Sinergismo in vitro de una fracción insoluble en agua

de Uncaria tomentosa combinada con fluconazol y terbinafina

contra aislamientos resistentes de Candida albicans
Renata Cougo Moraes , un Anderson Ramos Carvalho , un Aline Jacobi Dalla Lana , un Samuel
Kaiser , unBruna Pippi , b Alexandre Meneghello Fuentefría , a, by George González Ortega a

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responsabilidad

Resumen
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Introducción
Las especies de Candida son levaduras saprófitas inofensivas, un componente normal
de la biota humana en el tracto gastrointestinal y las mucosas orales y vaginales. Estas
levaduras pueden causar infecciones superficiales manifestadas como aftas y
vaginitis; excepto en pacientes inmunocomprometidos y inmunodeprimidos, por
ejemplo, a quienes pueden causar infecciones sistémicas graves. Los factores de riesgo
para los pacientes incluyen la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana
(VIH), la terapia contra el cáncer, el trasplante de órganos, la cirugía abdominal, los
catéteres, la diabetes y el uso de antibióticos de amplio espectro (Cruz et al. 2002 ;
Morschhäuser 2002 ).
Además, las nuevas especies y aislamientos emergentes que no son Candida
albicans (NCA) se convierten en un desafío para la salud pública debido a la resistencia
a los antimicóticos. Además, los enfoques terapéuticos están limitados por la seguridad
de los medicamentos, debido a las similitudes bioquímicas y metabólicas entre las
células fúngicas y las de mamíferos (Méan et al. 2008 ).
El fluconazol (FLZ) y la terbinafina (TRB) pertenecen al principal antifúngico utilizado
actualmente en la terapia antimicótica, que actúa en diferentes etapas de la biosíntesis de
la membrana celular. El derivado de triazol FLZ fue el antifúngico de elección utilizado
en el tratamiento de la candidiasis (Bossche 1985 ). Sin embargo, su uso no racional ha
contribuido al desarrollo de resistencia en Candida spp. (Sanglard 2003 ). TRB, un
antimicótico de clase alilamina, actualmente está indicado para el tratamiento de
infecciones causadas por dermatofitos. Además, TRB ha mostrado actividad in
vitro contra una amplia variedad de Candida spp. (Ryder et al. 1998 ), y también para el
tratamiento oral de la candidiasis ungueal (Segal et al.1996 ).
Para superar la resistencia a los hongos, la combinación de medicamentos antimicóticos
y no antimicóticos representa un enfoque terapéutico exitoso, dada la multiplicidad de
objetivos fúngicos contra los cuales los agentes actuales son efectivos (Mukherjee et
al. 2005 ). Incluye combinaciones efectivas de FLZ con extractos de plantas y
sustancias aisladas de ellos (Amber et al. 2010 ; Endo et al. 2010 ; Yan et al. 2012 ). Sin
embargo, la asociación de derivados de plantas con el objetivo de un efecto sinérgico
con TRB para el tratamiento de la candidiasis no se informó hasta ahora.
Uncaria tomentosa DC (Rubiaceae) es una enredadera ampliamente extendida en la
selva sudamericana y conocida popularmente como uña de gato (Heitzman et al. 2005 ;
Zhang et al. 2015 ). Se han realizado muchos estudios centrados en las actividades
biológicas de su corteza, especialmente antitumoral (Kaiser et al. 2016 ),
inmunoestimulante (Montserrat-De La Paz et al. 2015 ), antiinflamatorio (Aguilar et
al. 2002 ), antiviral (Caon et al. 2014 ), antioxidante (Pilarski et al. 2006 ), actividades
antimicrobianas (Heitzman et al. 2005 ; Ccahuana-Vasquez et al. 2007 ; Kloucek et
al. 2007 ; Zhang et al.2015 ), que con frecuencia se ha atribuido a su fracción de
alcaloide oxindol.
Por otro lado, las actividades inmunomoduladoras (Lenzi et al. 2013 ), antioxidantes y
antiinflamatorias (Amaral et al. 2009 ) se vincularon con la garra de gato de bajo peso
molecular y los polifenoles solubles en agua. Con respecto a la fracción de polifenoles
de alto peso molecular de la corteza de la uña de gato, no hay informes científicos sobre
ninguna actividad biológica, hasta donde sabemos. Es una fracción muy baja soluble en
agua, que puede caerse durante un procesamiento adicional del extracto por
concentración de extractos acuosos e hidroetanólicos. Tal vez explique por qué
generalmente no se ha tenido en cuenta en los trabajos biológicos.
En este trabajo, investigamos la actividad antifúngica de la fracción insoluble de
polifenoles de la corteza de la uña de gato contra especies de NCA, y su sinergia en
combinación con fl uconazol y terbinafina. La participación de posibles interacciones
moleculares que ocurren fuera de la pared celular también se discute.
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materiales y métodos

Obtención de fracción insoluble en agua (WIF)

Una muestra auténtica de cortezas de tallo de U. tomentosa provistas de Perú, donadas
amablemente por Induquímica SA (Lima, Perú), se trituró en una fresa (SK1 Retsch,
Alemania), provista de un tamiz de acero de 2 mm. La extracción de la corteza de la uña
de gato se realizó con soluciones hidroetanólicas al 50% (v / v) mediante maceración
dinámica de 2 h en una placa de agitación magnética (300 rpm) (RO 15 Power, IKA,
Alemania) a temperatura ambiente (23 ± 1 ° C) (Kaiser et al. 2013a), seguido de
filtración y concentración al vacío a 40 ° C hasta la mitad de su peso original (BüchiR-
114, Alemania) con el objetivo de eliminar el etanol. El extracto concentrado se
mantuvo durante la noche en frío (10 ± 1 ° C). Después, se pudo verificar un precipitado
voluminoso. Para obtener la fracción insoluble en agua (WIF), este precipitado se
separó de la fracción soluble en agua por filtración al vacío y se secó en horno (37 ° C ±
1 ° C) durante 24 h.

Caracterización química de WIF

La caracterización química completa de WIF se realizó adecuadamente en un estudio
anterior (Moraes et al. 2015 ). Brevemente, los contenidos y perfiles de alcaloides de
oxindol (Kaiser et al. 2013b ), glucósidos de ácido quinovico (Pavei et al. 2012 ) y
polifenoles de bajo peso molecular (Pavei et al. 2010 ) se llevaron a cabo utilizando
métodos HPLC-PDA previamente validados . Por otro lado, el contenido de
proantocianidinas se realizó mediante el método del ácido de vainillina (Sun et
al. 1998 ).
Microorganismos
El conjunto de cepas de NCA incluía: Candida krusei ATCC 6258, CK01,
CK04; Candida glabrataCG40039, CG10, RL02, RL03, todos ellos de las colecciones
de cultivo del Laboratorio de Investigación Micológica Aplicada, Universidade Federal
do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Brasil.

Muestras de trabajo y soluciones farmacológicas de referencia.

Todas las muestras de trabajo se disolvieron en metanol al 2.5% (v / v) para lograr una
concentración de 1.0 mg mL -1 . TRB (Cristália, Brasil) y FLZ (Cristália, Brasil) se
disolvieron en agua ultrapura (Milli Q, Millipore, Bedford, MA, EE. UU.). Los
disolventes utilizados para disolver las muestras, el control positivo para verificar el
crecimiento correcto del inóculo y el control negativo que contenía RPMI solo se usaron
como controles.

Inhibición del crecimiento celular

TRB y FLZ, solos y combinados con WIF, se probaron mediante el procedimiento de
tablero de ajedrez utilizando la técnica de micro-dilución (Kontoyiannis &
Lewis 2004) Se utilizaron soluciones de los productos probados a concentraciones
determinadas a partir de sus valores MIC. Se dispensaron alícuotas de 50 μL de cada
muestra de trabajo en una microplaca de 96 pocillos y se mezclaron con 100 μL de
inóculo para obtener una combinación única de concentraciones de fármacos y
sustancias previamente extraídas. Las microplacas se incubaron a 35 ° C durante 48 h, y
la densidad óptica se evaluó visual y espectrofotométricamente (Envision 2104
Multilaber Reader, Perkin Elmer, EE. UU.). Los resultados se expresaron en porcentaje
de daño celular. El ensayo se realizó por cuadruplicado. Las interacciones entre
antifúngicos y fracciones se determinaron a través del Índice de concentración
inhibitoria fraccionaria (FICI).A  +  FIC B ). La interacción se definió como sinérgica para
FICI ≤0.5, como aditiva para 0.5 <FICI <1, como indiferente para 1 ≤ FICI <4, y como
antagonista para FICI fue ≥4 (Lewis et al. 2002 ; White et al. 1996 ) .

Ensayo de daño celular con MTT

La evaluación cuantitativa de la sinergia se evaluó mediante el ensayo de porcentaje de
daño celular, con modificaciones (Chiou et al. 2001 ). Después del tiempo de
incubación (3 h), el sobrenadante de cada pocillo se retiró cuidadosamente y se
desechó. Se añadió una alícuota de 100 μl de solución de MTT (0,05 mg mL -1 ) a cada
pocillo, seguido de incubación durante 3 ha 32 ° C. Posteriormente, el sobrenadante se
retiró nuevamente y se desechó. Por separado, se añadieron 100 μL de isopropanol y los
contenidos celulares se homogeneizaron individualmente. Luego, una parte alícuota de
cada pozo se transfirió a una nueva microplaca, siguiendo el orden de pipeteo. La
absorbancia se midió a 570 nm y 690 nm. El porcentaje de daño celular se calculó
mediante la Ecuación 1 - [(A 570nm - A 690nm con droga) / (A570nm - A 690nm sin droga)] × 100,
donde la absorbancia con la droga son los datos de interés y la absorbancia sin drogas
actúa como control positivo.

Obtención de la mezcla de muestras - WIF-TRB y WIF-FLZ

Por separado, las cantidades apropiadas de WIF, TRB y FLZ se ponderaron con
precisión para lograr relaciones de mezcla de 1: 4 y 1: 2 (p / p) para WIF-TRB y WIF-
FLZ, respectivamente. Cada muestra se disolvió en metanol al 2,5%, se agitó
magnéticamente en un baño de agua durante 48 h, a 32 ° C, protegida de la luz del
día. Después de este período, todas las muestras se liofilizaron como de costumbre
(liofilizador Edwards EF4 Modulyo, Reino Unido) y se mantuvieron a 4 ° C hasta su
uso.

Microscopía electrónica de barrido (SEM) de levaduras

Candida krusei (CK04) previamente tratada como se describe anteriormente en el
ensayo de susceptibilidad antifúngica, utilizando WIF solo y combinado con FLZ y
TRB, se fijaron con glutaraldehído al 2,5% durante 24 ha 10 ° C. La fijación posterior
se realizó con tetróxido de osmio al 1% en tampón de cacodilato durante 1
h. Posteriormente, las muestras se deshidrataron en grados acetona, punto crítico se secó
en CO 2 recubierto con oro y se examinaron con un microscopio electrónico de barrido
(AG - EVO 50 Carl Zeiss, Alemania) (Maurya et al. 2011 ). La levadura no tratada se
usó como control positivo.

Microscopía electrónica de barrido (SEM) de mezcla de muestras

Las fotomicrografías de las muestras se tomaron usando un microscopio electrónico de
barrido (JSM 6060, Tokio, Japón) a un voltaje de 10 kV. Las muestras se montaron
previamente en trozos de aluminio con cinta adhesiva de doble cara y se recubrieron al
vacío con una fina capa de oro.

Análisis FT-IR de mezcla de muestras

Los espectros FT-IR de las mezclas WIF-TRB y WIF-FLZ se registraron en un rango de
frecuencia de 4000-600 cm −1 , usando una resolución de 4 cm −1 y después de 40
acumulaciones (espectrómetro Shimadzu DR-8001 FTIR, Japón). Los discos KBr se
prepararon comprimiendo al vacío mezclas físicas de aproximadamente 1,5 mg cada
una.

Análisis de calorimetría diferencial de barrido (DSC)

Las muestras pesadas con precisión de aproximadamente 2 mg de cada una de las
mezclas WIF-TRB y WIB-FLZ se analizaron en bandejas de aluminio ondulado
(calorímetro Shimadzu DSC-60, Japón). Las condiciones de funcionamiento fueron 10 °
C min -1 de velocidad de calentamiento (25 a 350 ° C) y flujo de nitrógeno a 50 ml min -
1
.

Análisis FT-IR de pseudomicellio

El efecto de WIF, TRB y WIF-TRB sobre la pared celular y la membrana celular de
la cepa C. krusei CK04 se evaluó utilizando una relación WIF: mezcla antifúngica 1: 4
(p / p) a una concentración subinhibitoria de 8: 32 μg / ml. Por separado, se aplicó una
alícuota de 100 μL de cada suspensión fúngica que contenía 1 × 10 6 a 5 × 10 6 UFC
mL −1 en placas Petri que contenían agar de papa dextrosa y se proporcionó un orificio
central de 7 mm de diámetro (Galindo et al. 2013), excavados a propósito para recibir
100 μL de cada muestra. Se usó agua Milli-Q (sistema Milli-Q, Millipore) como
control. Después de una incubación de 48 ha 32 ° C, se recogió una muestra de levadura
raspando cuidadosamente, se congeló de una vez a -20 ° C, se liofilizó y se almacenó
adecuadamente hasta el análisis. Este procedimiento se realizó por triplicado.

Ensayo de bomba de eflujo

La actividad de las bombas de eflujo se analizó utilizando el inhibidor verapamilo, que
disminuyó la MIC cuando la resistencia se correlacionó con el mecanismo de bomba de
eflujo Cassete (ABC) de unión a ATP (Prudêncio et al. 2000 ). El verapamilo se
disolvió directamente en medio de cultivo RPMI con una concentración final
establecida de 0,098 mg mL -1 (200 μM). Todas las cepas se probaron con y sin agregar
verapamilo al medio RPMI 1640. Los valores de concentración inhibitoria mínima
(MIC) se determinaron mediante micro-dilución de caldo utilizando el método de
dilución doble de acuerdo con las directrices CLSI (M27-A3) con RPMI-MOPS (medio
RPMI 1640 que contiene L-glutamina y sin bicarbonato de sodio) (Sigma-Aldrich Co.,
St Louis, MO) tamponado a pH 7,0 con tampón MOPS 0,165 M. Las concentraciones
de FLZ y TRB analizadas oscilaron entre 500 y 0,98 μg mL -1 contra C. krusei y C.
glabrata . El ensayo se realizó por triplicado.

análisis estadístico
Se aplicó ANOVA seguido de la prueba de Tukey, y los resultados se expresaron como
media ± SEM. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas
para p  <.05. Los análisis de datos se realizaron con el software Minitab 16.0 (Minitab
Inc., State College, PA).
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Resultados

Caracterización química de WIF

La caracterización química completa de WIF fue realizada por Moraes et al. ( 2015 ) en
un estudio anterior. Esta fracción mostró un alto contenido de proantocianidinas
(70.80%, p / p) derivadas de oligómeros de catequin y epicatenina. Además, WIF
también mostró contenidos menores de alcaloides de oxindol (7.91%, p / p), glucósidos
de ácido quinovico (7.79%, p / p) y polifenoles de bajo peso molecular (3.77%, p /
p). En relación con el perfil de alcaloides de oxindol, el WIF estaba compuesto solo por
alcaloides de oxindol pentacíclicos, principalmente mitrafilina y pteropodina. Además,
el pico 3, un derivado diglicosilado del ácido quinovico previamente caracterizado por
análisis de EM (Pavei et al. 2012 ), fue el principal derivado encontrado en WIF.

Estudios inhibitorios mediante el ensayo de tablero de ajedrez.

La combinación de WIF con TRB y FLZ fue capaz de reducir los valores de MIC
determinados por el ensayo inhibitorio y los efectos aditivos o sinérgicos pudieron
notarse claramente en todos los aislamientos probados. La mediana de los FICI de los
ensayos de microdilución de tablero de ajedrez para las levaduras estudiadas se
muestran en la Tabla 1 . Para la combinación WIF-TRB se observó un efecto sinérgico
en cuatro aislamientos diferentes, siendo dos C. krusei y dos C. glabrata , pero también
para WIF-FLZ en tres aislamientos, siendo uno C. krusei y dos C. glabrata ( Tabla 1 )
. En otros aislamientos se observó un efecto aditivo.
Tabla 1.
Concentración inhibitoria fraccionada (FIC) y tipo de interacción obtenida por el ensayo
de microdilución de tablero para probar una combinación de agentes antifúngicos.

TRB + WIF FLZ + WIF

Son TRB WIF FIC Interacción FLZ WIF FIC Interacción

C. krusei CK01 0.500 0.260 0,760 aditivo 0.250 0.266 0,516 aditivo

CK04 0,125 0.133 0.258 sinergia 0.250 0.250 0.500 aditivo

CK6258 0,062 0.250 0,312 sinergia 0,125 0.250 0,375 sinergia

C. CG10 0.500 0.266 0,766 aditivo 0.250 0.266 0,516 aditivo

glabrata

CG40039 0,062 0.250 0,312 sinergia 0,125 0.266 0.391 sinergia

RL03 / 0,062 0,066 0,129 sinergia 0.250 0,033 0.283 sinergia

RL02 *

WIF: fracción insoluble en agua de U. tomentosa ; TRB: terbinafina; FLZ: fluconazol.

*
RL03 corresponde a TRB + WIF y RL02 a FLZ + WIF.

Ensayo de daño celular con MTT

Los resultados indican que TRB y FLZ probados solos hasta una concentración de 64
μg mL -1 no pudieron inhibir el crecimiento de ninguno de los aislados considerados
( Tabla 2 ). La adición de WIF a TRB dio como resultado una mejora de la actividad
antifúngica de TRB. Por lo tanto, TRB y WIF combinados en una relación de
concentración 8: 1.95 μg mL −1 , respectivamente, causaron una mayor inhibición del
crecimiento en el aislado resistente a terbinafina CK6258 (aproximadamente 88%) que
TRB y WIF solo (40.7% y aproximadamente 20%, respectivamente). TRB y WIF en un
4: 1.95 μg mL −1la relación de concentración, respectivamente, causó daño celular
significativo (79.52%) con respecto al aislado CK04. La terbinafina, el WIF-FLZ fue
capaz de inducir un efecto sinérgico significativo en casi todos los aislamientos. Con
respecto al aislado CK04 resistente a fluconazol, se pudo notar un daño celular de
aproximadamente el 80% para WIF y FLZ en una relación de concentración de 1.95: 8
μg mL −1 . En ese caso, los compuestos solos mostraron 50% de daño celular por debajo
usando la misma relación de concentración.
Tabla 2.
Porcentaje de daño celular causado por terbinafina (TRB) y fluconazol (FLZ) solos y
sus combinaciones con la fracción insoluble en agua de la corteza de U.
tomentosa (WIF), después del método de microdilución de tablero de ajedrez.

(a) Combinación WIF-TRB (b) Combinación WIF-FLZ

Son Peine1 Comb2 Comb3 Peine1 Comb2 Comb3

CK04

C 7.81 / 64 7.81 / 32 15,62 / 32 15,62 / 16 7.81 / 16 3.91 / 16

(μg /
ml)

CDA 45.07 D /50. 45.07 D/52.5 52.51 CD/52 52.51 B /40 45.07 AC/4 35,80 C
(%) 23CD 1 CD .51 CD .05C 0.05 C /
40,05C
 (a) Combinación WIF-TRB (b) Combinación WIF-FLZ

Son Peine1 Comb2 Comb3 Peine1 Comb2 Comb3

CDC 90.05 AB 91,22 A * 70.01 a. C. 89,52 A 82,67 A * 73,13 A

(%)

CK01

C 7.81 / 4 3.91 / 4 1.95 / 4 7.81 / 8 3.91 / 8 1.95 / 8

(μg /
ml)

CDA 26.02 B /15.5 24.54 B/15.5 14,69 B 26.02 B /32 24.54 B /32 14,69 B
(%) 2B 2B /
15,52B .49B .49B /
32,49B

CDC 57,56 A 72,42 A 79,52 A * 80,22 A * 73,27 A 73,96 A

(%)

CK625
8
 (a) Combinación WIF-TRB (b) Combinación WIF-FLZ

Son Peine1 Comb2 Comb3 Peine1 Comb2 Comb3

C 1.95 / 4 1.95 / 8 1.95 / 16 7.81 / 16 3.91 / 16 3.91 / 32

(μg /
ml)

CDA 19.83 C /18.3 19.83 C/40.7 19.83 C 70,40 C 49,68 D 49,68 D

(%) 8C 4B /
37.92a . C. /
12,61E /
12,61 E /
13,04E

CDC 85,16 A * 87.95 A 86,4 A 91,36 A 79,15 B 94.15 A *

(%)

CG10

C 15,62 / 32 3.91 / 32 0.98 / 64 15,62 / 16 7.81 / 16 3.91 / 16

(μg /
ml)

CDA 51,02 CD /57. 42.92 DE/57. 16.89 E /55. 51.02 AC/3 40.51 D /39 42.92 CD /3
(%) 12BCD 12 BCD 01CD 9.58 D .58D 9.58D
 (a) Combinación WIF-TRB (b) Combinación WIF-FLZ

Son Peine1 Comb2 Comb3 Peine1 Comb2 Comb3

CDC 88,89 A 75.74 ABC * 82,73 AB 55.08 B 86,77 A * 52,67 a .

(%)

CG400
39

C 3.91 / 4 1.95 / 4 1.95 / 8 3.91 / 8 1.95 / 8 0.98 / 8

(μg /
ml)

CDA 35,26 B 32.86 B/33.7 32.86B/37.8 35.26B/31. 32.86B/31. 28.20B/31.

/
(%) 33,77B 7B 5B 59B 59B 59B

CDC 67.54A 70.25A* 87.65A 62.89A 64.57A 60.79A*

(%)

RL03/R
L02
 (a) Combinación WIF-TRB (b) Combinación WIF-FLZ

Son Peine1 Comb2 Comb3 Peine1 Comb2 Comb3

C 1.95/8 0.98/8 0.98/4 3.91/8 1.95/8 0.98/32

(μg/
mL)

CDA 22.88BC/31.3 7.32D/31.37B 7.32D/11.62 30.22C/16. 30.19C/16. 24.02CD/40

(%) 7B CD
77D 77D .84B

CDC 61.16A 65,35 A 56,92 A * 44.03 B 24.55 CD 65.00 A *

(%)

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WIF: fracción insoluble en agua de U. tomentosa ; TRB: terbinafina; FLZ: fluconazol; daño celular
antifúngico solo (CDA) y en combinación (CDC) expresado en porcentaje (%). Sobre el daño celular se
muestran concentraciones (C) de los respectivos agentes antifúngicos. Se eligieron tres combinaciones
con efectos aditivos y sinérgicos para demostrar la interacción.
*
Combinaciones utilizadas para calcular FIC.
**
Letras diferentes representan resultados estadísticamente distintos ( p  <.05) para MIC.

Microscopía electrónica de barrido (SEM) de levaduras

C. krusei CK04 ejemplificó el efecto de WIF, WIF-TRB y WIF-FLZ sobre la
morfología y la ultraestructura de los aislamientos resistentes ( Figura 1 ). El perfil de
gemación normal ( Figuras 1 (A), (C) y (E) ). En contraste con los patrones de
florecimiento irregulares, el material depositado en las paredes celulares y la pérdida de
integridad celular, después del tratamiento con WIF solo ( Figura 1 (B) ) y combinado
con TRB ( Figura 1 (D) ) y FLZ ( Figura 1 (F ) ).
 Abrir en una ventana separada
Figura 1.
Micrografías SEM de Candida krusei (CK04) tratadas con la fracción WIF de Uncaria
tomentosa , solo y en combinación con terbinafina (TRB) y fluconazol (FLZ). (A) Control sin
tratamiento (10,000 ×); (B) WIF 7,81 μg ml-1 (10.000 ×); (C) cepa resistente a FLZ 64 μg ml-1
(10.000 ×); (D) WIF-FLZ 3.91: 16 μg ml-1 relación de concentración (18,000 ×); (E) cepa
resistente a TRB 32 μg ml-1 (5000 ×); (F) WIF-TRB 7.81: 16 μg ml-1 (1000 ×).

Microscopía electrónica de barrido (SEM) de mezcla de muestras

Las fotomicrografías de WIF, FLZ, WIF-FLZ, TRB y WIF-TRB ( Figura 2 ) permiten
observar modificaciones cristalinas definitivas sin ambigüedades. Las micrografías FLZ
mostraron partículas aglomeradas que tenían una superficie irregular y agrietada, y
ocasionalmente un hábito acicular ( Figuras 2 (A) y (B) ), mientras que las TRB
presentaban cristales planos en forma de placa de diversos tamaños ( Figura 2 (E) ). Se
observaron cambios en el hábitat cristalino de FLZ después del análisis de la mezcla
FLZ: WIF ( Figura 2 (D) ), específicamente, la aparición de microcristales en forma de
aguja embebidos en una matriz amorfa y suelta. La mezcla WIF-TRB se produjo como
placas rotas con una superficie ligeramente irregular y estructuras amorfas a su
alrededor ( Figura 2 (F)) A primera vista, estos cambios morfológicos en el hábitat
cristalino se pueden atribuir a factores como el medio de liofilización y cristalización en
sí, pero eso no excluye por completo la posibilidad de interacciones moleculares como
la causa de estas modificaciones.
 Abrir en una ventana separada
Figura 2.
Las microfotografías SEM obtenidas de (A) y (B) fracción insoluble en agua de U.
tomentosa (WIF), (C) fluconazol, (D) mezcla de WIF-fluconazol liofilizada, (E) terbinafina, (F)
WIF liofilizada -terbinafina asociación.

Análisis de calorimetría diferencial de barrido (DSC)

Los termogramas DSC de WIF, FLZ, TRB y las combinaciones correspondientes se
encuentran en la Figura 3 . WIF presenta un pico endotérmico amplio e indefinido a
aproximadamente 80 ° C, que revela su estado amorfo ( Figura 3 (A) ). El termograma
FLZ mostró un pico único y agudo a 140 ° C y un proceso endotérmico amplio centrado
a aproximadamente 300 ° C, que refleja la degradación térmica ( Figura 3 (B)). El
termograma TRB mostró un pico de inicio claro característico a 205 ° C seguido de un
amplio proceso endotérmico. El efecto de la combinación de TRB y FLZ con WIF se
ejemplificó usando relaciones de concentración críticas ( Figuras 1 (D) y (F)) Las
modificaciones en los termogramas TRB y FLZ se notaron claramente después de su
combinación con WIF. La desaparición completa del pico TRB y el desplazamiento del
pico de inicio de FLZ a 175 ° C indicaron una fuerte interacción molecular de WIF con
TRB y FLZ indistintamente. Además, el análisis adicional de DSC mostró que la
intensidad de la interacción molecular depende del antifúngico: relación de
concentración de WIF (datos omitidos).

Figura 3.
Las curvas de calorimetría diferencial de barrido (DSC) de (A) fracción insoluble en agua de
la corteza de U. tomentosa (WIF), (B) fluconazol (FLZ), (C) WIF: FLZ relación de
combinación 1: 2, (D) terbinafina (TRB) ), (E) Relación de combinación WIF: TRB 1: 4.

Análisis FT-IR del WIF de U. tomentosa , terbinafina, fluconazol y sus

combinaciones.
El espectro FT-IR de WIF mostró una banda fuerte y ancha a 3230 cm −1 (asignada a
una asociación de polímeros OH), 1613 cm −1 (tramo C-C de fenilo característico en
compuestos de polifenol), 1445 cm −1 ( aromático C = C) y 1065 cm −1 (enlace aromático
C – H) ( Figuras 4 (A) y (D) ). Al comparar los datos de la literatura (Foo 1981 ),
algunas bandas sugirieron la presencia de catequinas y derivados de procianidina, por
ejemplo, bandas a 1540–1520 cm −1 (relacionadas con hidroxilo de catequinas) y las
bandas de huellas dactilares a 780–770 cm - 1 (deformación fuera del plano de enlaces H
aromáticos).

Figura 4.
(A) espectro FT-IR de la fracción WIF; (B) terbinafina; (C) complejo (WIF: TRB en relación de
combinación 1: 4); (D) WIF; (E) fluconazol; (F) asociación (WIF: FLU en relación de
combinación 1: 2).
El espectro TRB ( Figura 3 (B) ) mostró una banda de gran intensidad en 2440
cm −1 (vibración C≡C), que se asoció con las bandas adicionales 1450–1500
cm −1 (aromático C = C) y 600-800 cm -1 (C-Cl) permitió una identificación confiable
del clorhidrato de terbinafina (Silverstein et al. 1991 ; Arunprasad et al. 2010 ). Como
una amina terciaria, no hay bandas típicas de enlace N – H presentes en el rango del
espectro de 3300–3500 cm −1 .
El espectro FLZ fue comparable a los datos de la literatura (Cyr et al. 1996 ),
especialmente las bandas en 3119, 1507 y 1420 cm −1 (enlaces triazol CH), 1618
cm −1 (estiramiento de anillo aromático), 1074 cm −1(C –OH enlace) y 1114
cm −1 (enlace C – F).
Los espectros FT-IR de la combinación WIF-TRB se ilustraron mediante la mezcla
WIF: TRB en una relación de concentración 1: 4. La modificación principal evaluada
fue la desaparición completa de las bandas del espectro WIF a 3308 y 1613 cm −1 , y el
formador de banda TRB ubicado a 2440 cm −1(asignado a una vibración C≡C). Con
respecto al último, también se notó la formación de una nueva banda a 2631 cm −1 . TRB
solo mostró tres bandas en la región de 1360–1470 cm −1 , que se redujo a solo una
ubicada en 1453 cm −1 . Se pudieron notar cambios espectrales adicionales en la región
de 700–900 cm −1 .
Los espectros FT-IR de la combinación WIF-FLZ se ejemplificaron mediante la mezcla
con una relación de concentración 1: 2. La modificación principal fue la desaparición de
las bandas de 3308 cm −1 y 3119 cm −1 de WIF y FLZ, respectivamente; la aparición de
una nueva banda en el rango 2600–2900 cm −1 y una disminución de la intensidad de
la banda 1614 cm −1 , en referencia a los enlaces de carbono del anillo
aromático. Además, el rango de 1300–1400 cm −1 y 600–800 cm −1 evidenciaron algunas
alteraciones.

Análisis FT-IR del pseudomicecio después del tratamiento con la fracción

insoluble combinada con TRB
Los espectros FT-IR del pseudomicecio de C. krusei mostraron pequeñas diferencias
después del tratamiento con WIF, ya sea solo o combinado con TRB ( Figura
5 ). Después del tratamiento con WIF, no se observaron cambios sustanciales en la
región de 2996–2800 cm −1 y 1500–1200 cm −1 , cuyas bandas de absorción están
asociadas a los lípidos de la membrana, como se describió anteriormente (Galindo et
al. 2013 ). Los cambios menores inducidos por WIF-TRB en la banda de 1359 cm −1 se
asignaron tentativamente a interacciones con los lípidos de la pared celular. En
contraste, cambios espectrales más intensos en 1600–400 cm −1 y 900–600 cm −1Las
regiones sugirieron una interacción molecular de WIF con las proteínas de la pared
celular y los polisacáridos ( Figura 4 ), pero diferente de las observadas con TRB solo
( Figura 4 (C) ). El espectro FT-IR de WIF-FLZ retuvo las mismas características
descritas en los espectros de FLZ y WIF solo (datos no mostrados).
 Abrir en una ventana separada
Figura 5.
Espectros FT-IR de C. krusei pseudomycelium expuestos a (A) control sin tratamiento, (B)
fracción insoluble en agua (WIF) de corteza de U. tomentosa , (C) cepa resistente a terbinafina,
(D) WIF: TRB en 1: 4 relación de combinación

Ensayo de bomba de eflujo

La actividad de las bombas de eflujo se verificó utilizando el inhibidor verapamilo, que
disminuye la MIC cuando la resistencia se debe a la bomba de eflujo Cassete (ABC) de
unión a ATP. La susceptibilidad fúngica de dos aislamientos multirresistentes, a saber,
CK6258 y CG40039, se probó para TRB y FLZ. En ambos casos, no se pudo detectar
un cambio sustancial de los valores de MIC.
Ir:

Discusión
La combinación de medicamentos antimicóticos con compuestos vegetales se ha
mencionado como una estrategia potencial para mejorar la actividad antifúngica a través
de efectos aditivos y sinérgicos (Wagner y Ulrich-Merzenich 2009 ). Con respecto a los
polifenoles vegetales, muy pocos trabajos habían enfocado este tema. Vale la pena
mencionar la combinación de polifenoles de Punica granatum con fluconazol, lo que
permitió una disminución doble de los valores de MIC contra C. albicans y C.
parapsilosiscepas (10). A pesar de que el efecto sinérgico se atribuyó al polifenol
punicalagina, no se presentaron más pruebas para aclarar mejor el mecanismo detrás de
este hallazgo. Del mismo modo, varios estudios se han centrado en mostrar la actividad
antifúngica de los derivados de plantas (Silva et al. 2011 ; Ahmad et al. 2013 ; Jun et
al. 2013 ); sin embargo, pocos han abordado el impacto en la morfología celular de las
interacciones químicas y fisicoquímicas que ocurren entre estos compuestos.
La caracterización química de WIF se realizó en un estudio previo (Moraes et
al. 2015 ). Esta fracción insoluble en agua de la corteza de la uña de gato comprende
principalmente proantocianidinas (70.80%, p / p) y, en menor medida, alcaloides de
oxindol (7.91%, p / p), glucósidos de ácido quinovico (7.79%, p / p) y bajos polifenoles
de peso molecular (3.77%, p / p). También, el anti- Candida actividad de WIF se
estableció anteriormente (MICs de 3,90 a 15,62 g / ml contra C. glabrata , C.
krusei y C. parapsilosis ) (Moraes et al. 2015) Sin embargo, su potencial sinergia con
FLZ y TRB recibió poca atención en ese momento. Esencialmente, los alcaloides de
oxindol (OALK), los polifenoles de baja masa molecular (LMPOL) y los contenidos de
derivados del ácido quinovico (QAD) en las fracciones solubles e insolubles en agua del
extracto hidroetanólico de la corteza de la uña de gato fueron analizados previamente
por HPLC-PDA . Un análisis similar de la fracción de proantocianidinas insolubles
(PROAN) que muestra principalmente oligómeros de catequina y epicatequina (datos
omitidos), ha confirmado trabajos previos (Gonçalves et al. 2005 ). Además, el
contenido de PROAN se determinó en ambas fracciones mediante la prueba de
vainillina (Moraes , et al. 2015 ). Estos autores también informaron una estrecha
relación entre la actividad antifúngica contra Candidaespecies y algunas características
relacionadas con la composición química de ambas fracciones. Por lo tanto, contenían
cantidades significativas de OALK, LMPOL y QAD, sin embargo, el contenido de
PROAN superó a los demás y fue claramente mayor en la fracción insoluble en agua
que en las solubles en agua (70.80% versus 21.07%). Parecía relacionado con el hecho
de que la fracción PROAN mostró la mayor actividad antifúngica contra Candida, que
incluso excedió la determinada para terbinafina y fluconazol. Mientras tanto, las
fracciones OALK, LMPOL y QAD fueron bastante inactivas contra ambas especies
cuando se analizaron por separado.
En este trabajo, se eligieron seis aislamientos de C. krusei y C. glabrata que muestran
resistencia a azole y terbinafina para este propósito, y se trataron por separado con FLZ
y TRB, pero también combinándolos con WIF. En todos los aislamientos probados, la
combinación WIF-antifúngica demostró ser más efectiva que TRB y FLZ solo. De
hecho, los datos de concentración inhibitoria fraccional (FIC) ( Tabla 1 ) revelaron
efectos sinérgicos y aditivos asociados a la combinación de ambos antifúngicos con
WIF. Los datos de la prueba de daño celular permitieron reforzar este hallazgo ( Tabla
2) El efecto sinérgico prevaleció en aquellos casos en los que se probó la combinación
WIF-TRB, específicamente, en el 66% de las pruebas. Se observó un efecto análogo con
respecto a la combinación WIF-FLZ, pero aquí cae al 50%. Además, los aislados de C.
krusei fueron los más susceptibles, particularmente a la combinación TRB-WIF, donde
se notaron niveles de inhibición superiores al 80%. En ese caso, el valor MIC de TRB-
WIF disminuyó hasta 16 veces en comparación con TRB solo. Aunque la
susceptibilidad antifúngica fue diversa entre los aislamientos de Candida , el análisis
SEM puede notar algunas modificaciones importantes en la morfología celular. En esta
ocasión, C. kruseiSe seleccionó CK04 con fines ilustrativos, debido al efecto sinérgico
observado inequívocamente para este aislado. Las micrografías SEM de pseudo hifas
CK04 tratadas con concentración subinhibitoria de WIF-TRB y WIF-FLZ ( Figura 1 )
revelaron alteraciones morfológicas importantes, como un patrón de brote irregular,
material depositado en la pared celular y pérdida de integridad celular. Al expandir la
línea de pensamiento a los otros aislados, podemos suponer que los efectos antifúngicos
y sinérgicos pueden estar directamente relacionados con el daño a la estructura de la
pared celular, al menos. Además, hallazgos similares reportados en la literatura sobre
alteraciones en la ultraestructura de la pared celular de levadura, y causados por
antifúngicos asociados con extractos de plantas (Nakamura et al. 2004 ; Ishida et
al. 2006; Endo y col. 2010 ), tienden a corroborar nuestra suposición.
DSC puede evaluar fácilmente las interacciones moleculares relacionadas con los
antifúngicos en asociación con productos vegetales (Pawar et al. 2012 ). En este estudio,
las alteraciones observadas en los termogramas registrados para las combinaciones de
WIF con terbinafina y fluconazol se distinguen por la desaparición de los picos
endotérmicos característicos de TRB y FLZ a 205 ° C y 140 ° C, así como la
manifestación de nuevos picos en 195 ° C y 175 ° C, respectivamente. Asimismo, Al-
Marzouqi et al. ( 2009 ) estudiando los sistemas de ciclodextrina fluconazol-β pudieron
corroborar complejos de inclusión mediante el desplazamiento de los picos de
fluconazol medidos por DSC. Por lo tanto, los hallazgos dejan pocas dudas sobre las
interacciones moleculares que tienen lugar entre WIF y ambas drogas.
El análisis FT-IR de WIF reveló el predominio de los derivados de catequina y algunos
patrones de absorción característicos de los taninos, como se observó anteriormente
(Morais et al. 1999 ; Hye et al. 2009 ). Además, permitió excluir polifenoles de bajo
peso molecular de la composición de WIF, al menos en cantidades tangibles, y también
detectar grupos funcionales involucrados en las interacciones entre WIF y ambos
antifúngicos TRB y FLZ. Dado que no hay banda de absorción cerca de 1750
cm −1 (estiramiento vibratorio C = O o COOH generalmente relacionado con el ácido
carboxílico (Manrique y Lajolo 2002) se observó que el ácido gálico y clorogénico y
sus derivados podrían excluirse de la composición de WIF. Además, por análisis UV de
la solución metanólica de WIF, los flavonoides se detectaron solo como trazas, ya que
no se detectó absorción por encima de 360 nm (datos no mostrados) (Geiger y
Quinn 1975 ).
Los taninos son polifenoles poliméricos capaces de formar complejos de alcaloides
mediante la formación de límites covalentes (Spencer et al. 1988 ) y, presumiblemente
otras bases débiles, como TRB y FLZ. Como resultado, se puede mejorar la solubilidad
en agua de los alcaloides. En ese contexto, la técnica FT-IR permite una caracterización
directa de las interacciones moleculares entre el polímero antimicótico, o su ausencia,
como se relacionó anteriormente para TRB y el polímero PEG 6000 (Kuminek et
al. 2013 ).
El análisis de WIF, TRB y FLZ por FT-IR y DSC respalda consistentemente la hipótesis
de que las interacciones moleculares entre polifenoles y antifúngicos tienen lugar fuera
de la membrana celular. Entonces, la comparación de los espectros FT-IR del
antifúngico solo, y en combinación con WIF, permite reconocer diferencias claras
en bandas de 3000, 1600, 1400 y 700–800 cm −1 . Refleja, por lo tanto, las interacciones
moleculares entre los dos medicamentos antimicóticos y la fracción WIF de la corteza
de la uña de gato.
Además, el análisis SEM de TRB y FLZ por separado, y combinado con WIF,
proporcionó información complementaria que respalda la aparición de la interacción
antifúngica: WIF. El cambio en el hábitat cristalino se hizo evidente en las
microfotografías de TRB solo y combinado con WIF, es decir, de una forma chapada
con cristales de superficie lisa ( Figura 2 (E) ) a bloques poliédricos que tienen trazas de
masas amorfas ( Figura 2 (F) ) . De manera similar, el hábitat cristalino FLZ
experimentó una clara modificación de formas irregulares ( Figura 2 (C) ) a una forma
en forma de aguja más organizada ( Figura 2 (D) ) después de mezclar con WIF.
Las modificaciones en el hábitat de la microestructura están de acuerdo con los datos de
DSC descritos anteriormente, cuando indudablemente se produjeron cambios térmicos
en el punto de fusión y otros procesos endotérmicos después de mezclar TRB y FLZ
con WIF ( Figura 3 ). A pesar de polimorfismo ya se reconoció en algunos derivados de
azol, como miconazol (Pedersen et al. 1993 ), en este punto una tal declaración en favor
de polimorfismo sería cuestionable, una vez que el análisis se realizó utilizando mezclas
físicas en lugar de sustancias aisladas. Es de destacar que el hábitat cristalino de algunos
antifúngicos, incluidos TRB y FLZ, también puede sufrir una marcada modificación de
acuerdo con el medio de cristalización y el procesamiento tecnológico, pero sin implicar
un polimorfismo genuino (Pedersen et al. 1993; Kuminek y col. 2013 ). En
consecuencia, los eventos polimórficos deben descartarse en favor de una interacción
antifúngica-WIF concreta, como lo demuestran los datos de FT-IR y DSC
El análisis FT-IR del pseudomicelio de C. krusei (CK04) corrobora la acción de WIF en
la pared celular. Mediante el tratamiento con la combinación WIF y WIF-TRB, la
alteración de las bandas IR ubicadas a 1600–400 cm −1 y 900–600 cm −1 denota
modificaciones en la proteína y el polisacárido ubicados en la membrana de la pared,
que eran imperceptibles en muestra fúngica no tratada. De acuerdo con Galindo et
al. ( 2013 ) una disminución o cambio en el contenido de estos componentes puede estar
relacionado con la pérdida de integridad celular y una mejora de la permeabilidad de la
membrana a los antifúngicos.
El verapamilo es un inhibidor conocido de la bomba de eflujo y se ha utilizado a
menudo para estudiar la reversión de la resistencia a los antimicóticos. A pesar de la
gran homología entre la secuencia de aminoácidos de la glucoproteína P (P-gp) y los
transportadores de proteínas fúngicas del casete de unión a ATP (ABC), se informó
anteriormente una gran variabilidad en la sensibilidad de las proteínas ABC de la
levadura (Sanglard et al. 1997 ; Sanglard & Odds 2002 ). No obstante, los datos del
ensayo realizado con FLZ y TRB mostraron que la resistencia de los aislamientos
multirresistentes TRB y FLZ CK6258 y CG40039 parece no estar relacionada con la
bomba de eflujo ABC (Guinea et al. 2006 ).
Ir:

Conclusión
La fracción insoluble en agua de uña de gato presenta un efecto sinérgico con FLZ y
TRB contra C. kruseiy C. glabrata . Los datos de DSC y FT-IR mostraron que esta
fracción compuesta principalmente por proantocianidinas interactúa con FLZ y TERB
sin lugar a dudas. La participación de eventos polimórficos y la bomba de eflujo ABC
parece estar fuera de discusión. La actividad antifúngica se explica sobre la base de la
interacción molecular fuera de la pared celular, el problema es relevante y, al mismo
tiempo, desafiante.
Ir:

Declaración de divulgación
Los autores declaran que no tienen conflicto de intereses.
Ir:

Fondos
Este trabajo fue apoyado por Coordenação de Aperfeiçoamento do Pessoal de Nível
Superior (CAPES).
Ir:

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Los artículos de Biología Farmacéutica se proporcionan aquí por cortesía de Taylor & Francis