FACULTAD DE INGENIERIA

ING. AGROINDUSTRIAL

FISIOLOGIA POSTCOSECHA

INFORMES DE LABORATORIO No. 6“ACCION ENZIMATICA Y PROCESOS

DE OXIDACION”

ESTUDIANTES: Andrés Felipe Gordillo S. CODIGOS: 20172162654

Nicolas Daimler Salazar P. 20172161614
Yimmy Julian Gutiérrez P. 20172161111

DOCENTE: Jennifer Katiusca Castro Camacho MSc.

FECHA: 20 de Noviembre 2019

 OBJETIVOS
 Conocer la actividad enzimática de algunas frutas.
 Aprovechar las propiedades de las enzimas para mejorar las características
organolépticas de las proteínas.
 Entender las diferentes interacciones que se presentan entre las proteínas en los
procesos de transformación de alimentos.

INTRODUCCION
Este laboratorio se dividió en dos partes en primera mediada se estudió la actividad de las
enzimas Proteolíticas presentes en algunas frutas , utilizando gelatina como sustrato modelo
de proteína. El principio de este método es para controlar el proceso de gelificación que
depende de la integridad de las cadenas poliméricas de la proteína. Si hay cualquier
fragmentación de las cadenas de polímero, la formación de gel se ve comprometida, dado
que el proceso de gelificación, no se produce , se identificó la proteína presente en la piña
como bromelina la cual es una proteasa que fragmenta las cadenas poliméricas. (Jesus, 2008)
afirma: “las Enzimas Proteolíticas tiene un alto uso en la industria alimentaria como lo es el
ablandamiento de carnes y en la farmacéutica una variedad de aplicaciones como
antiinflamatorios y medicamento para trastorno digestivo”.
Para la mayoría de las especies frutales cuyo destino es el consumo en fresco, la calidad se
basa en sus características organolépticas y aspecto externo, sobre todo, en la forma, tamaño,
color y ausencia de lesiones. El tamaño final que adquiere el fruto, la ausencia de
magulladuras y de mancha púrpura, como desorden fisiológico, son aspectos valorados por
el consumidor y, por tanto, son problemas importantes a los que se enfrentan los cultivadores
en todo el mundo. (Morante Carriel, y otros, 2014) Cualquiera de estos daños, cambian la
textura o el color del tejido, debido a la destrucción de los compartimentos celulares del fruto,
que permiten que los sustratos de naturaleza fenólica sean accesibles a la enzima polifenol
oxidasa, dando lugar a polímeros oscuros siendo uno de los mayores problemas en perdida
de valor comercial en la industria alimentaria para ello se busca implementar diversos
métodos que detengan o retarden la actividad enzimática principalmente de la PPO y otras
enzimas oxidativas con el uso de inhibidores o antioxidantes. Para el cual se evaluó la
eficiencia de un acidulante como lo es el acido cítrico presente en el limón y como retarda la
oxidación enzimática con diferentes concentraciones, en diferentes ambientes con O2 y
vació.
 MARCO TEORICO
Proteasas
Algunas enzimas son capaces de romper enlaces peptídicos de proteínas denominadas proteasas.
La representación de una reacción catalizada por estas enzimas puede verse a continuación en la
Figura 1.

Figura 1. Reacción catalizadora por enzimas proteasas.

Fuente (Jesus, 2008)

En la Figura 1, se observa que la reacción catalizada por la reacción de hidrólisis de la proteasa es

una polipeptídica- cadena (sustrato) en la que menor aminoácidos y cadenas polipeptídicas Pueden
ser generados como producto inmediato de la reacción. Las enzimas proteolíticas son contradas en-
tanto en animales como en plantas. En los animales, que participan en los procesos biológicos
importantes, incluyendo: la digestión de proteínas, la coagulación de la sangre, la muerte celu- casa
y diferenciación de los tejidos. Sus actividades en el proceso digestivo, por ejemplo, es esencial para
el proceso de absorción debido a olefinas pro hidrolizar de los piensos a sus aminoácidos
(monómeros) puede ser absorbido por el cuerpo . Así mismo, diversos procesos proteolíticos son de
muy importante durante los tumores invasivos, así como durante todo el ciclo infeccioso de un gran
número de microorganismos patógenos y virus. Incluso las proteínas que componen nuestras
células están constantemente degradadas por proteasas dados complejo y sus componentes,
reutilizados por el cuerpo. (Jesus, 2008)

Enzimas oxidativas
Las polifenol oxidasas (PPOs) son enzimas ubicuas que catalizan la reacción dependiente de
oxígeno que transforma o-difenoles en o-quinonas. Estas quinonas son reactivas y capaces
de modificar covalentemente un amplio abanico de especies nucleó filas, del interior de las
células, que conduce a la formación de polímeros marrones, conocido como pardeamiento
enzimático. El fenómeno de pardeamiento durante el crecimiento, recogida, almacenamiento
y procesado de frutos y vegetales es un problema de primera magnitud en la industria
agroalimentaria y se reconoce como una de las principales causas de pérdidas de calidad y
valor comercial. Produce cambios importantes tanto en la apariencia como en las propiedades
organolépticas de frutos y vegetales comestibles, además suele ir asociado al
desprendimiento de olores y efectos negativos sobre el valor nutricional. (Morante Carriel, y
otros, 2014)
La Reacción química puede simplificarse a :
Figura 2.Reaccion química de la PPO Simplificada

Figura 3. Reacción enzimática de PPO en las plantas Fuente Gacche at (2013)

Análisis Anova

El análisis de la varianza (o Anova: Analysis of variance) es un método para comparar dos

o más medias, que es necesario porque cuando se quiere comparar más de dos medias es
incorrecto utilizar repetidamente el contraste basado en la t de Student. por dos motivos:

En primer lugar, y como se realizarían simultánea e independientemente varios contrastes de

hipótesis, la probabilidad de encontrar alguno significativo por azar aumentaría. En cada
contraste se rechaza la H0 si la t supera el nivel crítico, para lo que, en la hipótesis nula, hay
una probabilidad a. Si se realizan m contrastes independientes, la probabilidad de que, en la
hipótesis nula, ningún estadístico supere el valor crítico es (1 - a)m, por lo tanto, la
probabilidad de que alguno lo supere es 1 - (1 - a)m, que para valores de a próximos a 0 es
aproximadamente igual a a m. Una primera solución, denominada método de Bonferroni,
consiste en bajar el valor de a, usando en su lugar a/m, aunque resulta un método muy
conservador. (Abraira & Perez de Vargas, 1996)

Por otro lado, en cada comparación la hipótesis nula es que las dos muestras provienen de la
misma población, por lo tanto, cuando se hayan realizado todas las comparaciones, la
hipótesis nula es que todas las muestras provienen de la misma población y, sin embargo,
para cada comparación, la estimación de la varianza necesaria para el contraste es distinta,
pues se ha hecho en base a muestras distintas.

El método que resuelve ambos problemas es el anova, aunque es algo más que esto: es un
método que permite comparar varias medias en diversas situaciones; muy ligado, por tanto,
al diseño de experimentos y, de alguna manera, es la base del análisis multivariante. (Abraira
& Perez de Vargas, 1996)
 RESULTADOS Y ANALISIS
Tabla No 1. Tiempo de Gelificación para cada Tratamiento.

Tratamiento(tubo de ensayo) Tiempo de Gelificación(min)

T1 (gelatina +trozo de piña) No solidifico

T2(gelatina + jugo de piña) No solidifico
T3(gelatina + trozos de manzana) 14
T4(testigo: Gelatina) 14

Parte 1

Figura 4. Piña,
Figurazumo de piña
1. Piña, y mazana
j y mazana en en gelatina
gelatina sinsin solidificar
solidificar Figura
. 5. tubos de ensayo con frutas después de solidificarse la
gelatina

En la Figura 4 se utilizaron dos frutas diferentes para observar sus propiedades enzimáticas
sobre la proteína presente en la gelatina sin sabor las cuales fueron la piña y la manzana esto
con el fin de comparar la acción enzimática, se agregaron 5ml de gelatina a cada de los 4
tubos ensayo rotulados gelatina en su estado líquido y al primero se le agregaron trozos de
piña, al segundo zumo de piña, el tercer tubo contiene trozos de manzana y en el tubo 4 se
dejó solo la gelatina para tomar como sustrato modelo de proteína con el cual analizaremos
su comportamiento frente a una actividad enzimática.
En la Figura 5. Se observan los tubos después de 14 minutos tiempo en el cual se solidifica
la gelatina sin ninguna fruta o zumo, obteniendo como resultado para el tubo de ensayo
número 1 en el cual están los trozos de piña, se observa que no hay una solidificación de la
gelatina esto se debe a su enzima Bromelina la cual es una enzima proteolítica la cual (Jesus,
2008) afirma: “es capaz de romper enlaces peptídicos de proteínas, esta enzima pertenece a
un grupo denominadas proteasas”. La cual después de una reacción química impide que se
generen cadenas polipeptídicas como producto inmediato de la reacción. El tubo numero 2
presento los mismos resultados que el tubo numero 1 ya que este tenia zumo de piña en el
cual esta presenta la misma enzima Bromelina cade recalcar que este presento ningún indicio
de solidificación esto se debe a una mayor concentración enzimática por estar en su estado
líquido completamente.
El tubo de ensayo numero 3 presento des pues de 14 minutos una solidificación igual al tubo
de la gelatina sola, en la cual las enzimas presenten en la manzana no afectaron este proceso
esto debido a que la enzima presente es la polifenol oxidasa la cual se encargada del proceso
de oxidación de diversas frutas al estar en contacto con oxigeno y al no ser una proteasa no
afecta las cadenas peptídicas de la proteína en la gelatina dejando que se solidifique de
manera normal.
Una solución a la actividad enzimática son algunos inhibidores de esta los cuales según
(Morante Carriel, y otros, 2014)” Entre los diversos tipos de inhibidores de PPOs se destacan
cuatro grupos: sulfitos, agentes antioxidantes o reductores, acidulantes y compuestos
quelantes.
Agentes reductores. Previenen el pardeamiento enzimático por la reducción de oquinonas a
o-difenoles no coloreados. Los compuestos derivados del azufre son los más ampliamente
empleados en la industria de los alimentos. Ejemplo el bisulfito (HSO3 - ) y sulfitos (SO3 2-
) (Marshall et al. 2007). En esta clasificación también encontramos al ácido ascórbico y la
cisteína, la cual tiene efectos negativos sobre el sabor (Amiot 1997).
Acidulantes. Los acidulantes son aplicados generalmente para mantener el pH por debajo
del punto óptimo de actividad catalítica de la enzima. Acidulantes como el ácido cítrico,
málico y fosfórico pueden inhibir el efecto de la PPO. Los acidulantes son usados
frecuentemente con otros antioxidantes. (Guerrero, 2009)
Quelantes. Las enzimas generalmente poseen iones de metales en su sitio activo. Los agentes
quelantes remueven estos iones inactivando a la enzima. Tanto los complejos formados entre
los agentes quelantes y los prooxidantes tales como el cobre o el hierro, son inhibidores.
Agentes a complejantes. La más importante propiedad funcional de la ciclodextrina como
agente acomplejante es su habilidad para la inclusión de moléculas dentro del núcleo
hidrofóbico o ligeramente apolar, convirtiéndose en un excelente inhibidor de pardeamiento
en frutas frescas y vegetales crudos (Hicks et al.1990; Otwell et al. 1992).
Inhibidores de enzimas. El 4-hexilresorcinol, es un compuesto m-difenólico que está
estructuralmente relacionado con los sustratos fenólicos, tienen un efecto inhibidor
competitivo 23 con la PPO (Otwell et al. 1992; Mc-Evily et al. 1991). La actividad de la
monofenolasa y difenolasa de la tirosinasa son inhibidas por el 4-HR. Este es efectivo a bajas
concentraciones, tiene estabilidad química, y presenta alto sinergismo con el ácido ascórbico
mientras reduce las quinonas (Guerrero et al. 2004).

El rango optimo de temperatura para la actividad enzimática. Cada enzima tiene una
temperatura óptima de actuación. Por debajo y por encima de esta temperatura, la enzima
ralentiza la velocidad de la reacción enzimática. Se observa que muchas de las enzimas,
duplican la velocidad de una reacción enzimática cuando se aumenta la temperatura de unos
10° C aproximadamente y luego cae muy rápidamente por encima de los 40° C. (Santin,
2011) esto se ve reflejado en la conservación de frutas en la postcosecha refrigerándolas en
bajas temperaturas para así detener su metabolismo y con ello la actividad enzimática de
igual forma con atmosferas controladas.
Parte 2

Figura 6. cajas de Petri con muestras de manzana con Figura 7. muestra de manzana con funda y diversas
diversas concentración de ácido cítrico y agua concentraciones de ácido cítrico y agua

Tabla No. 2. Tiempos promedio de oxidación

Tiempo de oxidación en minutos

Almacenamiento
0:0 (Testigo) 0:10 10:00 5:.5

Sin Funda 13 49 25 31

Con Funda 14 71 37 55
Tabla No. 3. Análisis de Varianza

Origen de las Suma de Grados de Promedio de Valor crítico

F Probabilidad
variaciones cuadrados libertad los cuadrados para F
Entre grupos 2306,375 3 768,7916667 5,10401107 0,074649368 6,591382116
Dentro de los
602,5 4 150,625
grupos

Total 2908,875 7

Al evaluar los datos calculado del estadístico F con el valor critico de F de la Tabla 3, se
puede determinar que estos valores son diferentes, por lo que, no se puede aceptar la hipótesis
de que las medias son iguales, es decir, que la hipótesis nula se rechaza. Por lo tanto, se acepta
la hipótesis alterna donde las medias son diferentes por lo menos en un grupo de medias en
sus datos, con 95% de confiabilidad.
Basado en los resultados obtenidos de la acción de oxidación la cual se derivada de la
actividad enzimática de la fruta, en este caso de la manzana, se puede deducir que el efecto
de la concentración, en este caso del ácido cítrico presente en el limón Tahití el cual es un
inhibidor enzimático acidulante, en el tiempo de oxidación de la fruta dependerá del nivel
concentración empleado, es decir, a una mayor concentración suministrada, mayor será el
tiempo de oxidación y, de igual forma, inversamente. (Guerrero, 2009)
Por otra parte, el tiempo de oxidación de una fruta también se ve afectado por el tipo de
almacenamiento al cual es inducido, esto en relación con la presencia o no de oxígeno.
Entonces, si se impone un ambiente en presencia de oxígeno, menor será el tiempo de
oxidación de la fruta y en ausencia de oxígeno, prácticamente un medio al vacío, el tiempo
de oxidación de la fruta deberá de ser mayor. Esto se debe a que, la enzima que esta presente
en la manzana denominada polifenol oxidasa reacciona con la presencia de oxígeno
transformando los o-difenoles en o-quinonasla y luego, estas últimas al sufrir una serie de
reacciones forman un pigmento denomino melanina, que es un biopolímero presente
ampliamente en la naturaleza y es quien le da la coloración marrón a la fruta. (Morante
Carriel, y otros, 2014)

CONCLUSIONES
 La enzima presente en la piña la cual es la bromelina tiene una amplia aplicación en
la industria alimentaria la cual puede ser aprovechada al máximo ya que esta no se
extrae solamente de a fruta si no también de los tallos los cuales son residuos de las
plantaciones de piña que no son bien aprovechados en aplicaciones de las enzimas
proteolíticas como el ablandamiento de carne dándole más propiedades
organolépticas y de uso terapéutico en la industria colombiana.
  Se concluye que el uso de una concentración alta de ácido cítrico presente en el limón
es un buen antioxidante combinado con ambientes sin presencia de oxigeno puede
aumentar la vida útil de la fruta disminuyendo la actividad enzimática el cual dio un
tiempo de 71 minutos para presentar indicios de oxidación este tiempo se puede
aumentar si se combina con temperaturas bajas teniendo en cuenta, que temperatura
puede resistir la fruta.
 En la naturaleza se encuentra una amplia variedad de enzimas presentes
principalmente en frutas y vegetales de origen animales, como también, tienen origen
microbiano derivado de productos obtenido por fermentación y curado. Estas enzimas
poseen funciones específicas como son el caso de la bromelina que se caracteriza por
el rompimiento de proteínas o la PPO la cual reacciona en presencia de oxígeno para
la creación de pigmentos a base de biopolímeros. En general, estas funciones
enzimáticas especificas tienen su aporte más significativo en la industria alimentaria
para optimización los procesos de producción, de manera que sean más sostenibles,
y para el desarrollo de nuevos productos alimenticios.

Bibliografía
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