UNIVERSIDAD NACIONAL DE JUJUY - FACULTAD DE INGENIERÍA - CATEDRA DE BIOINGENIERIA.

TRABAJO PRÁCTICO Nº 2
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
Nutrición de los microorganismos
Los microorganismos, al igual que los demás seres vivos, para crecer deben tomar del ambiente todas las
sustancias necesarias para la síntesis del material celular y para la generación de energía. Estas sustancias
nutritivas o nutrimentos se encuentran en cantidades suficientes en los medios de cultivo.
La nutrición varía considerablemente entre las distintas especies en cuanto a la fuente de carbono y
energía. Los autótrofos requieren dióxido de carbono (CO 2) como fuente de carbono y las sales inorgánicas.
Los heterótrofos requieren compuestos orgánicos como fuente de carbono y pueden necesitar sales
inorgánicas.

El oxígeno en la nutrición
El oxígeno es usado para la respiración, proceso por el cual se provee de energía a la célula. Algunas
bacterias son capaces de obtener energía por la misma vía metabólica sin utilizar el oxígeno molecular,
fenómeno que se conoce como respiración anaeróbica.
En relación al aire hay cuatro tipos de bacterias: los aerobios estrictos, los facultativos, los indiferentes y los
anaerobios.
Los aerobios: son organismos que necesitan oxígeno (aire) para vivir.
Los facultativos: pueden vivir sin oxígeno (por el metabolismo fermentativo), pero también pueden vivir en
presencia de oxígeno (por el metabolismo respiratorio), condiciones en las que suelen desarrollarse mejor.
Los indiferentes: son organismos a los cuales no les afecta la presencia o ausencia de oxígeno. A veces
estos organismos crecen mejor en presencia de una pequeña cantidad de oxígeno (aire), por lo que se les
denomina “microaerófilos”.
Los anaerobios: son organismos que sólo pueden vivir en ausencia de oxígeno.
Cuando las células vegetativas de anaerobios estrictos son expuestas al oxígeno, mueren, pero no los
endosporos.

Alimentación mineral
Además de oxígeno, hidrógeno, carbono y nitrógeno, los microorganismos precisan alimentos inorgánicos,
como fósforo, azufre, potasio, magnesio, calcio, hierro, etc.
Todos los elementos metálicos requeridos pueden servir como nutrientes en forma de cationes de sales
inorgánicas. Algunos como potasio, magnesio, calcio, hierro se precisan en cantidades relativamente grandes
y deben incluirse siempre como sales en los medios de cultivo. Los requerimientos cuantitativos de
manganeso, cobalto, cobre, molibdeno, zinc, son pequeños y por ello se los conoce como elementos traza u
oligoelementos.

Requerimientos de carbono
Los organismos que realizan fotosíntesis (fotoautótrofos), y los que obtienen energía por la oxidación de
compuestos inorgánicos (quimioautótrofos) utilizan el anhídrido carbónico como única o principal fuente de
carbono. Todos los otros obtienen el carbono de los compuestos orgánicos.
Prácticamente todos los compuestos orgánicos de la naturaleza pueden ser utilizados como fuente de
carbono por algún microorganismo. Algunos como las Pseudomonas pueden utilizar cualquiera de noventa
compuestos orgánicos diferentes; otros, como las bacterias que oxidan el metano, sólo pueden utilizar dos
sustratos orgánicos (metano y metanol), y las bacterias que descomponen la celulosa sólo pueden utilizar
este compuesto.
Los ácidos orgánicos que derivan de los glúcidos constituyen la principal fuente de carbono para algunos
microorganismos. Otros utilizan la glicerina o los ácidos grasos de los lípidos y otros utilizan los restos de
carbonados procedentes de la amonificación de materias proteicas.

Requerimientos de nitrógeno:
Algunos microorganismos son capaces de utilizar directamente el nitrógeno atmosférico, especialmente
aquellos que viven en simbiosis con las leguminosas (género Rhizobium). Las azotobacterias y ciertos tipos
de clostridios pueden también utilizar el nitrógeno atmosférico cuando en el medio falta otra fuente
nitrogenada.
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Algunas bacterias y hongos no fotosintéticos pueden cubrir sus necesidades de nitrógeno a partir de nitratos.
Algunos son incapaces de reducir este anión y se les debe proporcionar el nitrógeno en forma reducida como
sales de amonio.
El nitrógeno orgánico es descompuesto a nitrógeno amoniacal (amonificación) y así utilizado.

Medios de cultivo
Un medio de cultivo permite proporcionar a un microorganismo cualquiera una mezcla equilibrada de
nutrimentos, a concentraciones necesarias, requeridas para un buen crecimiento.

 Medio sintético: es aquél en donde la identidad y la cantidad de cada compuesto químico son
conocidas. O sea es un medio químicamente definido. Puede consistir en sales orgánicas o mezclas
de sales inorgánicas y sustancias orgánicas (como aminoácidos, ácidos grasos, carbohidratos); o en
productos inorgánicos y orgánicos asociados a vitaminas.
Se emplean cuando se desea averiguar el efecto que un organismo produce sobre ciertas sustancias
y para determinar las necesidades nutritivas de los mismos.

 Medio complejo: es aquel que contiene sustancias de composición química desconocida. Tales
sustancias, como: extracto de carne, extracto de levadura, etc. Permiten el crecimiento de una
variedad de organismos.
Cuando se desea aislar e identificar un solo tipo de microorganismo se emplea un medio selectivo,
cuya composición química permite sólo el desarrollo de la especie que se desea aislar. Pueden
usarse para obtener microorganismos de la naturaleza por aislamiento directo o por enriquecimiento.

1. La mayoría de las bacterias heterótrofas pueden crecer en un medio comúnmente denominado caldo
nutritivo que se hace disolviendo 3 g de extracto de carne (0,3 %) y 5 g de hidrolizado de
proteínas (0,5 %) en un litro de agua. Se suele añadir 0,3 % de cloruro de sodio, que da cierto
grado de protección osmótica. El extracto de carne es un extracto acuoso de músculo bovino
concentrado hasta una consistencia pastosa que contiene las porciones solubles en agua tales como
azúcares, aminoácidos, etc. El hidrolizado de proteínas es un digesto del músculo bovino o caseína o
proteínas de soja, con pepsina (peptona) o tripsina (triptona), que contiene péptidos y aminoácidos.
2. Si se gelifica con 1,5 % de agar se obtiene un medio llamado agar nutritivo. Pero estos medios
contienen algunos componentes desconocidos y su composición varía con cada preparación. Además,
la concentración de azúcares y la capacidad reguladora son bajas.
3. Agar nutritivo estándar. Se logra mejorar los resultados en un medio con la siguiente composición:
peptona o triptona 0,5 %, extracto de levadura 0,5 % (para proveer minerales y vitaminas), glucosa 0,1
% (para dar una fuente fácil de energía, fosfato dipotásico 0,5 % (para tener la capacidad reguladora de
la acidez formada durante el crecimiento), agar 1,5% (para gelificar).
4. Un medio de cultivo muy simple, útil para algunas bacterias que requieren solamente glucosa y sales
minerales, tiene la siguiente composición: glucosa 0,5 %, fosfato dipotásico 0,7 %, fosfato
monopotásico 0,3 %, citrato de sodio cristalizado 0,5 %, sulfato de magnesio cristalizado 0,1 % y
sulfato de amonio 1%.
5. Un medio sintético empleado para el cultivo de mohos es el de Czapek, que contiene una solución de
sales: nitrato de sodio 0,2 %, cloruro de potasio 0,05 %, sulfato de magnesio 0,05 %, sulfato
ferroso 0,001 % y fosfato dipotásico 1%, a la que se agrega glucosa o sacarosa (5% o 3 %)
respectivamente, y agar 1,5 %. Este medio también es ácido.
6. Para el cultivo de levaduras puede emplearse agar nutritivo estándar o el agar de Sabouraud, pero
también un medio compuesto por extracto de levadura 1%, extracto de malta 2,5 %, glucosa 1% y
agar 1,5 % que se denomina Agar malta-levadura. En este medio desarrollan bien algunas bacterias
heterótrofas.
Los medios de cultivo se esterilizan generalmente en autoclave (TPL. Nº 1) con vapor de agua a
2kg /cm2 de presión absoluta.

Control de p H

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Al preparar un medio de cultivo adecuado para el crecimiento de un microorganismo, debe tenerse en cuenta,
que el desarrollo de éstos puede limitarse por lo cambios químicos que se producen como consecuencia del
metabolismos de los mismos, produciendo una notable variación en la concentración de los iones hidrógeno,
modificando la acidez o alcalinidad del medio. Par evitar esta alteración se agrega en el medio de cultivo una
solución reguladora del pH. Esta consiste ene una mezcla de fosfatos mono y dibásicos cuyo pH está
aproximado a la neutralidad, actuando como amortiguador (buffer o tampón) cuando se producen cambios en la
concentración de iones hidrógeno.
NOTA: si Usted No dispone de un peachimétro autoclavable, puede medir el pH de su medio en forma
aproximada, utilizando papel o bandas para pH o en su defecto una solución de rojo de metilo y azul de
bromotimol que le dará los siguientes valores de pH:

Color pH
Rojo 4
Anaranjado 5
Amarillo 6
Verde 7
Azul 8

Efecto de la temperatura
La zona de temperatura en que ocurre el crecimiento de los microorganismos varía según las distintas especies.
Hay una temperatura mínima, otra óptima y otra máxima.
Mínima, es la menor temperatura a la que puede crecer un organismo, óptima: la temperatura a la cual alcanza
su máximo desarrollo y máxima: es la mayor temperatura compatible con la vida de ese microorganismo. Por
encima de la misma el crecimiento se detiene como consecuencia de la desnaturalización de las proteínas
celulares, y por debajo de la mínima mantienen la viabilidad durante un determinado tiempo, llegando a la
inhibición a ser total por inactivación de las enzimas.
Según la relación existente entre el crecimiento y la temperatura los microorganismos se clasifican en:
Mesófilos: la temperatura óptima se encuentra entre 25º C y 37º C, la máxima entre 40º C y 50º C y la mínima
entre 10º C y 15º C.
Termófilos: la temperatura óptima se encuentra entre 55º C y 75º C; la máxima entre 60º C y 80º C y la mínima
entre 35º C y 40º C.
Psicrófilos:
a. Facultativos: temperatura óptima 25º C a 30º C; máxima entre 30º C y 35º C y mínima entre –5º C y 5º C
b. Obligados: temperatura óptima entre 15º C y 18º C; máxima entre 19º C y 22º C y mínima entre –5º C y 5º C
Medio de cultivo para anaerobiosis
La adición de sustancias reductoras, tales como cisteína, glucosa o tioglicolato sódico, a medios líquidos,
permite generalmente el crecimiento de bacterias anaeróbicas en las condiciones de cultivo corrientes.
El medio con tioglicolato contiene peptona de caseína 1,5 %, extracto de levadura 0, 5%, glucosa 0,5 %, cloruro
de sodio 0,25 %, L-cisteína 0,075 %, tioglicolato de sodio 0,05%, resazurina 0,0001%, agar 0,075%. El color
deber ser amarillo.
Cuando el medio se vuelve rosado indica que está oxidado. Sin embargo, pude ser utilizado después de
calentarlo en un baño de agua hirviente durante 15 minutos, pues el oxígeno es menos soluble en el medio
caliente. Los tubos se enfrían sin agitar el líquido para evitar una redisolución del oxígeno.

ANEXO GUIA SOBRE MEDIOS DE CULTIVOS

I. Instrucciones para la preparación, uso y la conservación de ingredientes para medios de cultivo
deshidratados

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Para preparar su medio de cultivo siga las instrucciones de su guía de TPL o de su instructor. También, puede
recurrir a bibliografía especializada (Libros de texto, manuales, folletos...). En el caso de los medios
deshidratados “listos para usar” las instrucciones figuran normalmente en la etiqueta del producto.
Use solamente en todo momento material de laboratorio químicamente limpio, incluyendo la espátula con que
pesa.
Pese correctamente cada ingrediente sólido y mida correctamente el volumen de agua destilada que emplee en
su preparación. Recuerde que los frascos con ingredientes para medios de cultivo listos para usar y
deshidratados son altamente higroscópicos; por lo tanto:
i. Cuando pese, mantenga el frasco abierto la menor cantidad de tiempo posible.
ii. Cuando termine de usarlo cierre el frasco herméticamente.
 Para solubilizar estos productos deshidratados en agua proceda así:
1. Suspenda la cantidad indicada de sólido en agua destilada o desmineralizada.
2. Si es necesario (solución no homogénea) caliente suavemente con agitación frecuente. Para evitar
calentamiento excesivo, puede recurrir a un baño María hasta que se disuelvan los componentes. Evite
calentamiento prolongados innecesariamente.
3. Esterilice según instrucciones.
 Conserve los frascos con ingredientes y medios de cultivo deshidratados herméticamente cerrados, en
lugar seco y fresco, lejos de conductos o al abrigo de la luz (puede usar un refrigerador) sin iluminación,
asegurando un contenido de humedad bajo.
 Coloque la fecha de recepción de estos productos deshidratados, y use siempre el lote o partida más
antiguo. Examine regularmente su stock, llevando registros asegurarse una provisión suficiente y un buen
estado del producto (sobre todo en el caso de frascos previamente abiertos). Una vez preparado verifique el
buen desempleo del medio de cultivo, y su pH, que no deberán registrar cambios mayores de 0,2 unidades de
pH con respecto al valor esperado para los productos en buen estado.

II. Conservación de medios de cultivo “preparados”:

1. Observe las instrucciones de la caja o etiqueta.
2. Todos los medio de cultivo preparados en cápsula de aluminio y con tapa de goma pueden
conservarse a temperatura ambiente, en las mismas condiciones que los deshidratados.
3. Dependiendo del producto los medios preparados en tubos con tapa a rosca podrían conservarse
a temperatura ambiente o deberán conservarse en heladera a 4º C
III. Esterilización por Tindalización y por filtración:
Medio de cultivo Agar-Leche
i. Microorganismos cuyo desarrollo favorece: particularmente “Fermentos lácticos”, tales como los del
yoghurt (Streptococcus termophilus y Lactobacillus bulgaricus) y los de la leche cultivada (diga en su
informe cuales son).
ii. Composición: Peptona pancreática de carne : 5g
Glucosa: 1 g
Leche descremada fresca: 5 cc
Agar: 15g
Agua destilada: 1000 cc
iii. Esterilización y mezclado:
a) Por separado, a saber: agar y peptona en solución: en autoclave, a 120ºC durante 20 minutos (o
equivalente).
 Leche: distribuir la solución de leche descremada en tubos de ensayo (por ejemplo: 10 cc en c/u) y ya sea:
1. Llevar a autoclave (115º C, 15 minutos)
2. Tindalizar
“Tindalizar”, es decir: hervir durante 20 a 30 minutos diarios en baño María durante 3 días consecutivos.
 Glucosa en solución: filtrar con un filtro de membrana de 0,2 micrones de porosidad, en un equipo de
filtración esterilizado (por ejemplo por ebullición durante 3 minutos). Se recomienda preparar una solución de
glucosa entre 10 y 40 %, ya que se inhibirá así el crecimiento de microorganismo.

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Una vez hecho todo esto, mezclar las soluciones de leche y glucosa, e incorporar esto al agar a 60-70º C (o
mezclar agar y agua azucarada, ambas a 45ºC) homogeneizar por rotación entre las palmas y verter en cajas de
Petri o dejar solidificar en el tubo.
También puede esterilizarse el agar leche con todos sus ingredientes bien solubilizados a 115º C durante 40
minutos.

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Desarrollo: Preparación de los distintos medios de cultivo

1.CALDO NUTRITIVO: Crecimiento de bacterias heterótrofas

Composición:
 Extracto de carne 0,3%
 Peptona 0,5%
 Cloruro de sodio 0,3%
 Volumen: 100 ml
Los componentes colocarlos en un Erlenmeyer de 250 ml y disolverlos. Taponarlos con una torunda (tapón de
algodón) y esterilizar en autoclave 20 minutos a 1,18 kg/cm2.
Luego repartir en tubos de ensayo (aprox. 10 ml) y dejar reposar a temperatura ambiente en el laboratorio. Se
puede conservar en heladera considerando un determinado tiempo de permanencia, pues se produce
desecación. No inclinarlos pues se trata de un medio de cultivo líquido.
2. AGAR NUTRITIVO:
La composición es idem al anterior pero gelificar con 1,5 % de agar. En este caso sí se deja solidificar en pico de
flauta este medio en un tubo de ensayo.

3.AGAR NUTRITIVO ESTANDAR: Su uso es para crecimiento de levaduras.

Composición:
 Peptona 0,5%
 Extracto de levadura 0,5%
 Glucosa 0,1%
 Fosfato dipotásico 0,5%
 Agar 1,5%
 Volumen 100 ml

4. MEDIO DE CULTIVO SIMPLE: se usa para crecimiento de algunas bacterias. Es un medio de cultivo líquido e
incoloro.
Composición:
 Glucosa 0,5%
 Fosfato dipotásico 0,7%
 Fosfato monopotásico 0,3%
 Citrato de sodio cristalizado 0,5%
 Sulfato de magnesio cristalizado 0,1%
 Sulfato de amonio 1%
 Volumen 100 ml

SIEMBRA DE MICROORGANISMOS
1- OBJETIVOS: Comparar el comportamiento (desarrollo) de bacterias, levaduras y hongos considerando
como parámetros: el medio de cultivo, la temperatura de incubación, presencia y/o ausencia de oxígeno y el
origen del microorganismo, manteniendo para tal fin uno de los parámetros constante, mientras los otros varían.

2- SECUENCIA DE TRABAJO:
a- Cada grupo prepara todos los tubos de ensayo, cajas de Petri, etc. necesarios para realizar las siembras
previstas de acuerdo al cuadro elaborado teniendo en cuenta el cumplimiento de los objetivos, de tres de los
nueve medios de cultivo que les tocó.
b- Cada grupo deberá controlar el pH de los medios de cultivo, antes de usarlos, con el indicador de mezcla
azul de bromotimol y rojo de metilo 1/1 y con papel de pH.

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c- Para controlar la temperatura de los medios sólidos, los que deberán ser fundidos (baño María) para
preparar los medios de siembra, se utilizarán un baño termostático; el que estará a 45-50 ºC, temperatura que
será sensible al tacto. La razón de esta determinación se debe a que como ya se sabe es necesario dejar enfriar
hasta esta temperatura los mismos para evitar condensaciones en las cajas de Petri y como en todo momento
debemos tener presente las condiciones de asepsia en la que debemos trabajar no se puede tomar la
temperatura con termómetros.
d- En los medios sólidos pico de flauta la siembra se hará en forma de línea y no de estría como en el caso de
las cajas de Petri.
La temperatura de incubación de los medios es de 30ºC.

3- SIEMBRA EN ANAEROBIOSIS: únicamente la siembra vertical (tubos verticales sólidos). Tener en cuenta
que en este caso la temperatura de incubación es de 45 ºC y que se necesita la cámara húmeda para mantener
las condiciones del medio.
4- MATERIAL:
a. Filamentos y mangos de Kolle: Ansa de ojal (líquidos, estrías y línea recta)
Ansa aguja: (punción)
Ansa gancho: (macro y microcultivo: Mohos)
Ansa cuchillo: (microcultivo)
b. Cajas de Petri y tubos de ensayo esterilizados.
c. Porta y cubreobjetos para microcultivo previamente lavados con detergente y alcohol.
d. Estufa a 30 y 45ºC
e. Mecheros

CRITERIOS DE DISTRIBUCIÓN DE TIPOS DE SIEMBRA

a) Nº de alumnos = 4, cada uno prepara el medio en el que hará la siembra

Alumno Origen M. O Tipo de siembra Condiciones Medio Temperatura

Suspensión de 30º C (parafina)

1 TVL Anaerobiosis CNA
tierra 45º C (vaspar)
Suspensión de 45º C (vaselina)
TVS Anaerobiosis Tioglicolato
tierra

Levadura TVS Aerobiosis A. S. 30º C

Levadura C. P . Aerobiosis Fav: A.3 30º C y 45º C

Fav: A.C. 30º C
Pan P.F. Aerobiosis
Desfav: A. E.

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