Contenido

1 RESUMEN ............................................................................................................. 2
2 INTRODUCCIÓN ................................................................................................... 3
3 OBJETIVOS .......................................................................................................... 3
3.1 Objetivos generales: ....................................................................................... 3
3.2 Objetivos específicos: ..................................................................................... 3
4 MARCO TEÓRICO ................................................................................................ 4
5 RESULTADOS: ..................................................................................................... 5
6 DISCUSION DE RESULTADOS: ........................................................................... 8
7 CONCLUSIONES: ................................................................................................. 8
8 RECOMENDACIONES: ......................................................................................... 8
9 CUESTIONARIO ................................................................................................... 8
9.1 Establecer la diferencia entre poder de resolución y apertura numérica: ........ 8
9.2 Señala la función de las siguientes partes del microscopio............................. 8
9.3 Hacer una tabla en relación a enfermedades microbianas que son
transmitidas por el aire, agua y alimento ................................................................... 8
9.4 Responder: ..................................................................................................... 9
9.4.1 ¿existen diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram
positivas y los gramnegativos? .............................................................................. 9
9.4.2 ¿afecta la edad de cultivo a la reacción de tinción del Gram? ................. 9
9.5 Hacer una lista de 5 bacterias Gram positivas y 5 bacterias gramnegativos
con las enfermedades que provocan ......................................................................... 9
10 FUENTES DE INFORMACIÓN: ....................................................................... 10
11 ANEXOS: ......................................................................................................... 10

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1 RESUMEN

En el trabajo de laboratorio lo primero que desarrollo el docente encargado con ayuda

de algunos compañeros fue la preparación de laminas utilizando el método Gram para
la coloración, se uso laminas limpias para evitar cualquier alteración, y se paso varias
veces cortando la llama del mechero Bunsen, dejamos enfriar la lamina y colocamos
sobre ella una gotita de suero fisiológico con el inoculador esteril, frotamos el cultivo
con el inoculador hasta extenderlo sobre la parte central del portaobjeto, cuidando
siempre de que forme una película muy delgada. Secamos la película al aire, fijamos
la preparación sobre el porta objeto pasándolo por la llama del mechero tres veces,
manteniendo la película hacia arriba de la llama. Posteriormente cubrimos la película
con el colorante cristal violeta (Gram #1) y asi dejar cubierto por un espacio de 20
segundos, después lavamos con agua durante 20 segundos. Luego tratamos la lamina
con la solución de lugol (Gram #2) durante un minuto, luego del minuto la decoloramos
con alcohol acetona de 95° (Gram #3) de 1 a 20 segundos, posteriormente lavamos l
lamina con agua durante dos segundos, colocaos la safranina (Gram #4) y dejamos
teñir por unos 20 segundos mas o menos. Finalmente dejamos secar secar y
examinamos al microscopio la preparación, si resulta un organismo Gram positivo
retendrá el color cristal violeta y aparecerá teñido de azul o morado y un organismo
Gram negativo tendrá el color rosado o rojo de la safranina.

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2 INTRODUCCIÓN

Los microorganismos, excepto las algas, son por lo general incoloros y muy
ligeramente refractantes por lo tanto son difíciles de estudiarlos tal como se
encuentran en la naturaleza. Para poder hacerlos visibles se los colorea o tiñe
previamente antes de observarlos al microscopio. La coloración hace resaltar también
algunas características morfológicas que otra manera no son visibles. En microbiología
el microscopio se utiliza de forma rutinaria, ya que proporciona importante información
para la identificación temprana y definitiva de los microorganismos. En la valoración de
las muestras, es trascendente el poder de resolución del microscopio, el cual se define
como la capacidad que posee un objetivo para distinguir la distancia mínima entre dos
puntos del objeto para que se puedan visualizar como dos puntos separados. El poder
de resolución de un objetivo es el responsable de la calidad, claridad, nitidez y fineza
detallada de la imagen, y depende de la longitud de onda (λ) del haz de luz utilizado y
de la apertura numérica del objetivo empleado. El máximo poder de resolución en un
microscopio de luz emitida es de 0.2 μm, por lo que se requiere de una amplificación
entre 1000-1400x, mientras que el poder de resolución del ojo humano es de
aproximadamente 0.2 mm. Para aprovechar esta ventaja de los microscopios, se han
desarrollado técnicas tintoriales que destacan las características morfológicas de los
microorganismos. Existe una gran variedad de tinciones que pueden ser aplicadas
dentro del campo de la microbiología.

3 OBJETIVOS
3.1 Objetivos generales:

 Reconocer los microorganismos Gram positivos y negativos, aligual de la aplicabilidad

clínica de la tinción.
3.2 Objetivos específicos:

 Preparación de extendidos y de coloraciones.

 Observación microscópica de los extendidos.
 Conocer los fundamentos de las diferentes coloraciones utilizadas en la observación
microscópica de microorganismos.
 Comprender los pasos necesarios para realizar la tinción deGram

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4 MARCO TEÓRICO

La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en

microbiología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Se
utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder
realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose
Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria
Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo o grosella.

Tipos de coloración:
a) Simples: utilización de un solo tinte con el cual podemos evaluar solamente la
morfología.  Las tinciones simples es cuando toda la muestra se tiñe del mismo color
y se utiliza un solo colorante.
b) Compuestas ó especiales: constituidas por 2 ó más tintes o reactivos y sirven para
clasificar las bacterias u observar sus características especiales.
c) Positivas: se observa teñida la célula sobre un fondo claro.
d) Negativas: El fondo se tiñe de oscuro para observar la célula o estructuras
refringentes.
Tinción negativa
La tinción negativa fue desarrollada originalmente para microscopia de luz con el fi n de
rodear y delinear las bacterias no teñidas u otros materiales biológicos.6 Utilizamos
diferentes métodos de tinción negativa para evaluar estructuras individuales, tan
pequeñas como las vesículas sinápticas e incluso de gran tamaño, como los
microorganismos unicelulares. Este método es muy útil, aunque está limitado por la
presencia de un fondo oscuro que no permitirá la correcta identifi - cación de forma nítida
y detallada de los componentes de dichas estructuras.29 En microbiología, la tinción
negativa proporciona un resultado presuntivo de la presencia de Cryptococcus
neoformans, microorganismo causante de meningitis en pacientes con
inmunosupresión, siendo la técnica más utilizada para poner de manifi esto su cápsula.
Este hongo presenta dos formas durante su ciclo vital: una forma asexual y una forma
sexual; en la primera se presenta como levaduras encapsuladas que se reproducen por
gemación y puede ser visualizada por medio de la tinta china.29-31 El principio es
simple, ya que sólo se requiere depositar una gota de la muestra clínica sobre un
portaobjetos, posteriormente se coloca el colorante y se observa al microscopio sin
necesidad de fi jación, algunas estructuras difundirán el colorante y otras no, lo que
permitirá un contraste de las estructuras observadas. Se han utilizado diferentes
colorantes: uno de ellos es la mencionada tinta china, la cual tiñe el fondo de la muestra
de un color oscuro y la cápsula del C. neoformans permanece sin teñir. La principal difi

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cultad con la tinción negativa es que los microorganismos tienden a contraerse durante
el periodo de secado;31 para evitarlo, se ha optado por usar la tinción negativa húmeda,
en la cual los organismos se suspenden en una película de tinta china o mancha oscura
y el contorno de la cápsula puede ser observado sin el peligro de contracción.

PASOS GRAMPOSITIVAS GRAMNEGATIVAS

Colorante Violeta Violeta

principal: cristal violeta

Mordiente: Lugol Violeta Violeta

Decolorante: alcohol- Violeta “Transparente”

acetona

Colorante de Violeta Rojo

contraste: safranina

imagen 1 tincion del Gram

5 RESULTADOS:

CARACTERÍSTICAS COLONIA FORMA AGRUPACIÓN GRAM

DE LA
Tamaño 4mm
Borde Lobular Gram
Biblioteca Elevación plana Cocos Estreptococos Negativo
placa 1
Caracteres ópticos Opaca
color blanca
GRUPO
N°1
Tamaño 1mm Gram
Borde Lobular Cocos Estreptococos Negativo

Biblioteca Elevación plana

placa 1
Caracteres ópticos Opaca
Pigmentación blanca
Tabla 1Características de las colonias encontradas por el grupo 1

5
 CARACTERÍSTICAS COLONIA FORMA AGRUPACIÓN GRAM
DE LA
Tamaño 4mm
Borde ondulante Gram
Bibliteca Elevación concava cocos estreptococos negativos
placa 1
Caracteres ópticos Opaca
color anaranjado
GRUPO
N°2
Tamaño 3 mm
Borde Liso bacilos Estreptobacilos Gram
Biblioteca Elevación plana positivos
placa 1
Caracteres ópticos Opaca
Pigmentación amarillo

Tabla 2 características de las colonias encontradas por el grupo 2

CARACTERÍSTICAS COLONIA FORMA AGRUPACIÓN GRAM

DE LA
Tamaño 4mm
Borde Liso Gram
Centro de Elevación Convexa En estreptococos positivo (+)
estudiantes formas
(placa 1) de
del grupo 4 cadena
de cocos
Caracteres ópticos Opaca
color amarillo
GRUPO
N°3
Tamaño 1 mm
Borde Liso En forma Estafilococos Gram
irregular
de cocos
Biblioteca Elevación Convexa Negativo (-)
(placa 1)
del grupo 2
Caracteres ópticos Opaca
Pigmentación Blanco

Tabla 3 Características de las colonias encontradas por el grupo 3

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 CARACTERÍSTICAS COLONIA FORMA AGRUPACIÓN GRAM
DE LA
Tamaño 3mm
Borde Liso Gram
C.E.I.A. Elevación plano cocos Estafilococos negativo
placa G4
Caracteres ópticos Opaca
color Blanco
GRUPO
N°4
Tamaño 2mm
Borde Liso bacilos Estreptobacilos Gram
Biblioteca Elevación plana positivo
placa G2
Caracteres ópticos Opaca
Pigmentación amarillo

Tabla 4 Características de las colonias encontradas por el grupo 4

CARACTERÍSTICAS COLONIA FORMA AGRUPACIÓN GRAM

DE LA
Tamaño 3mm
Borde Lobular Gram
Laboratorio Elevación plana En estreptococos positivo
físico-químico formas de (+)
del grupo 4 cadena de
cocos
Caracteres Opaca
ópticos
color Crema
GRUPO
N°4
Tamaño 2 mm
Borde ondular En bacilos Gram
forma de
bacilos
Laboratorio Elevación plana Negativo
físico-químico (-)
del grupo 4
Caracteres Opaca
ópticos
Pigmentación anaranjado
Tabla 5 Características de las colonias encontradas por el grupo 5

7
6 DISCUSION DE RESULTADOS:

7 CONCLUSIONES:

8 RECOMENDACIONES:

9 CUESTIONARIO
9.1 Establecer la diferencia entre poder de resolución y apertura numérica:

PODER DE RESOLUCION APERTURA NUMERICA

Es la capacidad de distinguir dos puntos Es la suma de ángulos de apertura del
adyacentes como distintos y separados. objetivo y del condensador.
Esta en funcion de la longitud de onda
de la luz que se usa y de la apertura
numerica

9.2 Señala la función de las siguientes partes del microscopio

PARTES DEL MICROSCOPIO FUNCION

Ocular Capta y amplía la imagen formada en los
objetivos.
Objetivo Amplía la imagen, es un elemento vital
que permite ver a través de los oculares
Condensador concentra los rayos luminosos sobre la
preparación
Diafragma de iris Regula la cantidad de luz que entra en el
condensador.
Tornillo de ajuste fino Es el que consigue el enfoque correcto.
Tornillo de ajuste grueso Es el que aproxima el enfoque

9.3 Hacer una tabla en relación a enfermedades microbianas que son

transmitidas por el aire, agua y alimento

ENFERMEDADES TRANSMITIDAS POR EL AIRE

Tosferina Bordetella pertussis
Tuberculosis Mycobacterium tuberculosis
Legionelosis Legionella pneumophila
Actinomicosis Actinomyces israelii
Nocardiosis Nocardia asteroides
Fiebre Q Coxiella burnetii

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ENFERMEDADES TRANSMITIDAS POR EL AGUA
Diarrea:
Disentería:
Cólera
Paludismo:
Esquistosomiasis

ENFERMEDADES TRANSMITIDAS POR LOS ALIMENTOS

Salmonella
Escherichia coli
Campylobacter
Listeria
Bacillus cereus
Clostridium botulinum
Clostridium perfringens
Staphylococcus aureus

9.4 Responder:
9.4.1 ¿existen diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram
positivas y los gramnegativos?
Si existen diferencias entre la pared celular de las Gram positivas y la pared celular de
las Gram negativas

bacterias Pared celular

Gram positivas Mono capa gruesa
Gram negativas Triple capa delgada

9.4.2 ¿afecta la edad de cultivo a la reacción de tinción del Gram?

si, pero solo para cultivos gram positivos que sean viejos, que esten muertos o
tengan problemas en la pared celular. Al hacerte esta mas compleja se vuelve mas
permeable a la entrada de tintes y reacciona como Gram negativo. Es decir
obtienes un falso Gram negativo
9.5 Hacer una lista de 5 bacterias Gram positivas y 5 bacterias gramnegativos
con las enfermedades que provocan

BACTERIAS GAM(+) - Enfermedad que produce

Staphylococo aureu - Foliculitis, Osteomielitis, Endocarditis, Meningitis
Strptococco Pyogenes - Piodemitis, Impetigo, Erisipela, Escarlatina
Neumococos - Hemolisis, Optoquina
Clostridium - Tétano, Carbunco Sintomático, Edema Maligno
Actinomyces Israelli - Actinomicosis

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10 FUENTES DE INFORMACIÓN:
 http://www.divulgameteo.es/uploads/aire-microorganismos.pdf
 STETZENBACH, L. (1997): «Introduction to aerobiology». En: Hurst, C.J. et al. (ed). Manual of
environmental microbiology. Ed. American Society for Microbiology, Washington.
 PELAZ, C., y MARTÍN, C. (1993): Legionelosis. Datos de España, diagnóstico de laboratorio y
recomendacioness para su prevención y control en instalaciones de edificios. Ed. Instituto
de Salud Carlos III. Ministerio de Sanidad y Consumo, Madrid.

11 ANEXOS:

https://histoptica.com/apertura-numerica-an-o-na/
http://www.eumed.net/libros-gratis/ciencia/2013/22/microscopio.html
https://microinmuno.files.wordpress.com/2013/01/prc3a1ctica-02-uso-adecuado-
del-microscopio.pdf
http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MONOWEB/anexos/MIcr
ografiasInterpretacion3D/usocorrecto.htm

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