Título: Relación in-vitro entre la producción de IL-6 y citotoxicidad inducida por

curcuminoides en cáncer de mama triple negativo

In-vitro relation betwen citotoxicity and IL-6 producction induced by curcuminoids

at triple negative breast cancer

Autor: Ricardo Josué Rojas Humpire.

Estudiante del IV ciclo EP. Medicina Humana, Facultad de ciencias de la salud,

Universidad Peruana Unión, Lima, Perú.

Asesor: Alejandro Pino Figueroa, PhD, MS, BS.

Assistant Professor of Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy. MCPHS

University, Boston-USA.

Categoría: Trabajo de investigación

Conflictos de interés: El autor declara no tener ningún conflicto de interés.

Autor corresponsal

Nombre: Ricardo Josué Rojas Humpire

Dirección: Alameda III etapa Mz G-11, Ñaña, Lima, Perú.

Teléfono: + 51-940-183-056

Correo: ricardo.joshua.rojas@gmail.com

1
 Relacion in-vitro entre la produccion de IL-6 y

citotoxicidad inducida por curcuminoides en cancer de

mama triple negativo

Ricardo J Rojasa

a
EP. Medicina Humana, Universidad Peruana Unión

RESUMEN

Introducción: El cáncer de mama triple negativo (CMTN) es una patología del tejido

mamario de alta mortalidad y prevalencia en mujeres de origen latino. IL-6 es una citoquina

involucrada en diferentes patologías incluyendo el cancer, con participacion en procesos

tumorales como angiogénesis, proliferación y metastasis, razón por la cual esta

investigación tuvo como objetivos conocer la producción de IL-6 por MDA-MB 231,

variaciones en la producción de IL-6 en citotoxicidad y su relación con la misma Métodos:

Se realizo cultivos de lineas celulares a los que se midio la produccion de IL-6 por ELISA

luego se realizo el ensayo de citotoxicidad por MTS para determinar la respuesta de MDA-

MB 231 a curcuminoides junto con la medicion de produccion de IL-6 estableciendo la

relación por coeficiente de Pearson Resultados: WIL2-NS y MDA-MB 231 produjeron

5.5 ± 0.9 y 113.8 ± 12.2 pg/ml de IL-6 respectivamente, en el ensayo se citotoxicidad por

curcuminoides se encontro que la supervivencia celular disminuyo hasta 9% con curcumina

mientras que curcumina dietil succinato disminuyo hasta 16% (p<0.001). La relacion entre

2
la produccion de IL-6 y citotoxicidad para curcumina fue R= 0.68 mientras que para

curcumina dietilsuccinato fue R=0.58 Interpretación: La determinacion de IL-6 en cultivo

reveló que MDA-MB 231 es una linea productora de grandes cantidades de IL-6, por otro

lado la citotoxicidad con curcuminoides demostro ser dosis dependiente, presentando buena

relacion entre la produccion de IL-6 y la citotoxicidad, algo que nos indica un possible

mecanismo de supervivencia de este tipo de cancer.

Palabras clave: IL-6, CMTN, curcuminoides, citoxicidad

ABSTRACT

Introduction: triple negative breast cancer (TNBC) is a the breast tissue disease with high

mortality and prevalence in latinoamerican women origin. IL-6 is a cytokine involved in

different diseases as cancer, it have participation at tumoral development throught

angiogenesis, proliferation and metastasis, that was the reason why this research had the

targets know the production of IL-6 by MDA-MB 231, cytotoxicity variations of the

production of IL-6 and its relation. Methods: The production of IL-6 in cell line cultures

was measured by ELISA, after cytotoxicity assay MTS was performed to determine the

response of MDA-MB 231 with curcuminoids and measure of IL-6, finally we established

the relationship by Pearson coefficient Results: WIL2-NS and MDA-MB 231 produced

5.5 ± 0.9 113.8 ± 12.2 and pg / ml of IL-6 respectively, in the cytotoxicity assay with

curcuminoids cell survival decreased to 9% while curcumin curcumin diethyl succinate

decreased to 16% (p <0.001). The relationship between the production of IL-6 and

cytotoxicity for curcumin was R = 0.68 while for curcumin dietilsuccinato was R = 0.58

Interpretation: The determination of IL-6 in culture revealed that MDA-MB 231 is a

3
production line of hight amounts of IL-6, on the other hand cytotoxicity curcuminoids was

dose dependent, presenting good relationship between the production of IL-6 and

cytotoxicity, which shows us a possible mechanism of survival of this type of cancer.

Keywords: IL-6, TNBC, curcuminoids, cytotoxicity

INTRODUCCION

El cáncer de mama es una proliferación maligna de células epiteliales que revisten los

conductos o lobulillos que forman parte del tejido mamario, es el tipo de cáncer más

común entre las mujeres de todo el mundo representando el 16% de todos los canceres

femeninos [1]. Tiene una incidencia de 99.4 por 100000 mujeres a nivel mundial según

datos de la OMS [2], en Perú se registra una incidencia de 34 por 100000 mujeres con un

índice de mortalidad de 35.7% según datos del Instituto nacional de enfermedades

neoplásicas (INEN) [3]. El cáncer de mama triple negativo (CMTN), es un tipo de

clasificación histopatológica para los tumores mamarios que no poseen receptor para

estrógeno (ER-), progesterona (PR-) ni receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico

humano (HER2-). No posee un tratamiento farmacológico satisfactorio, siendo la tasa de

éxito clínico para el tratamiento de 1 por cada 10 pacientes con CMTN [4]. Es un cáncer

de alta mortalidad y prevalencia en mujeres de origen latino, registrándose en Perú una

frecuencia de 21.3 % dentro de todos los tipos de cáncer de mama en mujeres [2].

La investigación oncológica actual tiene como estrategia dilucidar los mecanismos

moleculares de proliferación, apoptosis y metástasis de este tipo de patologías, teniendo en

estudio numerosos blancos moleculares principalmente citoquinas [5]. IL-6 es una

citoquina pleiotrópica, perteneciente a la familia de las eritropoyetinas, interactúa con un

4
receptor de citoquinas de clase II unido a membrana (IL-6R) y soluble (IL-6Rs). La

subunidad catalítica gp130 tiene actividad tirosinoquinasa con señalización mediada por

activación de Jak/stat3 y la ruta PI3K, estas modulan la expresión genética de proteínas en

diferentes dianas celulares [6, 7]. La actividad biológica mediada por IL-6 ha sido

investigada en diferentes patologías incluyendo el cáncer. Habiéndose encontrado que en

procesos oncopatológicos necesarios para el desarrollo tumoral como angiogénesis,

proliferación y metástasis involucran la participación de esta citoquina [8, 9], pero a pesar

de ello se encontraron pocos trabajos relacionados con la contribución de IL-6 en el

desarrollo tumoral de CMTN, dejando duda si esta citoquina podría convertirse en un

posible blanco terapéutico. Razón por la cual esta investigación tuvo como objetivos

conocer la producción de IL-6 secretada por células de CMTN frente a otros tipos celulares,

variaciones en la producción de IL-6 en citotoxicidad y su relación con la misma.

MATERIALES Y METODOS

DISEÑO DEL ESTUDIO

El estudio fue de tipo experimental in-vitro

POBLACIÓN

LINEA CELULAR WIL2-NS

 Organismo: Homo sapiens, Humano

 Tipo celular: Linfocito B

 Enfermedad: Esferocitosis hereditaria.

5
  Edad: 5 años

 Género: Hombre

 Etnia: Caucásica

 Fuente: ATCC

LINEA CELULAR MDA-MB 231

 Organismo: Homo sapiens, Humano

 Tejido: Glándula mamaria/mamas, derivado de un sitio metastásico por efusión

pleural

 Tipo celular: Epitelial

 Enfermedad: Adenocarcinoma

 Edad: 51 años

 Género: Femenino

 Etnia: Caucásica

 Fuente: ATCC

UNIDAD DE ANÁLISIS

La unidad de análisis estuvo conformada por los pocillos embebidos de una solución de

curcumina o curcumina dietil succinato sobre la línea celular MDA-MB 231 y pocillos

solamente con línea celular WIL2-NS del laboratorio de post-grado en Farmacología del

Massachussets College of Pharmacy and Health Science University, Boston,

Massachussets, USA.

Se formaron los siguientes grupos:

6
Grupo 1: Pocillos con línea celular WIL2-NS (células B), cultivados en medio RPMI.

Grupo 2: Pocillos con línea celular MDA-MB 231 (CMTN), cultivados en medio DMEM

Grupo 3: Pocillos con línea celular MDA-MB 231 (CMTN), cultivados en medio DMEM,

los cuales fueron incubados con curcumina a diferentes concentraciones o diluciones.

Grupo 4: Pocillos con línea celular MDA-MB 231 (CMTN), cultivados en medio DMEM,

los cuales fueron incubados con curcumina dietil succinato a diferentes concentraciones o

diluciones.

CRITERIOS DE SELECCIÓN

1. Curcumina y Curcumina dietil succinato sintetizadas y caracterizadas en un

laboratorio de procedencia Tailandesa, pasando por control de calidad de insumos

en el laboratorio de química del Massachussets College of Pharmacy and Health

Science University, Boston, Massachussets, USA.

2. Pocillos con línea celular WIL2-NS

3. Pocillos con línea celular MDA-MB 231

4. Pocillos embebidos con curcumina o curcumina dietil succinato, a diferentes

concentraciones sobre MDA-MB 231

5. Condiciones controladas de línea celular WIL2-NS (Celulas B) (Medio RPMI,

suplementado con suero fetal bovino al 10%, antibiótico al 1% a 37oC y 5% de

CO2).

7
 6. Condiciones controladas de línea celular MDA-MB 231 (CMTN) (Medio DMEM,

suplementado con suero fetal bovino al 10%, antibiótico al 1% a 37oC y 5% de

CO2).

DEFINICIÓN OPERACIONAL DE VARIABLES

Variable Definición Indicadores Tipo Escala Valores

operatoria de
medición
Producción de Concentración ELISA Cuantitativa Razón pg/ml
IL-6 de IL-6
producida en
24 h de
exposición a
curcuminoide
Efecto Capacidad de Ensayo de Cuantitativa Razón % de viabilidad
citotóxico una sustancia MTS
para poder
disminuir la
viabilidad
celular
Curcuminoides Curcuminoides Concentración Cualitativo Nominal  Curcumina
sintetizados y de  Curcumina
caracterizados curcuminoides dietil
succinato
Línea celular Células de Frasco de Cualitativo Nominal  WIL2-NS
tejido cultivo celular  MDA-MB
especifico, 231
caracterizadas
por ATCC

PROCEDIMIENTOS

CULTIVO CELULAR

Las líneas celulares MDA-MB 231 y WIL2-NS fueron obtenidas de ATCC (colección

americana de cultivos, USA). Las cuales fueron cultivadas en Dulbecco's Modified

Eagle's Medium (DMEM) para MDA-MB 231 y Roswell Park Memorial Institute

8
medium (RPMI) para WIL2-NS, siendo suplementadas con suero fetal bovino al 10 % y

antibiótico al 1%. Las células fueron cultivadas a 37ºC en una atmósfera húmeda al 5%

de CO2 en condiciones de esterilidad. Se verifico el crecimiento celular cada 12 horas, en

un promedio de 5 a 8 días en microscopio invertido. Posterior al primer cultivo se realiza

subcultivos con previa verificación de la viabilidad del mismo, solo fueron usados los

cultivos que tuvieron viabilidad ≥ 95%.

ENSAYO DE VIABILIDAD.

El ensayo de exclusión de azul de tripán o viabilidad celular se realizó para la selección

de los cultivos celulares aptos para trabajo experimental y/o subcultivo, usando

exclusivamente los cultivos con viabilidad ≥95%. Se preparó una suspensión de células,

de donde se extrajo una alícuota de 1 ml y mezclo con 0.1 ml de solución stock de azul de

tripán, luego se realizó el conteo de las células en el Cellometer® Auto T4. El

instrumento proporcionó la viabilidad del cultivo y el número de células por mililitro

disponibles en el frasco de cultivo.

ENSAYO DE CITOTOXICIDAD POR MTS.

El ensayo se citotoxicidad inducida por curcuminoides fue evaluado utilizando la prueba

colorimétrica CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)

basada en la conversión del compuesto tetrazolium en formazan por enzimas

deshidrogenasas con NADH o NADPH de células metabólicamente activas. La prueba

fue realizada en una microplaca para cultivo celular de 96 pocillos esteril. En cada pocillo

se cultivaron 1x105 células/pocillo en 200 μL de medio (8 mm de diámetro; Falcon

9
Plastics, Oxnard,CA). Las muestras fueron incubadas a 37 ºC en una atmosfera húmeda al

5% de CO2 durante 24 horas. Posteriormente, se procedió a adicionar a la monocapa

celular curcumina y curcumina dietilsuccinato a diferentes concentraciones (1μM, 3μM,

10μM), en cada ensayo, se colocó un control positivo de viabilidad celular. Los cultivos

fueron incubados a 37ºC por 24 horas adicionales después de adicionar los

curcuminoides. La morfología de las células fue inspeccionada y observada al

microscopio por si se detectase alguna alteración. Posteriormente, se le adicionó 20μL de

solución de MTS a cada pocillo e incubadas durante 3 horas a 37 ºC. Finalmente, la

viabilidad celular fue calculada como porcentaje de la absorbancia obtenida en cada

pocillo versus el control de células control. La lectura se efectuó a una longitud de onda

de 490nm utilizando un espectrofotómetro para microplacas.

ENSAYO DE INMUNOABSORCIÓN LIGADO A ENZIMA (ELISA).

Se usó la técnica inmunológica, Human IL-6 ELISA Kit de Thermoscientific, para el

análisis de las concentraciones de IL-6.

Previo al análisis de las muestras, se realizó una curva de calibración del ensayo,

el estándar se reconstituyo en 1ml de agua ultrapura para después diluirlo a las

concentraciones de 400 pg/ml, 160 pg/ml, 64 pg/ml, 25.6 pg/ml, 10.24 pg/ml y 0 pg/ml en

medio de cultivo celular dependiendo de la línea celular respectiva. El procesamiento de

los estándares es el mismo que las muestras en investigación.

Primero se añadió en los micropozos 50 μl anticuerpo secundario biotinilado junto

con 50 μl de las diluciones estándares o sobrenadante de cultivo celular en investigación

10
por triplicado, dejando incubar por 2 horas. Después se sometió lavado con solución de

lavado, se añadió 100 μl de la solución estreptavidina-peroxidasa (enzima), este se une al

anticuerpo biotinilado para completar los cuatro miembros del sándwich, se dejó incubar

por 30 min. Después se sometió lavado con solución de lavado, se añadió 100 μl de

solución TMB (sustrato), que recibe la acción de la enzima unida para producir color, se

deja incubar por 30 min, pasado el tiempo se añadió la solución de STOP y se procedió a

medir las absorbancias. La intensidad del producto coloreado se detectó a una longitud de

onda cercana a 450nm. La absorción es directamente proporcional a la concentración de

IL-6 presente en la muestra original.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Los resultados fueron evaluados mediante el paquete estadístico SigmaPlott, a través del

cual se calcularon los siguientes estadígrafos:

 Medidas de tendencia central, media, error estándar.

 ANOVA

 Prueba de Tukey

 Coeficiente de Pearson

CONSIDERACIONES ETICAS

El presente estudio no presenta implicaciones éticas, porque se evaluó in vitro la

producción de IL-6 y la citotoxicidad de los curcuminoides en línea celular MDA-MB

231.

11
RESULTADOS

El presente estudio tuvo como objetivo determinar la relación entre la producción de IL-6

y la citotoxicidad inducida por curcuminoides en CMTN, para lo cual primero se

determinó la producción de IL-6 por ELISA en línea celular MDA-MB 231 (CMTN) y

línea celular no cancerosa WIL2-NS (Linfocitos B). Se encontró que la línea celular

MDA-MB 231 produjo 113.8 ± 12.2 pg/ml mientras que la línea celular WIL2-NS

produjo 5.5 ± 0.9 pg/ml. (Gráfica 1)

La citotoxicidad se indujo con curcuminoides en diferentes concentraciones (1μM,

3μM, 10μM), determinándose la supervivencia celular de MDA-MB 231 a través del

ensayo de citotoxicidad por MTS. Se encontró que a 1μM, 3μM y 10μM de curcumina la

supervivencia celular disminuyo a 20%, 13% y 9% respectivamente del grupo control con

95% de viabilidad (p<0.001), mientras que a 1μM, 3μM y 10μM de curcumina dietil

succinato la supervivencia celular disminuyo a 59%, 37% y 16% respectivamente del

grupo control con 95% de viabilidad (p<0.001) se determinó las diferencias entre grupos

a través de la prueba Tukey (p<0.05) (Tabla 1 y gráfica 2)

La cuantificación de IL-6 en citotoxicidad se realizó a través de ELISA. Se comparó

dos concentraciones de IL-6, una estimada de la producción y la real cuantificada en las

diferentes concentraciones de curcuminoides a los que se sometió a MDA-MB 231. En el

caso de curcumina dietilsuccinato se determinó que a 1μM, 3μM y 10μM con viabilidades

de 59%, 37% y 16% las concentraciones de IL-6 fueron 28, 33 y 26 pg/ml respectivamente

mientras que en el caso de curcumina a 1μM, 3μM y 10μM con viabilidades de 20%, 13%

12
y 9% las concentraciones de IL-6 fueron 42, 18 y 14 pg/ml respectivamente. (Tabla 2,

gráfica 3 y 4)

Para la relación entre la citotoxicidad y la producción de IL-6 se compararon los

parámetros de porcentaje de citotoxicidad, encontrando que para curcumina a 1μM, 3μM y

10μM fue 80%, 87% y 91% respectivamente mientras que para curcumina dietilsuccinato a

1μM, 3μM y 10μM fue 41%, 63% y 84% respectivamente. La producción de IL-6 en

porcentaje ajustado a supervivencia observada para curcumina a 1μM, 3μM y 10μM, fue de

210%, 138% y 156% de producción respectivamente mientras que para curcumina

dietilsuccinato a 1μM, 3μM y 10μM se encontró 53%, 100%, 186% de producción

respectivamente. La relación se determinó con la prueba de correlación de Pearson

encontrando R= 0.68 para la citotoxicidad inducida por curcumina, mientras que para la

citotoxicidad inducida por curcumina dietilsuccinato se obtuvo R=0.58. (Gráfica 5 y 6)

13
14
15
16
DISCUSION

La producción de proteínas pro-inflamatorias y citoquinas como IL-6 por células

cancerígenas es un fenómeno ampliamente documentado [10, 11]. En el presente trabajo

se encontró que MDA-MB 231 una línea de cáncer de mama triple negativa produce

cantidades elevadas de IL-6 frente a otros tipos celulares (WIL2-NS) (Gráfica 1). Esto

parece concordar con diversos trabajos respecto a las vías de señalización de esta línea

celular, donde se encontró que la ruta Jak/Stat3 es responsable de la supervivencia y

proliferación en este cáncer, la activación de Jak depende de la acción de la gp130

componente catalítico del receptor de la familia de las citoquinas de clase I, dentro de las

cuales se encontró como ligando caracterizado a la IL-6 [7].

En la actualidad el interés por remedios naturales cobra cada vez más rigor, sobre

todo en países en vías de desarrollo [12]. Los curcuminoides son metabolitos secundarios

de la Curcuma longa, caracterizados como polifenoles que tienen interés terapéutico en

diferentes dolencias. En el presente trabajo se usó curcuminoides procedentes de un

laboratorio tailandés, ambos la curcumina y su derivado sintético curcumina

dietilsuccinato demostraron tener efecto citotóxico sobre MDA-MB 231, siendo

curcumina la que presento el mayor efecto citotóxico a menores concentraciones que

curcumina dietilsuccinato (Gráfica 3 y 4), pero estudios sobre farmacocinética de

curcuminoides demostraron que el metabolismo de curcumina es muy elevado y es

probable que nunca se pueda a tener concentraciones terapéuticas sin antes llegar a tener

algún efecto tóxico , su derivado sintético curcumina dietilsuccinato parece tener interés

dado que la adición del grupo succinato mejora sus características farmacocinéticas [13].

17
 La producción de IL-6 por MDA-MB 231 en citotoxicidad se midió por ELISA.

La citotoxicidad encontrada para curcumina dietilsuccinato a 1μM mostro una

disminución de la producción de IL-6 hasta 53%, algo que podría deberse a los

mecanismos documentados sobre la modulación de NF-κB que controla la producción de

citoquinas o la interrupción de la activación de IL-6/Stat3 importante para el feedback

positivo de IL-6 [14] , las concentraciones de 3μM y 10μM mostraron aumentos hasta

186% en la producción de IL-6, por otro lado la citotoxicidad por curcumina presento

aumentos en la producción de IL-6 hasta del 210% , este aumento podría deberse a un

mecanismo de supervivencia que tal vez involucre la secreción masiva de esta citoquina

para vencer los mecanismos de inhibición por curcuminoides [15, 16] pero en su mayoría

no se encuentra documentado. Por último se estableció la relación entre los cambios de

producción de IL-6 y la citotoxicidad que presentó MDA-MB 231, encontrando buena

relación (Gráfica 5 y 6) en el aumento de la producción de IL-6 y la citotoxicidad

inducida por curcuminoides. Esta relación nos indica un posible mecanismo de

supervivencia del CMTN, que lo convierten en un atractivo blanco farmacológico.

Algunas limitaciones que se presentaron en el desarrollo del presente trabajo

fueron el factor tiempo para la realización del mismo, las leyes de uso de animales de

experimentación que obstaculizaron el uso de modelos transgénicos in-vivo, la

disponibilidad de cultivos primarios y líneas celulares de humanos. El autor recomienda

seguir trabajando con MDA-MB 231 y transfectar silenciadores del gen de IL-6 para

asegurar líneas sin producción de IL-6 y determinar su impacto en la supervivencia del

CMTN.

18
 Concluimos que MDA-MB 231 es una línea de CMTN productora de IL-6 en

concentraciones elevadas, presenta citotoxicidad por curcuminoides de manera dosis

dependiente. A medida que la citotoxicidad aumenta la producción de IL-6 se incrementa

tambien, encontrándose una buena relación entre estos dos fenómenos.

AGRADECIMIENTOS

El autor expresa su agradecimiento a los profesores que ayudaron en la orientación de

este trabajo de investigación a Alejandro Pino Figueroa PhD y Dra. Roxana Gutiérrez

Aranibar.

FUENTE DE FINACIAMIENTO

Convenio con el Massachussets College of Pharmacy and Health Science University,

Boston, Massachussets, USA. A través del programa SURF (Summer Undergraduate

Research Fellowship) que ofreció beca completa con disponibilidad de laboratorios y

reactivos.

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