Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
ISSN: 0258-5995
revcubanaquimica@cnt.uo.edu.cu
Universidad de Oriente
Cuba
Sánchez, L.; Romero, M.; Delgado, I.; Rodríguez, R.; Betancourt, A.; Villoch, A.
PRODUCCIÓN DE CONJUGADOS DE MICROPARTICULAS LÁTEX PARA EL
DIAGNÓSTICO DE LA VAGINITIS
Revista Cubana de Química, vol. XVII, núm. 1, 2005, pp. 138-143
Universidad de Oriente
Santiago de Cuba, Cuba
Resumen
Los diagnosticadores rápidos constituyen una atractiva opción para el diagnostico de la vaginitis en
la mujer ya que brinda resultados en minutos. En el CENSA se desarrolló y se registro un
diagnosticador para detectar agentes etiológicos en secreciones vaginales basados en el ensayo de
aglutinación con látex. El objetivo del presente trabajo fue obtener a escala de producción
conjugados de látex manteniendo los resultados obtenidos a nivel de laboratorio para su empleo en
el diagnosticador. Para la obtención de estos componentes a escala productiva se realizaron
conjugaciones con látex y gamma anti Candida albicans, anti Trichomonas vaginalis y anti
Gardnerella vaginalis y gammas negativas hasta un volumen de 250 y 500 mL
Se evaluaron la sensibilidad analítica y reacciones cruzadas de cada uno de los conjugados con sus
controles positivos y se enfrentaron ante un panel de muestras de exudados vaginales positivas y
negativas diagnosticadas por un método de referencia Los resultados obtenidos demostraron que
es factible el aumento de volumen de producción de los conjugados de látex bajo estas condiciones,
no se detectaron reacciones cruzadas con los controles positivos y la sensibilidad analítica fue
adecuada según lo establecido en los controles de calidad para cada uno de los conjugados de látex.
Se reconocieron satisfactoriamente las muestras evaluadas, y se recomienda continuar los estudios
de estabilidad y la evaluación del desempeño.
Keywords: conjugado, látex, vaginitis, diagnosticadores,
Introducción
La flora vaginal es un ecosistema que puede ser fácilmente alterado por la acción de antibióticos,
hormonas, medicamentos, contraceptivos, estrés, cambios de pareja frecuente, cambios de pH y
enfermedades transmitidas sexualmente, el equilibrio de este ecosistema se rompe y se produce el
reemplazo de Lactobacillus spp predominantes en la flora vaginal por otros microorganismos como
Gardnerella vaginalis y Candida albicans (1). Estos dos microorganismos y Trichomonas vaginalis
entre otros son los responsables de enfermedades ginecológicas que causan diversos síntomas
clínicos como la vaginitis con prurito, mal olor y abundante secreción o también endometritis,
salpingitis, fiebre post operatoria y riesgos de infertilidad, afectando a 120 millones de mujeres
anualmente según datos de la OMS. Algunos de ellos, como Trichomonas, se ha vinculado a un
aumento de riesgo del SIDA y a las enfermedades de transmisión sexual y tiene una incidencia de
más de un 40% (2). En cuanto a Candida y Gardnerella que en condiciones normales son parte de la
flora normal, cuando los niveles de estos microorganismos en la vagina aumentan, provocan los
síntomas clínicos descritos anteriormente con una incidencia entre 30% -50% y 30%-45%
respectivamente.
Los métodos de laboratorio convencionales para el diagnóstico de estos agentes infecciosos se
realizan en el laboratorio por examen directo de la muestra al microscopio, lo que adolece de falta de
sensibilidad, y por aislamiento en medio de cultivo lo que es demorado y costoso. Los
diagnosticadores rápidos constituyen una opción atractiva ya que brindan los resultados en poco
tiempo y no requieren infraestructura ni personal especializado para su ejecución. Por lo tanto,
Metodología
Las fracciones gamma globulinas anti G. vaginalis, anti T. vaginalis y anti C. albicans se obtuvo
por precipitación con sulfato de amonio a partir de antisuero obtenidos en carneros y conejos
inmunizados con suspensiones de células de G. vaginalis T. Vaginalis C. albicans según Espinosa
(4). Estas gammas fueron tituladas primeramente por inmunodifución (AGD)
Sensibilización de las partículas de látex: Se utilizaron partículas de 0.8 µ de diámetro (Latex
Cubano Multilatex ®) y se utilizó el procedimiento descrito por Cabronera y col (6) el cual
consistió en realizar diluciones dobles desde 1/32 hasta 1/512 de la fracción de gamma globulinas
anti G. vaginalis, anti T. vaginalis y anti Candida albicans en solución amortiguadora glicina (SAG)
0,001 M primeramente en un volumen final de 1 mL para buscar la dilución. Se le adicionó a cada
dilución y lotes partículas de látex para una concentración final de 1 %.
Se incubó durante 1- 3 horas (en dependencia del m.o) a 37 0C con agitación en zaranda
termostatada y se le adiciona albúmina bovina como bloqueador (BSA) y nuevamente se incubó
luego se centrifugó y el sedimento se resuspendió en iguales volúmenes de SAG
Sensibilidad analítica: Cada una de las diluciones anteriores de cada conjugado se enfrentó a una
prueba de aglutinación en láminas con su control positivo constituido por suspensiones de células
de G. vaginalis, T. vaginalis y C. albicans en concentraciones
1x 10 5- 1x 10 7UFC/mL.
Especificidad analítica: Se determinó mediante la reacción de los conjugados frente a suspensiones
de G. vaginalis, T. vaginalis y C. albicans en concentraciones de 1x 107 UFC/mL ajustadas por
conteo de colonias para G. vaginalis y C. albicans y conteo directo en cámara de Neubaur para T.
vaginalis. Una vez evaluada la sensibilidad y especificidad se prepararon nuevas diluciones del
conjugado en el rango comprendido entre la dilución más alta que detectó la concentración 1x 10 5
UFC/mL y la siguiente dilución que no detectó esta concentración y se repitieron para seleccionar
la dilución de trabajo.
Con la dilución de trabajo se obtuvieron los lotes anti G. vaginalis, anti T. vaginalis y anti C.
albicans en volúmenes mayores de 250 y 500 mL y se realizaron las pruebas de sensibilidad y
especificidad analítica con las condiciones antes descritas.
Obtención del conjugado látex Ig, control negativo.
El conjugado control negativo se obtuvo mediante la absorción de la fracción gamma globulina
procedente de suero normal de conejos New Zeland a las partículas de látex. La fracción se evaluó
previamente por inmunodifusión y se corroboró la ausencia de reacción con antígenos de G.
vaginalis, C .albicans T. vaginalis, el recubrimiento de las partículas de látex se realizaron según la
metodología descrita anteriormente.
Resultados y discusión
En la tabla 1 se observa el estudio de la sensibilidad de las partículas de látex en diluciones a
partir de los resultados obtenidos al aplicar la técnica de AGD para cada microorganismo. La
reacción de aglutinación no fue visible en algunos casos como en diluciones inferiores a 1/64,
esto se debe al efecto prozona, pues existe un exceso de anticuerpo que no permite visualizar la
reacción. Al evaluar un rango mas estrecho de diluciones 1/320 y 1/512 no se reconoció para látex
de C. albicans y T.vaginalis. Chalker (5).., recomienda que en el proceso de conjugación de los
antisueros a las partículas de látex se deben ensayar un rango amplio de diluciones de estos.
Tabla 1. Sensibilidad de las partículas de látex recubiertas con anticuerpos anti C. albicans, T.
vaginalis, G. Vaginalis.( * Dilución optima para cada conjugado de látex)
Conjugado de Látex anti T. vaginalis
Suspensiones de células de Suspensiones de células de T.
Diluciones SAG
T. vaginalis 107 UFC/mL vaginalis 106 UFC/mL
1/32 - + -
1/64 + ++ -
1//128 ++ ++ -
1/256 +++ +++ -
1/320* +++ +++ -
Con la dilución óptima para cada conjugado de látex estudiados se realizo la sensibilidad (Tabla
2) y especificidad analítica ( Tabla 3).
Tabla 2 Sensibilidad analítica de conjugados de látex con la dilución de trabajo.
Conjugado de Látex anti T. vaginalis
Dilución Suspensiones de células de Suspensiones de células de Suspensiones de células de
T. vaginalis 107 UFC/mL T. vaginalis 106 UFC/mL T. vaginalis 105UFC/mL
1/320* +++ +++ ++
Resulta de gran importancia que los conjugados látex realizados no reacciones inespecíficamente
con los microorganismos ensayados que pueden formar parte de la flora normal de la vagina como
C. albicans y G.vaginalis o en otros casos provocar un proceso clínico. La reacción de aglutinación
del conjugado látex control negativo con SAG pH 8.4 fue negativa al igual que frente a las
suspensiones de células de los diferentes microorganismos, también de gran importante para la
prueba diagnóstica para identificar la aglutinación no específica de la partículas recubiertas con
anticuerpos.
Con todos estos resultados se procedió a elaborar lotes de mayores volúmenes de 250 y 500 mL de
látex para cada microorganismo corroborando los resultados encontrados en la tabla 2 y 3.
En la tabla 4, se observa los resultados de los lotes de los conjugados de látex realizados frente a un
panel de muestras con una sensibilidad mayor de un 90 % , que nos demuestra que es posible
obtener lotes de conjugados con látex a estos volúmenes para detectar vaginitis en la mujer, se
recomienda continuar trabajando con un número mayor de muestras procedentes de la red
diagnóstica de nuestro país, como hospitales, consultorios del médico de la familia etc.
En la tabla 5 se observan los resultados obtenidos en el estudio de estabilidad se realizó por 12
meses y aún se encuentra en ejecución Los límites de detección para los lotes de conjugado anti T.
vaginalis, anti C. albicans y anti G. vaginalis. Ninguno de los lotes evaluados reaccionó con la
solución amortiguadora glicina se recomienda continuar el estudio de estabilidad hasta los 24
meses.
Tabla 5: Estabilidad de los lotes evaluados.
Suspensiones de células Suspensiones de células Suspensiones de células
Conjugado de 7
de T. vaginalis de C. albicans 10 de G.vaginalis 107
Látex
107 UFC/mL UFC/mL UFC/mL
Lotes (500mL)
3 meses 6 meses 9 meses 3 meses 6 meses 9 meses 3 meses 6 meses 9 meses
n= 3
Anti T.
+++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++++ +++
vaginalis
Anti. G.
+++ +++ N +++ +++ N +++ +++ N
vaginalis
Anti C.
+++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
albicans
Control
+++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
negativo
N. No se realizó
Agradecimientos
Agradecimiento al Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria por hacer posible este trabajo.
Referencias
1. http:// www.nau.edu/-fronske/vaginitis.html. US. DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN
SERVICES. Public health service August Vaginal infections and vaginitis. Prepared by : Office of
communications National Institute of Allergy and infectious Diseases National institutes of Health
Bethesda , Maryland 1992.
2. Jl. Thomason, SM. Gelbart Trichomonas vaginalis. Obstet Gynecol. Sep; 74 (3 Pt 2): 536-
41(1989)
3. Adad, SJ., De lima, RV.; Sawan, ZT; Silva , ML.; De Souza, MA. Saldanha JC Frecuency of
Trichomonas vaginalis, Candida sp and Gardnerella vaginalis in cervical- vaginal smears in four
diffrrente decades. Sao Paulo . Med. J 119 (6):200-5(2001).
4. Espinosa Ivett. Desarrollo y evaluación de un ensayo de aglutinación con paryículas de látex
para el diagnóstico de la vaginosis bacteriana. Tesis presentada por opción al grado científico de
Doctor en Ciencias de la Salud. Centro nacional de Sanidad Agropecuaria. La Habana 2003
5. Chalker, S Desind. Manufacture and marketing of rapid latex agglutination tests. J. Clin.
Microbiol. 37 (5)1591. (1996).
6. Carbronero, MC; Campos, E., Pizano, JJ y Romero, J: Evaluación de un método de aglutinación
de partículas de látex sensibilizadas para la detección de candidiasis vaginal. Med Cin(Barc). )4:
329-332. (1990).