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Producción de etanol a partir de saccharomyces

cerevisiae inmovilizada en alginato de calcio

Gabriel Pataquiva, Paula Bravo

a
Universidad de La Sabana, Facultad de ingeniería,

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RESUMEN
ABSTRACT

In this laboratory practice, the production of ethanol was carried out using Sacharomyces cerevisiae immobilized in calcium alginate.
This is a type of unicellular fungus or a type of yeast used industrially in the manufacture of beer, wine and bread. Therefore, our
main objective was to determine the yield in the production of ethanol from glucose using immobilized Sacharomyces cerevisiae,
likewise, we performed the determination of reducing sugars by means of dinitrosalicylic acid (DNS), for this, we had to perform two
curves, a standard for the DNS, and the calibration curve for ethanol, with refractive indexes. On the other hand, the cellular
immobilization was performed by entrapment, which means that the organisms were placed in polymeric matrices, so that the
fermentation does not require a centrifugation or filtration stage; this was done by dripping a 3% weight-volume calcium alginate
solution in a refrigerated 0.1 M calcium chloride solution. Finally, a concentration of sugars was obtained between a range of 2.42
and -0.210 and was carried out a cell count in the Neubauer chamber, obtaining the number of cells per unit, as a result it gave 1.96 x
10 6.
Keywords: Sacharomyces cerevisiae, alginato de calcio, Cámara de Neubauer, Fermentación alcohólica, etanol, atrapamiento.
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2
1. INTRODUCCIÓN pone un portaobjetos con la suspención bajo un microscopio
óptico, de acuerdo a la división de celdas se hizo el correcto
Las levaduras son microorganismos de verdadera importancia
conteo de las celdas de las 4 esquinas del medio. (Cañedo, V.
para la vida diaria, pues son muy usados a nivel industrial,
Ames, T. 2004).
porque muchas de sus especies pueden convertir,
principalmente, azúcares en alcohol etílico y dióxido de
2. Metodología
carbono. Varias de las aplicaciones más importantes que tienen Se preparó una solución de 50mL de alginato al 3% y se agregó
estos organismos, es su participación en la producción de el alginato lentamente al agua para evitar la formación de
cerveza, vino, alcohol industrial, glicerol y vinagre. La levadura grumos, para realizar una esterilización en calentamiento a baño
también se utiliza como alimento animal y humano, debido a su maría por 20 minutos y dejar en reposo esta solución a
alto contenido de proteínas. (Hernandez, A. 2000) temperatura ambiente.
Se pesó 1,5g de levadura para suspenderlos en 25 mL
La fermentación alcohólica se realiza a partir las
de agua destilada y mezclarla con la solución de alginato, se
levaduras que obtienen energía disociando las moléculas de tiene que hacer con una jeringa de manera lenta sin generar
glucosa y generan como desechos alcohol y CO2. La levadura ningún tipo de grumos, se realiza al lado de un mechero para
Saccharomyces cerevisiae es una de las especies más utilizadas poder evitar contaminación de la mezcla, esto se realiza en la
en la elaboración en masa pues después de un tiempo de solución de cloruro de calcio a 0,1M en agitación, mientras
reacción óptimo es posible alcanzar un rendimiento del 90% tanto se depositan 10 gotas de alginato en 10 mL de solución
para la generación de alcohol. salina para luego transferirlo a un balón aforado de 25 mL y
llevar hasta el aforo con solución salina, con esto se realiza el
En cuanto a la concentración de sustrato, es muy
conteo celular en la cámara de Neubauer
importante este factor, ya que si es muy alta, aumenta consigo la Cuando se formen las esferas en el cloruro de calcio, se
cantidad de azúcares, lo que produce que la velocidad de la retiran de la solución por un colador al lado del mechero,
reacción del proceso de fermentación sea menor, al momento de recordando que esta esterilizado para llevarlas a un Erlenmeyer
trabajar con una concentración de sustrato elevada, se ve una con desprendimiento que contenga 100 mL de medio de cultivo
notoria deficiencia en la producción de alcoholes, es por esto, estéril.
que se necesita mantener una especie de equilibrio en las Se tomó una muestra de 1 mL para medir los azucares
reductores y la concentración de etanol cada dos horas alrededor
concentraciones de cada especie involucrada. (García, M.
de un día y al terminar este tiempo se tomó la solución de
Quintero, R. López, A. 2004) hidróxido de calcio y se filtró. Se colocó en el horno para poder
Otros de los factores muy importantes para llevar a determinar la cantidad de carbonato de calcio.
cabo la fermentación, son las condiciones de temperatura y ph
óptimo, en cuanto a la temperatura en que el proceso tiene el 2.1 Determinación de azúcares reductores por medio de
mejor desarrollo y donde se encuentra el punto máximo de DNS
producto, será entre 15 y 20ºC. Con el aumento de la Se preparó la curva estándar con 6 tubos de ensayo
temperatura, disminuye el poder fermentativo, puede disminuir con las cantidades que aparecen en la tabla 1
la obtención de alcohol, crecer infecciones bacterianas o hasta la B 1 2 3 4 5 6
muerte de la levadura. (Valderrama, O. 1999). De igual forma, a Solución B
- 25 50 75 100 125 150
(µl)
bajos valores de pH, el cultivo bacteriano puede tener las
Agua
mismas consecuencias explicadas anteriormente, si no se
destilada 500 475 450 425 400 375 350
encuentra en un valor óptimo, en caso de cultivos bacterianos de (µl)
levadura, es correcto decir que crecen en un intervalo de pH de
Volumen
3 a 6. (Galvis, M. 2009). 500 500 500 500 500 500 500
final (µl)
De acuerdo a la inmovilización de células para un
proceso de fermentación alcohólica, se realiza estratégicamente Concentraci
- 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
ón (mg/ml)
ya que uno de los problemas al hacer esta reacción es la pérdida
que de biomasa que se genera después de concluido el proceso, Tabla1: Datos para realizar la curva estándar
entonces, para poder recuperar algo de lo perdido, se
inmovilizan algunas células de distintas maneras, mediante Con estas muestras tomadas con diferentes tiempos se cogen
50µl de cada solución y se colocan en tubos de ensayo para
método de absorción, entrecruzamiento, atrapamiento, adicionar 450µl y después DNS en cantidad de 500µl, luego de
microencapsulación y enlace covalente. (Fajardo, R. 2011), El realizar esto se sometió a baño María y posterior a un baño de
alginato de calcio es uno de los factores para lograr lo anterior hielo por 5 minutos. Se adiciona 5 mL de agua destilada para
dicho, para procesos de inmovilización, este fue el agente que se dejarlos en reposo y leer la absorbancia.
usó en el presente laboratorio con ese fin,
Para realizar el respectivo conteo celular, es necesario el 2.2 Curva de calibración de etanol mediante determinación
de índice de refracción
uso de una cámara de Neubauer, que consiste en contar la
cantidad de células de una manera más fácil y eficaz, donde se
Para la realización de la curva de calibración del
índice de refracción en función de la concentración
 3
de etanol se preparan las siguientes soluciones según
la tabla 2, posteriormente se midió el índice de
refracción
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
(µl)Agua destilada (µl)Etanol

100

120

140

160

180

200
20

40

60

80
0
1000

980

960

940

920

900

880

860

840

820

800
Grafica 1: Absorbancia vs concentración de fosforo

Por medio de la grafica se puede obtener la ecuación de la recta la cual

%v/v

10%

12%

14%

16%

18%

20%
es la siguiente:
2%

4%

6%

8%
0

Y = 0,0006x + 1,3333
Tabla2: Datos para realizar la curva de calibración de etanol Donde “y” representa el índice de refracción y “x” la concentración de
mediante los índices de refracción Etanol

3. RESULTADOS 3.2 Determinación de la concentración de Etanol

3.1 Curva de calibración etanol Los datos obtenidos fueron los siguientes:
Para la curva de calibración se tomaron los índices de refracción
a diferentes concentraciones de etanol, todo esto para saber cuál fue
la concentración de etanol presente en la muestra a diferentes Muestra Grupo
tiempos de fermentación. Los datos obtenidos de todos los grupos
haciendo el ejercicio en el laboratorio fueron los siguientes, 1 1,3412 1,397 1,3474 1,3423 1,346
Sl [] Índice de refracción 3 1,3338 1,3338 1,3338 1,3338 1,3476
n (v/v)
G. 1 G. 2 G. 3 G. 4 G. 5 G. 6
5 1,3414 1,3469 1,3473 1,3425 1,3476
1 0 1,3336 1,3335 1,3335 1,3335 1,3334 1,3335
2 2 1,3345 1,3344 1,3350 1,3345 1,3344 1,3345 7 1,3402 1,3461 1,3471 1,3405 1,3462

3 4 1,3349 1,3353 1,3358 1,3355 1,3354 1,3355 11 1,3413 1,347 1,3471 1,3338 1,3473
4 6 1,3364 1,3364 1,3360 1,3365 1,3362 1,3362
12 1,3412 1,3471 1,3471 1,3422 1,3471
5 8 1,3376 1,3374 1,3362 1,3376 1,3375 1,3379
6 10 1,3387 1,3376 1,3366 1,3387 1,3388 1,3394 Tabla 4: Indices de refracción obtenidos en diferentes tiempos

7 12 1,3393 1,3403 1,3371 1,3398 1,3391 1,3406 Con estos índices de refracción se pueden hallar las diferentes
concentraciones presentes en la fermentación a cada tiempo
8 14 1,3410 1,3413 1,3396 1,3410 1,3407 1,3426 reemplazando en la ecuación hallada con la curva de calibración y de
9 16 1,3424 1,3427 1,3414 1,3423 1,3416 1,3437 acuerdo a la tabla expuesta anteriormente, se logra graficar el
comportamiento que tiene el cambio en cuanto a la concentración de
10 18 1,3435 1,3444 1,3425 1,3431 1,3434 1,3444 etanol en el tiempo, de la siguiente manera.
11 20 1,3452 1,3459 1,3451 1,3448 1,3439 1,3449
Tabla3: datos de índice de refracción y concentración para la
curva de calibración de todos los grupos del laboratorio.
Los datos expuestos en la tabla anterior, correspondiente a la
número 3, son respectivamente:
Grupo 1, Karla y Jeni, grupo 2, Felipe y Lorena, grupo 3, Juliana
y Sofía, grupo 4, Nicolás y Julián, grupo 5, Mariana y Juan Manuel
y por último grupo 6, Gabriel y Paula. Para la realización de la
curva de calibración se procede a hacer un cálculo del R cuadrado
de cada uno de los datos por grupo, verificando cual de estos
presenta una tendencia lineal más cercana a 1, los cuales dan como
resultado, los datos del grupo número 4, como se muestra a
continuación.
4
Tiempo concentración

0 0,37765658

1 0,37174104

2 0,01320175

3 0,36063138

5 0,34908886

7 0,34331761
G
ráfica 2. Cambio de la concentración de etanol con respecto al tiempo. 21 0,32600384

3.3 Determinación de azucares reductores por medio de ácido Tabla7: Datos obtenidos de la absorbancia con su respectiva
dinitrosalicílico (DNS): concentración
La cuantificación de los azucares reductores se puede evidenciar en
como estos reaccionan con el DNS para generar 3-amino-5-
nitrosalicílico, para esto se obtuvieron los siguientes resultados.

Muestra [ ] Absorbancia

B - - - - - - -

1 0,2 0,09 0,119 0,129 0,045 0,124 0,100

2 0,4 0,191 0,238 0,131 0,203 0,197 0,210

3 0,6 0,325 0,357 0,365 -0,093 0,252 0,256

4 0,8 0,435 0,553 0,450 0,150 0,366 0,377

Grafica 4: Tiempo vs concentracion.
5 1 0,542 0,586 0,345 0,554 0,508 0,517
Analizando las concentraciones obtenidas se puede inferir que
6 1,2 0,666 0,698 0,957 0,070 0,588 0,541
hay una disminución en la concentración de los azucares, esto es
Tabla 6: Absorbancias obtenidas de todos los grupos del normal puesto que la glucosa que es el sustrato de la reacción se
laboratorio a diferentes concentraciones. consume para producir el etanol, es por esto por lo que en el
análisis del etanol se puede evidenciar este comportamiento.
Según (Morales,2014), “la disminución de concentración de los
azucares se disminuye en una proporción mayor con respecto a
la producción de etanol”

Ya con esto se puede sacar el rendimiento de la reacción de la

producción de etanol:

% rendimiento = (Rendimiento real / Rendimiento teórico) x

100

Se debe sacar el rendimiento teórico y se debe tener en cuenta

Grafica 3: Curva de calibración patrón de absorbancias. que la práctica se hizo uso de un cultivo estéril que contenía
100g/L de glucosa y la producción de etanol se da por la
Por medio de la gráfica se puede obtener la ecuación de la recta siguiente reacción
la cual es la siguiente:
C6H12O6 → 2C2H5OH + 2CO2 + ENERGÍA
Y= 0,5576x + 0,0295
Los cálculos son los siguientes;
Con la ecuación de la recta anteriormente expresada, se pueden
obtener los datos de la concentración de glucosa presente en
cada tubo.
x x

= 1,11015 mol de etanol
El rendimiento real es calculado gracias a la cantidad de calcio
obtenido.
En la práctica, lo que se midió fue la producción de Carbonato
de Calcio, es posible determinar la cantidad de CO2 y con ello la
cantidad de etanol, este valor corresponde a la cantidad real de
Etanol, los cálculos realizados para encontrar dicho resultado es
el siguiente:
La cantidad de carbonato de calcio obtenido es
= 0,2641 g de carbonato de calcio
Con este dato se calcula los gramos de carbonato de calcio con
una relación estequiométrica, lo cual permite calcular la
cantidad de dióxido de carbono
0,2641g de CaCO3 x (1 mol CaCO3/ 100,0869g CaCO3) x (1
mol CO2 /1 mol CaCO3)
= 0,002639 moles de CO2 y como se relaciona
estequiométricamente con el etanol, esas mismas moles son las
del etanol
Entonces el rendimiento es
% rendimiento = (rendimiento real / rendimiento teórico) X 100
= % de rendimiento = (0,002639mol C2H5OH / 0,1110
C2H5OH) X 100
= % de rendimiento = 0,02377 X 100 = 2,3774%
Relacionando teóricamente es que se reporta que por cada
gramo de glucosa transformada se obtiene 0,511g de etanol y
0,489g de CO2 y que el rendimiento experimental varía entre el
90% (Vázquez y Dacosta, 2007)
Material Peso (g)
Vidrio de reloj + papel filtro 44,1472
Peso total con CaCO3 44,4113
Tabla 8: Pesos de material y carbonato de calcio obtenido.
3.4 Conteo celular en cámara de Neubauer.
Con el objetivo de describir la cantidad de células atrapadas por
medio del alginato de calcio, que corresponde a un medio de
inmovilización, el cual evita la pérdida de biomasa a la hora de
finalizar una fermentación (Sossa, U. 2008),
El procedimiento es media una cámara de Neubauer, donde se
ve algo como esto cuando se quiere comenzar a hacer el conteo,
Imagen 1. Celdas sin zoom de la cámara de Neubauer.
5
Se utiliza la cámara de Neubauer, obteniendo los siguientes
resultados:
células /mL = (# CÉLULAS CONTADAS *10000 ) /
(Factor Dilución * # DE CUADROS CONTADOS)
Número de células contadas en las 6 áreas en total, es de 45,
Factor de dilución = 0,1
Células / mL = 2500 X 45 X 0,1 = 11250.
4. Conclusiones
 La producción del etanol es mucho mayor cuando en el
proceso mismo se utiliza la inmovilización de células ya que
esto alteró la composición de las células de la levadura por la
interacción con el soporte lo que aumentó la velocidad en el
proceso
 Las variables que afectan el proceso de fermentación se dan
en la inmovilización de las levaduras tanto como la
concentración, la temperatura, el sistema de cultivo cuando
hay altas concentraciones de glucosa actúa como un inhibidor
 La cámara de Neubauer permite hallar la concentración de
células en una suspensión celular
5. Referencias Bibliográficas
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Producción de Biomasa de Saccharomyces cerevisiae
empleada en la etapade Fermentación del Mosto de Cerveza,
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CYBERTESIS PERÚ
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numero-131/193-conociendo-las-levaduras.html
 Sossa, U. (2008). Inmovilización de Bacillus
licheniformis y Saccharomyces cerevisiae para la
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revistas.javeriana.edu.co/index.php/scientarium/article/
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VARIABLES CRITICAS, PARÁMETROS DE
CONTROL Y ANÁLISIS EN LOS PROCESOS
PRODUCTIVOS DE LA INDUSTRIA LICORERA
DE CALDAS. Retrieved from
http://bdigital.unal.edu.co/1045/1/marthaceciliaguevara
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 Sossa-Urrego, M. A.-A. (2008). Revistas javeriana.
Obtenido de
http://revistas.javeriana.edu.co/index.php/s
cientarium/article/view/1419/4440
 Franca, Lopes, & Vasconcelos. (2004). Continuous
ethanol production using yeast immobilized on sugar-
cane stalks. Rio de Janeiro: Brazilian Journal of
Chemical Engineering
6
 Matiz, Torres, & Poutou. (2002). PRODUCCIÓN DE láctico, con propiedades semejantes a las del tereftalato de
ETANOL CON CÉLULAS INMOVILIZADAS DE polietileno (PET) que se utiliza para hacer envases, pero que
Zymomonas mobilis spp. Bogotá: Javeriana. además es biodegradable. Se degrada fácilmente en agua
y óxido de carbono. Los PLAs se producen mediante por
polimerización por apertura de los anillos de lactidas.
Cuestionario
1. Fermentación butírica: En esta fermentación no se necesita
oxígeno. Aquí se convierte glúcidos en ácido butírico por la
acción de bacterias.
2. Si existe y es muy importante debido a que es necesario
conocer las condiciones de la fermentación para decider la
naturaleza de la celula que se piensa emplear debido a que
algunas trabajan mejor de forma anaerobia.
3. Las condiciones anaeróbicas son fundamentales para poder
llevar a cabo el proceso. .
4. El ácido poliláctico o poliácido láctico (PLA) es
un polímero constituido por elementos similares al ácido
7
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