Iai330 Microbiología General

Facultad de Ingeniería y Ciencias Agropecuarias
IAI330 - MICROBIOLOGÍA GENERAL
GUÍA PARA PRÁCTICAS DE

LABORATORIO
Ingeniería Agroindustrial y de
Alimentos
1
Facultad de Ingeniería y Ciencias Agropecuarias| Guía para Prácticas de
Laboratorio
Presentación
La presente Guía para Prácticas de Laboratorio ha sido desarrollada para que los
estudiantes de la asignatura de Botánica dispongan de la información necesaria
para la realización de las prácticas correspondientes de acuerdo a los temas,
objetivos y resultados de aprendizaje definidos. En este documento se incluye el
proceso en el laboratorio de experimentación e investigación, con los respectivos
recursos y resultados esperados, para que el estudiante pueda desarrollar su
práctica-taller y la elaboración de sus respectivos informes o cualquier otra evidencia
de aprendizaje, que serán evaluadas con las rúbricas que constan en los anexos.
La Guía presenta una secuencia donde se especifica cada sesión de prácticas en

laboratorio con su respectivo proceso didáctico y formativo.
2
Laboratorio
ASIGNATURA: SIGLA: IAI330 PARALELO: PERIODO:

Microbiología
General
2014-2
Fecha: May 2014 PRÁCTICA SESIONES: 2 TEMA:
No: 1 Bioseguridad en el
Laboratorio de
Microbiología
1.- OBJETIVO
Conocer las normas y los lineamientos que permiten cumplir con la Bioseguridad en
el Laboratorio de Microbiología, con el objetivo de prevenir contaminación y
consecuencias negativas para los usuarios.
2.- RESULTADOS DE APRENDIZAJE ESPERADOS
1. Identifica las condiciones de bioseguridad que deben cumplirse en el

laboratorio de Microbiología.
2. Aplica secuencialmente los pasos para salvaguardar la seguridad de los

usuarios de este laboratorio.
3.- MATERIALES/RECURSOS Y EQUIPOS
Para llevar a cabo esta práctica, es necesario el conocimiento teório previo de las
condiciones de bioseguridad que deben cumplirse en el laboratorio de Microbiología.
Los materiales a ser utilizados en la práctica son:
3
Laboratorio
- Mandil blanco manga larga

- Guantes de látex
- Mascarilla
- Gorro o cofía
- Botiquín de primeros auxilios: con todos los elementos médicos
- Basurero con identificación
- Bolsas de basura rojas
- Gafas de protección
Los equipos requeridos para realizar esta práctica son:
- Computadora con proyector y conexión a internet

- Cronómetro en correcto funcionamiento
Los recursos a utilizarse son:
- Laboratorio de Microbiología
4.- ACTIVIDAD FORMATIVA
Prerrequisitos (Antes de comenzar este ejercicio, deberás dominar lo siguiente:)
Antes de realizar la práctica, el alumno debe:
- Conocer los fundamentos de microbiología

- Dominar las normas de bioseguridad aplicables en un laboratorio de microbiología.
- Contar con los materiales necesarios para realizar la práctica
Descripción de la actividad:
En clase teórica, el docente describirá la terminología relacionada con la bioseguridad. Se

establecerán las condiciones y lineamientos para cumplir con esta prevención en el
laboratorio de microbiología.
4
Laboratorio
Se complementará el aprendizaje con recursos audiovisuales:
- Manual Merck: Seguridad en el laboratorio, disponible en:

https://www.youtube.com/watch?v=X09tFwCCssY
Previo al ingreso al laboratorio, los estudiantes deberán contar con los materiales
completos, limpios y en buen estado para realizar la práctica.
Se formarán grupos, los cuales deben exponer rápidamente:
- Normas generales sobre el comportamiento en el laboratorio

- Señalización y significado de advertencias: colores de seguridad
- Sistema globalmente armonizado de etiquetado de reactivos
- Diseño e instalaciones del laboratorio
- Normas de prevención de riesgos: primeros auxilios y evacuaciones
Una vez ejecutada la retroalimentación del curso y del docente en estos temas, se
procederá a identificar las diferentes áreas del laboratorio.
Se realizarán simulacros de:
- Ruptura de material de vidrio

- Evacuación
- Derrame de químicos
- Manejo de desechos biológicos
- Lavado de material de laboratorio
5.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
- Seguridad en el Laboratorio de Merck, disponible en:
https://www.youtube.com/watch?v=X09tFwCCssY
- Manual de Bioseguridad en el Laboratorio, Organización Mundial de la Salud, Tercera

Edición, 2005
- Bioseguridad en laboratorios de Microbiología y Biomédica, 4ed. Washington DC, Estados

Unidos, 1999.
5
Laboratorio
6.- MECANISMO DE EVALUACIÓN Y ANEXOS
Formato básico:
PRACTICA PARALELO
CATEGORIA 4 NOTA
Excelent 2
e 3 Bueno Regular 1 por mejorar
Normas generales Conoce y Conoce las Conoce No conoce las

sobre el aplica las normas y las normas de
normas las aplica normas comportamiento
comportamiento en el
generales parcialment de ni las aplica en
laboratorio de e en el comporta el laboratorio
comporta laboratorio miento y
miento en no las
el aplica en
laboratorio el
laboratorio /1
Señalización y Conoce y Conoce la Conoce No conoce la

significado de aplica la señalizació las señalización y
señalizaci ny señalizaci significado de
advertencias: colores
ón y significado ón y advertencias:
de seguridad significad de significad colores de
o de advertencia o de seguridad en el
advertenci s: colores advertenci laboratorio, ni los
as y de as: aplica
colores de seguridad colores de
seguridad parcialment seguridad
en el e en el y no los
laboratorio laboratorio aplica en
el
laboratorio /1
Sistema globalmente Conoce y Conoce y Conoce y No conoce ni

armonizado de aplica el aplica el no aplica aplica el sistema
sistema sistema el sistema globalmente
etiquetado de reactivos
globalmen globalment globalmen armonizado de
te e te etiquetado de
/1
6
Laboratorio
armonizad armonizado armonizad reactivos en el

o de de o de laboratorio
etiquetado etiquetado etiquetado
de de reactivos de
reactivos en el reactivos
en el laboratorio en el
laboratorio parcialment laboratorio
e
Diseño e instalaciones Conoce e Conoce e Conoce No conoce ni

identifica identifica mas no identifica el
del laboratorio
correctam parcialment identifica diseño e
ente el e el diseño el diseño instalaciones del
diseño e e e laboratorio
instalacio instalacion instalacio
nes del es del nes del
laboratorio laboratorio laboratorio /1
Normas de prevención Conoce y Conoce y Conoce, No conoce ni

de riesgos: primeros aplica las aplica las mas no aplica las
normas normas de aplica las normas de
auxilios
de prevención normas prevención de
prevenció de riesgos: de riesgos:
n de primeros prevenció primeros auxilios
riesgos: auxilios n de
primeros parcialment riesgos:
auxilios e primeros
auxilios /1
Procedimiento de Conoce el Conoce el Conoce Desconoce el

acciones correctiva de procedimi procedimie parcialme procedimiento
ento de nto de nte el de acciones
Ruptura de material de
acciones acciones procedimi correctivas en el
vidrio correctivas correctivas ento de caso de ruptura
en el caso en el caso acciones de material de
de ruptura de ruptura correctivas vidrio y domina
de de material en el caso las acciones
material de vidrio, no de ruptura correctivas
de vidrio domina las de
completa acciones material
mente y correctivas de vidrio y
domina no domina
las las
acciones acciones
correctivas correctivas /1
7
Laboratorio
Conoce el Conoce el Conoce el Desconoce el

procedimi protocolo protocolo protocolo de
ento de de evacuaciones y
protocolo evacuación evacuació su aplicación
de y lo aplica n y no lo
evacuació incompleta aplica
n y lo mente
aplica
Protocolo de Evacuación completa
mente /1
Acciones contra el Conoce Conoce las No No conoce las

Derrame de químicos las acciones a conoce acciones ni las
acciones llevarse a las deduce
a llevarse cabo en acciones
a cabo en caso de pero las
caso de derrame de deduce
derrame químicos correctam
de parcialment ente
químicos e
completa
mente /1
Manejo de desechos Conoce el Conoce el No conoce No conoce los

biológicos procedimi procedimie el riesgos en el
ento de nto de procedimi manejo de
manejo de manejo de ento de desechos
desechos desechos manejo de químicos
químicos químicos desechos
completa parcialment químicos
mente e /1
Lavado de material de Conoce el Conoce el Desconoc Desconoce el

laboratorio procedimi procedimie e el procedimiento
ento de nto de procedimi de lavado de
lavado de lavado de ento de material de
material material de lavado de laboratorio y no
de laboratorio material lo realiza
laboratorio y lo realiza de
y lo realiza parcialment laboratorio
completa e pero lo
mente realiza por
deducción /1
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Laboratorio
Rúbrica de evaluación escrita para presentación de informe de laboratorio:

Microbiología
General
9
Laboratorio
2014-2
Fecha: May 2014 PRÁCTICA SESIONES: 2 TEMA: Toma de
No: 2 muestras
1.- OBJETIVO
Conocer el protocolo de toma de muestras, su transporte y conservación con el

objetivo de garantizar la viabilidad del espécimen microbiológico.
1. Identifica los diferentes métodos para la toma de muestras microbiológicas
2. Aplica secuencialmente los pasos para salvaguardar las muestras a ser procesadas
en el laboratorio de microbiología.
Para llevar a cabo esta práctica, es necesario el conocimiento teórico previo de las
diferentes bacterias que pueden aislarse en las muestras. Adicionalmente, se debe
conocer las condiciones de transporte y conservación que permiten mantener la viabilidad
de las muestras.
Los materiales a ser utilizados en la práctica son:
- Mandil blanco manga larga

- Guantes de látex
- Mascarilla
- Gorro o cofía
- Frascos descartables para recolección de muestras con identificación
- Basurero con identificación
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Laboratorio
- Bolsas de basura rojas

- Gafas de protección
Los equipos requeridos para realizar esta práctica son:
- Computadora con proyector y conexión a internet

- Cronómetro en correcto funcionamiento
Los recursos a utilizarse son:
- Laboratorio de Microbiología
Antes de realizar la práctica, el alumno debe:
- Conocer los fundamentos de microbiología

- Dominar los métodos de toma de muestras microbiológicos en productos
alimentarios y ambientales.
- Contar con los materiales necesarios para realizar la práctica
En clase teórica, el docente describirá la terminología relacionada con la toma de

muestras, su manipulación, transporte y conservación. Se establecerán las condiciones y
lineamientos para cumplir con esta prevención en el laboratorio de microbiología.
Se complementará el aprendizaje con recursos audiovisuales:
- http://www.youtube.com/watch?v=M205v3wO4wU
- http://www.youtube.com/watch?v=aaWPUM6kZIo
- http://www.youtube.com/watch?v=70fGCTDjO2I
11
Laboratorio
Previo al ingreso al laboratorio, los estudiantes deberán contar con los materiales
completos, limpios y en buen estado para realizar la práctica.
Se formarán grupos, los cuales deben exponer rápidamente:
- Tipos de envase para el transporte de muestras, Requisitos en el etiquetado de las

muestras
- Toma de muestra para análisis de agua y tierra
- Toma de muestras para análisis de alimentos líquidos
- Toma de muestras para análisis de alimentos sólidos
- Transporte y conservación de las muestras
Manual de Laboratorio de Microbiología, disponible en:
http://www.izt.uam.mx/ceu/publicaciones/MMBG/files/manual_microbiologia_general.pdf
Detalle de las guías para la ejecución de las tareas: Informe, preguntas, video, etc.
Deben Incluir rúbricas donde se especifican los criterios de evaluación y su respectiva

ponderación.
Formato básico:
PRACTICA PARALELO
CATEGORIA NO
4 Excelente 3 Bueno 2 Regular 1 por mejorar TA
Tipos de envase para el Conoce y Conoce y Conoce y no No conoce ni

transporte de muestras, aplica aplica aplica los aplica los tipos
Requisitos en el completamen parcialment tipos de de envase para
etiquetado de las te los tipos e los tipos envase para el transporte
muestras de envase de envase el transporte de muestras, /1
12
Laboratorio
para el para el de muestras, Requisitos en

transporte de transporte Requisitos en el etiquetado
muestras, de el etiquetado de las
Requisitos en muestras, de las muestras
el etiquetado Requisitos muestras
de las en el
muestras etiquetado
de las
muestras
Toma de muestra para Conoce y Conoce Conoce y No conoce

análisis de agua y tierra aplica y aplica no aplica ni aplica
completamen parcial la toma toma de
te la toma de mente de muestra
muestra para la toma muestra para
análisis de de para análisis de
agua y tierra muestr análisis agua y
a para de agua tierra
análisis y tierra
de
agua y
tierra
/1
Toma de muestras para Conoce y Conoce y Conoce y no No conoce ni

análisis de alimentos aplica aplica aplica la aplica la Toma
líquidos completamen parcialment Toma de de muestras
te la Toma de e la Toma muestras para análisis
muestras de para análisis de alimentos
para análisis muestras de alimentos líquidos
de alimentos para líquidos
líquidos análisis de
alimentos
líquidos /1
Toma de muestras para Conoce y Conoce y Conoce y no No conoce ni

análisis de alimentos aplica aplica aplica la aplica la Toma
sólidos completamen parcialment Toma de de muestras
te la Toma de e la Toma muestras para análisis
muestras de para análisis de alimentos
para análisis muestras de alimentos sólidos
de alimentos para sólidos
sólidos análisis de
alimentos /1
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Laboratorio
sólidos
Transporte y Conoce y Conoce Conoce y No conoce

conservación de las aplica y aplica no aplica ni aplica el
muestras completa parcial completa Transporte
mente el mente mente el y
Transport el Transport conservaci
e y Transp e y ón de las
conserva orte y conserva muestras
ción de conserv ción de
las ación las
muestras de las muestras
muestr
as
/1
Rúbrica de evaluación escrita para presentación de informe de laboratorio:
14
Laboratorio
15
Laboratorio

Microbiología
General
2014-2
Fecha: May 2014 PRÁCTICA SESIONES: 2 TEMA: Elaboración
No: 3 de la Columna de
Winogradsky
1.- OBJETIVO
Objetivo General:
Familiarizarse con los procedimientos y conceptos relacionados a la colonización,

ubicuidad, biodiversidad microbiológica, biofilms, ciclos biogeoquímicos, reciclaje
de la materia y transformación de los elementos.
Adquirirás las siguientes habilidades:

- Colectar, confeccionar y mantener un micro-ecosistema microbiano con la elaboración
de una columna donde se desarrollarán diversos tipos de microorganismos con
distintos tipos de nutrición
- Aplicando secuencialmente los pasos desarrollara un criterio lógico del procedimiento
básico de muestreo de recursos biológicos que paulatinamente estructurarán un
ambiente micro-ecológico, con el fin de que el estudiante examine las fuentes, procesos
y cambios en un microambiente
Como resultados se estima recopilar, contar, observar y reconocer los distintos tipos de
microorganismos en un ensayo preliminar
16
Laboratorio
EQUIPOS MATERIALES
Microscopio óptico Columna transparente de cristal de 1000 mL* 1
Espátula metálica * 1
Incubadora Vaso de precipitación 300 mL *1
INSUMOS REACTIVOS
Hojas de césped cortas Azul de metileno
Agua de río fresca

Un huevo o fuente de azufre
Tierra fértil
Barro de charca
Para la presente práctica se debe conocer sobre fundamentos de ecología

microbiana, tipos de nutrición de los microorganismos su vida celular fundamentada
metabólicamente es los distintos tipos Tróficos (Quimiotrofía, Fototrofía,
Organotrofía, Litotrofía) , los distintos tipos de respiración (Aerobia, Anaerobia,
Anaerobia facultativa, microaerófilos)
Procedimiento de muestreo
- En el vaso de precipitación colocar aproximadamente 300 g de tierra fértil y mezclar con
la fuente de azufre (yema de huevo).
- Colocar el barro de charca aproximadamente formando una capa de 10 cm en el fondo
de la columna de vidrio.
17
Laboratorio
- Colocar la fuente de celulosa (césped recién cortado, hojas de lechuga, papel colocar
en el fondo de la columna, es importante que las hojas estén en el fondo o en la parte
intermedia, no en la parte superficial porque los microorganismos celulolíticos son
anaeróbicos, de tal modo que forme unos 5 cm de capa.
- Colocar la mezcla de tierra fértil y huevo empacando este material, eliminando burbujas
o aire comprimido, hasta formar una capa de 5 cm.
- El empaque de estas tres capas puede quedar en un rango de 10-15 cm de espesor
- Añadir por las paredes de la columna el agua de rio fresca, procurando no desempacar
el fondo de la columna.
- Tapar con un film plástico la boca de la columna y colocarla en un lugar aireado y bien
iluminado.
- Examinar periódicamente la columna y observar los cambios que se generan por lo
menos una vez cada dos días.
- Tomar muestras periódicas de las capas formadas y observar al microscopio, con el fin
de estudiar los distintos tipos microbianos, realizar tinciones simples.
Al finalizar la sexta semana se observará capas de comunidades bien diferenciadas
donde se distinguirán zonas como
Zona aeróbica-superior (color verde brillante) con presencia de microorganismos
fotosintéticos, cianobacterias, flagelados etc.,
Zona acuática microaerófila iluminada (bandas verdes y rojizas sobre la capa solida de
barro) presencia de microorganismos fotosintéticos anoxigénicos y dependientes del
azufre.
Zona superior barro (capa de barro marrón rica en azufre) se encontrara
microorganismos litótrofos
Zona aeróbica (negro) microorganismos anaeróbicos capaces de vivir en anaerobiosis, y
fermentadores.
PROFUNDIZACIÓN
* Señale las zonas de la columna con un diagrama y adjunte los distintos tipos de
microorganismos que esperaría encontrar en las distintas zonas citadas.
* Enumere con 3 ejemplos microorganismos que tienen este tipo de vida, y
metabolismo?
Donde se localizan los metanógenos y por qué? Qué papel cumple el azufre y la celulosa?
Gamazo, G., (2005), Manual práctico de Microbiología, Barcelona España: Ediciones

Masso, 3era Edición.
Harley, Klein, (2008) Microbiologia De Prescott, España ,Ediciones: Mcgraw-Hill /
Interamericana De España, S.A., 7ª ma edición.
18
Laboratorio
Detalle de las guías para la ejecución de las tareas:

Elaborar un informe que esté compuesto por las siguientes secciones:
Introducción (no más de 3 carillas), Objetivos, Materiales, Métodos, Resultados, Discusión
y Conclusiones
Sistema de Evaluación:
19
Laboratorio

Microbiología
General
2014-2
Fecha: May 2014 PRÁCTICA SESIONES: 2 TEMA: Tinción
No: 4 Bacteriana
1.- OBJETIVO
Objetivo General:
Realizar tinciones de bacterias para observar su estructura y clasificarlas.
Objetivos Específicos:
1. Realizar tinciones simples de bacterias.

2. Realizar tinciones diferenciales de Bacterias.
3. Observar las diferencias de bacterias Gram+ y Gram – mediante la
observación en el microscopio.
4. Clasificar las bacterias de acuerdo a la reacción de la pared celular con
colorantes.
El estudiante será capaz de:
1. Preparar muestras para observación en microscopio con tinciones simples y

diferenciales de bacterias.
2. Clasificar bacterias de acuerdo a la reacción de coloración de la pared celular de las
mismas.
3. Comparar los resultados de observación de bacterias mediante tinciones simples y
tinciones diferenciales.
20
Laboratorio
Resultados esperados:
Desarrollar tinciones simples de bacterias para observar su morfología.

Realizar tinciones diferenciales de bacterias para clasificarlas en Gram + y Gram -.
Determinar las ventajas de las tinciones diferenciales en comparación con las tinciones
simples.
Asas de laboratorio
Microscopios
Cronómetros
Cepas de bacterias
Portaobjetos
Cubreobjetos
Agua destilada
Alcohol cetona
Azul de metileno
Safranina
Cristal violeta de genciana
Lugol
Medidas de seguridad para el laboratorio:
Usar mascarilla, mandil.
21
Laboratorio
Métodos de tinción de bacterias.

Microscopía óptica y utilización del microscopio óptico compuesto.
Estructura y tamaño de las bacterias.
Clasificación de bacterias de acuerdo a la estructura .
Se van a utilizar al menos dos cepas de bacterias diferentes. Usar cada cepa de
cada tipo de medio de cultivo para preparar las muestras que se describen a
continuación:
Tinciones Simples para observación en Microscopio:
1. Pescar con la ayuda de un asa microbiológica colonias de bacterias del

medio líquido y del medio sólido.
2. Formar una capa fina en un portaobjetos.
3. Secar la muestra acercándola a la llama del mechero bunsen (tener cuidado
de no calentar excesivamente). Si se calienta demasiado, se daña la
estructura de las células.
4. Una vez que está seca la muestra, se pasa unas tres o cuatro veces sobre la
llama del mechero bunsen para fijarla. Se calienta la parte inferior del
portaobjetos.
5. Una vez fijada la muestra, se deja enfriar y luego se procede a la tinción:
6. Cubrir con Azul de Metileno o con safranina la placa, dejar reposar por 1
minuto. Lavar luego con abundante agua destilada. Secar con un papel
suavemente.
7. Observar en el microscopio.
Tinciones Diferenciales: Tinción Gram
1. Recuperar con la ayuda de un asa microbiológica colonias de bacterias del

medio líquido y del medio sólido.
2. Formar una capa fina en un portaobjetos.
3. Secar la muestra acercándola a la llama del mechero bunsen (tener cuidado
de no calentar excesivamente). Si se calienta demasiado, se daña la
estructura de las células.
22
Laboratorio
4. Una vez que está seca la muestra, se pasa unas tres o cuatro veces sobre la
llama del mechero bunsen para fijarla. Se calienta la parte inferior del
portaobjetos.
5. Una vez fijada la muestra, se deja enfriar y luego se procede a la tinción:
6. Cubrir la muestra con violeta de genciana durante 1 minuto.
7. Escurrir el colorante y cubrir con Lugol. Dejar actuar durante 1 minuto y
enjuagar con abundante agua destilada.
8. Decolorar la muestra con alcohol cetona durante 15 segundos.
9. Cubrir con el colorante que da contraste: Safranina. Dejar actuar durante 1
minuto. Luego lavar con agua destilada y secar con un papel suavemente.
10. Observar en el microscopio con el objetivo de inmersión. Cuidado!!! Usar
aceite de inmersión con este objetivo del microscopio.
Gamazo, C., López I., Díaz R. (2005). Manual Práctico de Microbiología. Barcelona
España. 3a Ed. Masson.
Forbes B., Sahm F., Weissfeld A. (2009). Diagnóstico Microbiológico de Bailey & Scott.
Madrid, España. Editorial Médica Panamericana. 12a Edición. 1160 p.
Tortora G., Berdell R., Case C. (2007). Introducción a la Microbiología. Editorial Médica
Panamericana. 9a Edición. 988 p.

y Conclusiones
23
Laboratorio
Además se incluyen formatos, plantillas, modelos, fotografías u otros, necesarios para la

realización de la tarea.
Fecha: PRÁCTICA No: 5 SESIONES: 2 TEMA: Cultivo e identificación de

bacterias
23/05/2014
24
Laboratorio
1.- OBJETIVO
Cultivar e identificar bacterias de importancia agroindustrial y de alimentos.

1. Aislar y cultivar bacterias en condiciones in vitro mediante técnicas de cultivo en
medio sólidos.
2. Identificar géneros y especies bacterianas mediante técnicas microscópicas, de
tinción y bioquímicas.
1. Manipular bacterias de importancia agroindustrial y de alimentos mediante técnicas

de cultivo in vitro (crecimiento bacteriano en cultivos puros).
2. Diferenciar y clasificar diferentes tipos de bacterias con importancia agroindustrial y

alimentaria mediante el uso de técnicas y equipos actuales para su diagnóstico en
el laboratorio.
Resultados o productos esperados de la práctica
Aislados y cultivos bacterianos en medio in vitro.
Identificación (clasificación taxonómica) de diferentes tipos de bacterias por sus

características microscópicas, de tinción y bioquímicas.

Equipos de laboratorio
Microscoscopio óptico
Incubadora
Cámara de flujo laminar
25
Laboratorio
Insumos
Aislamiento y cultivo in vitro

Asa de inoculación
Mechero o lámpara de alcohol
Tubos con AN y CN estéril
Gradillas para tubos
Cajas de Petri con AN estéril
Identificación de bacterias en laboratorio

Solución acuosa de verde de malaquita al 5%
Solución acuosa de Safranina al 0.5%
Peróxido de hidrógeno al 10%
Tubos con agar inclinado TSI (triple azúcar – hierro)
Kit Test API 20E
Solución salina estéril 0.9%
Pipeta Pasteur estéril y goma de gotero
Papel filtro
Placas porta objetos
Asa de inoculación
Manejo de microscopio óptico.

Preparación de medios de cultivo generales y específicos para microorganismos en
laboratorio.
Conocimiento de normas de bioseguridad para manejo de microorganismos.
Técnicas preparación de frotis bacterianos y tinción simple y diferencial.
A partir de una muestra bacteriana pura (problema) cada estudiante o grupo realizará el
aislamiento y cultivo bacteriano en medio líquido y sólido siguiendo los pasos:
26
Laboratorio
1. Esterilizar un asa de inoculación mediante exposición al calor del mechero.

2. Tomar una gota de la muestra problema y transferir a un tubo con agar nutritivo (AN)
inclinado estéril. Repetir el procedimiento con caldo nutritivo (CN). Realizar en trabajo
cerca del mechero o bajo la cámara de flujo laminar para evitar contaminación.
3. Repetir el procedimiento y sembrar una gota de la muestra problema en una caja de Petri
con AN mediante la técnica de triple estriado como se muestra en el diagrama:
4. Marcar los tubos y las cajas sembradas según la muestra.

5. Poner a incubar a 37ºC y observar el crecimiento luego de 24 y 48 horas según los
diagramas adjuntos.
Identificación de bacterias en laboratorio
Tinción diferencial del endosporas
La técnica se utiliza para identificación de bacilos Gram positivos esporulados,

productores de endosporas como Bacillus spp. y Clostridium spp. siguiendo los siguientes
pasos:
1. Realizar un frotis bacteriano a partir del cultivo puro de Bacillus spp. de 72 h de crecimiento
27
Laboratorio
sobre una placa portaobjetos y fijar al calor.

2. Colocar una lámina de papel filtro sobre el frotis y teñir con verde de malaquita durante 5
minutos. Durante la tinción usar calor para favorecer a la tinción.
3. Lavar y teñir con safranina durante 5 a 10 minutos.
4. Lavar, secar y observar la presencia de endosporas en el microscopio. Las endosporas
aparecen coloreadas de verde y los cuerpos bacterianos de las bacterias en rojo.
Reacciones enzimáticas (catalasa)
La catalasa es una enzima que descompone el peróxido de hidrógeno (H2O2) en oxígeno y

agua. El peróxido de hidrógeno se forma como uno de los productos finales del
metabolismo oxidativo o aeróbico de los hidratos de carbono. Si se deja acumular, el
peróxido de hidrógeno es letal para las células bacterianas. Se usa para identificar
Diferencia los géneros Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+). La
prueba de la catalasa, llevada a cabo siguiendo los pasos:
1. Poner 2 o 3 gotas de peróxido de hidrógeno sobre una placa porta objetos limpia.
3. Tomar biomasa de una o dos colonias de un cultivo bacteriano de 24 h de crecimiento en
AN.
4. Mezclar la biomasa con la gota de peróxido y observar burbujeo (positivo) o no (negativo)
(ver esquema).
Pruebas de crecimiento en medio selectivo (bioquímica)
Metabolización de azúcares y producción de gas
El agar TSI estudia la utilización de la sacarosa, glucosa y lactosa, la producción de gas y
28
Laboratorio
ácido sulfhídrico (como producto metabólico final de los aminoácidos azufrados). Este
medio se usa para la identificación de enterobacterias como Escherichia coli. El
procedimiento es:

2. Tomar una gota de la muestra problema y transferir a un tubo con agar TSI.
3. Poner a incubar a 37ºC y observar el crecimiento luego de 24 y 48 horas y observar los
cambios de coloración:
Si la bacteria problema fermenta la glucosa, acidificará el medio haciendo virar a amarillo
el indicador en el fondo del tubo, mientras que si no es fermentadora de glucosa, el medio
permanecerá de color rojo.
Si la bacteria problema fermenta lactosa o sacarosa, acidifica el medio en su superficie
volviéndolo de color amarillo, mientras que si no lo es, la superficie del medio continuará de
color rojo.
Si produce ácido sulfhídrico (debido a la reducción de las sales de hierro), se presentará
un ennegrecimiento del tubo.
Si aparece rotura o desplazamiento del medio, significa que la bacteria es productora de
gas.
Pruebas API
La batería de pruebas API20E es un sistema de identificación rápida para bacterias de la

familia Enterobacteriaceae y otras bacterias Gram (-). Básicamente consta de pruebas
bioquímicas estandarizadas y miniaturizadas junto con una base de datos. Este sistema
presenta
las ventajas de ser rápido, eficaz y de permitir realizar numerosas pruebas a la vez. Cada
tira de API 20E contiene 20 microtubos o pocillos con distintos sustratos deshidratados. La
prueba se realiza siguiendo los pasos:
1. Humidificar el sistema mediante adición de agua destilada en los pocillos de la base

de plástico transparente.
2. Tomar con el asa de siembras una colonia de la cepa a analizar y resuspender en
5ml de suero fisiológico estéril.
3. Con ayuda de una pipeta Pasteur estéril (y goma de gotero) rellenar los pocillos del
sistema de identificación según las indicaciones. Hasta el borde del tubo en todos
los casos excepto en los marcados con el rectángulo abierto [_] en los que se
rellena también la cúpula (CIT, VP, GEL).
4. En el caso de los tubos marcados con subrayado _ (ADH, LDC, ODC, H2S, URE).
29
Laboratorio
Realizar la anaerobiosis mediante adición de parafina estéril rellenando la cúpula

del tubo (una vez lleno el tubo con la muestra).
5. Incubar a 37º C durante 18-24 h. Cada tubo es una prueba bioquímica distinta (ver
tabla de resultados).
Aquiahuati, M., Pérez, M. (2004). Manual de prácticas de laboratorio de microbiología

general. Universidad Autónoma Metropolitana.
http://www.uamenlinea.uam.mx/materiales/licenciatura/diversos/AQUIAHUATL_RAMOS_M
ARIA_DE_LOS_ANGELES_Manual_de_practicas_de.pdf
Rúbrica de evaluación del informe
30
Laboratorio
31
Laboratorio
Preguntas
1. ¿Por qué el agar nutritivo es un medio de uso general para el cultivo de bacterias?
Proponga algunas substancias que se le agregan para hacerlo selectivo para bacterias
Gram negativas.
2. ¿Cuál es la información que se obtiene del cultivo de bacterias en agar inclinado y líquido
en tubos para diferentes tipos de bacterias?
3. Describa el método de identificación de bacterias por oxidasa y coagulasa.
4. Describa dos medios selectivos para el aislamiento e identificación de bacterias
contaminantes alimentarios del género Salmonella y Listeria.

Microbiología
General
2014-2
Fecha: May 2014 PRÁCTICA SESIONES: 2 TEMA: Efecto de los
No: 6 biocidas sobre las
bacterias
1.- OBJETIVO
Objetivo General:
Determinar el efecto que tienen los desinfectantes y antibióticos sobre el crecimiento

bacteriano.
Objetivos Específicos:
1. Determinar el efecto de un desinfectante sobre el crecimiento de bacterias en un

medio líquido.
2. Determinar el efecto de diferentes antibióticos sobre el crecimiento de bacterias
en un medio sólido.
32
Laboratorio
El estudiante será capaz de:
Resultados esperados:
I. Primera Parte
Tubos de ensayo con cultivo de E. coli.
Tubos de ensayo
Alfileres simples
Pinzas
Caldo nutritivo (Tripticasa de Soya)
Cloro comercial
Solución salina
Incubadora a 37°C.
Turbidímetro
II. Segunda Parte:
Tubos de ensayo con cultivo de Bacillus subtilis
Caja Petri con Agar Müller Hinton
Discos con antibióticos: Novobiocin, Penicillin, Oxaciclina, Chloranphenicol.
Asa de cristal o de Digralsky
Pipeta automática de 100 a 1000 µl.
Puntas de pipeta automática
33
Laboratorio
Incubadora
Regla
Definiciones de: antibiótico, biocida, desinfectante.

Patrones de crecimiento de bacterias en medios líquidos y medios sólidos.
Efecto de las substancias químicas sobre los microorganismos.
I. PRIMERA PARTE
1. Prepare dos soluciones de cloro:
● La primera al 5% y deposítela en un tubo de 20 ml.
● La segunda al 0.5% y deposítela en un tubo de 20 ml. (tome 1 ml de
cloro comercial y transfiera a 9 ml de agua destilada)
2. Esterilizar en el mechero bunsen tres alfileres con la ayuda de una pinza.
3. Depositar los tres alfileres en el tubo con el cultivo de E. coli.
4. Después de algunos segundos, transferir los alfileres de la manera siguiente:
a) pasar un primer alfiler al tubo con la solución de cloro comercial (al 5%).
Luego pasar el alfiler al tubo de solución salina estéril y finalmente pasar el
alfiler a un tubo de caldo nutritivo.
b) Pasar un segundo alfiler al tubo con la solución de cloro comercial diluido 10
veces (al 0.5%). Luego pasar el alfiler al tubo de solución salina estéril y
finalmente pasar el alfiler a un tubo de caldo nutritivo.
c) Pasar un tercer alfiler al tubo directamente al tubo de caldo nutritivo (que
servirá como testigo).
5. Incubar los tubos con caldo nutritivo a 37°C durante 24-48 horas para
determinar el crecimiento bacteriano en cada tubo. Determine su concentración
en el turbidímetro.
34
Laboratorio
Figura 1. Preparación de tubos para evaluación del efecto de desinfectantes sobre el

crecimiento bacteriano. Adaptado de Bason. 2002.
II. Segunda Parte:
Procedimiento:
1. Tomar 0.5 ml. (500 µl.) del cultivo bacteriano de Bacillus subtilis. Proceder a
inocular la caja Petri con Agar Muller Hinton con la ayuda del asa de Digraskil.
2. Dejar secar por 5 a 10 minutos.
3. Proceder a colocar los discos de antibióticos con la ayuda de una pinza
esterilizada al fuego (presionar ligeramente los discos contra el agar, pero sin
romper el mismo!!!). El disco debe tener una separación mínima con el borde
de la caja Petri de 15 mm. Y deben estar suficientemente separados entre sí.
4. Dejar reposar durante 15 minutos a temperatura ambiente para que el
antibiótico empiece a difundirse en el medio de cultivo.
5. Medir los diámetros de las zonas de inhibición con una regla con luz suficiente y
un fondo negro (oscuro).
35
Laboratorio
Figura 2. Procedimiento de caja Petri para evaluación de antibióticos sobre el

crecimiento bacteriano. Adaptado de Gamazo 2013.
Benson, 2001. Microbiological Applications. Laboratory Manual in General Microbiology.

Mc. Graw Hill. 8th Edition.
Gamazo, C., López I., Díaz R. (2005). Manual Práctico de Microbiología. Barcelona
España. 3a Ed. Masson.
36
Laboratorio
Forbes B., Sahm F., Weissfeld A. (2009). Diagnóstico Microbiológico de Bailey & Scott.
Madrid, España. Editorial Médica Panamericana. 12a Edición. 1160 p.
Tortora G., Berdell R., Case C. (2007). Introducción a la Microbiología. Editorial Médica
Panamericana. 9a Edición. 988 p.

y Conclusiones
37
Laboratorio
Fecha: PRÁCTICA No: 7 SESIONES: 2 TEMA: Cultivo e identificación de

hongos
23/05/2014
1.- OBJETIVO
Cultivar e identificar hongos de importancia agroindustrial.

1. Aislar y cultivar hongos en condiciones in vitro mediante técnicas de cultivo en medio
sólidos.
2. Identificar géneros y especies de hongos mediante técnicas de microscópicas y de
crecimiento en medio de cultivo.
1. Manipular hongos de importancia agroindustrial y de alimentos mediante técnicas

de laboratorio.
2. Diferenciar y clasificar diferentes tipos de hongos con importancia agroindustrial y
38
Laboratorio
alimentaria mediante el uso de técnicas y equipos actuales para su diagnóstico y

manejo.

Equipos de laboratorio
Microscoscopio óptico
Microscopio de disección
Cámara de flujo laminar
Incubadora
Insumos

Asa de inoculación
Aguja de disección
Bisturí estéril
Pinzas
Mechero o lámpara de alcohol
Cajas de Petri con agar papa dextrosa (APD) estéril

Hipoclorito de sodio 5%
Agua estéril
Papel estéril
Identificación de hongos en laboratorio

Azul de lactofenol
Papel filtro
Placas porta objetos
Asa de inoculación
Prerrequisitos
Antes de comenzar este ejercicio, deberás dominar lo siguiente:
39
Laboratorio
Manejo de microscopio óptico y estéreo microscopio.

Preparación de medios de cultivo generales y específicos para microorganismos en
laboratorio.
Conocimiento de normas de bioseguridad para manejo de microorganismos.
Técnicas preparación de frotis fungoso y tinción simple.
Aislamiento y cultivo in vitro de hongos
Se utiliza la técnica descrita por Agrios (2005) para aislamiento de hongos fitopatógenos
de muestras vegetales in vitro que consiste en:
1. Trabajar en la cámara de flujo laminar o a lado del mechero.

2. Tomar una muestra de tejido vegetal infectado y desinfectar con hipoclorito de sodio 5%
durante 30, 60, 90 y 120 segundos.
3. Cortar en trozos cuadrados de 0.5 mm de lado
4. Enjuagar varias veces los trozos desinfectados con agua destilada estéril.
5. Esterilizar una pinza con calor y transferir los trozos de muestra a un papel estéril para
quitar los residuos de líquido.
6. Cuando las muestras estén secas, transferir a cajas de Petri con APD estéril e incubar a
20 °C durante 5 días hasta observar crecimiento (micelio).
7. Purificar el aislamiento del patógeno tomando partes del hongo en esas áreas y
transfiriéndolas a una nueva caja de Petri que tenga medio de cultivo APD fresco.
40
Laboratorio
Identificación de hongos
1. A partir de una muestra enferma con signos y síntomas de una enfermedad y su

cultivo puro del hongo aislado en caja de Petri con APD identificar esporas, hifas y
estructuras de fructificación. En el cultivo en APD identificar forma de la colonia
fungosa y color.
2. Mediante una aguja de disección o un trozo de cinta adhesiva tomar una porción de
hongo de un cultivo puro en caja de Petri y colocar sobre una placa porta objetos
con una gota de azul de lactofenol.
3. Colocar al microscopio e identificar estructuras fungosas de esporas, hifas y
estructuras para fructificación.
4. Tomar muestras en fresco y observar estructura en el estéreo microscopio.
5. Comparar la información observada con claves de identificación de la Fitopatología
general de Agrios (2005) y de géneros imperfectos de Barnett y Barry (1972)
(diagramas ejemplo adjunto)
FRUTOS INFECTADOS, COLONIAS FUNGOSAS Y CUERPO FRUCTIFERO DE

Penicillium spp. CAUSANTE DE PODREDUMBRE EN CITRICOS
41
Laboratorio
Aquiahuati, M., Pérez, M. (2004). Manual de prácticas de laboratorio de microbiología

general. Universidad Autónoma Metropolitana.
http://www.uamenlinea.uam.mx/materiales/licenciatura/diversos/AQUIAHUATL_RAMOS_M
ARIA_DE_LOS_ANGELES_Manual_de_practicas_de.pdf
Agrios, G. (2005). Plant Pathology (5ª ed.). USA: ELSEVIER Academic Press.
http://www.scribd.com/doc/57849124/Agrios-Plant-Pathology-5Th-Ed
Barnett H, Barry D. (1972). Illustrated genera of imperfect fungi (3a ed.). Minneapolis,
MN, U.S.A. Burgess Publishing Company ISBN: 9780808702665.
Rúbrica de evaluación del informe
42
Laboratorio
43
Laboratorio

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GUÍA PARA PRÁCTICAS DE

La Guía presenta una secuencia donde se especifica cada sesión de prácticas en

ASIGNATURA: SIGLA: IAI330 PARALELO: PERIODO:

2.- RESULTADOS DE APRENDIZAJE ESPERADOS

1. Identifica las condiciones de bioseguridad que deben cumplirse en el

2. Aplica secuencialmente los pasos para salvaguardar la seguridad de los

3.- MATERIALES/RECURSOS Y EQUIPOS

Los materiales a ser utilizados en la práctica son:

- Mandil blanco manga larga

Los equipos requeridos para realizar esta práctica son:

- Computadora con proyector y conexión a internet

Los recursos a utilizarse son:

4.- ACTIVIDAD FORMATIVA

Prerrequisitos (Antes de comenzar este ejercicio, deberás dominar lo siguiente:)

Antes de realizar la práctica, el alumno debe:

- Conocer los fundamentos de microbiología

En clase teórica, el docente describirá la terminología relacionada con la bioseguridad. Se

Se complementará el aprendizaje con recursos audiovisuales:

- Manual Merck: Seguridad en el laboratorio, disponible en:

Se formarán grupos, los cuales deben exponer rápidamente:

- Normas generales sobre el comportamiento en el laboratorio

Se realizarán simulacros de:

- Ruptura de material de vidrio

5.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

- Seguridad en el Laboratorio de Merck, disponible en:

- Manual de Bioseguridad en el Laboratorio, Organización Mundial de la Salud, Tercera

- Bioseguridad en laboratorios de Microbiología y Biomédica, 4ed. Washington DC, Estados

6.- MECANISMO DE EVALUACIÓN Y ANEXOS

Normas generales Conoce y Conoce las Conoce No conoce las

Señalización y Conoce y Conoce la Conoce No conoce la

Sistema globalmente Conoce y Conoce y Conoce y No conoce ni

armonizad armonizado armonizad reactivos en el

Diseño e instalaciones Conoce e Conoce e Conoce No conoce ni

Normas de prevención Conoce y Conoce y Conoce, No conoce ni

Procedimiento de Conoce el Conoce el Conoce Desconoce el

Conoce el Conoce el Conoce el Desconoce el

Acciones contra el Conoce Conoce las No No conoce las

Manejo de desechos Conoce el Conoce el No conoce No conoce los

Lavado de material de Conoce el Conoce el Desconoc Desconoce el

Rúbrica de evaluación escrita para presentación de informe de laboratorio:

ASIGNATURA: SIGLA: IAI330 PARALELO: PERIODO:

Conocer el protocolo de toma de muestras, su transporte y conservación con el

2.- RESULTADOS DE APRENDIZAJE ESPERADOS

1. Identifica los diferentes métodos para la toma de muestras microbiológicas

3.- MATERIALES/RECURSOS Y EQUIPOS

Los materiales a ser utilizados en la práctica son:

- Mandil blanco manga larga

- Bolsas de basura rojas

Los equipos requeridos para realizar esta práctica son:

- Computadora con proyector y conexión a internet

Los recursos a utilizarse son:

4.- ACTIVIDAD FORMATIVA

Prerrequisitos (Antes de comenzar este ejercicio, deberás dominar lo siguiente:)

Antes de realizar la práctica, el alumno debe:

- Conocer los fundamentos de microbiología

En clase teórica, el docente describirá la terminología relacionada con la toma de

Se formarán grupos, los cuales deben exponer rápidamente:

- Tipos de envase para el transporte de muestras, Requisitos en el etiquetado de las

5.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Manual de Laboratorio de Microbiología, disponible en:

6.- MECANISMO DE EVALUACIÓN Y ANEXOS

Deben Incluir rúbricas donde se especifican los criterios de evaluación y su respectiva