Microscopio óptico

Introducción:

El estudio de la estructura y funciones celulares ha experimentado tres

períodos fundamentales de progreso. El primer periodo se inicia a comienzos del
siglo XVII y se caracteriza por el descubrimiento de un mundo diminuto, no
detectable por el ojo humano pero sí por lupas o lentes. Las primeras
observaciones fueron de glóbulos rojos sanguíneos por Fierre Borel en 1656. En
1665, Robert Hooke introdujo el término célula para describir la estructura del
corcho y en 1674, Antón van Leeuwenhoek observó organismos unicelulares
vivos. Al paso de los años, los lentes se perfeccionaron y transformaron en
microscopios ópticos. En 1838-1839, Mathias Jacob Scheiden y Theodor Schwann
formularon la teoría celular, que considera a la célula como una unidad
estructural común de todos los seres vivientes, y que una célula madre es capaz
de dividirse en dos células hijas. Esto último fue un aporte hecho por Rudolph
Virchow en 1858. Ya a fines del siglo XIX se dispuso de tinción y fijación de los
tejidos que permitieron una enorme recopilación de detalles celulares como la división celular y la
fecundación celular. Los fenómenos de evolución y herencia empezaron a tener gran importancia.
El segundo período, comienza a fines del siglo XIX y se caracteriza por la tentativa de interpretar las
estructuras celulares con respecto a su función. El tercer período en cambio acentúa el conocimiento de
la función de lo componentes celulares a nivel molecular, donde el microscopio es sin duda el elemento
más importante para el estudio de la morfología celular. El tipo de microscopio más utilizado es el
microscopio óptico, que se sirve de la luz visible para crear una imagen aumentada del objeto. El
microscopio óptico más simple es la lente convexa doble con una distancia focal corta. Estas lentes pueden
aumentar un objeto hasta 15 veces. Por lo general se utilizan microscopios compuestos, que disponen de
varias lentes con las que se consiguen aumentos mayores. Algunos microscopios ópticos pueden
aumentar un objeto por encima de las 2.000 veces, lo que resulta de gran utilidad considerando, por
ejemplo, que una célula animal típica mide entre 10 y 20 μm de diámetro.
Las células, en la mayoría de los casos, no sólo son diminutas sino también transparentes. Debido a esto,
los principales descubrimientos sobre la estructura interna de las células dependieron del hallazgo, a fines
del siglo XIX, de diversas técnicas de preparación de los materiales - mediante fijación, corte y tinción -
que proporcionaron el contraste suficiente para hacerlas visibles. Además, el perfeccionamiento del
microscopio llegó a un alto grado y se pudieron obtener aumentos hasta 1500 veces.

El microscopio que usted utilizará en las actividades de laboratorio corresponde a

un Microscopio óptico compuesto por un sistema óptico y un sistema mecánico:
El microscopio óptico consiste en dos sistemas de lentes. El lente objetivo está compuesto de varias lentes
que crean una imagen real aumentada e invertida del objeto observado. Al observar a través del lente
ocular se ve una imagen virtual aumentada de la imagen real.
El aumento total del microscopio depende de las distancias focales existentes entre los dos sistemas de
lentes (ocular y objetivo).
Las lentes están dispuestas de forma que el objetivo se encuentre en el punto focal del ocular; y pueden
aumentar un objeto hasta 15 veces. Algunos microscopios ópticos pueden aumentar un objeto por encima
de las 2.000 veces, lo que resulta de gran utilidad considerando, por ejemplo, que una célula animal típica
mide entre 10 y 20 µm de diámetro (Fig.1)

Fig. 1: Relación de tamaños según tipo de microscopia utilizada

A) SISTEMA ÓPTICO:

a.- LENTES OCULARES: sistema de lentes situados cerca del ojo del observador, con distintos aumentos,
generalmente 10X o 15X. Su función es ampliar (aumentar) el tamaño de la imagen del objeto.

b.- LENTES OBJETIVOS: sistema de lentes situados cerca de la preparación, montados en el revólver.
Poseen diferentes aumentos: i) lupa (4X): éste puede estar o no en un microscopio y su aumento varía de
acuerdo al tipo de microscopio; ii) 10X, 40X y 100X. Éste último, también recibe el nombre de objetivo de
inmersión. La función de los lentes objetivos es ampliar el tamaño de la imagen del objeto, además, son
los únicos lentes con poder de resolución.

c.- FOCO (fuente luminosa): dirige los rayos luminosos hacia el condensador. Se ubica en la base del
microscopio.

d.- CONDENSADOR: sistema de lentes que concentra los rayos luminosos sobre la preparación
e.- DIAFRAGMA (iris): regula la cantidad de luz que se dirige hacia la preparación, desde el condensador.
Se ubica bajo la platina y posee un tornillo que permite regular la apertura del diafragma.

f.- ANILLO PORTAFILTRO: permite colocar un filtro de color anexo al condensador para destacar alguna
estructura de interés en la preparación.

B) SISTEMA MECÁNICO:

a.- SOPORTE: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie (o base de sustentación) y el brazo (o
columna).

b.- PLATINA: plataforma horizontal donde se deposita la preparación. Posee un orificio central por donde
pasa la luz y pinzas que permiten sujetar la preparación a observar. Bajo la platina se ubican dos tornillos;
uno permite mover la platina hacia delante y hacia atrás y el otro permite mover las pinzas hacia los lados

c.- TUBO: cilindro metálico que contiene los lentes oculares en su extremo superior (monocular o
binocular) y el revólver en su extremo inferior.

d.- REVÓLVER: pieza giratoria que contiene los lentes objetivos.

e.- TORNILLOS DE ENFOQUE: Son dos tipos de tornillos, ubicados a los lados del tubo. El tornillo
macrométrico proporciona un enfoque general de la preparación y se utiliza con los objetivos de 4X y 10X;
y el tornillo micrométrico proporciona un enfoque detallado (o de precisión) y se utiliza con los objetivos
de 40X y 100X.

Fig. 2: Partes del Microscopio

PODERES DE UN MICROSCOPIO

A) Poder de aumento: capacidad de las lentes de un microscopio de agrandar el tamaño del objeto a
observar. Depende del aumento de los lentes oculares en combinación con los lentes objetivos.

Fig 3. Aumento total con cada uno de las lentes objetivos

B) Poder de resolución: capacidad de las lentes de un microscopio de distinguir dos objetos, ubicados
muy cerca uno de otro, como dos entidades separadas. Depende de los lentes objetivos.

C) Poder de penetración: capacidad de las lentes del microscopio de poder distinguir distintos planos

D) Poder de definición: se refiere a la nitidez de las imágenes obtenidas, sobre todo respecto a sus
contornos. Esta propiedad depende de la calidad y de la corrección de las aberraciones de las lentes
utilizadas.

MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO

1.-Colocar el microscopio en una posición cómoda sobre una superficie plana. Tomarlo, siempre, del brazo
o columna.
2.- Colocar el lente objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina completamente.
Si el microscopio se guardó correctamente en el uso anterior, ya debería estar en esas condiciones.
3.-Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas.
4.-Comenzar la observación con el objetivo de 4X (si es que lo tiene). Una vez enfocado, colocar el objetivo
de 10X, sin mover la preparación (sólo moviendo la platina). Luego de enfocado, pasar al aumento de
40X de la misma manera.
5.-Para realizar el primer enfoque (4X):

a. Acercar al máximo la platina (con la preparación) al lente objetivo de 4X, empleando el tornillo
macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente la platina, y no a través de los lentes
oculares, ya que se corre el riesgo de incrustar el lente objetivo en la preparación pudiéndose
dañar alguno de ellos o ambos.

b. Mirando, ahora sí, a través de los lentes oculares, ir separando (bajando) lentamente la platina
del lente objetivo con el tornillo macrométrico y, cuando se observe algo nítida la muestra, girar
el micrométrico hasta obtener un enfoque fino.
6.-Pasar al siguiente lente objetivo girando el revólver hasta que se sienta un “clic”. La imagen debería
estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el tornillo micrométrico para lograr el
enfoque fino. Si al cambiar de lente objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a
enfocar con el objetivo anterior y repetir la operación desde el paso 3.

El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación y por ello es fácil que ocurran dos
tipos de percances: incrustarlo en la preparación si se descuidan las precauciones anteriores y
mancharlo con aceite de inmersión si se observa una preparación que ya se enfocó con el objetivo de
inmersión.

7.-Empleo del objetivo de inmersión:

a. Una vez enfocada la preparación con el lente objetivo de 40X, girar el revólver suavemente,
hacia el lente objetivo de inmersión dejándolo a medio camino entre éste y el lente objetivo de
40X.

b. Sin mover la platina, y con los lentes separados, colocar una gota de aceite de inmersión en el
centro de la preparación. Se puede guiar por el círculo de luz que indica la zona que se va a
visualizar.

c. Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del lente objetivo de inmersión.

d. Enfocar cuidadosamente moviendo el tornillo micrométrico. La distancia de trabajo entre el

lente objetivo de inmersión y la preparación es mínima, aún menor que con el lente objetivo de
40X, por lo que el riesgo de accidente es muy grande.

e. Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, no se puede volver a usar el
objetivo 40x sobre esa zona, pues se mancharía de aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo,
hay que bajar la platina y repetir la operación desde el paso 3.

f. Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se coloca el lente objetivo
de menor aumento girando el revólver. En este momento ya se puede retirar la preparación de la
platina. Nunca se debe retirar con el lente objetivo de inmersión en posición de observación.

g. Limpiar el lente objetivo de inmersión con cuidado, empleando un papel y una solución especial
para óptica. Comprobar también que el lente objetivo 40X está perfectamente limpio.

En ocasiones también se habla de "objetivos a seco" y "objetivos de inmersión", haciendo referencia a lo

que se encuentra entre la preparación y el objetivo. Así el objetivo a seco se refiere a que entre la
preparación la lente existe aire, mientras que los objetivos de inmersión requieren que exista entre la
lente y la preparación una sustancia conocida como aceite de inmersión.
 Figura 4. Trayectoria parcial de la luz, utilizando aceite de inmersión (mitad derecha) o aire (mitad
izquierda) como medio entre el portaobjetos y el lente objetivo.

Tipos de preparaciones

Existen dos tipos de preparaciones que se pueden observar al microscopio óptico, las permanentes y las
temporales o frescas. Ambas muestras deben ser lo más delgadas posibles para permitir el paso de la luz
a través de ellas y así lograr una buena observación.

Preparaciones permanentes: Son aquellas que se someten a un proceso largo de preparación, el cual les
permitirá mantenerse en buenas condiciones por periodos largos de tiempo. La preparación de estas
muestras incluye: fijación del material, deshidratación, inclusión en parafina, cortes finos de la muestra
(micrótomo), colocación de estas capas finas en un portaobjeto, disolución en parafina, tinción de la
muestra y colocación del cubreobjeto para proteger la preparación.

Preparaciones temporales (frescas): Son cortes frescos del material, los cuales se realizan en el momento
de la observación. Una vez realizado los cortes, se coloca en un portaobjeto con o sin gota de agua,
después se cubre con un cubreobjetos. Si desea observar diferentes estructuras celulares, debe utilizar
colorantes, con el fin de teñir el preparado. Luego se observa al microscopio.

LOS COLORANTES (tinciones) permiten mejorar la observación de las diferentes estructuras celulares al
contrastar de forma selectiva moléculas determinadas. Existen diferentes colorantes, los cuales se utilizan
de acuerdo a la afinidad química de estos con los diferentes componentes celulares. Un ejemplo de estos
es el Azul de metileno, colorante catiónico (molécula cargada +) y se combina con estructuras cargadas
negativamente, por ejemplo núcleo y pared celular.
DESCRIPCIÓN DE LO OBSERVADO

Debe seguir una estructura, que puede variar según el observador, pero que debe ser sistemática y
ordenada. Se sugiere que considere en sus observaciones el siguiente esquema:

a) Objetivo: referido al porque se realiza la observación (Ej. observación de núcleo)

b) Material: es el órgano o tejido del que se obtuvo la preparación (Ej. riñón de rata)
c) Método: se refiere a la técnica histológica usada para elaborar la preparación (a fresco o permanente)
y a la tinción utilizada. (Ej. Preparación a fresco de células catáfilo de cebolla)
d) Aumento: es la amplificación del objeto observado, es la multiplicación del aumento que nos brinda el
lente ocular por el aumento del lente objetivo que estamos utilizando.

Aumento = aumento del objetivo x aumento del ocular

e) Observaciones: considere describir la forma celular; relación con otros elementos presentes, tamaño
celular; forma, número y posición del núcleo y algunas características del citoplasma.
f) Tinción: Son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares
indica diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias o cortes celulares

TIPOS DE MICROSCOPIO

Microscopios especiales
Varias propiedades ópticas pueden utilizarse en combinación con un microscopio. Nos referiremos al
microscopio de campo oscuro, contraste de fases, fluorescencia y al microscopio electrónico.

Microscopio de campo oscuro

Se basa en la propiedad que tienen los objetos muy pequeños del orden de la longitud de onda de la luz
(o el borde de algunos objetos microscópicos tales como membranas celulares o de organelos) de
dispersar la luz, o sea el rayo de luz se “quiebra” al pasar por ellos. Si iluminamos oblicuamente el objeto
en tal forma que el rayo de luz no entre al objetivo, se observará un campo oscuro negro. Las membranas
biológicas, macromoléculas como las proteínas desvían la luz que los ilumina, permitiendo de este modo
que la luz entre al objetivo y sea vista por el observador. (Fig 5)

Fig. 5: Espermatozoides vistos a través de m. campo oscuro con objetivo de inmersión

Microscopio de contraste de fases
En este caso la luz es retardada en ciertas zonas del condensador y acelerada para compensar en las zonas
correspondientes del objetivo, por lo tanto si no hay preparación el resultado es compensado. Al haber
preparación, la luz se desvía más o menos de acuerdo a la refracción. La luz retardada por el condensador
en estas condiciones no pasa por la parte aceleradora del objetivo y el retardo de ella se hace evidente al
observador.
Además los diferentes índices de refracción de las distintas fases de la muestra producirán diferentes
desviaciones. El resultado es que la luz proveniente de la zona límite entre dos fases llega al observador
con diferentes grados de retardo, produciendo zonas oscuras donde hay cambio de fases.

Fig. 6: células sanguíneas vistas a través de m. de contraste de fases

Microscopio de Fluorescencia
Un objetivo fluorescente es aquel que, al recibir la luz de onda corta, la absorbe y emite luz de onda más
larga. La mayoría de los especímenes biológicos no son fluorescentes pero puede añadirse a la
preparación un marcador fluorescente. El microscopio de fluorescencia requiere dos filtros: uno que deje
pasar la luz de onda corta, pero no la de onda larga, para iluminar el objeto o el marcador, y el otro que
bloquea el paso de la luz de onda corta, usada para iluminar y deja pasar la luz de onda larga, emitida por
el objeto.

Fig. 7 Imagen de microtubulos (verde); cromosomas (azul) y cinetocoros (rosa). Muestra tratada con
marcadores fluorescentes.
Microscopio Electrónico
A principios de los años 1940 se desarrolló el microscopio electrónico, mucho más poderoso que el óptico.
Este instrumento, permite aumentos cercanos a 1.000.000 X (mil veces el aumento del microscopio de
luz), logrando visualizar átomos y moléculas. Su introducción en la década de los 50 abrió el campo de la
Citología clásica a la Biología Celular actual.
El principio de este instrumento es simple, puesto que la óptica usada es la misma que la del microscopio
de luz (o compuesto), usando electrones con una longitud de onda de fracciones de nanómetros. Los
electrones son fáciles de producir (basta un filamento caliente como el de una ampolleta) y de acelerar
para lograr una longitud de onda pequeña, pero no pasan por el aire, por ello el elemento más importante
de un microscopio electrónico son sus bombas de vacío.
El microscopio electrónico de transmisión consta de una columna donde está el cañón de electrones,
condensadores, objetivo, lentes intermedias, ocular – proyector y el portamuestra. Como los electrones
no son visibles al ojo humano incluyen una pantalla de observación y un sistema fotográfico. A diferencia
del anterior, el microscopio electrónico de barrido no posee lentes, salvo condensadores. Estos producen
un haz muy fino de electrones que choca en la superficie de la muestra y se desprenden nubes de
electrones secundarios. Estos, son reconocidos por un detector que asociado a un sistema generador de
imágenes nos da una imagen de la superficie de la muestra. ( Fig. 8)

Fig. 8 La figura izquierda muestra mitocondrias captadas con microscopía Electrónica de Barrido, mientras
que la foto derecha muestra mitocondrias captadas con microscopía Electrónica de Transmisión.
 LA LUPA BINOCULAR
INTRODUCCIÓN

La lupa binocular es un instrumento óptico que produce una imagen 20 y 40 veces aumentada del objeto
que se observa a través de ella, muy utilizado en laboratorios para observar organismos y objetos de
tamaño más grande de los que se suele observar en el microscopio óptico. La óptica de la lupa consta de
cuatro sistemas de lentes; los dos más próximos a los ojos del observador se llaman oculares y los dos
más próximos al objeto observado se denominan objetivos. Se llama lupa binocular por tener dos sistemas
oculares, para observar el objeto con los dos ojos a la vez. Esto permite tener una imagen del objeto en
relieve: es lo que se llama visión estereoscópica. Los oculares están insertados en dos cortos tubos. El
tubo del lado derecho posee un anillo para corregir la diferencia de visión que tengamos en nuestros ojos.
Los cuerpos de los oculares contienen unos prismas inversores que dirigen las imágenes a nuestros ojos y
pueden girar a derecha e izquierda para que su separación coincida con la separación de nuestros ojos.
(Figura n°9)

SISTEMA MECÁNICO

• Base o estativo: Base de la lupa.

• Platina: Donde se coloca la muestra a observar. Pueden utilizarse de distintos colores para aumentar el
contraste.
• Pinzas: para fijar la muestra
• Columna: donde se articulan el resto de los componentes
• Cuerpo de la lupa, que puede desplazarse verticalmente para que el objeto observado quede enfocado.
Esta operación se denomina enfocar y se lleva a cabo con dos tornillos laterales.
• Anillo de sujeción, para fijar el cuerpo de la lupa a la altura que estimemos.
• Mando de enfoque: tornillos laterales de movimiento simultáneo; éstos deslizan el cuerpo de la lupa, lo
que permite movimientos el enfoque.
COMPONENTES DE UNA LUPA BINOCULAR

(Figura n°9)