FERMENTACIÓN INDUSTRIAL

La Microbiología es una Ciencia experimental que se ocupa del estudio de los

microorganismos y de sus interacciones con otros organismos y con el medio ambiente.
La fermentación industrial es la aplicación de los conocimientos de la microbiología
respecto de todos aquellos aspectos de los microorganismos que tienen una aplicación
industrial, tanto en la transformación de productos empleados en la alimentación como
en la producción de sustancias tales como antibióticos, vitaminas, enzimas, así como en
la obtención de masa microbiana (proteína unicelular, vacunas, fertilizantes,
microbianos, biopesticidas).

Fruto del conocimiento de las capacidades que poseen los microorganismos ha

sido, y sigue siendo, su inmediato aprovechamiento para estos fines y, así, a los métodos
tradicionales de producción de sustancias por fermentación se han unido recientemente
las técnicas de manipulación genética de los mismos que han permitido obtener, de
forma masiva, nuevos productos de interés práctico que los microorganismos
normalmente no sintetizan tales como insulina, hormona de crecimiento humana e
interferón. La Biotecnología es la aplicación de los principios científicos y técnicos en el
procesamiento de los materiales por agentes biológicos para obtener bienes y servicios.
Actualmente, se denomina Biotecnología Molecular a la aplicación de las técnicas del
DNA recombinante en los seres vivos para la obtención de productos de interés
industrial.

OBJETIVOS DE LA MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL

Desde un punto de vista industrial, lo que se pretende es que se obtenga el mayor
rendimiento posible de producto a partir del sustrato utilizado. Estos altos rendimientos
se obtienen en la síntesis química; en la biosíntesis, la energía obtenida se utiliza no sólo
para la obtención del producto deseado sino que se aplica en todos los procesos
metabólicos que van a permitir a ese ser vivo crecer. Cuanto más complejo sea el ser
vivo, más energía requerirá para crecer y por lo tanto menor rendimiento obtendremos
del producto deseado. De ahí que siempre que se puede se utilizan microorganismos. No
obstante existen una serie de productos que, en la actualidad, no pueden ser sintetizados
por los microorganismos; de ahí que se recurra primero a las plantas y sino a los
animales. Por consiguiente, en la obtención de productos industriales la primera vía es la
síntesis química, si no funciona se recurre a los microorganismos, plantas y finalmente
animales.

Los productos de interés industrial producidos por los microorganismos se encuadran en

7 categorías principales:
1.- Las células microbianas propiamente dichas.
2.- Las macromoléculas que sintetizan, por ejemplo enzimas.
3.- Los productos de su metabolismo, tanto primario (compuestos esenciales para su
crecimiento) como secundario (compuestos no esenciales para su desarrollo). En
términos generales, los metabolitos tienen un peso molecular bastante bajo (menos de
1500 Daltons) si lo comparamos con el peso molecular de los enzimas que varía desde
10000 hasta varios millones de Daltons.
4.- Se acude también a las células microbianas para llevar a cabo conversiones
biológicas a través de las cuales un compuesto se transforma en otro estructuralmente
relacionado por intervención de uno o varios enzimas aportados por las células.
5.- La obtención de los derivados lácteos, cerveza, vino, pan, etc. constituyen alguno de
los procesos biotecnológicos más antiguos donde la intervención de los
microorganismos es crucial.
6.- Ciertos microorganismos se hallan detrás de un proceso metalúrgico que se remonta,
al parecer, hasta la época romana: la lixiviación bacteriana de menas de bajo contenido
para extraer de ellas metales. En la actualidad se utilizan microorganismos, Thiobacillus,
para extraer hierro, cobre y zinc de menas sin contaminar la atmósfera.
7.- La actividad microbiana se aplica también a la detoxificación y degradación de las
aguas residuales y desechos industriales. Las mareas negras y el vertido de lastres y
aguas de lavado de los petroleros son otros tantos problemas que plantean los residuos,
cuya solución quizás esté en manos de la Microbiología ya que se han aislado muchos
microorganismos capaces de consumir componentes del petróleo.

DESARROLLO HISTORICO
Empírico
El arte de la fermentación, definido técnicamente en su sentido más amplio como la
transformación química de compuestos orgánicos con la ayuda de enzimas (sobre todo
los producidos por microorganismos), es muy antiguo. La capacidad de las levaduras
para producir alcohol en forma de cerveza la conocían ya los Sumerios y Babilonios
antes del año 6000 a.c. Más tarde, aproximadamente hacia el año 4000 a.c., los Egipcios
descubrieron que el CO2 generado por la acción de las levaduras (Saccharomyces) podía
fermentar el pan. Referencias al vino, otro antiguo producto de fermentación, se hallan
en el Génesis, donde consta que Noé consumía algo más de lo debido.
Hacia el siglo XIV d.c., la destilación de bebidas alcohólicas a partir de grano
fermentado, práctica originaria de China, era común en muchas zonas del mundo
(Francia-Brandy; Escocia-Whisky). Los microorganismos proporcionaron alimentos y
bebidas durante más de 8000 años, sin que se tuviera noción de su existencia.
Leeuwenhoek, en el siglo XVIII, fué la primera persona que los describió en detalle al
observar, a través de su propio microscopio simple, el sedimento de vinos. Sin embargo,
estas observaciones no condujeron a ninguna investigación acerca de las posibles
actividades de los microorganismos descritos.
El papel de las levaduras como agentes fermentadores no fué reconocido hasta mediados
del siglo XIX por Pasteur que descubrió que las levaduras transforman el azúcar en
alcohol en ausencia de aire. A este proceso anaeróbico se le conoce como fermentación
alcohólica.
A finales del siglo XIX y gracias al desarrollo de las técnicas de cultivos puros, se aisla
y distribuye la primera cepa de levadura vínica, la Steinberg 92, para su uso comercial
en la producción del vino. Anteriormente, en 1883, Emil Christian Hansen obtuvo el
primer cultivo puro de levadura cervecera que denominó Saccharomyces carlsbergensis.
Con estos trabajos y los de Pasteur, la fermentación pasa de ser un arte (resultados
imprevisibles) a ser una ciencia (resultados previsibles).

Científico
Los progresos realizados en investigación bioquímica básica a partir del descubrimiento
de los enzimas por Buchner en 1897 fué considerable, pero no comenzaron a aplicarse
en la fermentación industrial hasta la primera guerra mundial (1914).
En el lado alemán, la obtención de glicerol para la fabricación de explosivos se convirtió
en una necesidad urgente. El bloqueo marítimo británico cortó la importación de aceites
vegetales, la materia prima tradicional en la producción de glicerol. Pero algunos años
antes, el bioquímico alemán Carl Neuberg había vuelto a considerar cierta observación
de Pasteur: en la fermentación alcohólica se solían originar pequeñas cantidades de
glicerol (fermentación gliceropirúvica -----> lágrima del vino). Avanzando en su estudio,
Neuberg descubrió que la adición de bisulfito sódico al tanque de fermentación
favorecía la producción de glicerol a expensas de la de alcohol. Este descubrimiento fué
desarrollado rápidamente por los alemanes en una fermentación industrial que producía
1000 toneladas de glicerol al mes.
Los ingleses, por su parte, andaban escasos de acetona para la fabricación de
municiones. Dificultad de la que salió al paso un químico de origen ruso, Chain
Weizmann. Weizmann desarrolló la fermentación butanol-acetona que depende de la
bacteria anaerobia Clostridium acetobutylicum. El descubrimiento de Weizmann jugó un
papel determinante en el desarrollo de la guerra. Al finalizar ésta, rehusó todos los
honores que le propuso el gobierno Británico. Sin embargo, utilizó su influencia para
que el gobierno Británico ayudará a establecer el estado Judio en Palestina. En 1949,
Weizmann fué elegido el primer presidente de Israel.
El proceso alemán de obtención de glicerol desapareció de la escena al final del
conflicto. Destino que no sufrió el proceso butanol-acetona; éste persistió como fuente
de acetona durante muchos años, hasta que al principio de los 50 lo desplazaron otros
procesos que se fundamentan en el petróleo.
La producción de ácido cítrico por microorganismos también tiene su origen en la
primera guerra mundial. Hasta entonces el ácido cítrico se extraía de los cítricos, siendo
Italia el mayor productor. Cuando los hombres fueron llamados a filas, los cultivos se
desatendieron y al final del conflicto la industria estaba en ruina aumentando el precio
del ácido cítrico. Todo esto favoreció la introducción en 1923 de un proceso microbiano
para su obtención. El organismo usado para la obtención de ácido cítrico, Aspergillus
niger, es un aerobio obligado, por lo que debe cultivarse en presencia de oxígeno, justo
lo contrario de Clostridium acetobutylicum. Para ello se desarrollaron los cultivos en
superficie y así poder mantener al microorganismo en contacto con el aire.
En 1928, Alexander Fleming observó que el hongo Penicillium notatum mataba sus
cultivos de la bacteria Staphylococcus aureus. Tras cultivar el hongo en medio líquido y
separar el líquido de las células, encontró que el líquido celular podía inhibir el
crecimiento de muchas especies bacterianas. Llamó al ingrediente activo del líquido con
el nombre de penicilina, aunque no continuó los estudios debido a que no poseía
conocimientos químicos (era médico) para aislarla. En la década de 1930, cierto número
de químicos británicos intentaron aislar la penicilina. Pero fracasaron debido a su
inestabilidad. Por último, un estudio comenzado en 1939 en la Universidad de Oxford
por Howard Florey, Ernst Chain y colaboradores condujo a la preparación con éxito de
una forma estable de penicilina y a la demostración de su impresionante actividad
antibacteriana, primero en cobayas y después en el hombre. El primer ensayo clínico con
una preparación de penicilina se llevó a cabo el 12 de Febrero de 1941. El paciente era
un policía de Oxford que se estaba muriendo por una infección con Staphylococcus
(septicemia). Al administrarle penicilina se observó un mejoramiento espectacular, pero
5 días después, cuando se les acabó la penicilina, la infección volvió a emerger y el
paciente murió. Este ensayo clínico falló debido a que no se podía obtener una
producción a gran escala de penicilina. En este punto (1940-1941), los británicos estaban
inmersos en la segunda guerra mundial. Florey y su colega Heatley consideraron que las
condiciones de una Inglaterra en guerra no eran las adecuadas para el desarrollo de un
proceso industrial de producción del antibiótico. Y así fué como se trasladaron a los
Estados Unidos, en 1941, en busca de apoyo. Con la ayuda del Departamento de
Agricultura y de varias compañías farmacéuticas y Universidades se hizo posible la
producción a gran escala de Penicilina un año después.
Al igual que Aspergillus niger, microorganismo utilizado en la producción de ácido
cítrico, Penicillium notatum es aerobio obligado y por lo tanto debía ser crecido en
cultivos en superficie, lo que favorecía la contaminación y por lo tanto disminuía el
rendimiento de penicilina. La necesidad de utilizar técnicas asépticas llevó al desarrollo
de los fermentadores con agitación que actualmente son los que más se utilizan para
cultivar a gran escala los microorganismos. Las condiciones asépticas se conseguían
esterilizando todo el equipo con vapor antes de la inoculación y manteniendo la presión
del interior del fermentador superior a la atmosférica. El oxígeno se introducía a través
de aire estéril y se distribuía en el medio por agitación.
Otra contribución al desarrollo de la biotecnología moderna que se realizó dentro del
programa de la penicilina fué el desarrollo de las técnicas de selección de cepas. El
Penicillium notatum original producía 2 mg de penicilina por litro de cultivo. El
muestreo de diferentes Penicillium llevó a la identificación de una cepa superproductora
de Penicilina, Penicillium chrysogenum. Para incrementar el rendimiento de esta cepa,
se sometió posteriormente y de una forma sistemática a una variedad de agentes
mutágenos, de tal manera que los supervivientes superproductores se seleccionaban y se
sometían a otra ronda de mutaciones. Combinando las mejoras en la fermentación con el
uso de mutantes, hoy en día el rendimiento se ha incrementado hasta los 20 g/L.
El advenimiento de la penicilina señaló el comienzo de la era de los antibióticos.
Siguieron pronto los descubrimientos de Selman Waksman quien aisló Streptomyces
gryseus que produce estreptomicina. A partir de entonces se hizo práctica estándar el
muestreo de un gran número de aislamientos del suelo, consiguiéndose obtener
numerosos antibióticos nuevos a partir fundamentalmente de un grupo de bacterias
denominadas Actinomicetos.

Ingeniería Genética
Después de la introducción de la fermentación de la penicilina no hubo prácticamente
ningún desarrollo significativo en la microbiología industrial durante 30 años. La
mayoría de las compañías se dedicaban a la búsqueda de microorganismos que
produjeran metabolitos o actividades deseadas, para posteriormente, realizar una
selección de cepas superproductoras y desarrollar la fermentación.
Al final de los 60 se generó cierto revuelo ante las expectativas de utilizar las células
microbianas (biomasa) como una fuente de proteínas, lo que se denomina Single Cell
Protein (SCP). Sin embargo, la introducción de la SCP no tuvo el éxito esperado debido
a que coincidió con un rápido incremento del precio del petróleo y con el desarrollo de
variedades de cultivos con alto rendimiento con lo que los países desarrollados no
necesitaban SCP y los países subdesarrollados no podían construir plantas industriales
para obtener SCP. El desarrollo en Biotecnología, como en otras áreas, está sujeto a
presiones políticas y económicas (en el mundo de los negocios existe poco altruismo).
En 1973 Stanley Cohen, Herbert Boyer y sus colaboradores desarrollaron la metodología
necesaria para transferir la información genética (genes) de un organismo a otro. El
desarrollo de la tecnología del DNA recombinante ha cambiado la naturaleza de la
biotecnología ya que la ingeniería genética provee la capacidad para crear (más que
aislar) cepas superproductoras.
El 15 de Octubre de 1980, a los 20 minutos de comenzar la sesión en la bolsa de Nueva
York, las acciones de la compañía Genentech subieron de 35 $ a 89 $. Fué, hasta la
fecha, la mayor subida de acciones en la historia de la bolsa de Nueva York. Era la
primera vez que esta compañía cotizaba en bolsa. Científicos de esta compañía, 2 años
antes (1978), habían conseguido producir insulina humana en la bacteria Escherichia
coli con lo que podía ser usada por aquellos diabéticos que eran alérgicos a la insulina
disponible hasta la fecha (Insulina de cerdo).
FUTURO
Las perspectivas futuras pueden llevar a los siguientes beneficios:
· Diagnóstico, prevención o cura de enfermedades infecciosas y genéticas.
· Aumento del rendimiento de cultivos creando plantas resistentes a insectos,
hongos y virus.
· Desarrollo de microorganismos que producirán compuestos químicos, polímeros,
aminoácidos, enzimas y varios aditivos de alimentos.
· Facilitar la eliminación de contaminantes y residuos tóxicos del medio ambiente.
Aunque es importante enfatizar los aspectos positivos de los nuevos avances, también es
necesario considerar las consecuencias sociales que pueden derivarse del uso de esta
tecnología:
¿Puede ser algún organismo modificado genéticamente perjudicial para otros
organismos o el medio ambiente?
¿Puede el desarrollo y uso de los organismos modificados genéticamente reducir
la diversidad genética natural?
¿Deben modificarse genéticamente a los hombres?
¿Los nuevos diagnósticos invadirán la privacidad de las personas?
¿Deben tener propietario los organismos creados por ingeniería genética?

CLASIFICACION DE LOS MICROORGANISMOS

Existen millones de organismos vivos en la Naturaleza, siendo algo característico del
hombre su afán por ordenar esa gran variedad de organismos. Con esa necesidad de
ordenamiento surge la Taxonomía como la ciencia de la clasificación, nomenclatura e
identificación. La Clasificación es algo creado por el hombre. Consecuencia de esta
artificialidad es la controversia que existe desde mediados del siglo XVIII sobre las
divisiones que se establecen entre los seres vivos. Lo que comenzó con Linneo siendo
una sencilla división de los seres vivos, los reinos Animalia y Plantae, ha ido haciéndose
cada vez más complejo al pasar por distintas modificaciones hasta llegar a nuestros días
con la propuesta de los tres dominios y varios reinos y con la sospecha de que no será la
última, ya que los conocimientos de que se dispone son cada vez mayores, así como las
posibilidades de aumentar esos conocimientos.
Carolus Linnaeus, a mediados del siglo XVIII, ordenó a todos los seres vivos en dos
Reinos bien definidos: el Reino Animalia que agrupaba a los animales, organismos
móviles y heterótrofos; y el Reino Plantae que incluía a los vegetales, individuos
inmóviles, autótrofos y fotosintéticos. Según el esquema de los dos reinos, los protozoos
se incluyeron en el Reino Animalia y el resto de microorganismos en el Reino Plantae.
Sin embargo, esta clasificación encontró pronto dificultades ya que existían numerosos
microorganismos que poseían características intermedias que no permitían su clara
adscripción a uno de los dos reinos preestablecidos. En 1866 Ernst Haeckel propuso un
tercer reino, el Reino Protista, para reordenar todos los seres vivos con organización
biológica sencilla ya fueran unicelulares, cenocíticos o multicelulares, pero todos ellos
carentes de especialización tisular y en los que cada individuo era capaz de realizar las
funciones propias y específicas que los tejidos de organismos superiores, animales y
plantas, tenían encomendadas. Según Haeckel, el Reino Protista incluiría bacterias,
algas, hongos y protozoos. Sin embargo, la validez del Reino Protista fué cuestionada a
medida que se obtenía más información acerca de la estructura interna de los
microorganismos debido a los avances en microscopía electrónica.
En 1937 Chatton dividió el mundo de los seres vivos en dos grandes grupos según
tuvieran o no membrana nuclear. Aparecieron así los términos eucariota para definir
organismos con células nucleadas que van desde los protozoos, algas y hongos hasta los
animales y plantas; y procariota para agrupar células sin membrana nuclear, como es el
caso de las bacterias. La dicotomía eucariota-procariota fué utilizada por los taxónomos
como una característica filogenética de primera magnitud.
Aparecieron de esta forma los esquemas de cinco reinos en los que los microorganismos
procariotas constituyeron un grupo taxonómico filogenéticamente independiente. El más
aceptado de todos ellos fué el de Whittaker, que en 1969 propuso un sistema de
clasificación de los seres vivos basado en los dos niveles de organización celular y las
tres formas principales de nutrición (fotosíntesis, absorción e ingestión) que dieron lugar
a los Reinos Monera (procariotas), Protista (eucariotas unicelulares), Plantae (eucariotas
fotosintéticos), Animalia (eucariotas fagotrofos) y Fungi (eucariotas osmotrofos). En el
esquema de Whittaker los microorganismos quedaron incluídos en los Reinos Monera
(bacterias), Protista (protozoos y microalgas) y Fungi (hongos filamentosos y levaduras).
Hasta este momento se utilizaron características morfológicas y fisiológicas hasta que el
desarrollo de la biología molecular permitió utilizar los constituyentes moleculares como
nuevos criterios clasificatorios.
Así, en 1987, Woese utilizando el 16S rRNA como reloj molecular comprobó que, a
través de la secuenciación de esta molécula, los procariotas quedaban divididos en dos
grupos. El primero de ellos incluye las bacterias más comunes, aisladas en su mayoría
del cuerpo, suelo y agua denominándose eubacterias. El segundo grupo incluye las
bacterias que producen metano (metanógenas), ciertas bacterias del azufre que pueden
crecer en ambientes muy ácidos y calientes (termófilas extremas) y bacterias que viven
en ambientes salinos (halobacterias). Estas bacterias se denominaron arqueobacterias.
En 1990 Carl Woese propuso un nuevo taxon superior a Reino que denominó Dominio
(Dominio ----> Reino ----> División ----> Clase ----> Orden ----> Familia ----> Género -
---> Especie). Todos los seres vivos se agruparían en 3 dominios: Bacteria, Archaea y
Eukarya. De los cuales, dos son exclusivamente microbianos y están compuestos
únicamente por células procariotas pertenecientes al Reino Monera (Bacteria y Archaea)
y el tercero (Eukarya), formado por eucariotas, incluiría entre otros los Reinos Protista,
Plantae, Animalia y Fungi.

CARACTERISTICAS DE LOS MICROORGANISMOS

INDUSTRIALES
Existen una serie de características que comparten todos los microorganismos y que
suponen ciertas ventajas para su uso en la industria. la más fundamental, el pequeño
tamaño de la célula microbiana y su correspondiente alta relación de superficie a
volumen. Esto facilita el rápido transporte de nutrientes al interior de la célula y permite,
por consiguiente, una elevada tasa metabólica. Así, la tasa de producción de proteína en
las levaduras es varios órdenes de magnitud superior que en la planta de soja, que, a su
vez, es 10 veces más alta que en el ganado. Esta velocidad de biosíntesis microbiana
extremadamente alta permite que algunos microorganismos se reproduzcan en tan solo
20 minutos (Escherichia coli). Los ambientes capaces de albergar vida microbiana son
muy variados. Se han encontrado especies que viven a temperaturas comprendidas entre
el punto de congelación del agua y el punto de ebullición, en agua salada y dulce, en
presencia y en ausencia de aire. Algunos han desarrollado ciclos de vida que incluyen
una fase de latencia en respuesta a la falta de nutrientes: en forma de esporas
permanecen inactivos durante años hasta que el medio ambiente, más favorable, permita
el desarrollo de las células. Los microorganismos se hallan capacitados para acometer
una extensa gama de reacciones metabólicas y adaptarse así a muchas fuentes de
nutrición. Versatilidad que hace posible el que las fermentaciones industriales se basen
en nutrientes baratos.
Un microorganismo de uso industrial debe producir la sustancia de interés; debe estar
disponible en cultivo puro; debe ser genéticamente estable y debe crecer en cultivos a
gran escala. Otra característica importante es que el microorganismo industrial crezca
rápidamente y produzca el producto deseado en un corto período de tiempo. El
microorganismo debe también crecer en un relativamente barato medio de cultivo
disponible en grandes cantidades. Además, un microorganismo industrial no debe ser
patógeno para el hombre o para los animales o plantas. Otro requisito importante es la
facilidad de separar las células microbianas del medio de cultivo; la centrifugación es
dificultosa o cara a gran escala. Los microorganismos industriales más favorables para
esto son aquellos de mayor tamaño celular (hongos filamentosos, levaduras y bacterias
filamentosas) ya que estas células sedimentan más fácilmente que las bacterias
unicelulares e incluso son más fáciles de filtrar.
DIFERENTES TIPOS DE MICROORGANISMOS
INDUSTRIALES
Los microorganismos que sintetizan productos útiles para el hombre representan, como
máximo, unos pocos centenares de especies de entre las más de 100000 descritas en la
Naturaleza. Los pocos que se han encontrado con utilidad industrial son apreciados por
elaborar alguna sustancia que no se puede obtener de manera fácil o barata por otros
métodos.

1.- Levaduras
Las levaduras se vienen utilizando desde hace miles de años para la fabricación de pan y
bebidas alcohólicas. La levadura que sin duda fué la primera y aún hoy en día sigue
siendo la más utilizada por el hombre es Saccharomyces cerevisiae de la que se emplean
diferentes cepas para la fabricación de cerveza, vino, sake, pan y alcoholes industriales.
Kluyveromyces fragilis es una especie fermentadora de la lactosa que se explota en
pequeña escala para la producción de alcohol a partir del suero de la leche. Yarrowia
lipolytica es una fuente industrial de ácido cítrico. Trichosporum cutaneum desempeña
un importante papel en los sistemas de digestión aeróbica de aguas residuales debido a
su enorme capacidad de oxidación de compuestos orgánicos, incluídos algunos que son
tóxicos para otras levaduras y hongos, como los derivados fenólicos.

2.- Hongos filamentosos

Los hongos tienen una gran importancia económica, no tan sólo por su utilidad, sino
también por el daño que pueden causar. Los hongos son responsables de la degradación
de gran parte de la materia orgánica de la Tierra, una actividad enormemente beneficiosa
ya que permite el reciclaje de la materia viva. Por otro lado, los hongos causan gran
cantidad de enfermedades en plantas y animales y pueden destruir alimentos y
materiales de los que depende el hombre.
Los efectos perjudiciales de los hongos están contrarrestados por su utilización
industrial. Los hongos son la base de muchas fermentaciones como la combinación de
soja, habichuelas, arroz y cebada que dan lugar a los alimentos orientales miso, shoyu y
tempeh. Los hongos son también la fuente de muchos enzimas comerciales (amilasas,
proteasas, pectinasas), ácidos orgánicos (cítrico, láctico), antibióticos (penicilina),
quesos especiales (Camembert, Roquefort) y, evidentemente, de las setas.

3.- Bacterias
Entre las especies bacterianas de interés industrial están las bacterias del ácido acético,
Gluconobacter y Acetobacter que pueden convertir el etanol en ácido acético. El género
Bacillus es productor de antibióticos (gramicidina, bacitracina, polimixina), proteasas e
insecticidas. Del género Clostridium cabe destacar Clostridium acetobutylicum que
puede fermentar los azúcares originando acetona y butanol. Las bacterias del ácido
láctico incluyen, entre otras, las especies de los géneros Streptococcus y Lactobacillus
que producen yogur. Corynebacterium glutamicum es una importante fuente industrial
de lisina. El olor característico a tierra mojada se debe a compuestos volátiles
(geosmina) producidos por Streptomyces aunque su principal importancia radica en la
producción de antibióticos como anfotericina B, kanamicina, neomicina, estreptomicina,
tetraciclina, etc.

METABOLITOS PRIMARIOS DE INTERES INDUSTRIAL

Los metabolitos primarios son moléculas de bajo peso molecular que intervienen, bien
como productos finales o intermediarios, en las distintas rutas anabólicas y catabólicas.
Los más importantes desde el punto de vista industrial son los aminoácidos, nucleótidos,
vitaminas, ácidos orgánicos y alcoholes.
· Alcoholes: etanol
· Aminoácidos: ácido glutámico, lisina, treonina
· Nucleótidos: ácido 5' guanílico, ácido 5' inosínico
· Acidos orgánicos: ácido acético, ácido propiónico, ácido succínico, ácido
fumárico, ácido láctico, ácido málico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido
glucónico
· Polioles: glicerol, manitol
· Polisacáridos: xantano
· Azúcares: fructosa, sorbosa
· Vitaminas: riboflavina (B2), cianocobalamina (B12)

La superproducción de metabolitos primarios es evitada por la mayoría de los

microorganismos, puesto que son procesos que consumen gran cantidad de energía, lo
cual hace que sean menos competitivos en los ambientes naturales. Sin embargo, existen
en la Naturaleza microorganismos que tienen alterados sus sistemas regulatorios y éstos
son precisamente los que a lo largo del proceso de búsqueda son seleccionados para su
utilización en microbiología industrial. Estos cultivos posteriormente se someten a un
profundo estudio mediante el cual, alterando las condiciones del medio y/o por
modificaciones genéticas, incrementamos la superproducción del producto que nos
interesa. Mediante estas alteraciones se ha conseguido, por ejemplo, que la bacteria
Pseudomonas denitrificans produzca 50.000 veces más vitamina B12. Las
manipulaciones más frecuentes son la alteración de la regulación por retroalimentación y
la alteración de la permeabilidad.
ALTERACION DE LA REGULACION POR RETROALIMENTACION
La regulación por retroalimentación es el control que utilizan los microorganismos para
evitar la superproducción de aminoácidos y nucleótidos. Para eliminar este control se
han empleado dos tipos de manipulaciones: alteración de la acumulación de productos
finales y obtención de mutantes resistentes a la regulación por retroalimentación.

1.- Alteración de la acumulación de productos finales:

A. Evitar la acumulación de productos finales.

En una ruta metabólica sencilla (no ramificada) la limitación de la capacidad de la célula
para acumular intracelularmente productos finales inhibidores o represores, se utiliza
generalmente para la superproducción de algún intermediario de esta ruta metabólica. En
el siguiente esquema se representa este principio:
Si nosotros deseamos obtener una superproducción del producto intermediario C en una
ruta metabólica sencilla donde el producto final E por retroalimentación inhibe al
enzima a y reprime a los enzimas a y b, lo primero que se hace es obtener un mutante
auxótrofo que le falte el enzima c. Al no poder sintetizar el producto E, este mutante
requiere para su crecimiento que se añada en el medio E. Si se añaden bajos niveles de
E, los necesarios para que el microorganismo crezca, éste microorganismo no podrá
acumular concentraciones de E que inhiban o repriman a los enzimas a y b con lo que
será posible obtener una gran acumulación de C.
Mediante este tipo de manipulación se ha conseguido por ejemplo, que un mutante de
Corynebacterium glutamicum auxótrofo en Arginina produzca 26 gramos/litro de L-
Ornitina.

B. Acumulación de productos finales.

Se utiliza en rutas metabólicas ramificadas. Consideremos una ruta metabólica
ramificada que conduce a dos productos finales, A y B. Con frecuencia, si conseguimos
disminuir la concentración de B, el producto A se acumularía.
El ejemplo más importante, con interés comercial, de la utilización de esta estrategia es
la superproducción de lisina. Este aminoácido se utiliza como aditivo nutritivo, puesto
que la mayoría de las proteínas de cereales son deficientes en este aminoácido. Pertenece
a la familia del aspartato y se produce en la mayoría de las bacterias en una ruta
metabólica ramificada que produce además metionina, treonina e isoleucina.
En Escherichia coli, el primer paso de esta ruta está regido por tres aspartato quinasas,
cada una de las cuales está regulada por un producto final diferente y, además, cada
producto final regula el primer enzima después de cada ramificación.
Sin embargo, en los microorganismos utilizados en la fermentación para la producción
de lisina (Corynebacterium glutamicum) existe una única aspartato quinasa regulada por
un mecanismo concertado de retroalimentación por la treonina y lisina. Así mismo,
tampoco poseen regulación en la ramificación.
Mediante la eliminación genética del enzima homoserina deshidrogenasa, se obtiene un
mutante que no puede crecer salvo que se añada en el medio metionina y treonina.
Mientras que los niveles de treonina que se añadan sean bajos, pero suficientes para el
crecimiento del microorganismo, no se producirá una inhibición por retroalimentación
de la aspartato quinasa, con lo que estos microorganismos son capaces de producir 50
gramos de L-lisina por litro.

METABOLITOS SECUNDARIOS DE INTERES INDUSTRIAL

Los metabolitos secundarios son moléculas sintetizadas por determinados
microorganismos, normalmente en una fase tardía de su ciclo de crecimiento, cuyas
características son:
(i) No son necesarios para el crecimiento del microorganismo que los produce.
En estado natural, sus funciones se hallan ordenadas a la supervivencia de
la especie, pero cuando los microorganismos que los producen se
desarrollan en cultivo puro los metabolitos secundarios no desempeñan esa
misión.

(ii) Generalmente se producen como mezclas de productos muy relacionados

químicamente entre sí. Por ejemplo, una única cepa de una especie del
género Streptomyces produce 32 antraciclinas diferentes.
(iii) Cada uno de estos productos es producido por un grupo muy reducido de
organismos.

(iv) La producción puede perderse fácilmente por mutación espontánea

(degeneración de la raza), por lo que son muy importantes las técnicas de
conservación de estos microorganismos.

De todos los productos tradicionales obtenidos por fermentación, los más importantes
para la salud humana son los metabolitos secundarios. Donde se incluyen, además de los
antibióticos, ciertas toxinas (micotoxinas), alcaloides (ácido lisérgico), factores de
crecimiento vegetal (giberelinas) y pigmentos.

Los metabolitos secundarios mejor conocidos son los antibióticos, de los que se han
descubierto más de 5000, cifra que aumenta a razón de una media aproximada de 300
por año, aunque la mayoría carecen de utilidad pues son tóxicos para los organismos
vivos. Aproximadamente el 75% de los antibióticos conocidos son producidos por
actinomicetos. Algunas especies son excepcionales productores de antibióticos, por
ejemplo Streptomyces gryseus produce al menos 40 antibióticos diferentes.
INCREMENTO DE LA PRODUCCION DE METABOLITOS
SECUNDARIOS
La mayoría de los controles descritos en este capítulo se eliminan mediante
manipulación ambiental o mediante la obtención de mutantes mal regulados.

1.- Manipulación ambiental

Catabolito: eliminación de la glucosa del medio.
Inducción: adición de manano al medio.
Carga energética: disminución de fosfato en el medio.
Precursores: adición de precursores al medio.

FERMENTADORES INDUSTRIALES
El objetivo de la biotecnología es obtener productos metabólicos útiles a partir de
materiales biológicos. La biotecnología comprende dos fases distintas: la fermentación
y la recuperación de los productos. Para el cultivo de microorganismos en
condiciones óptimas, así como para la producción, por parte de los microorganismos, de
los metabolitos o los enzimas deseados, deben ser desarrollados procedimientos de
fermentación como son el desarrollo de cepas mediante manipulación genética y/o la
regulación del metabolismo mediante la optimización del medio de cultivo así como el
control adecuado de los factores físico-químicos que afectan al rendimiento de las
fermentaciones industriales (02, Tª, pH, etc.). La recuperación del producto o
"procesamiento posterior" (del inglés downstream processing) conlleva la extracción y
purificación de los productos biológicos. La recuperación en los procesos bioquímicos
difiere de la recuperación química, principalmente, en que los materiales biológicos son
frecuentemente mucho más lábiles. Por lo tanto, la producción de productos metabólicos
útiles a partir de microorganismos conlleva una íntima relación entre la Ciencia y la
Tecnología. por un lado se deben desarrollar los microorganismos de interés industrial y
por otro se debe asegurar que estos microorganismos puedan crecer en gran cantidad
bajo aquellas condiciones que originen el mejor rendimiento posible del producto.

A simple vista uno puede pensar que aquellas condiciones que se han encontrado ser las
más efectivas a pequeña escala deberían ser igual de efectivas a larga escala y que para
conseguir este objetivo únicamente es necesario usar un recipiente mayor con el
correspondiente incremento de volumen del medio. Nada más lejos de la realidad. Por
ejemplo, se puede conseguir un buen crecimiento de un microorganismo aerobio en un
matraz de 200 mL mediante agitación en un incubador usando un rotor de 300 w. Si
nosotros simplemente ampliamos este sistema, un único fermentador de 10.000 litros
requeriría un agitador con un motor de 15 megawatios. Dicho motor debería ser tan
grande como una casa y el calor generado durante la agitación herviría a los
microorganismos.

En líneas generales, un proceso típico de fermentación comienza con la formulación y

esterilización del medio de cultivo así como la esterilización del equipamiento. Las
células se crecen primero en un cultivo de mantenimiento (5 a 10 mL), posteriormente
en un matraz (200 a 1.000 mL) y de ahí en un prefermentador (10 a 100 L) para
finalmente inocular el fermentador de producción (1.000 a 100.000 L). Una vez que la
fermentación se ha completado, las células se separan del cultivo líquido. Si el producto
es intracelular, se rompen las células, se eliminan los restos celulares y se recupera el
producto del fluido libre de restos celulares. Si el producto es extracelular, se purifica a
partir del sobrenadante libre de células. Hasta ahora hemos visto el desarrollo de las
cepas así como el diseño de los medios de cultivo. A continuación vamos a desarrollar
los aspectos tecnológicos de las fermentaciones.

DISEÑO Y FUNCIONAMIENTO DEL FERMENTADOR

El estudio detallado del diseño de un fermentador cae fuera del objetivo de esta
asignatura que se concentra en los principios biológicos de la biotecnología. Sin
embargo, como la tecnología de los procesos fermentativos es una amalgama de técnicas
biológicas e ingeniería química, se hace necesario proporcionar un breve resumen de los
tipos de fermentadores disponibles y de sus principales características. A continuación
paso a describir una lista de 13 puntos considerados como los criterios más importantes
para el diseño de un fermentador:
1.- El tanque debe diseñarse para que funcione asépticamente durante numerosos
días, así como para las operaciones de más larga duración.
2.- Se debe proporcionar un sistema adecuado de aireación y agitación para cubrir
las necesidades metabólicas de los microorganismos.
3.- El consumo de energía debe ser tan bajo como sea posible.
4.- Debe tener un sistema para el control del pH.
5.- El fermentador debe tener un sistema para la toma de muestras.
6.- Debe existir un sistema para el control de la temperatura.
 7.- Las pérdidas por evaporación no deben ser excesivas.
8.- El diseño del tanque debe ser tal que las operaciones laborales durante el
funcionamiento, recolección, limpieza y mantenimiento sean mínimas.
9.- El tanque debe ser versátil para la aplicación de diversas modalidades de
procesos.
10.- Las superficies internas del tanque deben ser lisas, utilizando, donde sea
posible, soldaduras.
11.- La geometría del fermentador debe ser similar a otros tanques más pequeños
o mayores de la planta o a los de la planta piloto para poder reproducir procesos a
diferentes escalas.
12.- deben emplearse los materiales más baratos que proporcionen resultados
satisfactorios.

13.- Debe existir un servicio adecuado de repuestos para el fermentador.

El mantenimiento de un ambiente aséptico y unas condiciones aeróbicas son,
probablemente, los dos puntos de mayor relevancia que hay que considerar. Los
fermentadores más ampliamente utilizados a nivel industrial están provistos de
mecanismos de agitación, dispersión y aireación así como de sistemas para el control de
la temperatura, pH y formación de espuma.

TIPOS DE FERMENTACIONES

1.- Fermentación discontinua

Una fermentación discontinua (en batch) puede ser considerada como un "sistema
cerrado". Al inicio de la operación se añade la solución esterilizada de nutrientes y se
inocula con el microorganismo, permitiendo que se lleve a cabo la incubación en
condiciones óptimas de fermentación. A lo largo de toda la fermentación no se añade
nada, excepto oxígeno (en forma de aire), un agente antiespumante y ácidos o bases para
controlar el pH. La composición del medio de cultivo, la concentración de la biomasa y
la concentración de metabolitos cambia generalmente como resultado del metabolismo
de las células observándose las cuatro fases típicas de crecimiento: fase de latencia, fase
logarítmica, fase estacionaria y fase de muerte.
En los procesos comerciales la fermentación frecuentemente se interrumpe al final de la
fase logarítmica (metabolitos primarios) o antes de que comience la fase de muerte
(metabolitos secundarios).
2.- Fermentación alimentada (fed-batch)
En los procesos convencionales discontinuos que acabamos de describir, todos los
sustratos se añaden al principio de la fermentación. Una mejora del proceso cerrado
discontinuo es la fermentación alimentada que se utiliza en la producción de sustancias
como la penicilina. En los procesos alimentados, los sustratos se añaden
escalonadamente a medida que progresa la fermentación. La formación de muchos
metabolitos secundarios está sometida a represión catabólica (efecto glucosa). Por esta
razón en el método alimentado los elementos críticos de la solución de nutrientes se
añaden en pequeñas concentraciones al principio de la fermentación y continuan
añadiéndose a pequeñas dosis durante la fase de producción.

3.- Fermentación continua

En la fermentación continua se establece un sistema abierto. La solución nutritiva estéril
se añade continuamente al biorreactor y una cantidad equivalente de solución utilizada
de los nutrientes, con los microorganismos, se saca simultáneamente del sistema.
El objetivo fundamental de la industria de las fermentaciones es minimizar costes e
incrementar los rendimientos. Este objetivo puede alcanzarse si se desarrolla el tipo de
fermentación más adecuado para cada paso en particular. Si bien los procesos de
fermentación continua no se utilizan de forma general en la industria, debido
fundamentalmente al mayor nivel de experiencia que se tiene en el crecimiento de
células en fermentación discontinua, el coste de producción de biomasa mediante cultivo
continuo es potencialmente inferior al de cultivo discontinuo. De este modo se han
instalado plantas de producción para la producción continua de proteína de origen
unicelular a partir de n-alcanos, compuestos C1 y almidones.

Aunque muchas fermentaciones para la producción de metabolitos funcionan bien como

procesos continuos, sólo unos pocos procesos han resultado útiles para la aplicación
práctica por varias razones:
a.- Muchos métodos de laboratorio operan continuamente durante solamente 20 a 200
horas; para que sea de utilidad industrial el sistema debe ser estable durante al menos
500 a 1.000 horas.
b.- Mantener las condiciones estériles a escala industrial a lo largo de un largo período
de tiempo es difícil.
c.- La composición de los sustratos debe ser constante a fin de obtener una producción
máxima. La composición de las soluciones de nutrientes industriales son variables
(líquido de maceración del maiz, peptona, etc.) lo que puede originar cambios en la
fisiología de la célula y disminuir la productividad.
d.- Cuando se utilizan cepas de alto rendimiento se producen mutantes degenerados, los
cuales pueden crecer en cultivo continuo más deprisa que las cepas de producción por lo
que el rendimiento disminuye con el tiempo ya que cada vez son menos células las que
sintetizan el producto de interés.

4.- Reactores de enzimas o células inmovilizadas

Consiste en pasar el medio fresco a través de un biorreactor en el que por diversas
técnicas hemos inmovilizado células (o enzimas). En el biorreactor se producen las
transformaciones bioquímicas que deseamos y recuperamos el producto transformado
tras su paso por la columna. Con este sistema se eliminan los problemas de desequilibrio
(estabilidad) del sistema continuo clásico y además el producto resultante está libre de
células. Presenta el inconveniente de que no todos los microorganismos pueden
inmovilizarse.
Existen tres métodos de inmovilizar las células:
a.- Asociación física mediante resinas de intercambio iónico. La unión se puede
romper fácilmente.
b.- Unión covalente mediante glutaraldehido, tolueno, di-isocianato, iodo acetil
celulosa. Unión fuerte aunque inactivación.
c.- Atrapamiento mediante colágeno, gelatina, agar, alginatos, poliacrilamida,
poliestireno. Es el método más utilizado en inmovilización de células; para ello se
mezclan las células con el polisacárido líquido y posteriormente se deja enfriar
para que solidifique. Finalmente se fragmenta o granula y se empaqueta en una
columna.

FACTORES FISICO-QUIMICOS QUE AFECTAN AL

RENDIMIENTO DE LAS FERMENTACIONES INDUSTRIALES

1.- Oxígeno
Uno de los factores más críticos en la operación de fermentación a gran escala es el
suministro de un intercambio de gases adecuado. El oxígeno es el sustrato gaseoso más
importante para el metabolismo microbiano y el anhídrido carbónico es el producto
metabólico más importante. El oxígeno no es un gas muy soluble ya que una solución
saturada de oxígeno contiene aproximadamente 9 mg / L de este gas en agua. debido a la
influencia de los ingredientes del cultivo, el contenido máximo de oxígeno realmente es
más bajo de lo que debería ser en agua pura. El suministro se logra pulverizando aire en
el fermentador durante el proceso.
La ley de Henry describe la solubilidad del oxígeno en soluciones de nutrientes en
relación a la presión parcial del oxígeno en la fase gaseosa:

En esta ecuación C es la concentración de O2 de la solución de nutrientes a saturación,

P0 es la presión parcial del gas en la fase gaseosa y H es la constante de Henry que es
específica para cada tipo de gas. A medida que aumenta la concentración de O2 en la
fase gaseosa, aumenta la proporción de O2 en la solución de nutrientes. En consecuencia,
la presión más alta de O2 se consigue durante la aireación con oxígeno puro. Comparado
con el valor obtenido al utilizar aire (9 mg O2/L), en agua se disuelven 43 mg O2/L
cuando se utiliza oxígeno puro. Otra característica es que a medida que aumenta la
temperatura desciende la solubilidad del oxígeno.
Una vez disuelto el O2 éste tiene que transferirse desde la burbuja de gas a cada célula
individual. Para ello deben ser superadas varias resistencias parcialmente
independientes:
a.- La resistencia dentro de la película de gas a la interfase.
b.- La penetración de la interfase entre la burbuja de gas y el líquido.
c.- Transferencia desde la interfase al líquido.
d.- Movimientos dentro de la solución de nutrientes.
e.- Transferencia a la superficie de la célula.

En las fermentaciones que se llevan a cabo con organismos unicelulares como bacterias
o levaduras, el factor más importante que controla la velocidad de transferencia es la
resistencia en la interfase entre la burbuja de gas y el líquido. Las células microbianas
próximas a la burbuja de gas pueden absorber directamente el O2 a través de la interfase
aumentando la transferencia del gas a estas células. En los aglomerados de células o en
las bolitas de micelio, la transferencia de gas dentro del aglomerado puede ser un factor
limitante.

Por último indicar la concentración crítica de oxígeno que es el término utilizado para
expresar el valor de la velocidad específica de absorción de oxígeno que permite la
respiración sin impedimentos. Esta concentración crítica de oxígeno suele tener unos
valores concretos para cada microorganismo oscilando de forma general entre el 5% y el
25% de los valores de saturación de oxígeno en los cultivos.

2.- Temperatura
La temperatura es otro de los parámetros esenciales para el éxito de una fermentación.
Los microorganismos que crecen a una temperatura inferior a la óptima tienen retardado
su crecimiento y por lo tanto reducida la producción celular, es decir su productividad.
Por otro lado, si la temperatura es demasiado alta, pero no letal, se puede inducir una
respuesta de estrés al choque térmico con la consiguiente producción de proteasas
celulares que ocasionan una disminución en el rendimiento de los productos proteicos. A
fin de obtener rendimientos óptimos, las fermentaciones deben ser llevadas a cabo en un
margen estrecho de temperatura y a ser posible constante. La velocidad de producción
de calor debida a la agitación y a la actividad metabólica de los microorganismos no se
ve compensada por las pérdidas de calor que resultan de la evaporación, por lo que se
debe recurrir a sistemas de refrigeración. Dentro de éstos, los más utilizados en las
fermentaciones industriales son las camisas de agua.

3.- pH
La mayor parte de los microorganismos crecen óptimamente entre pH 5,5 y 8,5. Pero
durante el crecimiento en un fermentador, los metabolitos celulares son liberados al
medio, lo que puede originar un cambio del pH del medio de cultivo. Por lo tanto se
debe controlar el pH del medio de cultivo y añadir un ácido o una base cuando se
necesite para mantener constante el pH. Por supuesto que esta adición del ácido o base
debe ser mezclada rápidamente de tal manera que el pH del medio de cultivo sea el
mismo en todo el fermentador.

AGITACION Y MEZCLADO
La agitación es la operación que crea o que acelera el contacto entre dos o varias fases.
Una fermentación microbiana puede ser considerada como un sistema de tres fases, que
implica reacciones líquido-sólido, gas-sólido y gas-líquido.
1.- La fase líquida contiene sales disueltas, sustratos y metabolitos. Puede existir,
en algunos casos, una segunda fase líquida si existe un sustrato inmiscible en agua
como por ejemplo los alcanos.
2.- La fase sólida consiste en células individuales, bolitas de micelio, sustratos
insolubles o productos del metabolismo que precipitan.
3.- La fase gaseosa proporciona un reservorio para el suministro de oxígeno, para
la eliminación del CO2 o para el ajuste del pH con amonio gaseoso.

Una adecuada agitación de un cultivo microbiano es esencial para la fermentación ya

que produce los siguientes efectos en las tres fases:
1.- Dispersión del aire en la solución de nutrientes.
2.- Homogeneización, para igualar la temperatura, pH y concentración de
nutrientes, en el fermentador.
 3.- Suspensión de los microorganismos y de los nutrientes sólidos.

4.- Dispersión de los líquidos inmiscibles.

Bajo estas premisas se podría concluir que cuanto mayor sea la agitación, mejor será el
crecimiento. Sin embargo, la agitación excesiva puede romper las células grandes e
incrementar la temperatura lo que ocasiona un descenso en la viabilidad celular. Por lo
tanto, se debe conseguir un balance entre la necesidad del mezclado y la necesidad de
evitar el daño celular.

Los diferentes tipos de agitación que se utilizan en las fermentaciones se incluyen dentro
de las siguientes clases:
1.- Agitadores rotativos, los cuales tienen un sistema interno mecánico de
agitación.
2.- Columnas de burbujas, la agitación se realiza mediante la introducción de aire
a sobrepresión.
3.- Sistema aero-elevado (airlift), que pueden tener un circuito interno o externo.
La mezcla y circulación de los fluidos son el resultado de las corrientes de aire
introducido, las cuales causan diferencias en la densidad dentro de las diferentes
partes del fermentador.

De estos tres tipos el más utilizado es el primero ya que es más flexible en las
condiciones de operación, es más fácil de conseguir comercialmente, provee una
eficiente transferencia de gases a las células y es el tipo con el que se tiene más
experiencia.

ESTERILIZACION DEL AIRE DE FERMENTACION

La mayor parte de las fermentaciones industriales operan en condiciones de agitación

vigorosa y el aire que se suministra al fermentador debe ser esterilizado. El número de
partículas y microorganismos en el aire varía en gran medida dependiendo de la
localización de la planta, el movimiento del aire y el tratamiento previo del aire. Como
media, el aire exterior tiene 10 - 100.000 partículas por m3 y 5 - 2.000 microorganismos
por m3. De estos, el 50% son esporas de hongos y el 40% son bacterias G (-). Los
fermentadores funcionan generalmente con velocidades de aireación de 0,5 - 1,0 vvm
(volumen de aire/volumen de líquido por minuto). Un fermentador que tenga un
volumen de trabajo de 50 m3 con una velocidad de aireación de 1 vvm necesita 3.000 m3
de aire estéril por hora. La importancia crítica de la esterilización del aire en la
microbiología industrial puede ser deducida a partir de estos valores.
Los métodos existentes para la esterilización de los gases incluyen la filtración,
inyección de gas (ozono), depuración de gas, radiación (UV) y calor. De todos estos,
sólamente la filtración y el calor son prácticos a escala industrial. Durante muchos años
el aire se esterilizó pasándolo sobre elementos calentados eléctricamente, pero debido al
alto coste de la electricidad a partir de la crisis del petróleo de los años 70, este proceso
ha sido reemplazado por la filtración.

Actualmente, en los sistemas industriales el aire se esteriliza por filtración. En los

sistemas más antiguos se instalaban filtros en profundidad como los de lana de vidrio en
los que las partículas son atrapadas por una combinación de efectos físicos (inercia,
bloqueo, difusión, gravedad y atracción electrostática). Los dos últimos mecanismos
tienen un efecto mínimo sobre la eliminación de las partículas. Las desventajas de los
filtros de lana de vidrio incluyen el arrugamiento y la solidificación durante la
esterilización por vapor.

Actualmente están siendo reemplazados por filtros de cartuchos que utilizan membranas
plegadas. Las ventajas de estos filtros es que son sustancialmente más pequeños, debido
a la construcción de los cartuchos es fácil reemplazar los elementos filtrantes utilizados,
al poseer una estructura membranosa (ésteres de celulosa, polisulfona o nylon) tienen un
efecto de filtros absolutos. La desventaja de la mayor parte de los sistemas instalados
actualmente es que no existen todavía, para uso industrial, filtros absolutos para
bacteriófagos. Los bacteriófagos pueden ocasionar el fallo total de un sistema como por
ejemplo en la producción de ácido glutámico por Corynebacterium glutamicum o al
trabajar con Escherichia coli.

El aire que sale del fermentador también debe ser esterilizado, sobre todo si se trabaja
con organismos recombinantes. No sólo como medida de seguridad, sino también para
prevenir que las cepas industriales se liberen al medio ambiente y por lo tanto estén
disponibles de una forma gratuita para los competidores. De nuevo, se utiliza la
filtración.

RECUPERACION DE PRODUCTOS
El término recuperación (downstream processing) es un término colectivo, útil para
todas las etapas que se requieren a fin de recuperar los productos útiles de cualquier tipo
de proceso industrial. Cuando se discute la recuperación del producto se debe distinguir
entre los conceptos de purificación y concentración. Una etapa de recuperación cambia
la pureza y/o la concentración de un metabolito. En el proceso ideal de recuperación se
optimizan ambos parámetros.
En los primeros tiempos de la Microbiología Industrial las técnicas utilizadas en la
recuperación de productos (extracción, destilación, diálisis, cristalización, precipitación,
desecación) se tomaron más o menos directamente de la ingeniería química sin más que
un intento aproximado para adaptarlas a los materiales biológicos. Sin embargo,
gradualmente se comprendió que había que perfeccionar procesos específicos de
purificación para materiales biológicos ya que los bioproductos son frecuentemente
compuestos muy lábiles cuyas estructuras activas pueden sobrevivir solamente bajo
condiciones definidas y limitadas de pH, temperatura, fuerza iónica, etc. También
resultó claro que no existe una operación única, ideal o universal, ni siquiera secuencias
de operaciones que puedan ser recomendadas; las operaciones individuales unitarias
deben ser combinadas de la forma más adecuada para cada problema particular.

En muchos casos la primera etapa, al final de una fermentación, es la separación de los

sólidos del líquido que casi siempre es acuoso. El propio microorganismo puede ser el
producto final deseado, sin embargo, en la mayor parte de los procesos a gran escala el
producto deseado es un metabolito que está presente intra o extracelularmente. Ejemplos
de metabolitos intracelulares incluyen a los ácidos nucleicos, las vitaminas, enzimas y
ciertos antibióticos como la griseofulvina. Ejemplos de metabolitos extracelulares
incluyen a los aminoácidos, el ácido cítrico, alcohol, algunos enzimas (amilasas y
proteasas) y la mayor parte de los antibióticos (penicilina, estreptomicina). En unos
pocos casos se encuentran metabolitos tanto en las células como en el filtrado del cultivo
(vitamina B12).

Si el metabolito que se va a aislar es intracelular, éste debe ser liberado de las células
antes de proceder a las siguientes etapas. Una vez el metabolito ha sido separado de las
células, la selección de etapas adicionales de purificación dependerá del producto
deseado. La transparencia resume varios procesos de purificación, ordenados de acuerdo
con los principios de separación para partículas de varios tamaños, peso, carga, etc. Las
últimas etapas en la recuperación implican precipitación, cristalización y/o desecación.

A. Separación de las partículas

La primera etapa en la recuperación del producto es, por consiguiente, la separación de

la biomasa celular y los ingredientes insolubles del sobrenadante de cultivo. Para este
propósito existen varios métodos, que incluyen la floculación, flotación, filtración y
centrifugación.
1.- Floculación y flotación
Las células aisladas en el rango de tamaño de 1 a 10 µm sedimentan solo muy
lentamente y son difíciles de precipitar incluso con la centrífuga. En estos casos se
recurre a la floculación para producir grandes agregados que sedimentan mucho más
rápidamente ya que la velocidad de sedimentación de una partícula aumenta con su
diámetro (ley de Stokes).
En la mayor parte de los casos se añade un agente floculante como una sal inorgánica,
polielectrolitos orgánicos o hidrocoloides minerales. La floculación depende tanto del
agente floculante empleado como de otros factores como la naturaleza de las células, de
los constituyentes iónicos así como su concentración. La floculación puede ocurrir
reversiblemente si las cargas sobre la superficie de la célula pueden neutralizarse por
iones de carga opuesta, e irreversiblemente si se forman, entre las células, puentes de
moléculas poliméricas cargadas.
Si no se forma un flóculo suficientemente denso, puede utilizarse la flotación que es el
proceso reverso a la floculación. La flotación se consigue introduciendo gas en el
líquido. Las pequeñas burbujas de gas adsorben y atrapan a las células y suben a la capa
de espuma en la parte superior del recipiente donde pueden ser recogidas y sacadas del
biorreactor.

2.- Filtración
Lo más frecuente es que la primera etapa en el proceso de recuperación se lleve a cabo
por algún tipo de proceso de filtración. Los dos principales tipos de filtros son los
denominados filtros en profundidad y filtros en superficie; en ambos casos la fuerza
motriz es la presión, sea creada por sobrepresión o por vacío.

Un filtro en profundidad se construye a partir de una matriz filamentosa, como lana de

vidrio o papel de filtro, llevándose a cabo el proceso de filtración debido a que las
partículas que han de ser removidas quedan atrapadas dentro de la matriz. Las partículas
que van a ser filtradas son frecuentemente más pequeñas que los poros del filtro, pero a
pesar de ello son separadas a medida que pasan a través de los intersticios retorcidos del
filtro. Los filtros en superficie son membranas en las que el tamaño de los poros es más
pequeño que las partículas que van a ser filtradas. Las partículas son, por consiguiente,
separadas sobre las superficies de los filtros.

Los hongos filamentosos se filtran frecuentemente a través de filtros profundos. Por su

parte, los cultivos bacterianos deben ser filtrados en superficie. En cualquier caso, la
velocidad de filtración, es decir el volumen de filtrado que puede ser recogido en un
tiempo determinado, está influenciada por numerosos factores, como el tamaño de los
microorganismos, su morfología, la viscosidad del fluido, temperatura, etc.
Uno de los inconvenientes de la filtración en superficie es la colmatación. Debido a que
este proceso de filtración depende estrictamente del tamaño de los poros y del tamaño de
las partículas, a medida que el material celular se amontona sobre el filtro se forma una
capa que reduce la velocidad de filtración.

Una mejora considerable en el flujo que pasa por el filtro se consigue por filtración en
contracorriente, en la cual los sólidos que no pasen a través del filtro son mantenidos en
suspensión mediante un flujo turbulento a través de la membrana o ajustando palas
móviles o mediante un impulsor en el interior del filtro. El filtrado pasa a través de la
membrana y la biomasa se separa del filtro y se transfiere con el material que se retiene.
Con el método de contracorriente puede obtenerse un aumento de la velocidad de
filtración de 100 veces en comparación con la filtración estática.

Dependiendo del tamaño de las partículas que sean filtradas se reconocen tres tipos
principales de procesos de filtración:

Osmosis reversa, para partículas de 0,0001 a 0,001 µm

Ultrafiltración, para partículas de 0,001 a 0,1 µm
Microfiltración, para partículas de 0,1 a 10 µm

Las posibilidades de los procesos de ultrafiltración y ósmosis reversa se dan

generalmente en términos del peso molecular del tamaño de corte. La ósmosis reversa
implica generalmente a sustancias de pesos moleculares menores de 1.000 daltons y la
ultrafiltración a sustancias de pesos moleculares mayores de 1.000 daltons. El proceso
de microfiltración concierne principalmente a la separación de células o de fracciones
celulares. Se utilizan membranas fabricadas con ésteres de celulosa, polivinilfluoruros,
policarbonatos, polisulfonas y celulosa.

En los procesos clásicos de purificación utilizados en la industria de antibióticos

(micelios de hongos y actinomicetos), la biomasa se separa del filtrado del cultivo sobre
un filtro de tambor rotatorio a vacío que consiste en un tambor rotatorio en cuya parte
exterior se enrolla un paño y el vacío se produce desde el interior del tambor. Para
aumentar la eficiencia del proceso de filtración, se utiliza una ayuda filtrante como tierra
de diatomeas. Para mantener la eficiencia de filtración, se utiliza una cuchilla automática
para raspar continuamente del filtro la biomasa junto con una fina capa del material de
ayuda de filtración. Organizando el tambor en segmentos, la ayuda filtrante puede ser
lavada a medida que gira el tambor. Los filtros de tambor a vacío son especialmente
buenos para suspensiones que contengan una alta concentración de sólidos (20-60% de
volumen de micelio).
3.- Centrifugación
Las bacterias son normalmente demasiado pequeñas como para ser separadas con filtros
sencillos. Su separación por centrifugación también es difícil debido a las pequeñas
diferencias en densidad entre las partículas y la suspensión.

La centrifugación no sólo se utiliza para separar partículas sólidas de la fase líquida sino
también para la separación de fluido/fluido. Si bien la separación fluido/partícula es de
la mayor importancia, la separación fluido/fluido también es importante como es el caso
en la producción de penicilina para la separación del solvente que extrae el antibiótico
de la fase acuosa mediante una contracorriente continua en dos etapas con acetato de
amilo o de butilo a 0-3°C y pH: 2,5-3,0.

La separación eficiente de las células por centrifugación se ve favorecida por un tamaño

grande de las partículas, una gran diferencia entre la densidad de las partículas y el
líquido, una baja viscosidad del líquido, un radio elevado del rotor de la centrífuga y una
alta velocidad angular. Tanto el tamaño de las partículas, su densidad así como la
viscosidad del líquido normalmente no se pueden controlar. Además, el radio del rotor
de la centrífuga no puede incrementarse indefinidamente ya que el estrés mecánico
incrementa con el cuadrado del radio por lo que los límites de seguridad se alcanzan
fácilmente. Por todo esto y cuando se trabaja con grandes volúmenes se debe recurrir a
centrífugas de flujo continuo. En este tipo de centrífugas la separación de partículas es
más eficiente cuanto más lento sea el flujo de la suspensión a clarificar ya que se
incrementa el tiempo que cada partícula está expuesta a la fuerza centrífuga.

En la transparencia se muestran esquemáticamente algunos tipos de rotores: cámara

tubular, recipiente de cámara múltiple y centrífuga de rotor de discos. Todos los diseños
tienen desventajas individuales a las que deben ser añadidas las generales del coste
(incluyendo el mantenimiento), consumo de energía y (exceptuando las que incorporan
refrigeración) elevación de la temperatura.

B. Desintegración de los microorganismos

En algunos casos la recuperación de los productos requiere que los microorganismos
sean fragmentados por procedimientos químicos, físicos o biológicos. Un resumen de
los métodos utilizados en la desintegración de los microorganismos se encuentra en esta
transparencia. La selección de un método depende principalmente de la naturaleza de las
células. Aunque las membranas celulares no ofrecen especial resistencia a la ruptura, las
paredes celulares varían ampliamente en lo rápidamente que pueden ser rotas. Las
bacterias Gram + y los hongos son mucho más difíciles de romper que las bacterias G-
debido a la composición de la pared celular. Incluso dentro de un mismo
microorganismo las células varían significativamente en sensibilidad a la ruptura
dependiendo de su estado fisiológico. Al mismo tiempo, la desintegración debe ser
llevada a cabo sin destruir el producto que nos interesa. Por ejemplo, pueden utilizarse
ácidos para romper muchos microorganismos pero no pueden ser utilizados si el
producto de interés es lábil a los ácidos.

1.- Métodos químicos

Los métodos químicos utilizados para desintegrar células microbianas incluyen
tratamiento con álcalis o ácidos, solventes orgánicos y detergentes.

La lisis bacteriana mediante el uso de álcalis puede llevarse a cabo a gran escala y con
bajo coste siempre y cuando el producto sea estable a pH: 10,5-12,5. Por ejemplo, la
hormona de crecimiento humano recombinante se libera fácilmente de Escherichia coli
por tratamiento con hidróxido sódico a pH: 11. El tratamiento con solventes orgánicos es
un tratamiento sencillo y barato que se utiliza en el aislamiento de enzimas en levaduras.
No obstante, se corre el riesgo de que el tratamiento desnaturalice las proteínas por lo
que se debe chequear con antelación. Los detergentes permeabilizan las células
bacterianas al solubilizar las membranas celulares. Como consecuencia de esta actividad
se originan agujeros por los que salen al exterior las proteínas y otras moléculas.
desgraciadamente los detergentes son caros, desnaturalizan la mayoría de las proteínas y
a menudo aparecen como contaminantes en el proceso subsecuente de purificación. Para
la extracción de células de levadura se utiliza la plasmólisis que se consigue mediante la
adición de una concentración alta de cloruro sódico.

2.- Métodos biológicos

Se utiliza la lisis enzimática. Por ejemplo, la pared celular de las bacterias Gram + se
hidroliza con el enzima lisozima que se aisla de la clara de huevo. La pared celular de
las bacterias Gram - se hidroliza con lisozima y EDTA. La pared celular de las levaduras
se hidroliza con una combinación de uno o más de los enzimas β (1,3)-glucanasa, β
(1,6)-glucanasa, mananasa y quitinasa. Los tratamientos enzimáticos son muy
específicos y las condiciones para la lisis son suaves. En la actualidad, los costes limitan
el uso de los enzimas como agentes líticos celulares en la industria. Una variante que se
utiliza en levaduras es la autolisis en la cual los enzimas autolíticos endógenos de las
levaduras llevan a cabo la destrucción de su propia pared celular. La adición de cloruro
sódico, acetato de etilo o cloroformo y la incubación durante 24h a 45°C aumenta la
velocidad del proceso autolítico.
3.- Métodos físicos
La desintegración por ultrasonidos se utiliza ampliamente en el laboratorio, pero debido
a su alto coste no es adecuada para procesos a escala industrial. Otro método físico
incluye repetidos ciclos de congelación y descongelación pero en este caso muchas de
las células permanecen intactas. Industrialmente los métodos físicos más empleados de
desintegración celular suponen la acción mecánica. Los molinos de bolas llevan a cabo
la ruptura de las células mediante la acción de bolas de vidrio. Las células y las bolas de
vidrio se mezclan juntas y se someten a una alta velocidad de mezclado en una vasija de
reacción. La ruptura se produce cuando una bola de vidrio fuerza una célula contra las
paredes de la vasija. Con este método se consigue una velocidad máxima de ruptura de
aproximadamente el 80% de las células. Otro enfoque es el uso de homogeneizadores.
En tales artilugios el material biológico se coloca bajo una fuerte presión hidrostática
(alrededor de 500 atmósferas) y la presión se libera bruscamente permitiendo que el
líquido salga por una válvula, lo que ocasiona la lisis celular.

C. Métodos de aislamiento
Una vez que se han lisado las células, los restos celulares se retiran bien por
centrifugación de gran capacidad a baja velocidad o por filtración en membrana. Al final
obtenemos un líquido libre de células que es el que sufre los tratamientos posteriores
para aislar y en su caso purificar el producto de interés.

1.- Cromatografía
Algunas de las etapas más caras en la recuperación del producto implican el uso de
métodos cromatográficos. Tales métodos son de especial valor para la purificación de
materiales biológicos sensibles y encuentran un amplio uso en la preparación de
materiales farmacéuticos, reactivos de diagnóstico y reactivos para investigación. Los
distintos métodos cromatográficos que existen según su mecanismo de separación son:
filtración en gel (peso molecular), cromatografía de adsorción (interacciones
hidrofóbicas), cromatografía de intercambio iónico (carga), cromatografía de afinidad
(actividad biológica) y electroenfoque (punto isoeléctrico).

2.- Extracción
La extracción, cuando se aplica a los bioproductos, tiene tanto la función de separación
como la de concentración. El caldo acuoso de fermentación que contiene el producto
deseado se mezcla con un solvente inmiscible en el que se disuelva preferentemente y
del que pueda ser más fácil y específicamente recuperado. Una vez se ha concentrado el
producto deseado en la fase solvente puede ser adicionalmente purificado. La extracción
con solventes ha sido utilizada ampliamente en la industria de antibióticos, como la
penicilina, utilizando solventes como el acetato de amilo o de butilo. Para la separación
de enzimas en estado activo no pueden ser utilizados los solventes orgánicos pero sí
pueden ser utilizados sistemas acuosos en fase múltiple preparados en una solución de
sales con polímeros hidrofílicos (polietilenglicol-dextrano). En ambas fases el agua es el
componente principal, pero ambas fases no son miscibles por lo que los enzimas pueden
separarse fácilmente sin pérdida de actividad.

3.- Cristalización y precipitación

La cristalización a baja temperatura es una forma muy suave de purificación. La
cristalización se utiliza principalmente para la purificación de compuestos de bajo peso
molecular, como los antibióticos. Por ejemplo, la Penicilina G es generalmente extraída
del caldo de fermentación con acetato de butilo y cristalizada por adición de acetato
potásico en solución etanólica.

4.- Desecación
El secado del material biológico es en muchos casos el método final por el que los
productos son llevados a una forma estable adecuada para su manejo y almacenamiento.
La sensibilidad al calor de la mayor parte de los productos biológicos significa que los
únicos métodos que pueden ser utilizados son los que conducen a la eliminación de agua
con elevación mínima de la temperatura. En algunos casos, la termoestabilidad de los
productos, como enzimas o preparaciones farmacéuticas, es mejorada por la adición de
azúcares u otros estabilizantes inertes. La liofilización es el método de desecación más
suave debido a que el agua es sublimada a partir de una masa congelada. Muchos
productos farmacéuticos son liofilizados como vacunas, fracciones de plasma, hormonas
y preparaciones de enzimas, así como ingredientes muy lábiles y caros para diagnosis.
También se utiliza la liofilización cuando el producto final es un cultivo microbiano
vivo (cultivos para inoculación en las industrias lácteas).

D. Rendimiento
Las pérdidas en la recuperación dependen de la sensibilidad de las sustancias al proceso
y del número de etapas de purificación. El promedio de pérdidas atribuidas a la
purificación está en torno al 20% pero en casos extremos, con ciertos tipos de
metabolitos intracelulares, puede llegar a ser el 90%. En la transparencia se muestran los
datos para la purificación de ácido glutámico donde se observa la extensión en la que
deben ser combinados y optimizados los métodos de recuperación. El rendimiento final
es sólamente un factor, ya que el coste de los productos químicos, el equipo y los
salarios deben ser considerados en el cálculo global.