UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA

CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA

LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA INDUSTRIAL

LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA
INDUSTRIAL

PRÁCTICA N° 3

TÉCNICAS DE TINCION

Nombre: Erick Flores

Semestre: 5
Paralelo: 1
Fecha de Entrega: 24-10-2019

Quito – Ecuador
2019-2020
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RESUMEN
Observación en el microscopio de diferentes cultivos microbianos
aplicando diferentes técnicas de tinción realizando una determinacio
del tipo de microorganismos que se observan. Se llevo a cabo la
tinción flagelar usando un colorante, la tinción negativa, la tinción
Gram y la tinción acido resistente siguiendo el procedimiento que
dicta la teoría explicada previa la practica con el objetivo de preparar
e identificar estructuras por medio de la tinción con la ayuda de un
microscopio, identificando su morfología, estructura y
características que las diferencian de otras muestras.
Concluyendo que existen diferentes técnicas o métodos de
observación de estructuras que nos permiten identificar la
morfología de diferentes tipos de microorganismos por el
procedimiento que se realiza para cada una de ellas.

PALABRAS CLAVE:
MICROSCOPIO/CULTIVOS_MICROBIANOS/TÉCNICAS_DE_TINCÍON/
MORFOLOGÍA_MICROBIANA/ESTRUCTURA_MICROBIANA/
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PRÁCTICA 3
TÉCNICAS DE TINCION
INTRODUCCIÓN

Las tinciones en microbiología son las primeras herramientas que se utilizan en el laboratorio
para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas. Desde hace más de un siglo han ayudado
a resolver problemas de etiología microbiana. Hay una gran variedad de tinciones, que se han
ido desarrollando para la detección de los diferentes agentes infecciosos –en los que se
incluyen bacterias, parásitos y hongos–. La tinción de Gram se considera básica en la
valoración inicial de muestras para análisis bacteriológico, mientras que la tinción de Wright
se ocupa para el diagnóstico de enfermedades muy particulares en el rubro de la parasitología.
Hay técnicas de tinturas específicas de gran utilidad, como la tinción de Ziehl-Neelsen, que
se utiliza para el diagnóstico de enfermedades crónicas como la tuberculosis o la
actinomicosis, o la tinción de azul de lactofenol, que preserva e identifica a los componentes
estructurales de los hongos. Las diferentes tinciones en el laboratorio microbiológico tienen
una utilidad fundamental para el diagnóstico y tratamiento oportuno de múltiples patologías
de etiología infecciosa.

1. OBJETIVOS
1.1. Observar en el microscopio diferentes cultivos aplicando tinción.
1.2. Aplicar diferentes técnicas de tinción.
1.3. Determinar el tipo de microorganismos observados.

2. TEORÍA
2.1. Tinción.
Una tinción o coloración es una técnica auxiliar utilizada en microscopía para mejorar
el contraste en la imagen vista al microscopio. Los colorantes y tinturas son sustancias
que usualmente se utilizan en biología y medicina para resaltar estructuras en tejidos
biológicos que van a ser observados con la ayuda de diferentes tipos de microscopios.
Los diferentes colorantes pueden ser utilizados para aumentar la definición y examinar
grandes cortes de tejido (resaltando por ejemplo fibras musculares o tejido conectivo),
poblaciones celulares (por ejemplo, clasificando diferentes células sanguíneas) o incluso
para resaltar organelos dentro de células individuales. (Stanier, 1992)
2.2. Frotis
Se denomina frotis a la extensión que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o
cultivo con objeto de separar lo más posible los microorganismos, ya que si aparecen
agrupados en la preparación es muy difícil obtener una imagen clara y nítida. Este frotis
debe ser posteriormente fijado al vidrio del portaobjetos para poder aplicar los métodos
habituales de tinción que permiten la observación al microscopio de las bacterias sin
que la muestra sea arrastrada en los sucesivos lavados. La fijación de una extensión
bacteriana hace que las bacterias queden inactivadas y adheridas al vidrio alterando lo
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menos posible la morfología y bacteriana y las posibles agrupaciones de células que

pudiera haber. (Granados, 2003)
2.3. Tipos de tinción.
2.3.1. Simples: utilización de un solo tinte con el cual podemos evaluar solamente la
morfología.
Las tinciones simples es cuando toda la muestra se tiñe del mismo color y se utiliza
un solo colorante.
2.3.2. Compuestas o especiales: constituidas por 2 o más tintes o reactivos y sirven para
clasificar las bacterias u observar sus características especiales.
2.3.3. Positivas: se observa teñida la célula sobre un fondo claro.
2.3.4. Negativas: El fondo se tiñe de oscuro para observar la célula o estructuras
refringentes. (Granados, 2003)
2.4. Tinción Gram
La tinción de Gram, también conocida como coloración de Gram, es una técnica de
laboratorio que se utiliza rutinariamente en los estudios microbiológicos de las bacterias.
Fue diseñada por Christian Gram, un científico danés, en el año 1884. El objetivo de
Gram era conseguir una prueba con la que fuera posible diferenciar diferentes grupos de
bacterias para así poder estudiarlas y clasificarlas. La prueba resultó todo un éxito y
pronto se convirtió en una técnica muy útil no solo para el estudio de las bacterias, sino
también para poder identificarlas rápidamente en una infección y seleccionar el
antibiótico más adecuado para tratarla. (Granados, 2003)
2.5. Tinción Flagelar
Los flagelos son estructuras demasiado finas para ser visibles al microscopio óptico. Sin
embargo, si se tratan con suspensiones coloidales de sales de ácido tánico puede ponerse
de manifiesto su presencia y disposición en la célula, por medio de la formación de un
precipitado grueso que se deposita sobre la pared celular y los flagelos. De esta forma,
el diámetro de estas estructuras aumenta de tal modo que una tinción subsiguiente con
Fucsina Básica (Coloración de Leiffson) o Nitrato de Plata (Impregnación Argéntica),
las hace visible en el microscopio óptico. Es una tinción útil en la identificación de
bacilos Gram negativos no fermentadores. (Cervantes A., 2013)
2.6. COLORACIÓN DE AZUL DE METILENO DE LOEFFLER (coloración de
gránulos metacromáticos)
Es una coloración simple y de gran utilidad para el género Corynebacterium. Muchos
microorganismos, tanto procarióticos como eucarióticos, pueden acumular gránulos de
volutina, que se tiñen con colorantes básicos tales como azul de metileno. Estos cuerpos
de denominan también gránulos metacromáticos, porque presentan un efecto
metacromático, viéndose rojos cuando se tiñen con un colorante azul. En las
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micrografías electrónicas aparecen como cuerpos extraordinariamente densos a los

electrones. Los gránulos deben su comportamiento metacromático a la presencia de
grandes cantidades de polifosfato inorgánico que constituyen una fuente de reserva
intracelular de fosfato. (Granados, 2003)
2.7. Tinción negativa
El método consiste en mezclar una cantidad de bacterias en una pequeña cantidad de
tinta china. Este pigmento no es bacteriano, por lo cual no penetran en los
microorganismos lo cual produce que estos sean visibles en el campo obscuro. Sirve para
observar el tamaño y morfología. (Cervantes A., 2013)
2.8. Tinción ácido resistente.
Todas las bacterias se tiñen con la colorante fucsina en presencia de calor. Sin embargo,
la mayoría de las bacterias se decoloran después del tratamiento con etanol/HCl, excepto
las micobacterias y géneros relacionados que resisten al tratamiento decolorante y
retienen al colorante. Este ácido alcohol resistencia se debe al alto contenido de
sustancias hidrofóbicas (ácidos micólicos) en la pared celular.
Bacterias ácido alcohol resistentes, se denomina así a un grupo de bacterias (Género
Mycobacterium, Nocardia, Corynebacterium) que resisten la decoloración de un
solvente orgánico al que se le adiciona un ácido fuerte. Esta propiedad se debe a que
poseen una capa gruesa de ceras que resiste la coloración, pero que una vez teñida la
mantienen, aún después de un tratamiento drástico con etanol más 3% de ácido
clorhídrico concentrado. (Granados, 2003)
3. PARTE EXPERIMENTAL
3.1. Material y Equipo.
3.1.1. Lámpara de alcohol
3.1.2. Microscopio
3.1.3. Porta y Cubre objetos

3.2. Sustancias y reactivos

3.2.1. Cultivos.
3.2.2. Agua destilada
3.2.3. Tinta china
3.2.4. Alcohol Cetona
3.2.5. Lugol
3.2.6. Azul de metileno
3.2.7. Cristal violeta
3.2.8. Safranina
3.2.9. Fucsina Fenica
3.2.10. Alcohol-Acido
3.2.11. Colorante de Leiffson
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3.3. Procedimiento
3.3.1. Tinción Flagelar

3.3.1.1. Preparar una ligera concentración del M.O. en agua.

3.3.1.2. Colocar en un portaobjeto limpio con ácido. Dejar secar. Marcar con un lápiz
dermográfico la parte opuesta donde se realizó el extendido.
3.3.1.3. Cubrir con colorante de Leiffson. Colorear de 5 a 10 minutos (se formará un
precipitado).
3.3.1.4. Lavar el precipitado y enjuagar el portaobjeto y dejar secar

3.3.2. COLORACIÓN DE AZUL DE METILENO DE LOEFFLER (coloración de

gránulos metacromáticos)

3.3.2.1. Efectuar un extendido fino. Fijar a la llama.

3.3.2.2. Lavar con metanol para desengrasar dejar secar a ambiente.
3.3.2.3. Cubrir con azul de metileno durante un minuto.
3.3.2.4. Lavar el portaobjeto con agua. Y secar al mechero y observar.

3.3.3. Tinción negativa.

3.3.3.1. Se coloca en el portaobjetos una pequeña gota de tinta china, esta no debe
sobrepasar los 4 milímetros.
3.3.3.2. Se coloca el inóculo sobre la gota de tinta china.
3.3.3.3. Con otra placa de vidrio se realiza el frotis se deja secar por 1 minuto
3.3.3.4. Se coloca safranina como contraste y se deja actuar por 3 minutos se lava
con agua destilada y se fija al mechero.
3.3.3.5. Observar al microscopio.
3.3.4. Tinción Gram
3.3.4.1. Se realiza un frotis dependiendo si el medio es sólido o líquido.
3.3.4.2. Se cubre la muestra con violeta de genciana o cristal violeta por 10 segundos.
3.3.4.3. Lavar por con agua destilada, cuidando que no se arrastre la muestra y sacudir
para eliminar el exceso de agua.
3.3.4.4. Se coloca la solución de yodo. 10 segundos
3.3.4.5. Lavar por con agua destilada, remover el exceso de agua
3.3.4.6. Decolorar alcohol cetona 70% /30% por 5 segundos.
3.3.4.7. Lavar con agua
3.3.4.8. Cubrir con Safranina durante 10 segundos.
3.3.4.9. Lavar con agua remover el exceso de agua usando papel absorbente.
3.3.4.10. Dejar secar al mechero
3.3.4.11. Observar al microscopio con 40 x y 100 x usando aceite de inmersión.
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3.3.5. Tinción Ácido resistente.

3.3.5.1. Se realiza un frotis dependiendo si el medio es sólido o líquido.

3.3.5.2. Colocar Fucsina fenica por 10 segundos, luego colocar al calor del mechero
hasta que se note la presencia de vapores blancos
3.3.5.3. Dejar reposar por 10 minutos.
3.3.5.4. Lavar con Alcohol ácido.
3.3.5.5. Colocar Azul de metileno.
3.3.5.6. Lavar con agua destilada.
3.3.5.7. Fijar y observar en 40x y 100x con aceite de inmersión.

4. DATOS
4.1. DATSO EXPERIMENTALES

Tabla 4.1-1
Observaciones de técnicas de Tinción
Técnica de Tinción Observación.

Tinción Flagelar La muestra se torna de color rojo.

COLORACIÓN DE AZUL DE
La muestra de yogurt toma un color azul.
METILENO DE LOEFFLER

La muestra toma el color azul.

Tinción Negativa

La muestra se torna de color rojo.

Tinción Gram

Fuente: Grupo/Laboratorio de Biotecnología Industrial

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5. RESULTADOS

Tabla 5.1-1.
Observaciones en el microscopio
Técnica de Tinción Observación.

Tinción Flagelar Se observa la forma flagelar de los microorganismos

teñidos de color rojo.

COLORACIÓN DE AZUL
DE METILENO DE Se observa los lactobacilos, cocos y diplococos
LOEFFLER presentes en la muestra de yogurt de color azul.

Tinción Negativa Se observa la tinción de bacilos presentes en la

muestra de color azul.

Tinción Gram Se observa la distinción de organismos Gram positivos

tornándose de color azul que corresponde al reactivo
Cristal Violeta y los organismos Gram negativos
tornándose de color rojo correspondiente al reactivo
Safranina.

Fuente: Grupo/Laboratorio de Biotecnología Industrial

6. DISCUSIÓN
El método usado en la experimentación fue de carácter cualitativo, mismo que es
aceptado ya que se cumplió con cada uno de los objetivos determinados como la
aplicación de las diferentes técnicas de tinción y la determinación del tipo de
microrganismos que se observó en las diferentes muestras. Sin embargo, se observaron
errores de tipo aleatorio al momento de realizar la preparación de la tinción, puesto que
cuando se realizó la tinción acido resistente se evidencio que al momento de colocar el
portaobjeto con la muestra hacia la llama y al finalizar los procedimientos adecuados de
esta tinción se observó en el microscopio un color obscuro sin presencia de
microrganismos, puesto que la exposición inadecuada de calor, provoco la muerte de
estos, también al hacer el raspado de las colonias de los cultivos se puede correr el riesgo
de desprender el agar del cultivo y afectar de este modo al mismo. Se recomienda tener
una buena relación de distancia al momento de secar y fijar las muestras en el
portaobjetos, usando el tacto de la misma mano con la que se esta trabajando para que no
se queme la muestra ya que se puede presentar la pérdida de microorganismos y obtener
una buena visualización de estos en el microscopio, también ser precavido con el tiempo
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que debe ser sometido a tinción con el colorante ya que al lavar el exceso de colorante
puede irse todo el colorante impidiendo que al observar con el microscopio no se hayan
tinturado los microorganismos a observar..

7. CONCLUSIONES
7.1. Gracias a la previa experimentación con el microscopio, identificación de partes y como
se realiza una observación realizando un enfoque y manejo del microscopio facilito el
enfoque de las diferentes tipos de observación, teniendo en cuenta que al ser
microorganismos muchas de las observaciones se realizaron con el lente de 100x, para
poder observar con este lente se debe usar un líquido llamado aceite de inmersión para
que sea efectiva la observación que de otro modo no se va a poder observar nada o hasta
se puede llegar a dañar el lente.

7.2. Se aplicaron diferentes tipos de técnicas de tinción, identificando el procedimiento que

se debe seguir en cada uno de ellos y los reactivos y el orden de aplicación de los mismos
en función de un tiempo para que sea efectiva la tinción de las muestras puesto que no
todos los microorganismos se tiñen fácilmente o dependiendo al tipo de estructura su
morfología impide la tinción directa por lo que se debe realizar un procedimiento extra
previo a su observación e identificación.

7.3. Se logro identificar varios tipos de microrganismos gracias al método de tinción al

realizar la observación con el microscopio, identificando su morfología, el tipo de
estructura que posee el microorganismo observado y las características que los
diferencian unos de otros, ejemplificando, las estructuras del yogurt no son iguales a las
estructuras que se observaron en las colonias de cultivos.

7.4. Haber socializado previamente los diferentes tipos o técnicas de tinción ayudo mucho al
momento de realizar las muestras ya que no todos los procedimientos son iguales o
llevan el mismo tiempo, algunas se pre tratan o se deja expuestas las muestras largas
cantidades de tiempo para poder realizar la tinción ya que algunas se debe desengrasar
o quitar algún tipo de impedimento que tiene la misma para que se puede identificar el
microorganismo.

8. CUESTIONARIO
8.1. ¿Cuál es la aplicación de las preparaciones en fresco?

Las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos vivos y observar:

la movilidad, el tamaño y la forma de agrupación de los microorganismos en su estado
natural y sin alteraciones; así como gránulos retráctiles, esporas sin teñir y cloroplastos
dentro de las células vivas. (Calvo GA, Esteban RFJ, Montuenga FL.2009)
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8.2. ¿Qué grupos microbianos se observan con las preparaciones en fresco?

Con las preparaciones en fresco se pueden observar microorganismos, células humanas,

cristales, entre otros organismos a los cuales se examinan directamente, sin modificar o,
como mucho, se diluye o concentra. (Calvo GA, Esteban RFJ, Montuenga FL.2009)

8.3. ¿Por qué se fija una muestra? ¿Cuándo se lo hace con calor y cuando sin calor?

Los extendidos o frotes se dejan secar al aíre; para asegurar que las células queden
adheridas al portaobjetos y no se desprendan durante los lavados que se realizan durante
la tinción; la preparación se fija con calor moderado, pasando el portaobjetos 5 o 6 veces
sobre la flama del mechero, o adicionando sustancias deshidratantes y/o precipitantes
como metanol o cloruro mercúrico, procediendo a hacer la tinción. (Keller,2013)

8.4. ¿Cómo están constituidos los colorantes?

Están formados por un grupo cromóforo, que en la parte de la molécula ES responsable

del color y un grupo auxócromo que, al formar sales, les permite disociarse y
combinarse. Existen algunos, llamados colorantes vitales, que pueden añadirse
directamente a una preparación en fresco; por tanto, colorean células vivas.
(Keller,2013)

8.5. ¿Qué es una tinción diferencial?

Las tinciones diferenciales se utilizan para distinguir entre tipos de microorganismos. La

técnica de tinción diferencial consta de dos etapas: una tinción primaria (siguiendo el
mismo método que en una tinción simple) seguida de una tinción de contraste. En la
tinción de contraste se utiliza otro colorante que tiñe (y por tanto, revela) las células no
teñidas por el primer colorante. Estas tinciones son muy utilizadas en microbiología. Por
ejemplo, la tinción de Gram y la tinción de ácido-alcohol resistencia, ambas aplicadas a
bacterias. (Keller,2013)

8.6. ¿Cuál es la diferencia entre tinción Gram y tinción Ziehl Neelsen y cuál es su
importancia?

La tinción Gram se la utiliza principalmente para identificar bacterias Gram + y Gram -

, las cuales se tiñen de acuerdo con el tamaño del peptidoglicano de su pared celular, a
diferencia de la tinción Ziehl Neelsen que se usa principalmente para la identificación
de patógenos como la tuberculosis, y se lo utiliza para teñir microorganismos resistentes
a la decoloración por ácidos y alcoholes, los cuales poseen en su estructura ácidos
micólicos.
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La importancia de la tinción Ziehl Neelsen es en el campo clínico, pues gracias a este

tipo de tinción se puede lograr fácilmente el reconocimiento de microorganismos
causantes de alguna infección.

8.7. De qué color se observan las bacterias ácido alcohol resistentes, indique la causa.

Todas las bacterias se tiñen con la colorante fucsina en presencia de calor. Sin embargo,
la mayoría de las bacterias se decoloran después del tratamiento con etanol/HCl, excepto
las micobacterias y géneros relacionados que resisten al tratamiento decolorante y
retienen al colorante. Este ácido alcohol resistencia se debe al alto contenido de
sustancias hidrofóbicas (ácidos micólicos) en la pared celular.

8.8. ¿Qué tienen en común y en que se diferencian las paredes celulares de las Gram +
y Gram -? Cite un ejemplo de cada uno de los grupos.

La pared de las Gram negativas posee una o más capas delgadas de peptidoglicano y
presenta un contenido lipídico diez veces mayor que el de las Gram positivas. Las Gram
positivas poseen una capa gruesa de peptidoglicano que puede llegar a constituir hasta
el 90% de la pared celular.

9. BIBLIOGRAFÍA

9.1. Granados, R. (2003). Microbiología Tomo I. España: Paraninfo.

9.2. Stanier, R. (1992). Microbiología. Barcelona: Reverté S.A.
9.3. Cervantess A., (2013). Tinción de bacterias. Recuperado de sitio web:
https://es.slideshare.net/athzirycervantess/tincin-de-bacterias?next_slideshow=1
9.4. Keller PJ. Imaging morphogenesis.(2013) technological advances and biological
insights. Science. 340: 123-168
9.5. Calvo GA, Esteban RFJ, Montuenga FL. (2009). Técnicas en histología y biología
celular. 2nd ed. Madrid Spain: Elsevier.

10. ANEXOS
10.1. Diagrama del equipo. (Anexo a mano)
Anexo 1
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