UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE

MÉXICO
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES IZTACALA

BIOMOLÉCULAS

GRUPO: 2254

Hernández Villa Karina Elizabeth

Herrera Cortés Mauricio
Franco Elizalde Ana Cecilia
Lara Romero Angélica del Rosario
Rojas Manzanares César Isaac

PRÁCTICA:

Cuantificación de proteínas: método Bradford

Separación de proteínas por electroforesis en geles

desnaturalizantes de poliacrilamida (SDS-PAGE)
INTRODUCCIÓN

El nombre de proteínas (del griego ​proteios​) significa ​el primero ​o ​en primer lugar ​y
deriva del hecho de que son las macromoléculas más abundantes en las células y
constituyen la mitad del peso seco de la mayor parte de los organismos. Las
proteínas se caracterizan por encontrarse en todas las células. Existen centenares
de tipos de proteínas diferentes, desempeñado una gran cantidad de papeles
biológicos, por formar parte de estructuras celulares y ser las herramientas
moleculares de un gran número de procesos (Oliver ​et al.,​ 2003).
El número de proteínas diferentes que se puede encontrar en una célula humana es
considerablemente elevado; por ejemplo, solo en el plasma sanguíneo pueden ser
identificadas más de 300. Algunas proteínas son sintetizadas o circulante en plasma
únicamente en determinados momentos del desarrollo o en circunstancias
fisiológicas particulares (Oliver ​et al.​, 2003).
Debido a la importancia de las proteínas se han utilizado diversas técnicas para su
estudio y determinación de concentración de proteínas totales; los métodos más
utilizados para determinar la concentración total de proteínas están los métodos
colorimétricos ya que son sumamente precisos siempre y cuando se tenga un
control adecuado.
Uno de los métodos colorimétricos más usados es el de Bradford. El ensayo abarca
varias preparaciones del tinte Coomassie Brilliant Blue G-250 utilizado para fines de
cuantificación de proteínas, y fue descrito por primera vez por Bradford en 1976. El
mecanismo básico del ensayo es la unión del colorante a pH ácido a arginina,
histidina, fenilalanina, triptófano y residuos de tirosina ( Moreno ​et al., 1986) e
interacciones hidrofóbicas (Fountoulakis et al., 1992).
Este método provoca un desplazamiento del máximo de absorbancia de este
compuesto, desde 465 nm a 595 nm.Por lo tanto las medidas de absorbancia del
complejo proteína-colorante se realizan a 595 nm. (Oliver ​et al.,​ 2003).
Para estudiar una proteína a detalle es necesario separarla del resto de las
proteínas y disponer de técnicas que permitan determinar sus propiedades. Los
métodos clásicos de separación de proteínas aprovechan propiedades que varían
de una propiedad a otra, entre las que incluye el tamaño, la carga y las propiedades
de unión (David L. Nelson ​et al,​ 2009)
La electroforesis consiste en la migración de moléculas cargadas a través de un
medio por la acción de un campo eléctrico. Estas técnicas tienen como fuerza
impulsor la generada por el campo eléctrico y como fuerza retardante la que puede
ejercer el medio contra el movimiento. De esta manera, las técnicas electroforéticas
se fundamentan en una velocidad de migración diferencial de las biomoléculas
cuando son sometidas a un campo eléctrico. Tanto la dirección como la velocidad
de migración de cada molécula dependen del signo y de la intensidad de la carga
que presenta, así como de las características del medio en el que migra. La técnica
se ha refinado de manera que ahora también se pueden diferenciar moléculas de la
misma carga al ser separadas por su tamaño en medios que permiten el cribado
molecular (Oliver ​et al.,​ 2003).

Objetivos
● Separar las proteínas totales aisladas de una muestra de sangre.

● Obtener la masa molecular relativa de una o varias proteínas seleccionadas.

Materiales y métodos
1. Separación de proteínas por electroforesis en geles
desnaturalizantes de poliacrilamida (SDS-PAGE)
a) Extracción de proteínas de sangre

El equipo se colocó guantes y bata, posteriormente se

procedió a obtener sangre, debido a que no se pudo obtener
sangre necesaria de la primera persona, se procedió a
obtener sangre de otro integrante del equipo, con una lanceta
estéril se obtuvieron aproximadamente 9 gotas de sangre, las
cuales se pusieron en un tubo eppendorf de 1.5 mL.
Se centrifugó a 14000 rpm durante, posteriormente se
tomaron 10 µL del sobrenadante y se colocó en un tubo
eppendorf limpio de 1.5 mL, ésta se colocó en hielo.
b) Muestra control (Albúmina sérica de bovino)
 En un tubo eppendorf limpio se tomaron 60 µL de la muestra
control (proteína pura) con 20µL de buffer de carga el cual
contiene azul de bromofenol.

Se incubó la mezcla a baño maría 90º C por 2 minutos.

c)​ S
​ eparación de proteínas por electroforesis

Se tomaron 60 µL de la muestra de sangre y se agregaron 20

µL de buffer de carga, se incubó a baño maría a 90º C por 2
minutos.
Una maestra auxiliar armó la cámara de electroforesis, se
llenó el tanque con buffer de corrida y se retiró el peine de los
geles.
Con una jeringa de vidrio se cargó 10 µL de nuestras
muestras (muestra de sangre y muestra control), la maestra
auxiliar cargó 10 µL del marcador de peso molecular.
Se cerró el tanque de la cámara y se dejó corriendo a 200 V y
60 mA hasta que en frente de corrida llegará a
aproximadamente 0.5 cm de la parte inferior del gel.
Al acabar la electroforesis se sacaron los geles de la cámara
de electroforesis se sumergió el gel en azul de Coomassie
R-250 0.1%- metanol 40%- ácido acético 10%, los profesores
calentaron los geles en un horno por intervalos de 10
segundos, 3 veces.
Para revelar, los profesores sumergieron los geles en un
metanos 40%, ácido acético 10%. Lo calentaron en un horno
por intervalos de 10 segundo hasta que las bandas fueran
visibles.

2.​ C
​ uantificación de proteínas por método de Bradford

Se prepararon 7 tubos agregando los reactivos de la siguiente tabla:

 Se mezclaron bien cada uno de los tubos y posteriormente se
colocaron las soluciones en 7 cubetas para espectrofotómetro y se
calibraron en el espectrofotómetro con el blanco a 595 nm, se midió
la absorbancia y se tomó notas de los resultados arrojados por el
espectrofotómetro.

Resultados
CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS MÉTODO DE BRADFORD

Figura 1. Curva patrón de Albúmina

En la gráfica se observa la relación entre la concentración de Albúmina (​µg)

con respecto a la Absorbancia que se obtuvo mediante espectrofotómetro.
Como R² es mayor que 0.80 nuestra ecuación es apta para fines predictivos
 y con ella se determinó la concentración de Albúmina en la muestra
problema y en 0.1 mL de la misma que se presenta a continuación:

a)​ C
​ oncentración de albúmina en 0.1 mL de muestra =492.66 µg

b)​ C
​ oncentración de albúmina en la muestra problema(30​μL)​ =14.78

µg

SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS POR ELECTROFORESIS EN GELES DESNATURALIZANTES DE 

POLIACRILAMIDA (SDS-PAGE) 

Figura 2. Gel de poliacrilamida con muestras de sangre y albúmina.

En la figura se observa el gel de poliacrilamida con las muestras de albúmina

(carril 4) y sangre (carril 8), en comparación a los marcadores (carril 5).

Tabla 1. Resultados obtenidos del gel de poliacrilamida.

La tabla 1 muestra los datos obtenidos en las distancias de migración
tanto de las proteínas estándar (marcadores) y de las proteínas
desconocidas (proteínas identificadas en el gel de la muestra de sangre),
valor del log del tamaño de cada una de las muestras estándar así como
el valor aproximado del tamaño de cada una de las muestras
desconocidas.

Figura 3. Regresión lineal de Log10(peso molecular) vs Log10 (distancia recorrida)

En la gráfica se observa la relación entre el peso molecular y las distancia recorrida

de las proteínas estándar, obteniendo una regresión lineal la cual indica los valores
del tamaño de las muestras desconocidas a través de una interpolación, al tener
una R² de 0.96 indica que nuestra ecuación es apta para fines predictivos.

Discusión

A)​ C
​ uantificación de proteínas por método de Bradford

La ecuación de la curva de calibración de Albúmina (μg/ml) contra

absorbancia (nm) posee un coeficiente de determinación del 93% los
que nos sugiere que la variación de la absorbancia está en función de
la presencia de albúmina y además como la calidad de ajuste R² es
mayor que 0.80 nuestra ecuación es adecuada para
 determinar concentraciones de albúmina en las muestras problema, es
decir, próximas predicciones.A su vez indica que hubo un buen
manejo en el pipeteo. Por lo tanto la concentración calculada en
muestra problema deberá ser precisa.

B) S
​ eparación de proteínas por electroforesis en geles desnaturalizantes de

poliacrilamida (SDS-PAGE)

La ecuación de la regresión lineal de los logaritmos del Peso Molecular

(kD) contra los logaritmos de la distancia recorrida (cm) posee un
coeficiente de correlación del 96% la cual puede ser usada con fines
de predicción para así obtener los Pesos Moleculares relativas de las
proteínas desconocidas basados en la distancia recorrida de cada una
y una banda estándar (CSL-BBL Prestained Protein Ladder®)
(Apendice)

De acuerdo con los valores obtenidos con la ecuación de regresión

lineal en la banda problema 1 (sangre) y en la banda problema 2
(Albúmina Sérica de Bovino) se determinó que las proteínas presentes
en la muestra de sangre es la Ovalbumin (45 kD) al tener una similitud
en el peso de 54.50 kD (Tabla 1) y en la banda problema 1 también se
presenta la Anhidrasa carbónica (30 kD) similar al peso de 25 kD
(Tabla 1). Incluso la phophorylase b(97 kD) podría estar en la muestra
siendo similar al peso de 89.5 kD (Tabla 1).

Existieron errores al cargar la muestra de albúmina en el gel, por lo

cual no existió una diferencia con la muestra de sangre y se
distinguieron las mismas proteínas en ambas muestras. (Figura 2)

Conclusiones

Se cuantificó el contenido de la muestra problema a través del método de

Bradford obteniendo 14.78 ​μg​ en 30 μ
​ L​ y 492.66 ​μg​ en 1 ml. (Figura 1) 
Se identificaron los pesos moleculares de varias proteínas en la 
muestra problema, identificando O ​ valbumina (45 kD), la Anhidrasa
carbónica (30 kD) y la phophorylase b(97 kD), siendo similares a lo pesos
moleculares de las proteínas desconocidas en la muestra.

Se separaron las proteínas totales de la muestra de sangre (Carril 8)

(figura 2) y no se separaron las proteínas totales de la muestra de
albúmina (carril 4) (Figura 2).

Bibliografía

·​ Stoscheck CM. Quantitation of Protein. 1990. Methods in

​

Enzymology 182, 85 p.

·​ Moreno, M. R., Smith, J. F., and Smith, R. V. (1986).

​

Mechanism studies of coomassie blue and silver staining of

proteins. J. Pharm. Sci. 75, 907–911.

·​ Fountoulakis, M., Juranville, J. F., and Manneberg, M. (1992).

​

Comparison of the Coomassie brilliant blue, bicinchoninic acid

and Lowry quantitation assays, using nonglycosylated and
glycosylated proteins. J. Biochem. Biophys. Methods 24,
265–274.

·​ David L Nelson, Michael M Cox, Lehninger, principios de

​

bioquímica, quinta edición, 2008, 85 p.

·​ Oliver, J., Roca, P., Rodríguez, A. M. (2003). ​Bioquímica:

​

Técnicas y Métodos.​ Departamento de Biología Fundamental y

Ciencias de la Salud, Facultad de Ciencias, Universidad de las
Islas Baleares. Editorial Hélice. España. Pp. 149-148, 158

Apéndice