Prelabotarorio practica 8

Cromatografía bidimensional

Una vez separados los componentes de la muestra, parte de ellos o todos se someten a etapas
adicionales de separación bajo diferentes condiciones, en otra columna o, en el caso de la
cromatografía plana, en dirección perpendicular.

Ejemplo: Huellas dactilares estudio de proteínas

TECNICAS ELECTROFORESIS

Isoelectroenfoque

(También se llama enfoque isoeléctrico o IEF, de isoelectrofocusing). Se trata de una variante de

electroforesis en la que el gel (poliacrilamida) posee un gradiente de pH fijado en su estructura.
Esto se consigue incluyendo en su preparación moléculas ionizables con valores de pK diferentes.
Como consecuencia, al avanzar los componentes de la muestra a lo largo del gel se encuentran en
entornos de pH diferente, y eventualmente alcanzan una región en la cual el pH local es igual al
punto isoeléctrico de la molécula muestra y, en consecuencia, ésta detiene su avance. Se alcanza,
pues, un equilibrio y se consigue la separación de los componentes de la muestra de acuerdo con
su punto isoeléctrico, que además se puede medir, pues se conoce la geometría del gradiente de
pH fijado al gel.

Electroforesis bidimensional

Tras realizar una primera separación su resultado se somete a otra de diferente mecanismo en
dirección perpendicular. Generalmente la primera es un isoelectroenfoque en un gel cilíndrico
estrecho que luego se coloca como muestra para una SDS-PAGE. Se obtienen así mapas complejos
de bandas, muy característicos de cada muestra, cuya utilidad principal es la comparación con el
obtenido de otra muestra similar pero conocida.

Electroforesis de campo pulsante

Las moléculas o fragmentos de DNA de longitud superior a 20-40 kb no se pueden resolver

(separar) empleando la electroforesis convencional en gel de agarosa. Esto se debe, en primer
lugar, a la dificultad de manejo de los geles preparados con las bajas concentraciones de agarosa
que requerirían (inferior al 0,4%). Además, las moléculas de DNA, que adoptan una conformación
más o menos globular, poseen un tamaño excesivamente grande para atravesar los poros del gel y
no se separan en función de su tamaño. Para solventar este problema se ha ideado una
modificación de la técnica, conocida como electroforesis de campo pulsante (o pulsado, pulsed-
field gel electrophoresis , PFGE). Se emplean geles de agarosa al 1%, pero se altera periódicamente
la orientación del campo eléctrico aplicado, activando alternativamente dos pares de electrodos.
El frecuente cambio de dirección del campo eléctrico consigue que las moléculas se desplieguen y
avancen a través de los poros en conformación extendida. A mayor tamaño, se reorientan con más
dificultad, por lo que avanzan más despacio.
Electroforesis preparativa

Se han desarrollado variantes preparativas, es decir, que permiten la obtención de cantidades

significativas de los componentes de la muestra por separado

Inmunoelectroforesis

Combina una separación electroforética con una detección por inmunodifusión.

APLICACIONES

Determinación de la masa molecular

Como se ha indicado, se puede obtener una estimación de la masa molecular (en kDa) de
proteínas empleando SDS-PAGE, y de fragmentos de DNA (en pb) empleando electroforesis en
agarosa. En ambos casos, en uno de los pocillos del gel se carga una mezcla de moléculas patrón
de tamaño conocido, con el fin de pcoder trazar la curva de calibrado. Para las proteínas, la validez
del dato obtenido depende de que la desnaturalización con SDS haya sido completa y de que se
hayan separado las subunidades gracias a la reducción con mercaptoetanol; además, la presencia
de oligosacáridos en las glicoproteínas altera la movilidad, que ya no proporciona valores de masa
molecular fiables.

Determinación del punto isoeléctrico

Como se ha indicado, mediante isoelectroenfoque [↑] se obtiene una medida del punto
isoeléctrico de las proteínas (pHI o pI).

Isoenzimas

Las variantes de una enzima, con pequeñas diferencias en su estructura y en su actividad

enzimática, se analizan rutinariamente mediante electroforesis o, en especial, mediante
isoelectroenfoque. De hecho, los nombres de las isoenzimas derivan a veces de su movilidad
electroforética. Se puede aplicar análogamente a las isoformas de proteínas no enzimáticas.

Mapas de restricción

Una de las formas de estudiar la secuencia de los ácidos nucleicos, en especial el DNA, consiste en
tratarlo con distintas enzimas de restricción, analizar mediante electroforesis en gel de agarosa los
fragmentos resultantes e intentar reconstruir la secuencia de la molécula original formando
su mapa de restricción, uno de los tipos de mapa físico.

Secuenciación de ácidos nucleicos

La obtención de la secuencia completa, nucleótido a nucleótido, también depende del análisis

electroforético de fragmentos de DNA, tanto en el método químico de Maxam y Gilbert como en
el método enzimático de Sanger. Se utilizan en este caso geles de poliacrilamida, debido al tamaño
pequeño de los fragmentos, pudiéndose resolver fragmentos que se diferencian en un solo
nucleótido.