Informe de Microbiologia PDF

INFORME DE MICROBIOLOGÍA
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE
LEVADURAS Y BACTERIAS ACÉTICAS A
PARTIR DEL JUGO FERMENTADO DE LA
NARANJA VALENCIA
(Citrus sinensis)
Yesicka F. Sanabria
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS Y BACTERIAS

ACÉTICAS A PARTIR DEL JUGO FERMENTADO DE LA NARANJA VALENCIA
(CITRUS SINENSIS)
INTEGRANTES:
YESICKA F. SANABRIA
GRUPO: 48TGQID
INSTRUCTORA:
MAGALY SÁNCHEZ BENAVIDEZ
SERVICIO NACIONAL DE APRENDIZAJE, SENA

QUÍMICA APLICADA A LA INDUSTRIA
CENTRO DE GESTIÓN INDUSTRIAL
BOGOTÁ D.C.
2015
TABLA DE CONTENIDO
Pág.
INTRODUCCIÓN .................................................................................................... 4
1. OBJETIVOS ..................................................................................................... 5
Objetivo General ..................................................................................................... 5
Objetivos Específicos ............................................................................................. 5
3. MARCO TEÓRICO .......................................................................................... 6
2.1 Medios de Cultivo ............................................................................................. 7
2.2 Aislamiento de Microorganismos de Interés ...................................................... 7
2.3 Tinción de Gram o Coloración de Gram ............................................................ 8
2.4 Aislamiento por Estrías ..................................................................................... 9
2.5 Identificación de Microorganismos a partir de Pruebas Bioquímicas ............... 10
3. PROCEDIMIENTOS ...................................................................................... 11
3.1 Preparación de Medios de Cultivo................................................................... 11
3.2 Aislamiento de Microorganismos de Interés .................................................... 13
3.3 Tinción de Gram o Coloración de Gram .......................................................... 15
3.4 Aislamiento por Estrías ................................................................................... 17
3.5.1 Fermentación de azúcares........................................................................... 19
3.5.2 Tolerancia de Etanol .................................................................................... 21
4. RESULTADOS ................................................................................................ 22
4.1 Cálculos para Elaboración de Medios de Cultivo ............................................ 22
4.2 Cálculos para Aislamiento de Microorganismos de Interés ............................. 23
4.3 Caracterización de los medios de cultivo obtenidos ........................................ 24
4.4 Conteo de colonias ......................................................................................... 26
4.5 Identificación de Gram+ y Gram- ..................................................................... 26
4.6 Resultados de Aislamiento por Estrías ........................................................... 29
4.7 Coloración de Gram para Verificación de Pureza de Levaduras ..................... 30
2

4.8.1 Cálculos de Fermentación de azúcares ...................................................... 31
4.8.2 Cálculos de Tolerancia al Etanol ................................................................. 32
4.8.3 Resultados de Fermentación de Azúcares ................................................... 33
4.8.4 Resultados de Tolerancia al Etanol.............................................................. 35
5. ANÁLISIS DE RESULTADOS....................................................................... 36
6. CONCLUSIONES .......................................................................................... 37
7. BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................. 38
3
INTRODUCCIÓN
En este informe se abordará el aislamiento e identificación de las bacterias

adecuadas para la obtención de ácido acético a partir del jugo fermentado de
naranja valencia (Citrus sinensis), al cual se le realizaron varios cultivos de colonias
microbianas en varios niveles de disolución.
Con este fin se cultivaron los microrganismos en medios Agar-Agar GYC y Agar-
Agar YGC, además de determinar la UFC (Unidades Formadoras de Colonias) de
cada uno de los cultivos obtenidos, posteriormente se identificaron los
microrganismos de algunas de las colonias a partir de tinción o coloración de Gram,
a cada una de las disoluciones trabajadas. Para esto último se examinaron las
colonias por medio de microscopio electrónico y se tomaron fotografías como
evidencia del trabajo realizado obteniendo así Gram positivas y Gram negativas.
Como último procedimiento se realizaron pruebas bioquímicas: prueba de azúcares

y tolerancia de etanol las cuales permitirán conocer los microorganismos obtenidos.
Todo este trabajo con las colonias de microorganismos cultivadas se realiza con el
fin de aislar los microrganismos de utilidad para el proyecto de formación y bajo qué
condiciones se deben mantener para una mayor eficiencia y calidad en nuestro
producto final.
4
1. OBJETIVOS
Objetivo General
Conocer los procedimientos adecuados para el aislamiento e identificación de

levaduras y bacterias acéticas a partir de jugo fermentado de la naranja valencia
(Citrus sinensis).
Objetivos Específicos
 Preparar medios de cultivo para el desarrollo y crecimiento de

microorganismos de interés (levaduras y bacterias acéticas).
 Realizar aislamiento a partir de la caracterización macroscópica de los

microrganismos recuperados del fermento analizado.
 Caracterizar algunas colonias obtenidas en la preparación de medios de

cultivo y realizar el correspondiente conteo de acuerdo a las cantidades
halladas en la caja de Petri.
 Efectuar coloración de Gram para identificación de Gram positivas y Gram

negativas de acuerdo a las colonias ya caracterizadas.
 Aislar los microorganismos de interés a partir del método de aislamiento por

estrías.
 Hacer pruebas Bioquímicas a los microorganismos de interés como prueba

de fermentación de azúcares y tolerancia de etanol.
5
3. MARCO TEÓRICO
Los microorganismos como las Levaduras son organismos vivos microscópicos

unicelulares pertenecientes al reino de los hongos y al dominio eucariota, se
alimentan principalmente de azúcar produciendo fundamentalmente dióxido de
carbono y alcohol; su forma puede ser desde esférica, ovoide o alargada. Las
dimensiones varían entre 2 y 4 µm de ancho y 2 a 8 µm de largo, se encuentran
levaduras alargadas de 10, 15 o 25 µm de longitud. Poseen pared celular,
membrana fundamental, citoplasma y núcleo.
Imagen 1. Imagen de levadura Saccharomyces

cerevisiae. Tomada de google imágenes
Las levaduras son muy importantes debido a que contribuyen en la elaboración de

procesos fermentativos, Un ejemplo claro es la Saccharomyces cerevisiae que
es empleada industrialmente en la fabricación de pan, cerveza y vino. Se forma de
nutrición varía desde los carbohidratos hasta los aminoácidos. Entre los azúcares
que pueden utilizar están los monosacáridos como la glucosa, fructuosa y galactosa,
también puede emplear disacáridos como la maltosa y la sacarosa.
Para identificar una levadura se parte de cultivos puros, y se tienen en cuenta ciertas
características
 Morfológicas: Forma, medida, reproducción asexual

 Características de reproducción sexual
 Características fisiológicas y bioquímicas
Con lo anterior ya mencionado es necesario que los microorganismos para

reproducirse necesitan de medios de cultivo, ser aislados y a su vez identificados
por medio de pruebas de coloración como la Gram y pruebas bioquímicas como se
mencionarán a continuación.
6
2.1 Medios de Cultivo
Los medios de cultivo son soluciones compuestas por nutrientes específicos para
que así los microorganismos puedan desarrollarse en un laboratorio. La
composición precisa dependerá de la especie que se quiera cultivar, ya que las
necesidades nutricionales varían considerablemente. Se pueden clasificar de
acuerdo a su estado, complejidad, y aplicaciones.
En cuanto al estado se encuentran medios sólidos, semisólidos y líquidos, los

sólidos contienen una sustancia gelificante conocida como agar-agar, los
semisólidos contienen una menor concentración de agar-agar (0.5 a 0.7%) y los
líquidos no contienen agar-agar, debido a su naturaleza los medios sólidos o
agares se sirven en cajas de Petri mientras que los medios líquidos o caldos de
cultivo y los semisólidos se sirven en tubos de ensayo. Según las aplicaciones de
los medios de se clasifican en enriquecidos, selectivos, diferenciales. 1
Imagen 1. Medios de cultivo sólido

(Agar), tomada de google imágenes
Para la preparación de cultivos se requieren de ciertas condiciones generales tales

como la disponibilidad de nutrientes adecuados, la consistencia adecuada del
medio, presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases, condiciones adecuadas de
humedad, luz ambiental, pH, temperatura y esterilidad del medio.
2.2 Aislamiento de Microorganismos de Interés
Cuando se examina en el microscopio una gota de agua de lluvia, se observa una

gran variedad de microorganismos; algunos de ellos podrían ser útiles al hombre,
mientras que otros podrían ser patógenos. La separación de cada una de estas
variedades es lo que se conoce como aislamiento de microorganismos.
1Instructivopara la elaboración de medios de cultivo para el crecimiento de microorganismos de interés

biotecnológico práctica 1. Servicio Nacional de Aprendizaje. SENA, 2014.
7
Los microorganismos son ubicuos (pueden estar en cualquier lugar), gracias a esta
característica pueden colonizar cualquier ambiente, desde un rio hasta una
escultura de hierro, esa habilidad es debido a sus procesos metabólicos y sistemas
enzimáticos. Para aprovechar esas características de los microorganismos, en
beneficio de la industria y el medio ambiente, es de vital importancia poder aislarlos
de su medio natural y llevarlos a medios sintéticos para poder manipularlos en el
laboratorio.2
2.3 Tinción de Gram o Coloración de Gram
La coloración de Gram es un tipo de tinción empleado en microbiología que permite

diferenciar dos grandes grupos de bacterias: las Gram positivas aquellas que se
visualizan en morado y las Gram negativas aquellas que se visualizan de color rosa,
rojo o grosella según se comporten ante su tinción. El fundamento radica en la
diferente estructura de la pared celular de ambos grupos: la Gram positivas poseen
una gruesa capa de peptidoglicano mientras que las bacterias Gram negativas
poseen una capa peptidoglicano más fina y una capa de lipopolisacarídica externa.
Las bacterias Gram negativas pierden un colorante (el cristal violeta) con mayor
facilidad que las Gram positiva debido al grosor de la pared celular.
Imagen 2. Imagen de bacterias Gram

positivas (color morado) y bacterias Gram
negativas (color rosa). Tomada de google
imágenes
Para realizar la coloración de Gram son necesarios el uso de ciertos reactivos y

colorantes tales como: el cristal violeta, lugol, etanol y fucsina.
 Cristal violeta: Es un colorante primario de la coloración de Gram que se

adhiere a la pared de todas las células bacterianas, las Gram positivas absorben
este colorante debido al grosor de su pared celular y al porcentaje mayor de ácido
teicoico.
2Instructivopara la elaboración de medios de cultivo para el crecimiento de microorganismos de interés práctica

2. Servicio Nacional de Aprendizaje. SENA, 2014.
8
 Lugol: Es un compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de

potasio) y SI (siulterio), Cumple la función de fijar el colorante primario (cristal
violeta) en la preparación.
 Alcohol-cetona: Funciona para realizar la decoloración en este paso los

microrganismos Gram positivos no se decoloran mientras los Gram negativos si lo
hacen.
 Fucsina: Funciona como colorante de contraste, es el último compuesto que se

le adiciona a la coloración en Gram y en el cual se puede determinar las Gram
positivas y las Gram negativas de acuerdo al color y al contraste.
2.4 Aislamiento por Estrías
Una vez aislados los microorganismos e identificadas las colonias de interés, es

necesario realizar aislamientos que permitan obtener cultivos puros de los
microorganismos objeto de estudio. La técnica de aislamiento por estría o técnica
de siembra por agotamiento de colonias y la obtención de cultivos axénicos (una
sola especie microbiana proveniente de una sola célula) a partir de cultivos mixtos;
esta técnica diluye la muestra de microorganismos a partir del trazo de estrías
sucesivas sobre una placa de agar permitiendo el posterior crecimiento de colonias
totalmente aisladas. 3
Consiste en cargar el asa con la muestra y hacer estrías paralelas en la cuarta parte
de la superficie de la placa; se quema el asa, se enfría, se gira la placa a 90°c y se
vuelve a estriar tocando 3 o 4 veces el área sembrada inicialmente y cubriendo otro
cuarto de placa. Por último, sin quemar el asa, se estría el resto de la superficie sin
sembrar (Ver imagen 3).
Imagen 3. Imagen de procedimiento de

aislamiento de microorganismos por estrías.
Tomada de google imágenes
3
Instructivo para realizar la técnica de aislamiento por estrías práctica de laboratorio práctica 4.
Servicio Nacional de Aprendizaje. SENA, 2014.
9
2.5 Identificación de Microorganismos a partir de Pruebas Bioquímicas
La identificación microscópica y macroscópica de los microorganismos proporciona

una idea general acerca de la identificación de microorganismo, de hecho estas son
técnicas preliminares que permiten seleccionar pruebas de mayor especificad como
la realización de pruebas bioquímicas que dejan ver las características metabólicas
de los microorganismos frente a un compuesto específico; así como por ejemplo el
caso del género Saccharomyces, es necesario determinar las características de
asimilación y fermentación de diversos azúcares, así como la capacidad de
tolerancia al etanol y su reacción frente a la urea. 4
Las pruebas bioquímicas son un conjunto de reacciones que determinan la

actividad de una vía metabólica de la bacteria a partir de un sustrato de que se
incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no. Para
ello, hay que partir de un cultivo obtenido en el aislamiento, subcultivando de una
colonia bien aislada. La identificación de una especie requiere de estas pruebas. Es
aconsejable tener en cuenta:
 Cambios que se producen

 Reacciones químicas que se producen
 Enzimas que intervienen
 Productos intermedios
 Secuencia de las reacciones bioquímicas
 Prueba de Fermentación de azúcares: En esta prueba se determina si la

bacteria es capaz de fermentar un carbohidrato particular (producción de ácidos
acompañados o no de gases). Se aplica a bacterias con metabolismo fermentador,
ensayándose por separado con diferentes carbohidratos (glucosa, lactosa,
sacarosa, entre otras).
 Prueba de Tolerancia al Etanol: En este tipo de ensayo se determina si los

microorganismos obtenidos son resistentes al etanol y si son capaces de presentar
mayor rendimiento de este, ya que es una característica de las levaduras.
4
Instructivo para la identificación de microorganismos mediante pruebas bioquímicas práctica 5.
Servicio Nacional de Aprendizaje. SENA, 2014.
10
3. PROCEDIMIENTOS
3.1 Preparación de Medios de Cultivo
Observar la etiqueta de cultivo

deshidratado.
Realizar los cálculos de acuerdo

a las indicaciones de la etiqueta.
Para medio sólido (agar) se necesitan Para caldos de cultivo son necesarios
20mL del medio de cultivo. 10mL por tubo.
Pesar en un vidrio de reloj la cantidad de

medio requerida de acuerdo a los cálculos
realizados.
Medir con una probeta agua

desionizada para disolver el medio.
Disolver con agua el medio de cultivo

previamente pesado para lograr una
disolución eficaz.
Verter la mitad de agua desionizada en el

frasco de disolución y adicionar el cultivo, Rotular frascos
agitar y terminar de adicionar el agua.
Consultar en la etiqueta del medio

deshidratado si es necesario calentar
11
Si el medio que se prepara es un caldo de

cultivo antes de llevarlo al autoclave de servir
en tapas-rosca
Con ayuda del Beaker transferir 10mL

aprox. para cada tubo de ensayo.
Llevar el medio disuelto al autoclave y

esterilizar durante 15min a 15psi y 120°c
Una vez esterilizado el agar, sacar el

frasco y cerrar la tapa
Rotular cajas de Petri: nombre del medio,

fecha y grupo responsable
Servir en cajas de Petri estériles

acercando al mechero
Dejar solidificar el agar llevar a una

incubadora (37°- 48 horas)
Almacenar en refrigeración, las cajas de

Petri se deben agrupar y envolver en
papel vinipel
12
3.2 Aislamiento de Microorganismos de Interés
Pesar en un reloj de vidrio 10g de la muestra a

partir de la cual se aislaran los
microorganismos de interés
Adicionar los 10g de la muestra al frasco con

los 90mL de agua peptonada al 0.1% p/v
Homogenizar durante 5min, obteniendo la

dilución de 10-1
Realizar disoluciones seriadas a partir de la

disolución de 10-1 (ver imagen 4)
Tomar 1mL de la disolución de 10-1 y

suspender en 1 de los tubos con 9mL de agua
Agitar hasta homogenizar obteniendo la

disolución 10-2
A partir de la disolución 10-2 realizar la

disolución 10-3 y así sucesivamente hasta
llegar a la disolución 10-7
Sembrar 0.1mL de las disoluciones 10-4 a 10-7

sobre la superficie del agar específico
Homogenizar los 0.1mL sobre la superficie del

agar, empleando el asa de vidrio estéril
13
Homogenizar empezando por la caja donde se

sembró la mayor disolución
Dejar secar las cajas de Petri y llevar a la

incubadora
Seleccionar las cajas que tengan entre 30 y

300 colonias y realizar el recuento de todas las
colonias
Identificar las características morfológicas de

las colonias
Seleccionar aquellas colonias que

correspondan a las reportadas para el
microrganismo de interés
A las colonias seleccionadas realizar

identificación microscópica o enzimática
Imagen 4. Procedimiento de disoluciones. Imagen obtenida de google

imágenes
14
3.3 Tinción de Gram o Coloración de Gram
Tomar una lámina limpia, seca y estéril,

adicionar una gota de agua sobre esta
Con un asa esterilizada tomar un poco

del cultivo, colocarla sobre la lámina y
hacer un extendido sobre esta
Esperar a que seque a temperatura

ambiente y fijar pasando 5 veces la
llama del mechero
Adicionar 3-4 gotas de cristal violeta

sobre la lámina y esperar un minuto
Enjugar con agua
Adicionar 3-4 gotas de lugol sobre la

lámina y esperar un minuto
Enjugar con agua
Adicionar 3-4 de etanol sobre la lámina y

esperar 30 segundos
Enjugar con agua
Adicionar 3-4 de etanol sobre la lámina y

esperar 30 segundos
15
Enjugar con agua
Adicionar 3-4 de fucsina sobre la lámina

y esperar 1 minuto
Enjugar con agua
Esperar a que seque a temperatura

ambiente
Llevar al microscopio óptico y enfocar

primero en 4X
Adicionar una gota de aceite de

inmersión
Enfocar en 100X e identificar si son

Gram+ (moradas) o Gram-(rosa)
16
3.4 Aislamiento por Estrías
Tomar los cultivos mixtos donde se

encuentran los microorganismos de interés
Ubicar las colonias previamente

identificadas de acuerdos a identificación
microscópica y macroscópica realizada
Rotular base de la caja de Petri donde se

encuentra el medio de cultivo apto para el
crecimiento de microorganismo a aislar
Señalar el número de la colonia, la muestra

de donde proviene y la fecha
Esterilizar el asa recta hasta que tome un

color rojo incandescente y dejarla enfriar
Tomar una muestra de la colonia con el

asa estéril y fría al lado del mechero
Colocar la muestra en un extremo de la

superficie del agar estéril
Esterilizar el asa y dejarla enfriar
Realizar de 5 a 6 con el asa redonda estéril

estrías paralelas, consecutivas y juntas no
superpuestas
17
Realizar un primer grupo de estrías en el

cuadrante 1 de la caja (ver imagen 2)
Cerrar la caja Petri y girarla 90°, destapar y

empezar un segundo grupo de estrías
aprox. 4 a partir de la última realizada

empezar un tercer grupo de estrías aprox.
4 a partir de la última realizada

empezar un cuarto grupo de estrías aprox.
4 estrías realizando una especie de espiral
Llevar caja de Petri a incubar, después de

ello realizar identificación macro y
microscópica de las colonias aisladas
Imagen 5. Caja de Petri, aislamiento por estrías tomada de guía

de práctica de laboratorio, aislamiento por estrías
18
3.5.1 Fermentación de azúcares
Tubo1: Caldo Glucosa Elaborar una batería compuesta para cada

Tubo2: Caldo Sacarosa microorganismo a probar por 6 tubos de 5 mL
Tubo3: Caldo Maltosa
Tubo4: Caldo Ribosa Rotular los tubos de ensayo con la
Tubo5: Caldo Xilosa identificación de la colonia a probar, azúcar,
Tubo6: Caldo Lactosa número de grupo y fecha
Para preparación de medios
ver Tabla 1.
Esterilizar el asa y dejar enfriar cerca del
mechero
Tomar una muestra de la colonia del

microorganismo seleccionado y sembrar en el
caldo de glucosa
Suspender la colonia agitando el asa dentro

del medio, tapar el tubo y agitar
Esterilizar el asa, volver a tomar de la

muestra de la misma colonia y sembrar en el
caldo de sacarosa
Repetir los 3 pasos anteriores hasta terminar

de sembrar en cada uno de los azúcares a
probar
Llevar a incubar los tubos a 30°C,

revisándolos a las 24, 48 y 72 horas y
reportando como fermentación o asimilación
Reportar las reacciones bioquímicas como

asimilación: si hay presencia de CO2, turbidez
y cambio de pH. Comparar resultados con
Tabla 2.
19
Tabla 1. Preparación de Medio para fermentación de azúcares (Tomada de guía

de laboratorio práctica N° 4)
COMPONENTE g/L
NaCl 8.5
Peptona 5
Carbohidrato a probar 10
Rojo de fenol 1 mL
Agua destilada 1000 mL
Tabla 2. Fermentación de azúcares para Saccharomyces cerevisiae (Tomada de

guía de laboratorio práctica N° 4)
Saccharomyces cerevisiae
Glucosa +
Galactosa +
Ribosa -
Arabinosa -
Sacarosa +
Maltosa +
Celobiosa -
Trehalosa +
Lactosa -
Xilosa -
Rafinosa +
Ramnosa +
20
3.5.2 Tolerancia de Etanol
Para cada microorganismo a identificar

elaborar 4 tubos en calo OGY
Tubo1: 2% de etanol
Tubo2: 4% de etanol Después de esterilizado el medio OGY
Tubo3: 6% de etanol adicionar etanol en cada uno de los 4 tubos
Tubo4: 8% de etanol
Rotular los tubos de ensayo con la
identificación de la colonia a probar,
concentración de etanol, número de grupo y
fecha
Esterilizar el asa y dejar enfriar cerca del

mechero
Tomar una muestra de la colonia del

microorganismo seleccionado y sembrar en
tubo de ensayo con concentración de etanol
mayor
Suspender la colonia agitando el asa dentro

del medio, tape el tubo y homogenizar
Esterilizar el asa, volver a tomar una muestra

de la misma colonia y sembrar en tubo de 8%
Repetir los 3 pasos anteriores hasta terminar

de sembrar en cada una de las
concentraciones de etanol a probar
Llevar tubos de ensayo a la incubadora a 30°C

durante 5 días
Terminar el tiempo de incubación, realizar

lectura del crecimiento en el medio de cultivo
(verificar por turbidez)
21
4. RESULTADOS
4.1 Cálculos para Elaboración de Medios de Cultivo
 Agar YGC Hongos y levaduras
10 cajas de Petri
Preparar 200mL
38,1𝑔
200𝑚𝐿 ∗ ( ) = 7,62𝑔
1000𝑚𝐿
 Agar GYC Bacterias acéticas
10 cajas de Petri
A diferencia del agar YGC que ya viene preparado, el agar GYC necesita ser
adecuado agregando así diferentes componentes para que los microrganismos se
desarrollen, a continuación se observan cada uno de ellos con sus
correspondientes cálculos:
Glucosa 50𝑔/ 1𝐿
50𝑔
200𝑚𝐿 ∗ ( ) = 10𝑔
1000𝑚𝐿
𝐶𝑎𝐶𝑂3  5𝑔/ 1𝐿
5𝑔
200𝑚𝐿 ∗ ( ) = 1𝑔
1000𝑚𝐿
Agar-agar 20𝑔/ 1𝐿
20𝑔
200𝑚𝐿 ∗ ( ) = 4𝑔
1000𝑚𝐿
Cabe aclarar que el etanol se adiciona después de realizar el proceso de

esterilización.
22
Etanol70𝑚𝐿/ 1𝐿
70𝑚𝐿
200𝑚𝐿 ∗ ( ) = 14𝑚𝐿
1000𝑚𝐿
4.2 Cálculos para Aislamiento de Microorganismos de Interés
Extracto:
10𝑔
200𝑚𝐿 ∗ ( ) = 2𝑔
1000𝑚𝐿
Adicionar en agua destilada y seguir procedimiento imagen 6:
Imagen 6. Disoluciones para aislamiento de microorganismos de

interés, agua peptonada con jugo de fermento de naranja valencia
En la preparación para el aislamiento de los microorganismos de interés se

disuelven 10mL del jugo fermentado de naranja valencia en 90mL de agua
peptonada, luego se toma 1mL de esta disolución y se agregan en los 9mL de gua
peptonada en cada tubo de ensayo, se realiza procedimiento consecutivamente
hasta llegar a la disolución de 10-6 como se observa en la imagen 6. Se emplean
las diluciones de 10-4 ,10-5 y 10-6 para la obtención de los microorganismos de interés
debido a que las demás poseen gran cantidad de carga microbiana.
23
4.3 Caracterización de los medios de cultivo obtenidos
 AGAR YGC
Tabla 1. Agar YGC 10-4
COLONIA FORMA COLOR TAMAÑO APARIENCIA MICROSCOPÍA
A Redonda Beige 2 mm Cremosa Levaduras
B Circular Beige 5 mm Cremosa Levaduras
C Borde Beige 4 mm Cremosa No se realiza

irregular
D Redonda Beige 1.5 mm Cremosa No se realiza
E Borde Beige 6 mm Cremosa No se realiza

irregular
A Forma Beige 5 mm Brillante, Levaduras

irregular cremosa ovaladas
B Redonda Beige 3 mm Lisa, brillante Levaduras
C Circular Beige 3 mm Cremosa No se realiza
D Redonda Beige 2 mm Cremosa No se realiza
E Redonda Beige 4 mm Cremosa No se realiza
A Redonda Beige 1 mm Cremosa, No se realiza

hueca
B Redonda Beige 0.5 mm Cremosa, Levaduras

hueca
24
C Redonda Beige 1 mm Cremosa No se realiza
D Redonda Beige 0.5 mm Cremosa, lisa Levaduras
 AGAR GYC
Tabla 4. Agar GYC 10-4
A Redonda Crema 1 mm Cremosa, lisa No se realiza
B Redonda Crema 3 mm Cremosa, Levaduras

rugosa
C Redonda Crema 1.5 mm Cremosa, Levaduras

rugosa
D Redonda Crema 1 mm Cremosa, No se realiza

brillante
E Redonda Crema 1.5 mm Cremosa, No se realiza

opaca
A Redonda Crema 4 mm Cremosa, Levaduras

opaca ovaladas
B Redonda Crema 3.5 mm Cremosa, No se realiza

opaca
C Redonda Crema 3 mm Cremosa, No se realiza

opaca
D Redonda Crema 4 mm Cremosa, No se realiza

opaca
E Redonda Crema 4 mm Cremosa, Levaduras

opaca ovaladas
25
A Redonda Amarilla 2 mm Cremosa, Cocos Gram+

opaca
B Redonda crema 1 mm Cremosa, Levaduras

opaca
C Redonda crema 4 mm Cremosa, No se realiza

opaca
4.4 Conteo de colonias
 AGAR YGC
10-4 = 6560000 = 6,56 x 106 UFC/mL

10-5 = 2000000 = 2 x 106 UFC/mL
10-6 = 500000= 5 x 105 UFC/mL2
 AGAR GYC
Imagen 7. Colonias en caja de
10-4 = 6960000 = 6,96 x106 UFC/mL Petri ubicado en un contador de
colonias. Imagen tomada en
-5 7
10 = 22600000= 2,26 x 10 UFC/mL laboratorio de microbiología, SENA
10-6 = 25000000= 2,5 x 107 UFC/mL
4.5 Identificación de Gram+ y Gram-
A – GYC 10-5
B – GYC 10-4
C – YGC 10-6
D – YGC 10-4
E – YGC 10-5
F – GYC 10-6
26
IMAGEN OBSERVADA EN EL
DESCRIPCIÓN DE LAS COLONIAS
MICROSCOPIO ÓPTICO
OBSERBADAS 100X
- Gram positivas (color morado intenso)

- Levaduras
- Ovaladas
- En gran cantidad dilución de GYC 10-5
- Gram positivas (color morado no tan

intenso)
- Levaduras
- Ovaladas
- Un poco menos que la cantidad de la A
dilución de GYC 10-4

- Levaduras
- Ovaladas
- Un poco menos que la cantidad de la B
dilución de YGC 10-6
27

- Levaduras
- Ovaladas
- Dilución de YGC 10-4

- Levaduras
- Ovaladas
- Dilución de YGC 10-5

- Cocos
- Forma redonda bien definidas
- En gran cantidad dilución GYC 10-6
28
4.6 Resultados de Aislamiento por Estrías
A continuación se observan los resultados de aislamiento por estrías que se le

realizaron a los medios seleccionados en donde se encontraban los
microorganismos de interés:
A B
C D
Las anteriores imágenes son el resultado del método de aislamiento por estrías que
se le realizaron a las diluciones de 10-4 y 10-5. Como se puede observar solo A y B
cumplen con los requerimientos adecuados para poder realizar pruebas
bioquímicas, ya que C y D no fueron aisladas correctamente y por ende no se toman
en cuenta para poder seleccionar el microorganismo de interés.
29
4.7 Coloración de Gram para Verificación de Pureza de Levaduras
Para confirmar la pureza de las levaduras encontradas se toma una de las colonias
de los cada medio en este caso de A y B, los cuales fueron aislado correctamente
y por ende se procede a realizar coloración de Gram para poder realizar pruebas
bioquímicas y confirmar la pureza de los microorganismos de interés:
COLONIA SELECCIONADA COLORACIÓN DE GRAM OBSERVACIONES
Según los resultados de

coloración de Gram que
se realiza al medio A, se
observa que los
microorganismos
obtenidos son levaduras
y por tanto se puede
realizar pruebas
biomequimicas esta. Se
verifica que no están
contaminadas.
A
Según los resultados de

coloración de Gram que
se realiza al medio B, se
observa que los
microorganismos
obtenidos son levaduras
y por tanto se puede
realizar pruebas
biomequimicas esta. Se
verifica que no están
contaminadas.
B
30
A continuación se realizan las pruebas bioquímicas de fermentación de azúcares y

tolerancia de etanol para el microorganismo de interés en este caso las levaduras
obtenidas según la coloración de Gram y los medios empleados que se utilizaron
para elaborar estas pruebas.
4.8.1 Cálculos de Fermentación de azúcares
Se preparan 30mL para cada uno de los medios en 6 tubos de ensayo para cada
carbohidrato a probar:
NaCl  8.5 g/L
8,5𝑔
30𝑚𝐿 ∗ ( ) = 0,25𝑔
1000𝑚𝐿
Peptona 5 g/L
5𝑔
30𝑚𝐿 ∗ ( ) = 0,15𝑔
1000𝑚𝐿
Carbohidrato a probar:
(Glucosa, sacarosa, maltosa, ribosa, xilosa y latosa) 10 g/L
10𝑔
30𝑚𝐿 ∗ ( ) = 0,3𝑔
1000𝑚𝐿
El rojo de fenol es aplicado después de haber diluido cada uno de los componentes
en la preparación del medio.
Rojo de fenol 1mL
10𝑔
30𝑚𝐿 ∗ ( ) = 0,3𝑔
1000𝑚𝐿
31
Se toma muestra de A y B y se homogeniza en cada uno de los medios como se

ve en la figura 8.
Imagen 8. Procedimiento de fermentación de azúcares
4.8.2 Cálculos de Tolerancia al Etanol
Etanol al 2%
2𝑚𝐿 100𝑚𝐿
5𝑚𝐿 ∗ ( )( ) = 0,104𝑚𝐿
1000𝑚𝐿 96𝑚𝐿
Etanol al 4%
5𝑚𝐿 ∗ ( )( ) = 0,208𝑚𝐿
1000𝑚𝐿 96𝑚𝐿
Etanol al 6%
5𝑚𝐿 ∗ ( )( ) = 0,313𝑚𝐿
1000𝑚𝐿 96𝑚𝐿
32
Etanol al 8%
5𝑚𝐿 ∗ ( )( ) = 0,417𝑚𝐿
1000𝑚𝐿 96𝑚𝐿
Se homogeniza la muestra en cada una de las concentraciones del etanol como

se visualiza en la figura 9.
Imagen 9. Procedimiento de tolerancia al etanol
4.8.3 Resultados de Fermentación de Azúcares
Maltosa Sacarosa Glucosa
33
Lactosa Xilosa Ribosa
Imagen 10. Fotos de resultados de prueba de azúcares, realizada en

laboratorio de Microbiología
Positiva +
Negativa  -
Tipo de azúcar Muestra A Muestra B

-5
YGC 10 YGC 10-4
Maltosa + +
Sacarosa + +
Glucosa + +
Lactosa - -
Xilosa - -
Ribosa
- -
Se observa que en esta prueba solo dan positivas la maltosa, la sacarosa y la
glucosa y las demás son negativas, estos resultado indican la posible presencia del
microorganismo de interés que en este caso es la Saccharomyces cerevisiae
según el marco teórico.
34
4.8.4 Resultados de Tolerancia al Etanol
La siguiente prueba de tolerancia de etanol se le realiza solo a la muestra A (dilución

YGC 10-5) la cual muestra los siguientes resultados:
Imagen 11. Imagen de resultados de prueba de etanol
En la anterior imagen se observa que solo el tubo ensayo que contiene un 6% de

estanol dio positiva que a diferencia de las otra dieron negativa la siguiente foto es
evidencia de ello:
Imagen 12. Foto de resultados de prueba de tolerancia de etanol

realizada en laboratorio de Microbiología
35
5. ANÁLISIS DE RESULTADOS
Al desarrollar la práctica de laboratorio se prepararon varios medios de cultivo para

el crecimiento de los microorganismos de interés en este caso levaduras y bacterias
acéticas a partir del jugo obtenido de naranjas de la variedad “valencia” o citrus
sinensis.
Se encontraron en las diferentes colonias observadas, las cuales fueron clasificadas

a partir de las disoluciones obtenidas que por medio de método de tinción de Gram,
todas dieron gram positivas. Además se encontró que al efectuar el conteo de
unidades formadoras de colonias existentes en cada una de las muestras
realizadas, estas presentan un mayor valor en las colonias preparadas en el Agar –
agar GYC que en las colonias preparadas en el agar – agar YGC.
El conteo de la carga microbiana para cada una de las muestras trabajadas es el

siguiente, varía de acuerdo a la disolución y el medio.
Disolución al 10-4 en Agar YGC con carga microbiana de 6,56 x 106 UFC/mL.
Disolución al 10-5 en Agar YGC con carga microbiana de 2 x 106 UFC/mL.
Disolución al 10-6 en Agar YGC con carga microbiana de 5 x 105 UFC/mL.
Disolución al 10-4 en Agar GYC con carga microbiana de 6,96 x 106 UFC/mL.
El resultado de aislamiento por estrías es un método que fue realizado a las

disoluciones 10-4 y 10-5 y como se observa, solo las muestras A y B cumplen con
los requerimientos adecuados para realizar pruebas bioquímicas ya que fueron
correctamente aislados los microorganismos de interés.
Por ultimo en los resultados de pruebas bioquímicas, en la prueba de azúcares la

maltosa, la sacarosa y la glucosa dieron positivas, mientras que la lactosa, la xilosa
y la ribosa dieron negativas los cual de acuerdo a estos resultados, podemos dar
posible certeza de la presencia del microorganismo de interés Saccharomyces
cerevisiae, el cual esta bacteria acética ayudará a la elaboración de vinagre de
Naranja Valencia. En la prueba de Tolerancia de Etanol se observan en los
resultados que solo el que posee el 6% de etanol da positivo mientras que el de
2%, 4% y 8% dan negativos lo cual nos indica que se puede dar posible certeza de
presencia del microorganismo de interés, ya que la tolerancia de etanol es una de
las características de la levadura acética.
36
6. CONCLUSIONES
Se prepararon los respectivos medios de cultivo agar-agar YGC y GYC para el

crecimiento y desarrollo del microorganismo de interés (levaduras y bacterias
acéticas), realizando los respectivos cálculos y adecuándolos de acuerdos a lo
requerido. Para lo anterior se tuvieron en cuenta diferentes tipos de disoluciones
preparadas partiendo del agua peptonada y el fermento de la Naranja Valencia.
Se realizó aislamiento microbiano a partir de la caracterización macroscópica de

los cada uno de los microorganismos recuperados del fermento de Naranja valencia
(Citrus sinensis).
Se caracterizaron algunas colonias obtenidas en la preparación de medios de cultivo

y realizar el correspondiente conteo de acuerdo a las cantidades halladas en la caja
de Petri.
Se efectuó coloración de Gram para identificación de Gram positivas y Gram

negativas de acuerdo a las colonias ya caracterizadas.
Se aislaron los microorganismos de interés a partir del método de aislamiento por

estrías.
Se hicieron pruebas Bioquímicas a los microorganismos de interés como prueba de

fermentación de azúcares y tolerancia de etanol, las cuales dieron positivas de
acuerdo a lo esperado para evidenciar la presencia del microorganismo de interés.
37
7. BIBLIOGRAFÍA
Instructivo para la elaboración de medios de cultivo para el crecimiento de

microorganismos de interés biotecnológico práctica 1. Servicio Nacional de
Aprendizaje. SENA, 2014.
Instructivo para realizar la técnica de aislamiento por estrías práctica de laboratorio

práctica 2 y 3. Servicio Nacional de Aprendizaje. SENA, 2014.
Instructivo para la identificación de microorganismos mediante pruebas bioquímicas

práctica 5. Servicio Nacional de Aprendizaje. SENA, 2014
HERNANDEZ, Alicia. Microbiología Industrial. [En línea].

http://books.google.com.co/books?id=KFq4oEQQjdEC&printsec=frontcover&sourc
e=gbs_ge_summary_r&cad=0#v=onepage&q&f=false> [Citado el 23 de julio de
2014]
38

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INFORME DE MICROBIOLOGÍA

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS Y BACTERIAS

MAGALY SÁNCHEZ BENAVIDEZ

SERVICIO NACIONAL DE APRENDIZAJE, SENA

4.8 Identificación de Microorganismos a partir de Pruebas Bioquímicas ............... 31

En este informe se abordará el aislamiento e identificación de las bacterias

Como último procedimiento se realizaron pruebas bioquímicas: prueba de azúcares

Conocer los procedimientos adecuados para el aislamiento e identificación de

 Preparar medios de cultivo para el desarrollo y crecimiento de

 Realizar aislamiento a partir de la caracterización macroscópica de los

 Caracterizar algunas colonias obtenidas en la preparación de medios de

 Efectuar coloración de Gram para identificación de Gram positivas y Gram

 Aislar los microorganismos de interés a partir del método de aislamiento por

 Hacer pruebas Bioquímicas a los microorganismos de interés como prueba

Los microorganismos como las Levaduras son organismos vivos microscópicos

Imagen 1. Imagen de levadura Saccharomyces

Las levaduras son muy importantes debido a que contribuyen en la elaboración de

 Morfológicas: Forma, medida, reproducción asexual

Con lo anterior ya mencionado es necesario que los microorganismos para

2.1 Medios de Cultivo

En cuanto al estado se encuentran medios sólidos, semisólidos y líquidos, los

Imagen 1. Medios de cultivo sólido

Para la preparación de cultivos se requieren de ciertas condiciones generales tales

2.2 Aislamiento de Microorganismos de Interés

Cuando se examina en el microscopio una gota de agua de lluvia, se observa una

1Instructivopara la elaboración de medios de cultivo para el crecimiento de microorganismos de interés

2.3 Tinción de Gram o Coloración de Gram

La coloración de Gram es un tipo de tinción empleado en microbiología que permite

Imagen 2. Imagen de bacterias Gram

Para realizar la coloración de Gram son necesarios el uso de ciertos reactivos y

 Cristal violeta: Es un colorante primario de la coloración de Gram que se

2Instructivopara la elaboración de medios de cultivo para el crecimiento de microorganismos de interés práctica

 Lugol: Es un compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de

 Alcohol-cetona: Funciona para realizar la decoloración en este paso los

 Fucsina: Funciona como colorante de contraste, es el último compuesto que se

2.4 Aislamiento por Estrías

Una vez aislados los microorganismos e identificadas las colonias de interés, es

Imagen 3. Imagen de procedimiento de

2.5 Identificación de Microorganismos a partir de Pruebas Bioquímicas

La identificación microscópica y macroscópica de los microorganismos proporciona

Las pruebas bioquímicas son un conjunto de reacciones que determinan la

 Cambios que se producen

 Prueba de Fermentación de azúcares: En esta prueba se determina si la

 Prueba de Tolerancia al Etanol: En este tipo de ensayo se determina si los

3.1 Preparación de Medios de Cultivo

Observar la etiqueta de cultivo

Realizar los cálculos de acuerdo

Pesar en un vidrio de reloj la cantidad de

Medir con una probeta agua

Disolver con agua el medio de cultivo

Verter la mitad de agua desionizada en el

Consultar en la etiqueta del medio

Si el medio que se prepara es un caldo de

Con ayuda del Beaker transferir 10mL

Llevar el medio disuelto al autoclave y

Una vez esterilizado el agar, sacar el

Rotular cajas de Petri: nombre del medio,

Servir en cajas de Petri estériles

Dejar solidificar el agar llevar a una

Almacenar en refrigeración, las cajas de

3.2 Aislamiento de Microorganismos de Interés

Pesar en un reloj de vidrio 10g de la muestra a

Adicionar los 10g de la muestra al frasco con