismo nombre) que comprende a las cianobacterias y, en algún sentido, a sus
descendientes por endosimbiosis, los plastos. Las cianobacterias se caracterizan por ser los
únicos procariotas que llevan a cabo fotosíntesis oxigénica, por ello también se les denomina
oxyphotobacteria.
MATERIALES
1. Agua con cianobacterias

2. Láminas portaobjetos
3. Laminillas
4. Microscopio
PROCEDIMIENTO
Colocar en el centro de la lámina portaobjeto una gota del agua que trajo como muestra y
colocar luego una laminilla encima de esta preparación y esperar 2 minutos. Finalizado este tiempo
montar al microscópio y observar en 10X, 40X y 100X.
CUESTIONARIO PRÁCTICA No9.

1. Explique qué función tiene el carboxisoma en las cianobacterias
2. Explique qué función tiene las vesículas gasíferas en las cianobacterias
41
3. ¿Qué son los tilacoides?, ¿Cuál es su función y donde se ubican en las cianobacterias?
4. Dibuje:
Cianobacteria formadora de filamentos simples
Heterocisto
42
3. ¿Qué son los tilacoides? ¿Cuál es su función y dónde se ubican en las cianobacterias?
4. Dibuje:
Cianobacteria formadora de filamentos simples
Heterocisto
42
Anabaena sp
Nostoc sp
Volvox sp
43
OBSERVACIONES HECHAS EN EL LABORATORIO
44
CUESTIONARIO – PRACTICA No. 9.
1. Defina qué es hacer una dilución y explique la lectura de los resultados de un Sistema de
diluciones.
2. ¿Qué es el método Número Mas Probable NMP y por qué es importante para análisis de
agua?
3. Mencione mínimo cuatro grupos de microorganismos utilizados como bioindicadores en

suelos
4. Explique otro método que le permita determinar el número de microorganismos presentes en

una muestra de suelos
45
PRACTICA No9. RECUENTO DE UNIDADES FORMADORAS DE

COLONIAS-UFC.
Microorganismo aerobio mesófilo son todas las bacterias, levaduras y hongos capaces de
desarrollarse en condiciones de aerobiosis a 30°C. Es un parámetro que sirve para estimar la
flora total, pero sin especificar tipos de microorganismos. Es uno de los indicadores más útiles
del estado microbiológico de un alimento, agua, suelo entre otros. Tiene un valor limitado
como indicador de la presencia de patógenos o sus toxinas. Altos recuentos microbianos se
consideran poco aconsejables para la mayor parte de los alimentos.
MATERIALES
1. 2 cajas de Petri estériles

2. 4 tubos de ensayo con agua peptonada al 0.1% estériles
3. 4 Pipetas de 1 mL o una pipeta automática (100 – 1000 µL)
4. 1 frasco de dilución con 90 mL de agua peptonada al 0.1%
5. 50 mL de agar nutritivo previamente preparado y atemperado a 45 - 48°C
6. Marcador de vidrio
7. Incubadora a 35°C
8. Contador de colonias
9. Balanza
PROCEDIMIENTO
1. Hacer diluciones de la muestra líquida de acuerdo al tipo de

producto.
• Si es una muestra contaminada deben realizarse
diluciones altas
• En muestras procesadas se hacen diluciones bajas
2. Sembrar en profundidad por duplicado 1 mL de cada una de las diluciones seleccionadas
3. Adicionar de 15 – 20 mL del agar nutritivo a la temperatura adecuada
4. Mezclar inmediatamente el inóculo con el medio, con movimientos circulares de la placa a
favor y en contra de las manecillas del reloj, como en ángulo recto. Debe evitarse que el
medio impregne la tapa.
5. Dejar solidificar, adicionar una capa sellante de 5 mL sobre la caja y dejar solidificar
nuevamente.
6. Una vez solidificado el agar, se vierten las placas e introducen en la incubadora (35°C
durante 72 horas) .7. Sacar de la incubadora y realizar el recuento
8. Lectura: se deben contar las cajas cuyo número de colonias esté comprendido entre 30 y
300 UFC. Es conveniente ir marcando las colonias para evitar volver a contarlas. Hallar la media.
El número contado se multiplica por el factor de dilución y los resultados se expresarán
en unidades formadoras de colonia (UFC) por mL o g, dependiendo del tipo de alimento
de partida.
9. Siempre se informan dos números enteros y el resto en exponente
46
REFERENCIA
ICMSF. Microorganismos de los alimentos 1: su significado y métodos de enumeración.

Segunda edición. Editorial ACRIBIA S. A. Zaragoza (España). 2000.
RESULTADOS
Fecha:
47
CUESTIONARIO – PRACTICA No. 10
1) Defina:
a) Comensalismo :
b) Protocooperación
c) Simbiosis
d) Amensalismo
e) Predación
f) Parasitismo
48
2) Para las anteriores definiciones escriba una relación microbiana s o b r e e l m e d i o

a m b i e n t e que describa lo que usted escribió.
49
PRACTICA No10. PRUEBAS DE ANTAGONISMO

La composición de la microflora y de la microfauna de un ecosistema está regulada por las
interacciones de los microorganismos de una comunidad entre sí y de los mismos con el medio
no biótico de lo cual surge un equilibrio dinámico. Si dos o mas especies que coexisten en un
lugar no se afectan mutuamente la relación es neutralismo. Cuando algo de esto se modifica, las
especies comienzan a interactuar y las relaciones que se presentan pueden ser: comensalismo,
protocooperación, simbiosis, amensalismo, predación, parasitismo. La evaluación de estas
relaciones in vitro permiten aislar y seleccionar microorganismos con capacidad de
biocontroladores.
MATERIALES
1) 3 Cajas con Agar Nutritivo

2) Asas bacteriológicas y micológicas
3) Marcador de vidrio
4) Hongos
5) Bacterias
6) Incubadora a 37oC y 25oC
PROCEDIMIENTO
1) Técnica por enfrentamiento
Se toma la caja de Petri con el medio de cultivo nutritivo y se divide en la parte trasera por la
mitad con un marcador de vidrio y se señala la mitad de cada una de las mitades previamente
divididas. Se marca cual microorganismo va a inocular en cada lado y finalmente por punción
sembrar los microorganismos. Incubar a 37oC si uso bacterias ó a 25oC si uso hongos.
Microorganismo 1 Microorganismo 2
50
Método de Igarashi
Se toma una caja de petri y se divide en 4/4 y sembrar por siembra masiva con una asa redonda,
en un espacio de tres (3) centímetros un microorganismo seleccionado y finalmente siembre en
el centro por punción otro microorganismo que usted crea tenga características de
biocontrolador.
MICROORGANISMO 1 en estrías
MICROORGANISMO 2 en el centro.
51
Escuela de Ciencias Agrícolas, Pecuarias y del Medio
Ambiente Protocolo de prácticas de la Escuela – versión
2011
3) Técnica de estrías
En una caja de Petri en la cual previamente usted sembró con una estría en el centro una
bacteria, sembrar a 0.5 cm, por medio de estrías, cuatro bacterias a evaluar. En el revés de la
caja con marcador de vidrio señale que microorganismos sembró. Incubar a 37oC.
Microorganisms
REFERENCIA
S
PEDROZA, A. M., MATIZ V, A., QUEVEDO H, B. C. & AGUIRRE R, A. C. Manual

de introducción a la biotecnología. Colección Apuntes. Editorial CEJA. 2007.
MARTINEZ, M. M. & MARTINEZ N, P. Manual de laboratorio Microbiología Ambiental.
Colección apuntes. Editorial CEJA.
2001.
52

Guia de Laboratorio 2014

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GUÍAS DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL

CÓDIGO DE CURSO: 358010

4 PRACTICA No.1. NORMAS BIOSEGURIDAD/ ELEMENTOS DE LABORATORIO

18 PRACTICA No. 3. TÉCNICAS DE TINCIÓN.

25 PRACTICA No. 4. OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE HONGOS

48 PRACTICA No. 10. PRUEBAS DE ANTAGONISMO

TEORÍA PRACTICA No.1 BIOSEGURIDAD EN EL

1.1.1. El acceso al laboratorio estará limitado al personal autorizado.

1.2. Clasificación de los microorganismos infecciosos por grupo de riesgo

1.2.1. Grupo de riesgo 1 (riego individual o poblacional escaso o nulo)

Nivel de bioseguridad 1 Laboratorio básico

1.3. Código de prácticas en laboratorios básicos

1.4.8. Todo el material que se use en microbiología de estar estéril.

QUIZ No. 01.

2. ¿Cuál es la utilidad del asa recta y del asa curva?

3. ¿Cómo se esteriliza un medio de cultivo en microbiología?

6. ¿Qué utilidad tiene la esterilización en frío?

PRACTICA No.2. MÉTODOS DE SIEMBRA –

La inoculación de medios de cultivo para la recuperación, mantenimiento y/o aislamiento de

1. Muestra contaminada con microorganismos

1. Desinfectar el área de trabajo, prender el mechero y preparar el material de trabajo.

Figura 1. Técnica de aislamiento de colonias

Este procedimiento se denomina aislamiento de bacterias, debido a que las bacterias

PRACTICA No.2. MÉTODOS DE SIEMBRA – Parte B

Figura 2. Técnica de aislamiento de colonias por el método de rejilla.

Figura 3. Técnica de aislamiento de colonias por el método francés.

Figura 4. Morfología macroscópica (UFC)

Figura 5. Siembra en medio líquido

Figura 6. Siembra en medio semisólido con superficie plana

Figura 7. Siembra en medio sólido con superficie inclinada

Figura 8. Crecimiento en medio líquido

Figura 9. Patrón de crecimiento en medio sólido

ESCOBAR de RICO, M. Fundamentos de microbiología. Editorial CEJA. 1999.

CUESTIONARIO – PRACTICA No.3.

2. ¿En qué momento se deben filtrar los colorantes y por qué?

4. ¿Cuáles son los colorantes más utilizados en microbiología y por qué?

5. ¿Describa una coloración para teñir el núcleo bacteriano?

6. ¿Qué utilidad tiene la tinción con sudan III?

7. ¿Mencione 5 razones de la selectividad de las bacterias por los colorantes de Gram?

PRÁCTICA No.3. TÉCNICAS DE TINCIÓN.

Figura 1. Observación de imágenes en el microscopio óptico.

a. Realizar un frotis de la muestra seleccionada

Figura 2. Tinción de Gram

Figura 3. Morfología Microscópica bacteriana.

a. Coloración de Glicocálix con Rojo Congo

b. Coloración de Glicocálix con Tinta China

PRACTICA No. 4. OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE HONGOS

CUESTIONARIO PRÁCTICA No.4

Hifa septada Hifacenocítica

Cuerpo fructífero de un Aspergillus y nombre sus partes

Cuerpo fructífero de un Penicillium y nombre sus partes

Cuerpo fructífero y macroconidias de un Fusarium y nombre sus partes

Cuerpo fructífero y nacroconidias de una Alternaria y nombre sus partes

Cuerpo fructífero de un Rhizopus y de un Mucor y nombre sus partes

RESULTADOS PRÁCTICA No.4 OBSERVACIONES HECHAS EN EL

CUESTIONARIO – PRACTICA No. 05.

1. ¿Cuál es la diferencia entre adaptación evolutiva y adaptación fisiológica de los

Escriba que significan los siguientes términos.

3. ¿Cuál es la utilidad microbiológica de los medios de cultivo simples; enriquecidos;

PRACTICA No. 6. MEDIOS DE CULTIVO DIFERENCIALES Y

De acuerdo a la composición y a la combinación de los anteriores ingredientes mencionados los

1. Agar EMB (selectivo para enterobacterias patógenas)

PRACTICA No.7.REACCIONES BIOQUIMICAS