Práctica No 2

Laboratorio de Bioquímica

Cuantificación de Lactato en suero

Objetivos

» Identificar la ruta metabólica, condiciones de oxigenación y células involucradas

en la producción de lactato.

» Identificar valores de concentración normal y anormal de lactato en una muestra

de suero sanguíneo.

» Determinar la concentración de lactato en una muestra de suero sanguíneo mediante un método

enzimático colorimétrico.

Introducción

La glucosa se metaboliza a piruvato a través de la vía de la glicólisis para la producción

de energía o de otros intermediarios metabólicos. El piruvato producido puede ser

convertido en acetil CoA, el cual puede ser utilizado en diferentes rutas anabólicas u

oxidado completamente a CO2

y H2

O en el ciclo de Krebs en un ambiente aeróbico

para la producción de ATP en la cadena transporte de electrones y fosforilación oxidativa, dependiendo

de las necesidades fisiológicas de la célula. Por otra parte, el piruvato

puede ser reducido a ácido láctico, o lactato, en condiciones anaeróbicas en determinado tipo de
células, entre ellas glóbulos rojos, células de la retina del ojo y células

musculares en una condición de hipoxia (por ejemplo, ejercicio anaeróbico intenso).

Esta reacción es catalizada por la enzima lacatato deshidrogenasa y requiere como

coenzima NADH, procendente de la vitamina B3 o niacina. En condiciones anaeróbicas o hipóxicas,

muchos organismos regeneran NAD mediante la transferencia de

electrones desde el NADH al piruvato, con la formación de lactato.

Figura 1. Reaccion catalizada por la Lactato deshidrogenasa.

Otros organismos, como las levaduras, regeneran NAD mediante la reducción de piruvato a etanol y CO2

. En estos procesos anaeróbicos (fermentaciones), no hay oxidación

o reducción neta de los carbonos de la glucosa (figura 2).

Figura 2. Diferentes destinos del piruvato producido en la glucólisis.

El lactato producido por las células es transportado por el torrente sanguíneo al tejido

hepático, en donde sirve como sustrato para la gluconeogénesis (figura 3) y entra a esta

ruta a través de la oxidación a piruvato, el cual es carboxilado a oxalacetato y convertido

2 ETANOL

2 ACETIL -S -COA

2 PIRUVATO

GLUCOSA

2 LACTATO

Fermentación láctica

( sin O2 )

Glocuse

2 Pyruvate 2 Lactate

2NAD +

Fermentación Alcohólica 2NADH

( sin O2 )

2CO2

2CO2

Glucólisis

( IO reacciones )

Condiciones

anaeróbicas

Condiciones

aeróbicas

Respiración Celular ( con O2 )

Condiciones

anaeróbicas

2 ETANOL

2 ACETIL -S -COA
2 PIRUVATO

GLUCOSA

2 LACTATO

Fermentación láctica

( sin O2 )

Glocuse

2 Pyruvate 2 Lactate

2NAD +

Fermentación Alcohólica 2NADH

( sin O2 )

2CO2

2CO2

Glucólisis

( IO reacciones )

Condiciones

anaeróbicas

Condiciones

aeróbicas

Respiración Celular ( con O2 )

Condiciones

anaeróbicas

Glucosa

NADH + H+

Pyruvate

lactante

dehydrogenese CH3

C=O

NAD+
O OL-Lactate

CH3

HO–C=H

O O-

MANUAL PRACTICO BIOCIENCIAS -SEGUNDO SEMESTRE

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a fosfoenolpiruvato, molécula que se regresa en la vía contraria a glucólisis. La velocidad

de este mecanismo se regula con las concentraciones de glucosa en el torrente sanguíneo,

de esta manera una disminución en la glicemia, incrementa la velocidad del proceso.

2 NADH + H+ 2 NAD+

2 ADP Galactosa

Glucosa

2 ATP

COO- COOC O HO C H

Lactato

deshidrogenasa CH3 CH3

2 Piruvato 2 Lactato

LACTATO LACTATO

GLUCOSA GLUCOSA

PIRUVATO PIRUVATO

Sangre

Sangre 2 Musculo

GLUCOLISIS 2 piruvato

Higado

LACTASA

Figura 3. Producción de lactato a partir de lactosa y conversión en glucosa mediante gluconeogénesis en

el tejido

hepático.
Cuando el lactato se produce en grandes cantidades durante la contracción muscular

vigorosa, la acidificación que resulta de la ionización del ácido láctico en el músculo y la

sangre limita el período de la actividad. El aumento de los niveles de lactato se relaciona

proporcionalmente con la disminución de la fuerza física.

Interpretación clínica de la acumulación de lactato en suero

Los niveles elevados de lactato se encuentran principalmente en condiciones de hipoxia

como shock, hipovolemia e insuficiencia ventricular izquierda, en condiciones asociadas

con enfermedades como diabetes mellitus, neoplasia y dolencias hepáticas y en condiciones asociadas
con fármacos o toxinas como etanol, metanol o salicilatos. El diagnóstico clínico debe realizarse
teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.
Práctica No. 3

Laboratorio de Bioquímica

Determinación de lipasa pancrética en muestra de suero

Objetivos

» Reconocer la importancia biológica de la lipasa pancreática en la digestión de los

lípidos.

» Determinar la actividad específica de la lipasa pancreática en suero humano.

» Evaluar los resultados de la actividad de la lipasa pancreática y su aplicación clínica para el estudio de
alteraciones pancreáticas.

Introducción

Aproximadamente el 90% de la grasa de la dieta está constituida por triacilgliceroles

(TAG) y el resto por colesterol, ésteres de colesterol, fosfolípidos y ácidos grasos libres.

Puesto que los triacilgliceroles son insolubles en agua y las enzimas digestivas son

hidrosolubles, la digestión de las grasas tiene lugar en la interfaz lípido-agua en el

intestino delgado. Los ácidos o sales biliares son moléculas anfipáticas similares a detergentes que
solubilizan la grasa y facilitan la acción de la lipasa pancreática que degrada

los triacilgliceroles de la dieta (figura 1).

COO Región -

hidrofóbica

Región

hidrofilica

Interación con

TGAs

HO

HO HO

OH OH

OH

OH
OH

OH

OH

OH

OH

OH

HO HO

HO

HO

HO

Ácido cólico

OH

Sal biliar

Sales biliares Lipasa pancreática

Micela

Ácidos grasos y MAGs

Digestión

con lipasa

TGA

TAG

FL

LFL

MAG

DAG

Micela mezclada

Digestión

(Lúmen intestinal)

Lipasa

Fosfolipasa
Colipasa

AGL

AGL

Emulsión

OH

OH

OOC

OOC

COOCOOH

COOCOOCL

SB

Figura 1. Micelas digestivas formadas por las sales biliares, lipasa pancreática, fosfolipasa, colipasa y
lípidos de

la dieta. TAG: Triacilglicerol, DAG: Diacilglicerol, MAG: Monoacilglicerol, CL: Colesterol libre, FL:
Fosfolípido, LFL:

Lisofosfolípido, AGL: Ácido graso libre y SB: Sal biliar.

La enzima lipasa pancreática (triacilglicerol lipasa) cataliza la hidrólisis de los triacilgliceroles en sus
posiciones 1 y 3 para formar 2-monoacilglicerol y 1,2 diacilglicerol.

La unión de la enzima a la interfaz lípido - agua requiere de micelas de fosfatidilcolina, sales biliares y
colipasa pancreática, una proteína de 90 residuos que forma

MANUAL PRACTICO BIOCIENCIAS -SEGUNDO SEMESTRE

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un complejo 1:1 con la lipasa. En ausencia de micelas lipídicas, el sitio activo de la

lipasa está cubierto por una “tapa” helicoidal de 25 residuos, pero en presencia de

las micelas, la lipasa sufre una reorganización estructural que da como resultado la

exposición de un dominio hidrófobo de 10 residuos llamado bucle β5, que constituye

el sitio activo de la enzima. Por otro lado, la colipasa se une al dominio C-terminal de

la enzima, creando una superficie hidrófoba que ayuda a unir el complejo proteico a
los lípidos procedentes de la dieta. Otras lipasas como la fosfolipasa A2 que hidrolizan

fosfolípidos, también catalizan reacciones en interfaces lipídicas.

Interpretación clínica del aumento de lipasa en suero

La determinación de lipasa en suero se utiliza para evaluar alteraciones pancreáticas

puesto que su actividad se incrementa significativamente después de un ataque de

pancreatitis aguda. En general, la elevación de amilasa y lipasa ocurren simultáneamente, pero la

elevación de lipasa persiste por más tiempo. También ocurre aumento

debido a una obstrucción del ducto pancreático por cálculos o por carcinoma y en

enfermedades renales. El diagnóstico clínico no debe realizarse teniendo en cuenta el

resultado de un único ensayo sino que debe integrar los datos clínicos y de laboratorio.