Desarrollo de un ensayo inmunoabsorbente ligado a

enzimas para el diagnóstico precoz del embarazo en

bovinos
RESUMEN
El requisito previo para mejorar la eficacia reproductiva y el éxito del parto es un
diagnóstico temprano y preciso del embarazo. Se desarrolló un ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA, por sus siglas en inglés) altamente sensible
que utiliza la segunda técnica de recubrimiento de anticuerpos y el conjugado de
peroxidasa de rábano picante como un marcador para la determinación de la proteína
estimulada por interferón, 15 kDa (ISG15) en vacas lecheras. Para validar un ELISA
basado en lisado de neutrófilos para el diagnóstico precoz del embarazo, se recogieron
muestras de sangre de vacas Karan Fries (KF) multiparares sanas el día 0 (día de la IA),
10, 14, 16 y 21 después de la inseminación artificial. El embarazo y el no embarazo en
vacas se confirmaron mediante análisis de progesterona en plasma, ecografía y
palpación rectal. El rango de detección del ensayo fue de 0,312 a 25 ng / ml con una
sensibilidad de 0,13 ng / ml. El coeficiente de variación interensayo e intraensayo fue de
12.1% y 10.1%, respectivamente. El paralelismo para las concentraciones medidas y
esperadas tuvo un valor r2 de 0.90 y 0.93, respectivamente. Se observó que la
concentración de ISG15 fue mayor (P <0.01) en embarazadas en comparación con las
vacas no embarazadas, siendo la mayor 9.36 ± 0.50 ng / ml en el día 16 en vacas
gestantes. Con el uso de inmunocitoquímica, hubo una tinción positiva para ISG15 con
una mayor tinción en los neutrófilos de las vacas gestantes del día 16. El estudio revela
que la proteína ISG15 en un lisado de neutrófilos se puede utilizar como biomarcador
para el diagnóstico precoz del embarazo en vacas. Palabras clave: ELISA; Bovino;
Diagnóstico de embarazo; Lisado de neutrófilos; ISG15.

1. Introducción
Para una ganadería lechera rentable, el ganado lechero debe parir cada 12 a 14 meses.
Se están utilizando muchos métodos directos e indirectos de diagnóstico de embarazo
para el ganado; ninguno de estos, sin embargo, es tan preciso como deseable para un
método ideal de diagnóstico de embarazo debido a las limitaciones de las técnicas. Los
avances en la detección temprana de embriones o embarazos pueden llevar al
desarrollo de estrategias para mejorar la fertilidad en el ganado. Los métodos de
diagnóstico del embarazo para detectar el embarazo dentro de las 2 semanas
posteriores a la inseminación son muy deseados por los productores de productos
lácteos, ya que con este enfoque habrá una disminución en el período cuando las vacas
no están embarazadas y, por lo tanto, el intervalo de partos será más corto para los
animales en el rebaño (Morton y Wynn, 2010). Una de las estrategias más efectivas para
el manejo de la fertilidad para prevenir y reducir las pérdidas económicas en los hatos
lecheros es identificar los animales embarazados y no embarazados tan pronto como
sea posible después de la inseminación (Ott et al., 2014). El interferón-τ, un polipéptido
de 172 aminoácidos, es producido por las células trofoblásticas mononucleares del
conceptus entre los días 14 y 16 después de la fertilización (Roberts et al., 1999; Roberts,
2007). Algunos IFNτ se transportan desde el útero y se pueden detectar en la sangre en
los días 16 a 18 de gestación en las ovejas (Bott et al., 2010). La concentración circulante
de IFNτ es extremadamente baja en este momento y este hecho impide su uso como
marcador para la detección temprana del embarazo. Un enfoque alternativo para
detectar el embarazo en una fecha temprana es medir la respuesta de los leucocitos
circulatorios al IFNτ. Los leucocitos, incluidos los neutrófilos, responden al IFNτ
expresando genes estimulados por interferón (ISG), incluido el ISG15.
El rápido avance en el desarrollo de técnicas moleculares ha dado lugar a nuevos
enfoques para explorar ISG en leucocitos de sangre periférica (PBL) durante el embarazo
temprano. Las PBL también tienen una respuesta ISG relativamente mayor a otros
interferones, por lo que es necesario conocer las fechas de inseminación y luego el
diagnóstico confirmatorio del embarazo. El presente estudio fue un esfuerzo con la
hipótesis de que la detección de ISG15 a través del inmunoensayo podría facilitar el
diagnóstico precoz del embarazo en las vacas.

2. Materiales y métodos
2.1. Sustancias químicas y reactivos
La mayoría de los productos químicos y reactivos utilizados en el experimento se
obtuvieron de Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.), Thermo Fisher Scientific (EE. UU.),
Invitrogen (EE. UU.), OriGene (EE. UU.), Boster Biological Technology Ltd. (EE. UU.) ,
Qiagen (India Pvt. Ltd), Cusabio Ltd. (EE. UU.), Abcam (EE. UU.).
2.2. Permiso etico
El experimento fue aprobado por el Comité Institucional de Ética en Animales (IAEC) del
ICAR-Instituto Nacional de Investigación de Productos Lácteos (NDRI) constituido según
el Artículo 13 de las regulaciones de CPCSEA, desarrollado por el Gobierno de la India
(Reg. No. 1705 / GO / ac / 13 / CPCSEA Fecha: 7/03/2013). Todas las pautas éticas fueron
seguidas durante el curso del experimento.2.3. Muestreo de sangre y aislamiento de
neutrófilos.
2.3. Muestreo de sangre y aislamiento de neutrófilos.
Para desarrollar un ELISA basado en lisado de neutrófilos para el diagnóstico precoz del
embarazo, se seleccionaron vacas multíparas Karan (KF) sanas, de aproximadamente 3,5
años de edad, en su segunda paridad. Las vacas se agruparon en embarazadas (n = 6) y
no embarazadas (n = 6) según la cuantificación de la progesterona plasmática del día 19
al 21, ecografía (Prosound 2, Aloka Ltd., Japón) el día 30 a 45 y por día. Palpación rectal
en el día 60 post inseminación. Las muestras de sangre (6-7 ml) se recogieron en tubos
Vacutainer en los días 0 (día de AI), 10, 14, 16 y 21 después del estro / AI. Las muestras
se transportaron de inmediato al laboratorio en condiciones de hielo frío y se
procesaron dentro de 1 hora después del muestreo. El aislamiento de los neutrófilos de
la sangre completa se realizó mediante el método de centrifugación en gradiente de
densidad utilizando las soluciones 1077 de Histopaque® (número de catálogo 10771,
Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) Y 1119 (número de catálogo 11191, Sigma Aldrich,
St. Louis, MO, EE. UU.) En tubos de polipropileno Falcon de 15 ml, utilizando los métodos
informados por Costa et al. (2006) con algunas modificaciones.
2.4. Lisis de neutrófilos para la cuantificación de ISG15.
Los neutrófilos aislados de sangre total se trataron con tampón hipotónico (NaOH 10
mM, PMSF 0,5 mM, pH 7,1). Los contenidos se sonicaron con sonicador de células Vibra
durante 20 s estallidos seis veces en hielo seguido de ultra centrifugación a 10.000 g
durante 30 min. El homogeneizado se almacenó a 80 ºC hasta que se cuantificó para
ISG15.
2.5. Protocolo
2.5.1. Recubrimiento con anticuerpo de captura.
El anticuerpo de captura (anticuerpo anti-ISG15 policlonal de conejo específico bovino,
número de catálogo TA432596, OriGene Technologies, Inc. Rockville, Maryland, EE. UU.)
Se diluyó a una concentración de 2 μg / ml en tampón de recubrimiento (1: 500 en
Na2CO3 15 mM). Se administraron 35 mM de NaHCO3, 0,02% de tiomersal, pH 9,6) y
100 µl de la misma en los pocillos de una placa de microtitulación de poliestireno
(Greiner Labortechnik, Alemania). La placa recubierta se incubó durante la noche a 4ºC.
Después de la incubación durante la noche, los pocillos se lavaron con 250 µl de tampón
de lavado (Tween 20 al 0,05% en TBS) tres veces durante 5 minutos cada uno.
2.5.2. Bloqueo (postcoat)
Para saturar los sitios de unión restantes, se agregaron 250 μl de tampón de bloqueo
(BSA al 1%) a todos los pocillos y se incubaron durante 90 minutos a temperatura
ambiente con agitación constante. Después de la incubación, la solución de la capa
posterior se retiró y los pocillos se lavaron con tampón de lavado (Tween 20 al 0,05% en
TBS) tres veces durante 5 minutos cada uno.
2.5.3. Protocolo de ensayo
Hubo 100 μl de estándares (proteína recombinante ISG15 bovina, CSB-MP011843BO,
Cusabio, Houston, EE. UU. En concentraciones de 0, 5, 10, 15, 20 y 25 ng / ml) y muestras
de lisado de neutrófilos (dilución 1: 5 en PBS) añadido en los respectivos pozos. La pureza
de la proteína ISG15 fue> 85% según lo determinado por SDS-PAGE. La placa se incubó
a 37 ºC durante 2 horas. Los contenidos de todos los pozos se aspiraron pero se dejaron
sin lavar. Luego, se agregaron a cada pocillo 100 μl de anticuerpo Biotin (número de
catálogo ab97049, Abcam, Suite, MA, EE. UU.) Y la placa se incubó a 37 ºC durante 1
hora. El proceso de aspiración y lavado se realizó dos veces con 200 μl de tampón de
lavado. Se siguió dispensando 100 μl de IX HRP-avidina (número de catálogo 43-4423,
Invitrogen, EE. UU.) A cada pocillo. La incubación se produjo a 37 ºC durante 1 hora. Los
procesos de aspiración y lavado se repitieron cinco veces.

2.5.4. Reacción del sustrato

Para una reacción de sustrato, se agregaron 90 μl de sustrato TMB (número de catálogo
N301, Thermo Fisher Scientific, Rockford, EE. UU.) A cada pocillo en la oscuridad y se
incubaron durante 20 minutos. La reacción se detuvo mediante la adición de 90 µl de
H2SO4 0,18 M y el color se midió a 450 nm utilizando un lector de microplacas (MutiSkan
GO, ThermoScientific, Finlandia). La concentración de las muestras se calculó
extrapolando la concentración de estándares en el eje X respecto a su densidad óptica
en el eje Y (Figura 1) y los datos se linealizaron mediante análisis de regresión.
2.6. Coeficientes de variación inter e intraensayo
Los mismos controles con cantidades relativamente mayores y menores de ISG15 se
analizaron por cuadruplicado en cinco placas diferentes para controlar la variación de
placa a placa. Las medias de la placa para cantidades relativamente mayores y menores
se calcularon y luego se usaron para calcular la media general, la desviación estándar y
el% CV utilizando la fórmula:% CV = SD de la media de la placa / media de la placa x 100.
El promedio del% CV para las muestras con cantidades relativamente menores y
mayores de ISG15 se informó como el CV entre ensayos.
Las concentraciones de ISG15 se midieron por duplicado para 32 muestras. El% de CV
para cada muestra se calculó determinando la desviación estándar de los resultados 1 y
2, dividiendo eso por el promedio duplicado y multiplicando por 100. El promedio de los
CV individuales se informó como el CV intraensayo.
2.7. Sensibilidad
La sensibilidad se determinó agregando dos desviaciones estándar a la OD media
obtenida de las réplicas de cero estándares.
2.8. Paralelismo
Para determinar el paralelismo, una muestra con una concentración relativamente
mayor de ISG15 y el estándar con la mayor cantidad de ISG15 se diluyó 1: 5, 1:10 1:20,
1:50, 1: 100 con cero estándar y se pipeteó en los pocillos por triplicado
2.9. Inmunotinción de ISG15 en neutrófilos sanguíneos.
Después de aislar los neutrófilos mediante centrifugación en gradiente de densidad, el
frotis celular se fijó en un portaobjetos de vidrio con paraformaldehído al 4% (P6148,
Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) Durante 10 minutos a temperatura ambiente. La
capa celular se lavó dos veces con PBS-tween (Tween-20 al 0,1% (9005-64-5, Sigma-
Aldrich) en PBS). Para permeabilizar las células, se utilizó PBST (0,1% Triton X-100 (9002-
93-1, Sigma-Aldrich) en PBS). El tampón de permeabilización se eliminó y las células se
lavaron con PBS-tween. Los sitios de unión no específicos se bloquearon con solución de
bloqueo (BSA al 1% (número de catálogo A7030, Sigma-Aldrich) en PBST) durante 1 hora.
Después de eliminar el tampón de bloqueo, la capa de células se incubó con el
anticuerpo policlonal de conejo específico bovino anti-ISG15 (número de catálogo
TA432596, OriGene Technologies, Inc. Rockville, Maryland, EE. UU.; 1: 1000 en tampón
de bloqueo) y se incubó a 4 ºC durante la noche . Después de la incubación, el anticuerpo
primario se aspiró y las células se lavaron tres veces con PBS-Tween. Se añadió
anticuerpo secundario anti-conejo de cabra conjugado con FITC (1: 2000; número de
catálogo BA1105-1, Boster Biological Technology, Ltd.) y se incubó durante 90 minutos
en la oscuridad a temperatura ambiente. Después de la incubación con anticuerpo
secundario, las células se lavaron tres veces con PBS-Tween en una habitación oscura.
Para visualizar el núcleo, se utilizó la tinción de Hoechst (1: 2000 en PBS; H33342, Sigma-
Aldrich) y las células se incubaron en la oscuridad durante 5 min. Las células se
examinaron posteriormente en la oscuridad usando un microscopio fluorescente
(Olympus, Tokio, Japón).
2.10. Aislamiento de ARN de neutrófilos
El ARN total de los neutrófilos (de 24 animales con estado patofisiológico variado, cada
categoría con seis animales) se aisló utilizando el Mini Kit RNeasy (número de catálogo
74104, Qiagen, India Pvt. Ltd.) según el protocolo del fabricante. El ADN genómico que
contamina la muestra se eliminó mediante el uso del conjunto de ADNasa libre de
ARNasa (Qiagen, India Pvt. Ltd.) según las pautas del fabricante. El ARN que se aisló se
usó para el procesamiento posterior después de evaluar su pureza e integridad. Se usó
electroforesis en gel de agarosa (1,5%) para evaluar la integridad del ARN mediante la
observación de bandas de ARN (28S y 18S). La pureza del ARN se verificó mediante la
relación de absorción de densidad óptica (OD) a λ260 / λ280 utilizando un
espectrofotómetro Biospec-nano (Shimadzu Corp., Japón). Una proporción de 2.0 fue
generalmente aceptada como "pura" para el ARN.
2.11. Síntesis de ADNc y reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qPCR)
El ARN total (250 ng) se transcribió de manera inversa en cDNA utilizando el kit de
síntesis de cDNA Revert Aid First Strand (número de catálogo K1622, Thermo Scientific,
EE. UU.) Según las pautas del fabricante. La reacción de RT se realizó a 65 ºC durante 5
minutos, 42 ºC durante 60 minutos y 70 ºC durante 5 minutos en un termociclador (Bio-
Rad, EE. UU.). Los cebadores para GAPDH, ß-Actina e ISG15 se seleccionaron según la
literatura publicada (Tabla 1). El tamaño del fragmento de ISG15 (Placa 1) se confirmó
mediante electroforesis en gel de agarosa (1,8%) contra reglas de Gene, escaleras de
ADN de 100 pb y 50 pb (Thermo Scientific, EE. UU.). La reacción de RT-PCR se realizó en
un instrumento Applied Biosystems® 7500 RT-PCR utilizando un cDNA de plantilla (1 μl),
una mezcla maestra de color verde SYBR de Dynamo color flash (10 μl), cebadores
directos e inversos (1 μl cada uno) de ISG15. Se usó agua libre de nucleasas para hacer
un volumen de reacción total de hasta 20 µl. El programa de reacción de RT-PCR
consistió en un calentamiento inicial a 50 ºC durante 2 min, 95 ºC durante 10 min y los
contenidos se amplificaron durante 40 ciclos (95 ºC durante 30 s, 59 ºC para ISG15, 58.2
ºC para GAPDH y ß-actina durante 30 s). La extensión final a 72 ºC de incubación ocurrió
durante 10 min. La GAPDH y la ß-actina se utilizaron como controles endógenos. La
cuantificación relativa del gen diana se realizó mediante el método 2-ΔΔCT (Livak y
Schmittgen, 2001).
2.12. análisis estadístico
Los datos se analizaron utilizando el Software SAS, versión 9.1 del Sistema SAS, Copyright
© (2011) SAS Institute Inc., Cary, NC, EE. UU. Los datos de diferentes experimentos se
presentaron como media ± SE. La diferencia a P≤0.05 fue considerada como
estadísticamente significativa. Los datos se analizaron mediante ANOVA unidireccional
de medidas repetidas para el análisis dentro del grupo y ANOVA bidireccional de
medidas repetidas para el análisis entre grupos. La comparación por pares de los medios
se realizó utilizando la prueba de comparación múltiple de Tukey.

3. Resultados
3.1. Coeficientes de variación inter e intraensayo
Los mismos controles con cantidades relativamente mayores y menores de ISG15 se
analizaron por cuadruplicado usando cinco placas diferentes para monitorear la
variación de placa a placa. Para el CV de ensayo interno, se cuantificaron las
concentraciones de ISG15 en duplicados para 32 muestras. El CV entre ensayos (n = 5) y
el CV entre ensayos (n = 32) fue de 12.1% y 10.1%, respectivamente.
3.2. Sensibilidad
La sensibilidad determinada mediante la adición de dos desviaciones estándar a la OD
media obtenida de las réplicas de estándares cero fue de 0.13 ng / ml.
3.3. Paralelismo
La prueba de paralelismo del ensayo (Figura 2) dio como resultado un valor r2 de 0.8973
para las concentraciones medidas y 0.9251 para las concentraciones esperadas.
3.4. Concentración de ISG15 en el lisado de neutrófilos.
Se observó un aumento significativo (P <0.01) en la concentración de ISG15 (Figura 3)
desde el día 0 (1.13 ± 0.07 ng / ml) hasta 21 (4.35 ± 0.17 ng / ml) con el valor máximo en
el día 16 (9.36 ± 0.50 ng / ml) en vacas preñadas. En vacas no preñadas, las
concentraciones de ISG15 se mantuvieron en valores basales desde el día 0 hasta el día
21 con valores ligeramente mayores en el día 14 (1.91 ± 0.04 ng / ml). Las
concentraciones de ISG15 fueron mayores (P <0.01) en vacas preñadas que en vacas no
preñadas.
3.5. Detección de ISG15 en vacas preñadas
El uso de inmunocitoquímica dio como resultado una fuerte intensidad de señal en los
neutrófilos de las vacas preñadas del día 16 (Lámina 2). Las señales de ISG15 fueron casi
insignificantes en los neutrófilos recolectados el día de AI y el día 10 de vacas preñadas.
Además, en los días 14 y 21, la respuesta ISG15 se atenuó.
3.6. ARNm de ISG15 en animales con diferentes estados fisiopatológicos
La evaluación de la abundancia de ARNm de ISG15 se realizó en 24 animales, y cada
grupo tenía seis animales. La abundancia de ARNm varió (P <0.05) en diferentes
condiciones fisiopatológicas (Figura 4). Se observó que la abundancia de ARNm de ISG15
era máxima en las vacas preñadas (7.44 ± 0.53), seguidas de las vacas mastíticas (5.05 ±
0.15), las vacas laminíticas (2.30 ± 0.14) y las novillas normales (1.00 ± 0.00), que se tomó
como referencia con valor uno.

4. Discusión
Para la detección de la proteína ISG15 en lisado de neutrófilos, se utilizó el
inmunoensayo enzimático directo, simple y altamente sensible que utiliza un sistema de
amplificación de biotina-avidina-peroxidasa y la segunda técnica de recubrimiento de
anticuerpos. El uso del ELISA en sándwich es deseable porque con su uso no hay
necesidad de purificar el antígeno / analito. La concentración de ISG15 fue mayor desde
el día 0 al 21, con un valor máximo en el día 16 en vacas preñadas. El aumento en la
concentración de ISG15 en el día 16 posterior a la inseminación coincide con la mayor
secreción de IFNτ en ese día en particular. Está bien establecido que el reconocimiento
materno del embarazo ocurre en las vacas entre los días 16 y 19 del embarazo. Roberts
et al. (1989) observaron que el conceptus ovino produjo aproximadamente 100 μg / día
de IFNτ en el día 16 del embarazo. Sin embargo, las vacas no preñadas tenían
concentraciones menores de ISG15, posiblemente debido a una falla en el
reconocimiento materno del embarazo. Thakur et al. (2017) observaron que había una
mayor abundancia de ARNm de ISG15 en los días 14 y 16 después de la inseminación en
búfalos gestantes. La abundancia ligeramente mayor de ARNm de ISG15 en los días 0 y
10 después de la inseminación (es decir, antes de que se produzca el reconocimiento
materno del embarazo) puede deberse a la producción endógena de interferones de
tipo II y tipo III. Haq et al. (2016) informaron que hubo un aumento en las
concentraciones de proteína ISG15 en las PBMC de las vacas preñadas y en las PBMC
tratadas con IFNτ cuando se usó la inmunotransferencia para las cuantificaciones. Kizaki
et al. (2013) sugirieron que los perfiles de expresión génica de ISG15, MX1, MX2 y OAS1
se pueden usar como biomarcadores del embarazo en el ganado.
Se estudió el perfil de expresión del gen que codifica la proteína ISG15 y la expresión fue
mayor en las vacas preñadas que en las terneras sanas y en las vacas enfermas. Este
descubrimiento infiere que el IFNτ es más potente que los interferones de tipo II para
inducir la producción de ISG15. Estos resultados son consistentes con los de Shirasuna
et al. (2015) donde se informó que el IFNτ es más potente que el IFNϒ y el IFNß en la
inducción de la expresión del gen ISG15 en células lúteas del ganado bovino. Shirasuna
et al. (2012) informaron que en un experimento de cultivo celular in vitro, el tratamiento
con IFNτ indujo un aumento en la abundancia de ARNm para los ISG tanto en las PBMC
como en las PMN. Sheikh et al. (2018) informaron que había una regulación positiva de
ISG15, OAS1, MX1 y MX2 en el PMN en vacas lecheras preñadas. La respuesta de ISG15
a IFNτ está mediada a través de la vía JAK3 y PI3K en los neutrófilos (Sheikh et al., 2018).
Se estudió el perfil de expresión del gen que codifica la proteína ISG15 y la expresión fue
mayor en las vacas preñadas que en las terneras sanas y en las vacas enfermas. Este
descubrimiento infiere que el IFNτ es más potente que los interferones de tipo II para
inducir la producción de ISG15. Estos resultados son consistentes con los de Shirasuna
et al. (2015) donde se informó que el IFNτ es más potente que el IFNϒ y el IFNß en la
inducción de la expresión del gen ISG15 en células lúteas del ganado bovino. Shirasuna
et al. (2012) informaron que en un experimento de cultivo celular in vitro, el tratamiento
con IFNτ indujo un aumento en la abundancia de ARNm para los ISG tanto en las PBMC
como en las PMN. Sheikh et al. (2018) informaron que había una regulación positiva de
ISG15, OAS1, MX1 y MX2 en el PMN en vacas lecheras preñadas. La respuesta de ISG15
a IFNτ está mediada a través de la vía JAK3 y PI3K en los neutrófilos (Sheikh et al., 2018).
Para tener una mayor sensibilidad cuando se usan procedimientos EIA directos, se
realizó menos volumen de muestra o, de lo contrario, se diluyó la muestra para reducir
la unión no específica (Mutayoba et al., 1990). Meyer et al. (1986) prefirió el uso de un
segundo anticuerpo porque redujo la variabilidad asociada con la unión desigual a los
pocillos del tubo de ensayo y disminuyó aún más la cantidad de anticuerpo específico
de hormona necesaria en el inmunoensayo enzimático. Además, hubo atrapamiento del
antígeno / analito entre dos capas para reducir la variabilidad del ensayo. Tate y Ward
(2004) y Kragstrap et al. (2013) informaron que un ELISA validado para un tipo de
muestra específico puede no permitir cuantificaciones precisas incluso en las mismas
muestras ni se puede suponer que un ELISA validado para suero será válido para Plasma
tomada al mismo tiempo del mismo individuo. La evaluación del paralelismo del ensayo
dio como resultado un valor r2 de 0.8973 para las concentraciones medidas y 0.9251
para las concentraciones esperadas. Thomsson et al. (2014) reportaron un paralelismo
con un valor r2 de 0.994 y 0.993, respectivamente, para cuantificar el cortisol salival. La
sensibilidad del ensayo fue de 0.13 ng / ml. Isobe y Nakao (2003) informaron una
sensibilidad para un ensayo de progesterona de 4.4 pg / ml en plasma bovino. Aba et al.
(2001) también realizaron un ensayo de progesterona para la evaluación rápida del
estado reproductivo y la función lútea para la investigación y el uso clínico. Green et al.
(2005) establecieron un ELISA para la detección de glucoproteínas asociadas con el
embarazo (PAG) en la cuarta semana en el suero de vacas preñadas y novillas. El CV
interensayo y el CV intraensayo en el presente estudio fue de 12.1% y 10.1%,
respectivamente. En general, para un ensayo confiable, el CV entre ensayos y dentro del
ensayo debe ser inferior al 10% y al 5%, respectivamente.
Roy y Prakash (2007) informaron un CV intra e interensayo del 6,4% y 8,5% utilizando
plasma reunido para el ensayo de prolactina en búfalos. Los granulocitos tienen una vida
útil corta en la periferia, por lo que pueden responder rápida y específicamente a las
señales gestacionales del concepto. La producción de ISG15 en los PMN debido a una
infección viral no puede descontarse, como ocurre con la diarrea viral bovina (Hansen
et al., 2010; Weiner et al., 2012), por lo que las pruebas de confirmación con respecto
al diagnóstico de embarazo son importantes.

5. Conclusión
El inmunoensayo ISG15 en lisado de neutrófilos se puede usar para diagnosticar a los
animales que no están embarazados para rebrucarlos lo antes posible. El diagnóstico se
puede realizar desde el día 14 al 16 después de la IA. Debido a la posibilidad de
producción de ISG15 debido a infecciones virales, se debe realizar un diagnóstico
confirmatorio en etapas posteriores del embarazo.

- Conflicto de intereses
Los autores afirman que no hay conflicto de intereses.

Tabla 1. Transcripciones de genes, secuencias de cebadores y tamaño del

fragmento resultante
Fig. 1. Curva estándar para un inmunoensayo enzimático para
estimar ISG15 en lisado de neutrófilos

Fig. 2. Paralelismo de ISG15 después de diluir muestras de diferentes

concentraciones con diluyente de muestra.
Fig. 3. Concentración de ISG15 (ng / ml) en el lisado de neutrófilos de
vacas preñadas (P) y no preñadas (NP)

Fig. 4. Abundance of ISG15 mRNA in animals with different

pathophysiological status
Placa 1. Electroforesis en gel de agarosa del producto amplificado por PCR
de ISG15 (203 pb) en gel de agarosa al 1,8%.

Placa 2. Inmunotinción de ISG15 bovino en neutrófilos durante el embarazo

temprano (a); Los neutrófilos en el grupo de control se recolectaron de terneros sanos
que no habían sido desafiados previamente con IFNτ y no se detectaron señales de
ISG15 (b & c); Los neutrófilos recolectados el día 0 (día de la IA) y el día 10 después de
la IA tuvieron señales insignificantes con el anticuerpo secundario conjugado con FITC
(d & f); Los neutrófilos aislados el día 14 y el día 21 después de la AI tenían señales más
distintas de ISG15 que en el día 21 podrían atribuirse al efecto residual de IFNτ (e); La
evaluación de la inmunocitoquímica de los neutrófilos del día 16 dio como resultado la
detección de señales intensas que indicaban que el contenido de proteína ISG15 era
máximo en ese día en particular y coincide con la mayor concentración de IFNτ en el
día 16 en la circulación que induce la respuesta de ISG15 en la fracción PMN.