Resumen

La terapia celular es prometedora para el tratamiento de una variedad de enfermedades. La búsqueda de

una fuente disponible de células madre adultas sigue siendo un gran desafío en la terapia celular. La orina
se considera una fuente ideal de células madre adultas que pueden adquirirse fácilmente mediante
métodos no invasivos. Sin embargo, los tipos específicos de células en la orina no han sido bien
documentados. Aquí, el objetivo de nuestro estudio es identificar los tipos de células en la orina y aislar y
expandir las células progenitoras / progenitoras de la orina humana y evaluar su multipotencia.

Se recogieron muestras de orina de donantes sanos. La suspensión celular se sembró y se seleccionó

debido a la adherencia plástica. Colonias con dos morfologías diferentes aparecieron 7 días después. Un
tipo de colonia tenía forma de huso y se parecía a un fibroblasto; El otro tipo de celda muestra una forma
más redonda. Las células que presentaban una forma similar a la de los fibroblastos se enriquecieron
selectivamente utilizando un cilindro de clonación. Luego se aplicaron ensayos de inducción
multidiferenciación y ensayos de inmunofenotipificación. Los ensayos de caracterización indicaron que
las células adherentes poseían una potente capacidad de diferenciación del trineo y expresaron CXCR4 y
Nanog, así como algunos antígenos de la superficie de las células madre mesenquimales (incluidos CD90
y CD44). Tomados en conjunto, existen al menos dos poblaciones celulares en la orina humana. Una
subpoblación de células madre con capacidad de diferenciación del trineo de la orina humana puede
enriquecerse selectivamente utilizando el método del cilindro de clonación. La orina puede convertirse en
una fuente ideal de células madre adultas para la terapia celular y otras implicaciones clínicas.

Introducción
La terapia celular proporciona un enfoque novedoso para curar una serie de enfermedades [1], [2]. La
terapia celular tiene como objetivo restaurar los tejidos u órganos lesionados mediante la sustitución de
células perdidas o disfuncionales con células funcionales para restablecer sus funciones normales [3]. Las
células madre mesenquimales (CMM) son células estromales multipotentes que son capaces de auto-
renovación y diferenciación en linajes de tejidos mesenquimales, incluyendo estroma de hueso, cartílago,
grasa, tendón, músculo y médula ósea [4]. Se ha demostrado que varias poblaciones de MSC posnatales
multipotentes expresan marcadores asociados a la pluripotencia, como Nanog, que son esenciales para el
mantenimiento de la auto renovación y la diferenciación en las MSC [2].

En general, las células funcionales para terapia se recolectan de células somáticas derivadas de donantes o
células madre. Por lo general, el proceso de recolección de células madre adultas derivadas de donantes,
como las células madre derivadas de tejido adiposo o las células madre derivadas de médula ósea,
requiere la inserción de una aguja o una biopsia, que es altamente invasiva. Por lo tanto, es necesario
buscar una fuente disponible de células madre adultas. Sorprendentemente, la orina, que puede adquirirse
fácilmente de forma no invasiva, ha sido considerada como una fuente ideal novedosa de células madre
adultas para terapias regenerativas personalizadas [5], [6], [7], [8], [9], [10] . Estudios anteriores han
indicado que las células madre derivadas de la orina (USCs) poseen características de las células madre,
incluida la capacidad de adherencia plástica, la clonogenicidad y los potenciales de multidiferenciación
[11].

Sin embargo, se han publicado pocos manuscritos para describir los tipos de células específicas en la
orina humana. Además, los protocolos de cultivo estándar de las USC no han sido bien documentados.
Aquí, informamos que al menos dos subpoblaciones celulares en términos de diferentes morfologías
celulares están presentes en la orina humana, incluidas las células de tipo fibroblasto y las células de tipo
epitelial. Además, los ensayos de caracterización indicaron que las células CXCR4 y Nanog positivas
recolectadas poseían un potencial de multidiferenciación después de la expansión selectiva de colonias de
células similares a fibroblastos utilizando el método del cilindro de clonación.

materiales y métodos
Recolección de muestras de orina humana.
Las muestras de orina se obtuvieron de donantes adultos sanos (rangos de edad de 25 a 40 años, n = 5). El
proceso de recolección fue aprobado por el Comité de Ética e Investigación Clínica de la Universidad
China de Hong Kong o la Universidad de Medicina China de Guangzhou. Los procedimientos
experimentales para muestras de orina y células derivadas de orina se llevaron a cabo de acuerdo con las
directrices aprobadas. Todas las células utilizadas en este estudio se recolectaron con el consentimiento
informado de los donantes para su uso en investigación científica.
Cultivo de células madre derivadas de orina humana
Las muestras de orina (300 ml de cada donante) se centrifugaron a 300 g durante 10 minutos y luego se
lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Las células recolectadas se resuspendieron en
medios de cultivo completos que contenían medio esencial mínimo α (MEMEM-AA; Gibco / Invitrogen,
Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) Suplementado con suero bovino fetal al 10% (Gibco, EE. UU.) Y
penicilina / estreptomicina / neomicina al 1%. . La suspensión celular se sembró en placas de 6 pocillos a
una densidad de 0,3 x 105 células / cm2 y luego se incubó en una atmósfera humidificada de 5% de CO2
a 37 ° C. El medio de cultivo se renovó cada 3 días. Una vez que las células cultivadas primarias
alcanzaron una confluencia de aproximadamente el 60%, las células con forma de huso (USC) se pasaron
selectivamente utilizando un cilindro de clonación (Corning, EE. UU.).

Ensayos de diferenciación multilinaje in vitro

Diferenciación adipogénica
Las células derivadas de la orina humana se tripsinizaron y se sembraron en una placa de 6 pocillos con
medios de crecimiento a una concentración de 1 x 105 células por pocillo. Las células se incubaron en el
medio completo de α-MEM hasta que se alcanzó una confluencia del 90%. El medio se reemplazó luego
por un medio de inducción adipogénico que contenía suero fetal bovino al 10%, dexametasona 1 µM, 10
µg / ml de insulina, indometacina 50 µM e isobutilmetilxantina 0,5 mM. La inducción adipogénica duró 2
semanas y el medio se cambió cada 3 días. Las células se fijaron con 4% (peso / volumen) de
paraformaldehído (PFA) durante 30 min. Se aplicó tinción con Oil Red O y los resultados se observaron
bajo un microscopio.

Diferenciación osteogénica
Las células se sembraron y se cultivaron hasta que se alcanzó una confluencia de aproximadamente el
80%. El medio se reemplazó por un medio de inducción osteogénico que contenía dexametasona 100 nM,
β-glicerofosfato 10 mM y ácido l-ascórbico-2-fosfato 0,05 mM. Las células expuestas a medios de cultivo
completos sirvieron como grupos de control. Después de 2 semanas de inducción, se aplicó la tinción con
rojo de alizarina para evaluar la mineralización. La capa de células / matriz se tiñó con Alizarin Red S al
0,5% (pH 4,1) durante 5 min. La tinción positiva fue vista bajo un microscopio.

Diferenciación condrogénica
Las partes alícuotas que contenían 3 x 105 células se centrifugaron en tubos de polipropileno para formar
una micromasa granulada. Las células sedimentadas se incubaron en un medio de inducción condrogénico
químicamente definido que consiste en α-MEM complementado con 10 ng / mL de factor de crecimiento
transformante humano recombinante β1 (TGF-β1), dexametasona 100 mM, piruvato de sodio 1 mM,
ácido ascórbico 2 mM -fosfato (Sigma-Aldrich, EE. UU.) y Premezcla de ITS + (BD Biosciences, San
José, CA, EE. UU.). Las células cultivadas en un medio basado en α-MEM sirvieron como control
negativo. El medio se cambió cada 3 días. El proceso de inducción duró 3 semanas. Se aplicó Safranin O:
tinción verde rápida, y los resultados de la tinción se observaron en un microscopio de contraste de fase
(Leica Microsystems Wetzlar Gesellschaft mit beschrankter Haftung, Wetzlar, Alemania).

Inmunocitoquimica
Las células se sembraron en portaobjetos en una placa de 12 pocillos (3000 células por pocillo). Las
células se incubaron en medios de cultivo completos α-MEM durante 24 h. Las células se fijaron con
paraformaldehído al 4% durante 30 minutos después del lavado con PBS. Luego, las células se
bloquearon con PBS que contenía albúmina de suero bovino al 1% (BSA; Sigma-Aldrich, EE. UU.)
Durante 30 min a 37 ° C, seguido de permeabilización con Triton X-100 al 0,5% (Sigma-Aldrich, EE.
UU.). Los anticuerpos anti-CXCR4 (1: 300; R&D Systems, EE. UU.) Y anti-Nanog (1: 300; BD
Biosciences, EE. UU.) Se agregaron por separado y se incubaron a 4 ° C durante la noche. Los
anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor 488 (Life Technologies, EE. UU.) Se incubaron con
las células a 37 ° C durante 40 min. Las células se sellaron utilizando glicerina que contenía DAPI (4, 6-
diamidino-2-fenilindol; Life Technologies, EE. UU.) Después del lavado con PBS y luego se observaron
bajo un microscopio confocal.

Citometría de flujo
Las células derivadas de la orina se digirieron enzimáticamente con 0,25% de tripsina-EDTA (Gibco, EE.
UU.) Y luego se resuspendieron en un tampón de resuspensión que contenía BSA al 1% (Sigma, EE.
UU.) A 106 células / ml. Se transfirió un volumen de 300 μL de células a un tubo de citometría de flujo
de 5 ml. Las alícuotas de células se incubaron con CD90, CD44, CD29 y CD73 conjugados con
ficoeritrina (PE) o CD45 y CD34 conjugados con isotiocianato de fluoresceína (FITC) o cada uno de los
anticuerpos de control de isotipo correspondiente (BD Biosciences, EE. UU.) Durante 30 min a
temperatura ambiente. oscuro. Las células se resuspendieron en 1000 μl de tampón de resuspensión
después de lavar con PBS. Luego, la suspensión celular se analizó mediante análisis de citometría de flujo
utilizando el software Cell Quest. BD FACS Canto II se utilizó para la adquisición de datos mediante el
ajuste del voltaje y la compensación utilizando los canales apropiados de excitación y detección. El
análisis de los datos se realizó con el software FlowJo (FlowJo, EE. UU.).

análisis estadístico
Se realizaron al menos tres series de experimentos independientes para cada ensayo. Todos los datos
cuantitativos se transfirieron a hojas de cálculo estadísticas y se analizaron mediante un programa
estadístico disponible en el mercado SPSS versión 16.0 (IBM SPSS Inc., Chicago, IL, EE. UU.). La
prueba de la t de Student se utilizó para las comparaciones de los valores medios entre dos grupos con p
<0,05 considerado estadísticamente significativo. Todos los datos se presentan como media ± desviación
estándar.
Resultados
Observación de la morfología celular.
Se observaron células adherentes y colonias con dos morfologías 7 días después de la siembra (Fig. 1A).
Uno exhibió forma de huso y morfología similar a fibroblastos; La otra forma más redonda mostrada. Por
lo tanto, la orina puede contener al menos dos poblaciones celulares, incluidas las células de tipo MSC
(Tipo A) y las células de tipo epitelial (Tipo B). Luego, las células con forma de huso se pasaron
selectivamente y se expandieron usando el cilindro de clonación. Las células permanecieron en forma de
huso y se volvieron homogéneas en morfología después del pasaje (Fig. 1B). Sin embargo, las células con
forma más redonda pronto desaparecieron después de unas pocas semanas de cultivo porque las células de
tipo epitelial proliferan muy lentamente en los medios α-MEM, y su expansión requiere medios
específicos de células epiteliales [12], [13].

Figura 1
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Figura 1. Observación de la cultura y morfología de muestras derivadas de orina humana. (A)
Aparecieron células adherentes con dos formas diferentes 7 días después de la siembra. Un tipo mostraba
la forma del huso y el otro exhibía células de tipo epitelial. (B) Las colonias de células en forma de huso
se expandieron selectivamente utilizando el método del cilindro de clonación. Las células se volvieron
homogéneas en morfología y permanecieron en forma de huso después del pasaje. Barra de escala: 100
μm.

Ensayos de inducción e inmunofenotipificación de multidiferenciación.

Para determinar el fenotipo de las células derivadas de la orina cultivadas, se aplicó inmunocitoquímica.
Los resultados de la inmunotinción mostraron que las células en forma de huso aisladas de la orina
humana eran positivas para CXCR4 y Nanog (Fig. 2). Simultáneamente, las células se expusieron a varios
tipos de medios de inducción de diferenciación. Los resultados de los ensayos de inducción de
diferenciación del trineo (Fig. 4A-C) indicaron que las células con forma de huso derivadas de la orina
humana eran capaces de diferenciación osteogénica, adipogénica y condrogénica en condiciones de
inducción apropiadas. Además, los resultados de la PCR de transcripción inversa cuantitativa en tiempo
real (qRT-PCR) (Fig. 4D) confirmaron aún más el aumento de la expresión de marcadores asociados
condrogénicos (aggrecan, sox9 y colágeno 2a) del grupo de inducción en comparación con el grupo de no
inducción . Además, el análisis de citometría de flujo mostró que las USC eran positivas para CD90 y
CD44 (más del 85% de la tasa de expresión), pero carecían de la expresión de marcadores
hematopoyéticos (CD45 y CD34), CD29 y CD73 (Fig. 3). Por lo tanto, en este estudio, las USC poseían
capacidad de diferenciación de trilinaje y expresaron varios marcadores específicos de MSC. Una
subpoblación CD90 + / CD44 + / CD29- / CD73- / CD45- / CD34- USC podría enriquecerse
selectivamente a través de este protocolo.