TECNICAS DE RECOMBINACION DE ADN

Transformación por electroporación

Esta técnica se basa en la permeabilización relativa de las biomembranas

inducida por campos eléctricos de alta intensidad y corta duración. Los
primeros ensayos de electroporación se realizaron en células de ratón
deficientes en timidina cinasa (Neumann et al. 1982). Posteriormente se
realizaron ensayos en la cepa de E. coli K12 con la inserción del plásmido
pUC18. La optimización de este protocolo permitió la obtención de 5x109
transformantes por µg de ADN. Esta elevada eficiencia ha convertido la
electroporación en el método de rutina para la transformación de cepas de
E. coli en la gran mayoría de laboratorios del mundo. (Calvin y Hanawalt.
1988). En forma general el funcionamiento de un equipo de electroporación
se basa en la descarga de un capacitor que produce el campo eléctrico
requerido. Este campo eléctrico de duración de apenas unos 10 µs genera
poros instantáneos en la célula y permite el paso del ADN. Un capacitor es,
en breves palabras, un dispositivo de dos placas paralelas que permite el
almacenamiento de corriente eléctrica. El capacitor utilizado en las
diferentes marcas comerciales tiene una capacidad de almacenamiento
entre 2 y 1000 µF y utiliza voltajes entre 200 y 2000 voltios. La carga eléctrica
almacenada es liberada de manera casi inmediata a través de un
interruptor electrónico. El mecanismo de transferencia no está plenamente
comprendido. Una de las hipótesis en torno al proceso de captación en
células de mamífero se muestra en la figura 1. La acción del campo eléctrico
sobre la superficie celular genera una conductividad y una tensión eléctrica
que terminan por romper de manera reversible la membrana (Imai e Isaka.
2002). Al mismo tiempo las cargas electrostáticas ocasionan que las hebras
de ADN se adhieran a la superficie, de tal modo que al ocurrir los
rompimientos de dicha superficie, el ADN puede pasar al interior de la
célula.
Transformación por biobalística.

Este método fue diseñado para realizar la transformación de especies

vegetales en las cuales no existía la posibilidad de transformación por
Agrobacterium. La inserción de partículas por bombardeo ofrece un
método rápido de insertar ADN tanto para expresión transitoria como para
lograr una transformación estable. El principal beneficio de este método es
que puede utilizarse tejido intacto, sin someterlo a procesos de degradación
de la pared celular y sus consecuencias. La mayoría de los protocolos de
biobalística utilizan el mismo principio para la aceleración de partículas y su
inserción en el tejido blanco, es decir una fuerza generada por explosión o
expansión de un gas impulsa un transportador, que contiene las partículas a
liberar a través de un canal. De tal manera que el transportador al finalizar
su deslizamiento queda sujeto al equipo que lo impulsa mientras las
partículas son dirigidas hacia el tejido. Esta fuerza puede ser generada por
una pistola calibre 22 adaptada, una descarga de alto voltaje, expansión
acelerada de aire comprimido o helio. La muestra suele colocarse entre 6 a
10 cm del punto de liberación de las partículas. En la actualidad los equipos
de biobalística comerciales utilizan helio para generar la fuerza necesaria
para impulsar las partículas (Sunagawa et al. 2007. Herzog et al. 1996. Lorito
et al. 1993. Finer et al. 1992). Entre los parámetros a estandarizar en estos
modelos se encuentran la cantidad de inóculo, la presión de helio, la
distancia entre la liberación de laS partículas y el objetivo, el tipo de
transportadores a utilizar y el diámetro de los microproyectiles.
Transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens.

Agrobacterium tumefaciens es una bacteria fitopatógena, gram-negativa,

que puede transferir e integrar parte de su ADN plasmídico en el genoma
del organismo susceptible a infección. Las secuencias de inserción (T-ADN)
se encuentran localizadas en un plásmido “inductor de tumores” (Ti, por su
abreviatura en inglés). De manera natural, la región TADN que es transferida
a las células de la planta contiene genes que codifican hormonas vegetales
que son las causantes de la formación de tumores. También contiene
secuencias para la producción de moléculas llamadas octopinas o
nopalinas, que sólo pueden ser utilizadas por las bacterias. El plásmido Ti
contiene otro segmento llamado región de virulencia, el cual está
conformado por un gran número de genes denominados vir (Zhu et al. 2000).
Las proteínas codificadas por la región de virulencia están involucradas en
la formación, transporte y la integración del T-ADN. La región T-ADN del
plásmido está delimitada por bordes repetidos de 24 pb, lo cuales son la
señal de activación para el sistema de transferencia a las células de la
planta (Lacroix et al. 2008). La capacidad que tiene esta bacteria para
insertar genes en los genomas vegetales abrió la posibilidad de obtener las
primeras plantas transgénicas. La región T-ADN fue modificada para que en
lugar de inducir la síntesis de compuestos benéficos para la bacteria se
transfirieran secuencias con genes reporteros. Estudios posteriores mostraron
que, bajo condiciones de laboratorio, la capacidad de dicha bacteria para
transferir parte de su ADN no está limitada al reino vegetal. Los organismos
susceptibles a infección por Agrobacterium tumefaciens incluyen levaduras,
hongos filamentosos y células humanas.