SEGUNDO TP BIOQUIMICA HUMANA 2014

GLUCEMIA-ORINA- ELISA CHAGATEST

Las semanas del 22/9 al 26/9 y 29/9 al 3/10 se realizará el Trabajo Práctico N°2.

Los alumnos deberán asistir únicamente en la semana que les corresponda al

AULA de BIOQUIMICA del 4° PISO ASCENSORES DERECHA donde se realizará
primero una breve explicación de lo que se hará durante el práctico.
Se realizarán: Medición de Glucemia, ELISA, análisis de orina por tiritas reactivas y
una mostración de una corrida electroforética de proteínas. Las determinaciones
corresponden a dos pacientes X y Z y se agregan dos casos clínicos para discutir con los
resultados obtenidos.
Habrá protocolos resumidos en las mesadas para que los alumnos puedan seguirlos
pero NO deben llevárselas.

DETERMINACIÓN DE GLUCEMIA

FUNDAMENTO DEL MÉTODO:

Glu-oxidasa
Glucosa + O2 + H2O ácido glucónico + H2O2

peroxidasa
H2O2 + 4-aminofenazona + 4-hidroxibenzoato quinonimina roja

PROTOCOLO

TUBO H2O T MUESTRA REACTIVO

(ml) (ml) (ml) (ml)
B 1 - - 1
T1 0.75 0.25 - 1
T2 0.5 0.5 - 1
T3 0.25 0.75 - 1
T4 - 1 - 1
Muestra (X o - 1 1
Z)

A) Mezclar el contenido de los tubos sin formar espuma

B) Incubar 15 min a temperatura ambiente
C) Ajustar con el BLANCO el cero del fotocolorímetro a 500nm
D) Leer las A 500nm de los tubos de la CURVA DE CALIBRACION o de los tubos de
las MUESTRAS INCÓGNITAS (X o Z).
E) Realizar la curva de calibración (gráfico A vs [glucosa])
F) Interpolar el valor obtenido de la A500nm de las muestras incógnita en dicho
gráfico y determinar el valor de glucemia de las muestras. Analizar el resultado del
valor de la muestra, utilizando la curva.

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La concentración del testigo es de 250 mg%. Los alumnos deberán calcular la
concentración de glucosa de cada uno de los puntos que corresponden a:
Tubo blanco
Testigo 1: 60 mg%
Testigo 2: 125 mg%
Testigo 3: 190 mg%
Testigo 4: 250 mg%

Valores obtenidos por los docentes:

0.4

0.3
Absorbancia

0.2

0.1

0.0
0 100 200 300
Concentración glucosa mg%

Valores obtenidos por cada grupo de alumnos.

Graficar la curva de Absorbancia en función de la Concentración de Glucosa, en hoja
milimetrada, y luego obtener el valor de Glucemia del paciente X o el paciente Z. Informar
este valor a los docentes.

TUBOS Absorbancia

Blanco

Testigo 1 (60 mg%)

Testigo 2 (125 mg%)

Testigo 3 (190 mg %)

Testigo 4 (250 mg%)

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 ELISA

El enzimoinmunoanálisis es una de las técnicas inmunoquímicas más importante

desarrollada en los últimos años. Los inmunoensayos sirven para detectar y cuantificar
antígenos o anticuerpos y para estudiar la estructura de los antígenos. Si el ensayo es
adecuado son rápidos y fáciles rindiendo información que sería difícil obtener utilizando
otras técnicas.

El enzimoinmunoanálisis es un método objetivo y automatizable; a diferencia del RIA

está exento de legislación restrictiva y los reactivos usados se conservan durante un

tiempo relativamente prolongado. Estas consideraciones unidas al hecho de que sólo se

necesita un equipo sencillo y económico, han llevado al desarrollo reciente de

numerosos enzimoinmunoanálisis, muchos de los cuales son especialmente adecuados

para su utilización en laboratorios pequeños y en países en desarrollo.

Nos ocuparemos ahora de un tipo de enzimoinmunoanálisis conocido como análisis por

enzimas fijadas a inmunoadsorbentes (ELISA). Esta técnica presenta como requisito

que los anticuerpos o los antígenos se puedan ligar a una enzima y que este complejo

retenga tanto la actividad inmunológica como la enzimática.

En estos ensayos, el antígeno o el anticuerpo se une usualmente a un soporte de fase

sólida para facilitar la separación de los reactivos libres y combinados. Se ha hallado que
antígenos y anticuerpos se pueden unir covalentemente al material particulado, como

celulosa, poliacrilamida, y que también se puede obtener una adsorción pasiva

satisfactoria a tubos, perlas, discos o microplacas de nylon, poliestireno, polivinilo o

polipropileno. Como ya se ha mencionado una parte esencial del ELISA es la

conjugación del anticuerpo (o antígeno) con una enzima. Es necesario que la enzima

tenga actividad elevada, sea económica, fácil de obtener en forma pura, y que posea

una reacción con el sustrato fácilmente medible. Las enzimas consideradas hasta ahora

más satisfactorias son la peroxidasa del rábano picante, la glucosa oxidasa, la β-

galactosidasa y la fosfatasa alcalina. Estas son fijadas generalmente a anticuerpos o

antígenos por medio de glutaraldehído o periodato. Los conjugados así obtenidos han
demostrado ser estables durante muchos meses, incluso años.

3
La elección del sustrato es crítica en el ELISA . Los sustratos deben ser estables y
solubles antes y después de la reacción enzimática. Los sustratos cromogénicos deben

ser incoloros inicialmente y fuertemente coloreados después de la degradación. Los

sustratos fluorogénicos, que producen un compuesto fluorescente, pueden ser

ventajosos para análisis de alta sensibilidad.

ELISA INDIRECTO

Si bien existen muchas formas de llevar a cabo un ELISA y se los puede clasificar según

varios criterios diferentes, describiremos el método más comúnmente utilizado,

denominado Elisa Indirecto. Este método es ampliamente utilizado para la

determinación de anticuerpos, ya que se necesitan sólo unos pocos conjugados (ej.

anticuerpos anti-inmunoglobulinas humanas marcadas con enzimas) para analizar

anticuerpos de una gran variedad de enfermedades. La técnica es la siguiente:

1) El antígeno correspondiente se adsorbe a las placas de poliestireno, y luego se lavan.

2) Las muestras a ensayar se incuban en las concavidades y las placas se lavan

nuevamente; el anticuerpo presente reacciona con el antígeno inmovilizado en la

superficie de las concavidades.

3) El conjugado de antiinmunoglobulinas humana marcado con enzima se incuba en las

concavidades; éste reacciona con cualquier anticuerpo "capturado” en el paso anterior.

El exceso de reactivo se lava.

4) Se agrega el sustrato enzimático y las placas se incuban; la velocidad de la

degradación se indica por el cambio de color, que es proporcional a la concentración de

anticuerpo de las muestras del paso (2).

5) Se detiene la reacción y el color se determina en un espectrofotómetro

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 ELISA (Chagatest de Wiener lab)

Fundamento:

1- La muestra se coloca en el soporte (cubeta o pocillo) en el que se encuentra

inmovilizado el antígeno (antígenos citoplasmáticos y de membrana de Trypanosoma
cruzi). Si la muestra contiene el anticuerpo específico se formará un complejo antígeno-
anticuerpo que quedará unido a la cubeta. Luego de la incubación la fracción no unida se
elimina por lavado.
2- Se agrega el segundo anticuerpo (conjugado), que es un anticuerpo anti-
inmunoglobulina humana conjugado con la enzima peroxidasa. Si la muestra contenía
anticuerpos específicos que formaron complejo con el antígeno y quedaron adheridos a la
cubeta, entonces el anticuerpo conjugado se unirá a los anticuerpos específicos. Luego
de la incubación, el exceso de conjugado se elimina por lavado.
3- Se agrega el sustrato enzimático. Si se unió el conjugado, entonces la
peroxidasa producirá la reacción enzimática dando un color celeste. El sustrato es el
Revelador. La reacción se detiene con el stopper (ácido sulfúrico) con lo que el color
celeste vira a amarillo.

Protocolo:
1. Por grupo se utilizan dos pocillos para procesar:
una Muestra X (paciente X)
una Muestra Z (paciente Z)

5
Rotular los pocillos con Número de GRUPO y Número de Muestra. Mantener cubiertos
con cinta los pocillos sin usar y solo descubrir los que se vayan a usar en esa
determinación. Si el pocillo está rotulado, significa que ya ha sido usado.

2. Con el frasco gotero agregar 1 gota de MUESTRA X en uno de los pocillos

previamente rotulado como (1).

3. Con el frasco gotero agregar 1 gota de MUESTRA Z en uno de los pocillos

previamente rotulado como (2).

4. Cubrir con cinta los pocillos para evitar la evaporación e incubar durante 30
minutos a 37°C en baño termostático. Fijarse que los pocillos estén en contacto con el
agua, pero que no se hundan por completo. Se pueden colocar sobre una placa de Petri
plástica que flota en el líquido del baño.

5. Descartar el líquido de los pocillos en el recipiente de descarte. Lavar con BUFFER

DE LAVADO. Para ello, colocar un poco de este buffer en cada pocillo y después
descartar con firmeza el líquido en el recipiente. Repetir este lavado 4 veces más (5
lavados en total). Después del último lavado, eliminar por completo el líquido residual
invirtiendo los pocillos y golpeándolos varias veces sobre papel absorbente.

6. Luego, agregar 1 gota de CONJUGADO en cada pocillo.

7. Mezclar con golpes laterales suaves. Cubrir los pocillos e incubar 30 minutos a
37°C en baño termostático.

8. Descartar el líquido de los pocillos y lavar 5 veces con BUFFER DE LAVADO,

como se realizó anteriormente.

9. Agregar en cada pocillo 1 gota de REVELADOR . Mezclar con golpes laterales

suaves. Puede llevarse a 37°C y esperar hasta el desarrollo de color celeste en la
Muestra X (de 15 a 30 min).

10. Detener la reacción con 1 gota de STOPPER. El color celeste vira a amarillo.
Evaluar a simple vista los resultados. El color es estable durante 30 minutos.

ELECTROFORESIS

Observar cómo se siembran las muestras de proteínas en geles de poliacrilamida-SDS

al 10 %, para realizar una corrida electroforética de proteínas. En este sistema de
electroforesis las proteínas se separan solamente por sus diferencias en el peso
molecular, ya que todas están cargadas negativamente en su superficie por el SDS
(detergente). Luego, pueden observar cómo va avanzando la electroforesis con el paso
del tiempo.

También pueden ver algunos geles, en los cuales ya ha terminado la electroforesis y

luego fueron teñidos con un colorante para proteínas, llamado Coomasie Blue. Se
observa cada calle del gel con diferentes bandas teñidas de color azul, cada banda
corresponde a una, dos o tres proteínas del mismo peso molecular.
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 LOS ALUMNOS DEBEN ENTREGAR UN INFORME CON LOS RESULTADOS del
ELISA y de la GLUCEMIA TANTO DE LA MUESTRA X COMO DE LA MUESTRA Z y la
discusión de los casos clínicos

TIRILLAS REACTIVAS DE ORINA

Se colocará una gradilla con dos tubos, uno de orina del paciente X y otro de orina del
paciente Z en las puntas de cada mesada que dan al pizarrón. Cada grupo de alumnos
usará la orina correspondiente a la muestra del paciente que le tocó de la glucemia.

Protocolo:

1- Familiarizarse con la forma y la dirección de cómo debe sumergirse la tirilla reactiva

dentro de la orina (NO DEBEN APOYARSE LOS DEDOS SOBRE LAS
ALMOHADILLAS ¡!!).
2- Sumergir la tirilla dentro del tubo con la orina, retirándola a los pocos segundos.
3- Esperar un minuto, apoyando la tirilla sobre un papel absorbente sobre la mesada.
4- Comparar los colores de la tirilla reactiva con los resultados de la fotocopia del kit
comercial.
5- Anotar los resultados en el cuaderno y en el informe.

CASOS CLÍNICOS DE LOS PACIENTES ANALIZADOS EN EL TRABAJO PRÁCTICO

PACIENTE X

El señor O.G. de 35 años nacido en la provincia de Chaco concurre al servicio de Clínica

Médica a fin de realizarse un examen de rutina y serología para Chagas por un estudio
catastral que están realizando en la fábrica donde trabaja.
Antecedentes personales: fumador de 30 cigarrillos diarios desde hace 15 años. Peso: 95
kg, talla: 1, 67 m.
Sin antecedentes familiares de importancia.
Al interrogatorio refiere conocer la vinchuca y provenir de un área rural del norte de la
provincia.
En la consulta se le detecta TA: 160/95.

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Examen de laboratorio

Sangre Valores de Referencia

Glucemia: ______ 70-110 mg%

Proteinemia total: 7 g% 6-8 g%
Colesterol total: 260 mg% <200 mg%
Col HDL: 30 >40 mg%
Col LDL: 200 <100 mg%
TAG: 180 mg % <150 mg%
Bilirrubina total : 1 mg% 0.8-1 mg%
Bilirrubina Directa 0.15 mg % <0.2 mg%
GOAT: normal
GPT: normal
Creatininemia: 1mg % 0.6-1.4 mg%
Uremia: 25 mg% 15-45 mg%
Uricemia: 6.5 mg % <8 mg%

Chagatest por ELISA: _____

Orina:

CUESTIONARIO:

- En base a los valores indicados más arriba y los obtenidos en el trabajo práctico,
indique posibles alteraciones metabólicas presentes en este paciente.
1.- Qué características considera presentará la orina de este paciente a nivel de:
a) examen físico, b) químico y c) microscópico.
2.- Si el análisis de Chagatest por ELISA diera positivo, que otra técnica ¿que conoce
podría ser utilizada para confirmar el diagnóstico?

PACIENTE Z

Un paciente de 18 años de edad acude al servicio de urgencias con alteración del estado
de conciencia. Sus padres refieren que el paciente fue diagnosticado de diabetes hace 3
años y está siendo tratado con insulina, manteniendo un aceptable control glucémico.
Cinco días antes del ingreso había comenzado con diarrea y malestar general, pese a lo
cual fue a pasar unos días a la costa con amigos. Durante los últimos dos días, además
de la diarrea, presentó vómitos y en el último día había dejado de ponerse la dosis de
insulina de la noche.

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Examen Físico

Impresión de enfermedad aguda grave. Presenta signos de deshidratación con mucosas

secas y signo del pliegue. Aliento cetónico. Responde a estímulos dolorosos.
Temperatura: 38°C; TA: 100/60; pulso: 94/min. Pupilas normales y normorreactivas.
Auscultación cardiopulmonar normal. Abdomen distendido, doloroso a la palpación, sin
visceromegalias, ruidos intestinales aumentados. Peso aproximado: 60 kg

Datos Complementarios

Sangre: Valores de Referencia

Glucemia: -------- 70-110 mg %

Proteinemia total: 9,5 g% 6-8 g %
Na: 132 mEq/l 135-155 mEq/l
K: 3.0 mEq/l 3,5- 5,5 mEq/l
Cl: 95 mEq/l 98-107 mEq/l
pH: 7.10 7,38-7,42
pCO2: 30 mmHg 32-48 mmHg
% Sat O2: 95 95-98%
CO3H: 10 mEq/l 20–28 mM
leucocitos: 12500/mm3 5000-10000/mm3

Chagatest por ELISA:

Orina:

CUESTIONARIO:
1- Qué enfermedad tiene este paciente?
2- Analice las alteraciones metabólicas presentes en sangre y orina.
3- Qué tratamiento en líneas generales le daría a este paciente?