Clonación del fragmento de DNA correspondiente al gen 16S de Klebsiella sp.

en células
competentes de Escherichia coli mediante ligación con el vector pCR®2.1 TOPO
Apunte R. Michelle P., Ayala R. Emilia P., Cabezas V. Leslie P., Cadme V. Mauro E.
mpapunte@espe.edu.ec, epayala3@espe.edu.ec, lpcabezas1@espe.edu.ec, mecadme@espe.edu.ec
Departamento de Ciencias de la Vida y Agricultura – Laboratorio de Biotecnología Humana
Universidad de las Fuerzas Armadas – ESPE.
Sangolquí – Ecuador.
Resumen.

La clonación es el proceso por el cual se inserta un fragmento de DNA en un plásmido apropiado mediante
ligación, transformación, selección y posterior verificación. El objetivo de la práctica es la clonación del gen de
interés (GOI, gene of interest), en este caso, el fragmento de DNA correspondiente al gen 16S de Klebsiella sp.
con células competentes de E. coli, para lo cual se inició con la ligación del fragmento de interés, la clonación
mediante el método químico, la siembra de la bacterias en medio LB/kanamicina/IPTG/X-Gal, luego la detección
blanco-azul de bacterias transformadas, seguido de una colony PCR para la verificación de la inserción del
plásmido. Finalmente, como resultado se obtuvieron ASDASD colonias de E. coli recombinantes de coloración
blanca y ASDASD colonias azules (no recombinantes); además al ser el gen 16S un barcoding bacteriano, el
producto de la colony PCR serán bandas de 350pb.

Palabras clave: Clonación, fragmento de DNA, plásmido, célula recombinante, colony PCR.

Abstract.

Cloning is the process in which a DNA fragment is inserted into an appropriate plasmid by ligation,
transformation, selection and subsequent verification. The objective of the practice is the cloning of the gene of
interest (GOI), in this case, the DNA fragment corresponding to the 16S gene of Klebsiella sp. with competent E.
coli cells, for which it began with the ligation of the fragment of interest, the cloning by chemical method, the
culture of the bacteria was in LB/kanamycin/IPTG/X-Gal medium, then the detection of transformed bacteria,
followed by a PCR colony for verification of plasmid insertion. Finally, ASDASD white-colored recombinant E.
coli colonies and ASDASD blue colonies (non-recombinant) were obtained. In addition, the 16S gene is a
bacterial barcoding, so the product of the PCR colony will be 350 bp bands.

Key words: Cloning, DNA fragment, plasmid, recombinant cell, PCR colony
Introducción.

La clonación es el establecimiento de líneas posean los insertos de interés en su plásmido o en su

celulares puras ya que los miembros son genoma. Por lo tanto, este método ayuda al operador
genéticamente idénticos al ancestro común. Se a comprobar la transformación de las bacterias a
necesita ligar un fragmento de DNA con un vector de partir del medio que lo contiene. Posteriormente esta
clonación, es decir, este fragmento actúa de replicón técnica será aplicada para la obtención de varios
para poder amplificarse en el organismo genes de interés que serán almacenados por
amplificador. Por lo tanto, este vector de clonación congelación para tener controles positivos en el
con el fragmento de interés ligado a sí mismo se laboratorio (California State University Northridge,
convierte en un vector recombinante, generalmente 2007).
plásmidos. Estos plásmidos contienen un DNA
La electroforesis se comporta como un tamiz
circular, con un gen de resistencia a antibióticos y el
gelificado molecular ya que permite la separación de
operón Lac que servirá para la comprobación e
las moléculas cargadas basados en su tamaño
identificación de las bacterias transformadas
molecular. Gracias a la comparación con un
(blancas), de las no transformadas (azules)
marcador de peso molecular se puede determinar el
(Martínez, Pardo, & Riveros, 2018). Una de las
tamaño de la banda de interés. Su principio consiste
bacterias comúnmente utilizada en laboratorio es E.
en aplicar una carga eléctrica a la muestra
coli durante este paso, las células bacterianas
previamente cargada en un gel de agarosa, esto
competentes se someten a un choque térmico que las
permite el desplazamiento al polo contrario de su
predispone a incorporar ADN extraño (Dorado,
carga se parando así las bandas previamente
2015).
separadas (California State University Northridge,
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es 2007).
un método que permite producir múltiples copias de
El objetivo de esta práctica consiste en producir
un fragmento de DNA específico en poco tiempo.
células clonadas mediante la ligación de un
Esta técnica se basa en tres pasos importantes, la
fragmento del gen 16S en un vector, utilizando shock
separación de las cadenas que se desean amplificar a
térmico para la inserción del plásmido,
una temperatura de 95 a 96°C, el segundo paso
posteriormente identificar las colonias
comprende en bajar la temperatura para conseguir la
recombinantes por medio de un screening azul-
unión con los cebadores y el tercer paso es la
blanco y finalmente realizar una colony PCR para
generación de la cadena complementaria gracias a la
verificar la inserción del plásmido.
acción de la DNA polimerasa (Galván, y otros,
2006). Colony PCR es un método utilizado para la Materiales y métodos.

amplificación directa de colonias microbianas

específicas o en la identificación de colonias que
Bibliografía