AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE

2,4,6-TRINITROTOLUENO (TNT) A PARTIR DE AMBIENTES

CONTAMINADOS CON EXPLOSIVOS.

SONIA MARCELA VILLEGAS PLAZAS

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS
MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
BOGOTÁ D.C.
JUNIO 19 DE 2009

1 
 
 AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE

2,4,6-TRINITROTOLUENO (TNT) A PARTIR DE AMBIENTES

CONTAMINADOS CON EXPLOSIVOS.

SONIA MARCELA VILLEGAS PLAZAS

TRABAJO DE GRADO
PRESENTADO COMO REQUISITO PARCIAL
PARA OPTAR AL TÍTULO DE MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL

DIRECTOR: FABIO ROLDÁN, Ph.D.

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS
MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
BOGOTÁ D.C.
JUNIO 19 DE 2009

2 
 
 NOTA DE ADVERTENCIA

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada
contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan
ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el
anhelo de buscar la verdad y la justicia”.

Artículo 23 de la Resolución No. 13 de julio de 1946

3 
 
 AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE

2,4,6-TRINITROTOLUENO (TNT) A PARTIR DE AMBIENTES

CONTAMINADOS CON EXPLOSIVOS.

SONIA MARCELA VILLEGAS PLAZAS

APROBADO

__________________________ __________________________
Fabio Roldán, Ph.D. Ziv Arbeli, Ph.D.
Microbiólogo Microbiólogo
Director Codirector

__________________________ __________________________
Aura Marina Pedroza, Ph.D. Gloria Acosta, M.Sc
Bacterióloga Microbióloga
Jurado Jurado

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS
MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
BOGOTÁ D.C.
JUNIO DE 2009

4 
 
 AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE

2,4,6-TRINITROTOLUENO (TNT) A PARTIR DE AMBIENTES

CONTAMINADOS CON EXPLOSIVOS.

SONIA MARCELA VILLEGAS PLAZAS

_________________________ _________________________

Ingrid Schuler García, Ph.D Janeth Arias Palacios, M.Sc

Decana Académica Directora

Facultad de Ciencias Carreras Microbiología

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS
MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
BOGOTÁ D.C.
JUNIO 19 DE 2009

5 
 
 AGRADECIMIENTOS

A Fabio Roldán, Erika García, Ziv Arbeli y Joaquín Benavidez por permitirme
participar en un proyecto de aspiraciones grandes, imponentes e importantes. A
Fabio por ser el ejemplo de una carrera exitosa y a Erika por enseñarme a dar
pasos grandes. A Carlos por ser un compañero incondicional dentro y fuera del
laboratorio, porque gracias a su humor, serenidad y responsabilidad, este proceso
estuvo cobijado por una gran amistad. A todas las manos amigas que en momentos
de desesperación nos brindaron su ayuda, Johan, Juan Pablo, Angela y Angélica,
espero que sigan haciendo parte de este proyecto y que sus logros se queden en
casa.

A INDUMIL por creer en el proyecto y motivar la respuesta de sus participantes

dándonos un ejemplo de palabra y eficiencia. A la Unidad de Saneamiento y
Biotecnología Ambiental (USBA) por el espacio de trabajo y la formación académica.

A Fabio Roldán y Erika García por la dirección de este proyecto, los aportes
académicos, la confianza, la comprensión y el apoyo en momentos difíciles.

A mi familia por la confianza y la motivación para hacer las cosas cada día mejor y a
mis amigos por ser cómplices y víctimas de este proceso.

vi 
 
 TABLA DE CONTENIDO

AGRADECIMIENTOS …………………………………………………………………… VI

TABLA DE CONTENIDO ………………………………………………………………. VII

ÍNDICE DE FIGURAS …………………………………………………………………… IX

ÍNDICE DE TABLAS …………………………………………………………………….. X

RESUMEN ………………………………………………………………………………... XI

1. INTRODUCCIÓN ………………………………………………………………….…… 1

2. MARCO TEÓRICO ……………………..……………………………………………… 2

2.1 DEGRADACIÓN MICROBIOLÓGICA DE TNT …………………………………… 5

2.2 RUTAS METABÓLICAS …………………………………………………….……….. 7

2.2.1 VÍA I ………………………………………………………………………………….. 8

2.2.2 VÍA II …………………………………………………………………………………. 9

2.2.3 VÍA III ……………………………………………………………………...………... 11

2.3 MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE TNT ………………………….... 13

2.3.1 AISLAMIENTO ……………………………………………………………………. 13

2.3.1.2 MEDIOS DE CULTIVO ……………………………………………………….… 14

2.3.2 EVALUACIÓN DEL POTENCIAL DEGRADADOR ……………………….…... 15

3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN …………………….….... 16

4. OBJETIVOS ……………………………………………………………………….…... 17

5. MATERIALES Y MÉTODOS ………………………………………………………… 18

vii 
 
5.1 ANÁLISIS FÍSICO-QUÍMICO ……………………………………………………… 18

5.2 AISLAMIENTO ………………....………………………………………………...…. 19

5.2.1 ETAPA I: PREENRIQUECIMIENTO ……………………………….…………… 20

5.2.2 ETAPA II: AISLAMIENTO EN MEDIO DE CULTIVO SÓLIDO …………...….. 21

5.2.3 ETAPA III: SEGUNDO CULTIVO Y SELECCIÓN MACROSCÓPICA DE

COLONIAS………………………………………………………………………….……. 21

5.2.4 ETAPA IV: MÉTODOS ANALÍTICOS: HPLC ……………………………...…… 22

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ……………………….……………………………... 23

6.1 ETAPA I: PRE-ENRIQUECIMIENTO ……………………………………………... 24

6.2 ETAPA II: AISLAMIENTO EN MEDIO DE CULTIVO SÓLIDO ………….……... 27

6.3 ETAPA III: SUBCULTIVO Y SELECCIÓN DE COLONIAS ……………….……. 33

6.4 ETAPA IV: MÉTODOS ANALÍTICOS: HPLC …………………………..………… 35

7. CONCLUSIONES …………………………………………………………………….. 43

8. RECOMENDACIONES ……………………………………………………………..... 44

9. REFERENCIAS ……………………………………………………………………….. 45

10. ANEXOS …………….……………………………………………………………….. 48

viii 
 
 ÍNDICE DE FIGURAS

1. Estructura química del TNT …………..……………………………………… 3

2. Reducción de TNT mediante enzimas Nitroreductasas ………………..… 10

3. Formación del complejo Meisenheimer ……………………………………. 12

4. Transformación del complejo Meisenheimer …………………………….… 12

5. Diversidad de colonias obtenidas en T2 de la muestra No. 6 …………… 32

6. Subcultivo en medio líquido correspondiente a T2 ……………………….. 33

7. Coloraciones de Gram de las colonias T1, T100, T54 y T 137 ………….. 34

8. Cromatograma Estándar 100ppm TNT …………………………………….. 36

9. Cromatograma Control No 1 ……………………………………………….... 38

10. Cromatograma Control No 2 ….……………………………………………. 39

11. Cromatograma Cepa T1 ………………………………………………….... 41

12. Cromatograma Cepa T100 ………………………………………………… 42

ix 
 
 ÍNDICE DE TABLAS

1. Propiedades físico químicas del TNT ……………………………………..… 3

2. Estudios que reportan microorganismos como potenciales degradadores

de TNT …………………………………………………………………………..…. 6

3. Medios de cultivo más reportados para el aislamiento de microorganismos

degradadores de TNT …………………………………………………………… 14

4. Puntos de Muestreo seleccionados ……………………………………..…. 18

5. Tratamientos utilizados en el aislamiento de microorganismos

degradadores de TNT ………………………………………………………..…. 19

6. Caracterización físico química de las muestras ………………………….. 23

7. Morfología microscópica de los microorganismos desarrollados en los pre-

enriquecimientos ……………………………………………………………….... 26

8. Número de colonias seleccionadas a partir de cada muestra …………… 30

9. Cromatografía curva de calibración de TNT ……………………………… 37

10. Cromatografía Control No 1 ……………………………………………..… 38

11. Cromatografía Control No 2 …………………………………………….…. 39

12. Cromatografía Cepa T1 …………………………………………………….. 41

13. Cromatografía Cepa T100 ……….………………………………………… 42

x 
 
 RESUMEN

El 2,4,6-Trinitrotolueno (TNT) es un compuesto nitroaromático con

propiedades explosivas y gran estabilidad química. Su producción
incrementó desde la primera guerra mundial y actualmente supera los dos
millones de toneladas anuales. De la mano con su uso ha incrementado la
contaminación generada por este compuesto, el cual tiene efectos
mutagénicos y carcinogénicos. Estas características han generado la
necesidad de buscar estrategias para eliminarlo del ambiente; la
biorremediación se ha perfilado como una de las más efectivas debido a que
además de ser ambientalmente amigable, logra la mineralización completa
del contaminante. Para llevar a cabo este método es necesario conocer
microorganismos con capacidad metabólica para degradarlo. Los sitios que
presentan contaminación histórica con explosivos, son una excelente fuente
de aislamiento de microorganismos con potencial degradador, ya que están
adaptados a su presencia y han adquirido la capacidad de incorporarlo a su
metabolismo y transformarlo. El aislamiento se realizó a partir de zonas
aledañas a una de las plantas de producción y ensamblaje de explosivos
más importante de Colombia, donde se presumía había contaminación
histórica de TNT. Se utilizaron tres medios de cultivo, diferenciados
básicamente por la presencia o ausencia de fuentes adicionales de carbono
(glucosa, citrato, glicerol y acetato) y nitrógeno (NH4). El aislamiento se
realizó en tres fases diferentes, en las que se incrementó la concentración
del explosivo en el medio de cultivo desde 50ppm hasta 100ppm. Se
seleccionaron de todos los medios, las colonias que presentaron diferencias
morfológicas, y aquellas que en la última etapa se desarrollaron en el medio
de cultivo que no contenía ninguna fuente adicional de carbono y nitrógeno.
La degradación del explosivo por parte de los microorganismos aislados se
evaluó mediante la técnica de HPLC, la cual permitió comprobar el potencial
degradador de 31 cepas aparentemente diferentes.

0 
 
 ABSTRACT

2,4,6–Trinitrotoluene (TNT) is a nitroaromatic compound that has stand out

due to its explosive properties and its great chemical stability. Its production
has been increased since the World War II and now days it is over 2 million
tons per year. As well as the use of this product has been increase, the
contamination that it generates, which has mutagenic and carcinogenic
effects has also raised. These features have generated the need of strategies
that allow the elimination of this compound from the environment. The
bioremediation seems to be one of the most effective alternatives since it is
environmentally friendly and also it gets the whole mineralization of the
contaminant. In order to accomplish this method it is required to know
microorganisms metabolically capable to degrade this compound. Places that
present historic contamination with explosives or with some compounds of
similar chemical nature are an excellent isolation source of microorganisms
with degradation potential for these compounds. It occurs not only because
the microorganisms have adapted to the compound presence but also
because they have acquired the capability of incorporate it to its metabolism,
transforming it in simpler and less toxic compounds. The isolation was made
from zones near by the colombian more important explosive production and
assembly plant. Those places where presume to be contaminated with
nitroaromatics like TNT. Three different culture media were used, basically
differenced by the presence or absence of additional carbon sources
(glucose, citrate, glycerol and acetate) and nitrogen (NH4). The isolation was
made in three different phases in which the explosive concentration was
increased from 50ppm to 100 ppm. The colonies that were selected from all
the different media were those that presented morphological differences, and
those which in the last stage developed in the culture medium that has not
additional sources of carbon and nitrogen. The explosive degradation by the
microorganism was evaluated with the HPLC technique.

1 
 
1. INTRODUCCIÓN

El TNT es uno de los explosivos más importantes dentro de la industria

militar debido a que detona con gran potencia y por su estabilidad es fácil de
manipular. En Colombia, se viene utilizando en diversas actividades como la
minería, las excavaciones y las demoliciones, y esto ha provocado el
incremento de su producción.

Este compuesto es uno de los nitroaromáticos más conocidos y hace parte

de un grupo de xenobióticos recalcitrantes que generan efectos nocivos
sobre el medio ambiente. Dichas estructuras aromáticas nitrogenadas, se
caracterizan por ser compuestos persistentes y altamente tóxicos, son
químicos mutagénicos y carcinógenicos, que están clasificados por la
USEPA (del inglés United States Environmental Protection Agency) como
uno de los contaminantes de mayor prioridad, debido a su toxicidad con el
ambiente y el peligro que representan para la salud humana.

Estas características, han generado la necesidad de encontrar métodos

efectivos y ambientalmente amigables que permitan tratar diversos
ambientes contaminados con TNT. Aunque la incineración es el método más
utilizado a nivel mundial para tratar este tipo de contaminantes, en las últimas
décadas la biorremediación se ha convertido en una de las mejores
alternativas para la eliminación de contaminantes xenobióticos, debido a que
representa ventajas en cuanto a costos, seguridad, mineralización completa
y efectividad, frente a los otros métodos.

La biorremediación es definida como la degradación biológica de

compuestos orgánicos mediante el metabolismo de diversos organismos. Su
mecanismo de acción ha convertido al conocimiento de microorganismos con
potencial degradador de compuestos recalcitrantes como el TNT, en el
principal objetivo para su implementación en ambientes contaminados con
compuestos de esta naturaleza.

1 
 
Experiencias en biorremediación basadas en la degradación de compuestos
persistentes como explosivos, fenoles e hidrocarburos, reportan que los
microorganismos nativos presentes en estos ambientes contaminados son
los degradadores más efectivos, pues están adaptados a las condiciones del
ambiente y la presencia del contaminante. Esto lleva a pensar que los sitios
con presencia histórica de contaminación por TNT son unas de las mejores
fuentes para buscar degradadores nativos con capacidad para utilizar este
compuesto en su crecimiento como fuente de carbono y/o nitrógeno

2. MARCO TEÓRICO

A partir de 1830, con el desarrollo de la química orgánica, se empezaron a

sintetizar gran diversidad de compuestos, dentro de los que destacaron
gracias a su propiedad explosiva, los productos resultantes del proceso de
nitrificación (Lewis et al., 2003). La Primera Guerra Mundial, trajo consigo
un gran avance en la producción de estos compuestos, que logró consolidar
la industria militar como una de las industrias más importantes durante el
siglo XX. El 2,4,6-trinitrotolueno, más conocido como dinamita o TNT, ha sido
uno de los productos dominantes dentro de esta industria, siendo también
uno de los más utilizados en el desarrollo de bombas, granadas, propulsores
y dispositivos detonantes empleados en demoliciones (Nyanhongo et al.,
2008), gracias a que por su estabilidad es fácilmente manipulable.

El TNT es el producto de la nitración del tolueno (Figura 1), que se genera

mediante una reacción llamada sustitución electrofílica, la cual requiere la
presencia de una mezcla de ácidos nítricos y sulfúricos altamente
concentrados (McMurry, 2004). Este compuesto posee una gran estabilidad
química, y esto permite que en la producción de dispositivos detonantes
pueda utilizarse de forma pura, sin la presencia de ninguno de sus isómeros
(Unión Española de Explosivos, 1994). Sin embargo, en algunas ocasiones,
se generan mezclas con otro tipo de nitrocompuestos de igual naturaleza

2 
 
como el pentaeritritol, con el objetivo de aumentar el potencial detonante de
los productos (Ballesteros 2006).

Figura 1: Estructura química del 2,4,6-Trinitrotolueno.

Tomada de: Lewis et al., 2003

Tabla No 1: Propiedades físico químicas del TNT

Propiedad Magnitud
Punto de solidificación 80,6ºC
Punto de Degradación 300ºC
Temperatura de Explosión 400ºC
Solubilidad Agua 20oC 120mg/L
Coeficiente Henry 0,0018
Presión de Vapor 20oC 150Pa
Densidad 1,65g/cm3
Velocidad de Detonación 6900m/s
Peso Molecular 227,1 gmol

Tomada de: Unión Española de Explosivos, 1994

Byung-Hoon et al., 2008

Además de ser un compuesto químicamente estable, el TNT se caracteriza

por ser insoluble en agua, neutro y no corrosivo (Unión Española de
Explosivos, 1994). Forma cristales color amarillo pálido y bajo la luz solar se
torna color rojizo. Su temperatura de fusión está cercana a los 80,6ºC y la de
explosión supera los 400 ºC (Tabla 1), por lo cual debe utilizarse un
detonador para ocasionarla. Parte de la estabilidad de este compuesto se
debe a la insensibilidad que posee hacia los golpes, la fricción y la agitación

3 
 
(Unión Española de Explosivos, 1994). Es importante tener en cuenta que
para mantener estables sus características a temperatura ambiente y
trabajarla sin peligro de explosión, la muestra debe estar disuelta en
compuestos como etanol y acetona (Ballesteros, 2006).

EL TNT es uno de los explosivos más utilizados, su producción supera los

dos millones de toneladas anuales (Byung-Hoon In et al., 2008), y esta es
una de las razones por las cuales se ha convertido en un contaminante de
gran prioridad dentro de la lista especial que maneja la EPA acerca de los
químicos contaminantes tóxicos más peligrosos. Adicionalmente, el TNT
hace parte de un grupo de xenobióticos recalcitrantes nocivos para el
ambiente (Bradley et al., 1994); razón que cual ha motivado diversas
investigaciones dirigidas hacia la búsqueda de tratamientos que permitan
recuperar las zonas afectadas con estos compuestos, las cuales
generalmente están ubicadas alrededor de las plantas de producción, y
ensamble de armamento (misiles) o de lugares de alta actividad militar. Estas
zonas se han caracterizado por presentar concentraciones superiores a los
200g TNT/Kg de Suelo (Zoe & Neil, 2006).

Muchos de los compuestos nitroaromáticos, como los explosivos,

fertilizantes, insecticidas y solventes, han sido clasificados como compuestos
citotóxicos y carcinogénicos (Park et al., 2003). Por parte del TNT, se ha
reportado que tiene la capacidad de causar anomalías en los eritrocitos,
destrucción del hígado y diferentes tipos de cáncer (Zoe & Neil, 2006), y es
esta otra de las razones por las cuales se clasifica como un contaminante
prioritario.

Debido a que su estructura química no es similar a la de algún compuesto

generado de forma natural, el TNT, y en general todos los nitroaromáticos, se
han convertido en compuestos altamente persistentes, pues su constitución

4 
 
química artificial, limita el proceso de degradación por microorganismos
nativos presentes en los suelos contaminados (Zoe & Neil, 2006). Estas
características y su persistencia en el ambiente afecta la integridad del
ecosistema provocando efectos mutagénicos en los humanos, peces, algas y
microorganismos (Park et al., 2003).

Actualmente, se conocen diferentes tratamientos, físicos, químicos y

biológicos para tratar ambientes contaminados con explosivos, entre los que
destacan la incineración de suelos, el compostaje y la biorremediación. Sin
embargo, algunos estudios demuestran que la degradación biológica de
compuestos nitroaromáticos representa ventajas frente a las otras
soluciones, debido a que es un tratamiento ambientalmente amigable,
económico, seguro para el personal que lo efectúa y efectivo debido a que no
traslada el contaminante de un ambiente a otro, sino que realmente lo
trasforma en metabolitos simples e inocuos (Zoe & Neil, 2006).

Es así, como conocer el metabolismo de los microorganismos capaces de

degradar los explosivos en compuestos más simples y menos tóxicos para el
entorno, ha tomado gran importancia, abriendo las puertas al desarrollo de
métodos de remediación biológica.

2.1 Degradación Microbiológica de TNT

El hallazgo de microorganismos presentes en áreas contaminadas con

compuestos nitroaromáticos como TNT, solventes y fertilizantes, evidencia la
existencia de especies capaces de tolerar estos compuestos y utilizarlos en
su metabolismo, bien sea como fuente de carbono o nitrógeno. Esta
capacidad y la gran diversidad metabólica de los microorganismos se ha
convertido en un potencial biotecnológico para la biorremediación de
compuestos xenobióticos como los nitroaromáticos.

5 
 
Numerosos estudios han reportado el aislamiento de microorganismos con
potencial degradador de TNT (Tabla 2), capaces incluso de mineralizar este
compuesto, a partir de ambientes contaminados con explosivos.

Tabla No 2: Estudios que reportan algunos microorganismos

como potenciales degradadores de TNT.

FUENTE AÑO INVESTIGACIÓN

Desulfovibrio sp: Transformación de TNT en
Boopathy R., et al. 1993 compuestos como 2,4-diamino-6-
nitrotolueno.
Mycobacterium vaccae: Degradación de
TNT produciendo un compuesto marrón
Vanderberg L., et al. 1995
identificado como 4-amino-2,6-dinitroácido
benzóico.
Actinomyces sp: Degradación aeróbica y
Pasti-Grigsby M., et al. 1996 anaeróbica de TNT con producción de
intermediarios hidroxilaminotoluenos.
Estudio sobre la transformación de TNT en
Tope A., et al. 1999 aminonitrotoluenos por parte de una cepa
de Arthrobacter sp.
Anabaena sp: Transformación de TNT en
Pavlostathis S., et al. 2002
productos solubles y metabolitos polares.
Evaluación de la capacidad de Klebsiella
Kim H., et al. 2002 sp. Para degradar TNT en compuestos
menos tóxicos como amino-nitrotolueno.
Estimación de la cinética de degradación de
Park C., et al. 2002 TNT por parte de una cepa de
Pseudomonas putida.
Evaluación de la capacidad metabólica de
Escherichia coli para convertir TNT en
Yin H., et al. 2004
compuestos como Hidroxilamino-
dinitrotolueno.
Clostridium acetobutylicum: Degradación de
Kutty R., et al. 2005
TNT mediante enzimas nitroreductasas.
Raoutella terrígena degradación de TNT en
Claus H., et al. 2007
metabolitos más sencillos
Aislamiento en suelos contaminados con
Claus H., et al 2007 TNT de una cepa de Raoultella terrígena
capaz de degradar este compuesto.

6 
 
2.2 Rutas Metabólicas de Degradación de TNT:

Se conocen principalmente tres vías metabólicas por las cuales algunos

microorganismos degradan el TNT, convirtiéndolo en compuestos
intermediarios menos tóxicos. La primera (Vía I), se da en condiciones de
anaerobiosis y consiste en una transformación secuencial de los grupos nitro
unidos al anillo aromático hacia la correspondiente amina (Yin et al., 2004).
Esta vía de transformación, es generalmente realizada por microorganismos
anaeróbicos, donde Clostridium sp es uno de los más reportados, junto con
algunas bacterias sulfatoreductoras como Desulfovibrio sp (Zoe & Neil,
2006).

Así mismo, se han descrito otras dos vías alternativas, que ocurren en
presencia de oxígeno, aún cuando una de ellas no lo utiliza como aceptor
final de electrones. Precisamente, la segunda vía (Vía II), es aquella en la
que el TNT actúa como un aceptor de electrones, debido a la gran facilidad
que existe para reducir los nitro-grupos formados por los enlaces nitrógeno-
oxígeno altamente electrofílicos (Yin et al., 2004), con este metabolismo se
han reportado bacterias como Enterobacter cloacae, Escherichia coli y
Pseudomonas putida (Zoe & Neil, 2006).

La tercera vía (Vía III) es una de las rutas metabólicas más complejas, que
se caracteriza por la formación de un complejo llamado Meisenheimer, que
se genera cuando el microorganismo es capaz de atacar directamente los
enlaces que conforman el anillo aromático. Esta es una de las vías más difícil
y menos común dentro de los microorganismos reportados (Zoe & Neil,
2006).

7 
 
 2.2.1 Vía I

La descripción de esta ruta metabólica es dada con claridad en el estudio

realizado por Preuss y col. (1992), donde utilizaron bacterias
sulfatoreductoras crecidas en un medio con sulfato y piruvato como fuente de
energía y TNT como única fuente de nitrógeno.

Esta degradación consiste, básicamente, en una reducción secuencial de los

grupos nitro del TNT hasta sus respectivas aminas (Yin et al., 2004). Algunos
autores reportan que la reducción del primer nitro-sustituto del TNT, puede
darse bajo condiciones tanto de aerobiosis como anaerobiosis (Zoe & Neil,
2006). Cuando se lleva a cabo este paso se obtiene uno de los primeros
subproductos, denominado: 4-amino-2,6-dinitrotolueno (4-ADNT), y su
isómero: 2-amino-4,6-dinitrotolueno (2-ADNT) (Preuss et al., 1992). Una de
las características de esta secuencia de reacciones, es que el segundo grupo
nitrogenado no se reduce hasta que finaliza la reacción anterior, por lo cual el
segundo paso está definido por la transformación de 4-ADNT y 2-ADNT a
2,4-diamino-6-nitrotolueno (DANT) (Preuss et al., 1992).

La siguiente etapa es la reducción total del TNT, produciendo finalmente

triaminotolueno (TAT). Esta reacción requiere un donador de electrones
como el piruvato o el monóxido de carbono y un conjunto de enzimas
encargadas de catalizar la reacción, llamadas hidrogenasa, Piruvato:
ferredoxin oxidoreductasa y monóxido de carbono dihidrogenasa (Preuss et
al., 1992).

Por lo general, este paso ocurre de manera directa sin la generación de

ningún intermediario, sin embargo se han reportado casos en los que bajo la
acción de la enzima monóxido de carbono dihidrogenasa se genera un
compuesto intermediario conocido como 2,4-diamino-6-hidroxilaminotolueno

8 
 
(DAHAT) (Preuss et al., 1992). Los resultados obtenidos en este experimento
sugirieron que bajo estas condiciones, el monóxido de carbono juega un
papel bifuncional dentro de la reacción, donde además de ser el donador de
electrones puede ser inhibidor de la reducción de DAHAT a TAT (Preuss et
al., 1992).

2.2.2 Vía II

Esta es una de las rutas metabólicas que aunque no es estrictamente

aeróbica, por lo general ocurre en presencia de oxígeno (Kim et al., 2002). El
proceso, consiste en una reacción reductiva (Figura 2), a partir de la cual,
uno o máximo dos de los grupos nitro que componen el TNT son convertidos
en radicales nitroso e hidroxilamina, por acción de enzimas nitroreductasas
(Kim et al., 2002).

9 
 
 TNT 

Nitroso‐Dinitrotolueno 

Hidroxilamino‐Dinitrotolueno 

Amino‐Dinitrotolueno 

Figura 2: Reducción de TNT mediante enzimas Nitroreductasas

(Tomada de: Zoe & Neil, 2006)

10 
 
 2.2.3 Vía III

Esta ruta metabólica corresponde a la degradación aeróbica del TNT. La

formación del complejo Meisenheimer y la dependencia de oxígeno, son sus
principales características (Zoe & Neil, 2006). Actualmente no se reportan
muchos microorganismos capaces de llevar a cabo este mecanismo, sin
embargo se conoce con certeza que Pseudomonas fluorescens,
Enterobacter cloacae y Rhodococcus erythropolis son capaces de degradar
compuestos nitroaromáticos mediante esta vía (Núñes et al., 2001).

Este tipo de metabolismo, al ser uno de los más complejos, es también el

menos conocido, aunque no se han determinado con seguridad todos los
metabolitos producidos, se cree que la etapa final de esta ruta es la
mineralización total del TNT (Vorbeck et al., 1994; Núñes et al., 2001; Zoe &
Neil, 2006).

La formación del complejo Meisenheimer (Figura 3), implica la pérdida de las

propiedades aromáticas del benceno. Aunque este compuesto es uno de los
mejores donadores de electrones, cuando se encuentra nitrogenado (como lo
es el TNT), pierde propiedades oxidativas, debido a la presencia de los
grupos nitro unidos a sus carbonos 2,4 y 6 (Zoe & Neil, 2006). En
consecuencia, el potencial redox del TNT disminuye, llevándose a cabo un
ataque reductivo que trae consigo la formación NO2 y el complejo
anteriormente mencionado (Figura 4) (Núñes et al., 2001; Zoe & Neil, 2006).

11 
 
 Figura 3: Formación del Complejo Meisenheimer
(Tomada de: Vorbeck et al., 1994)

Complejo Híbrido‐Meisenheimer

Complejo Dihiíbrido‐Meisenheimer

Figura 4: Transformación del complejo Meisenheimer

(Tomada de: Zoe & Neil, 2006)

12 
 
Aunque los últimos productos de esta ruta metabólica no se han podido
identificar, se ha confirmado que la transformación del complejo dihíbrido-
Meisenheimer ocurre mediante varias reacciones de reducción que genera la
producción de diversos metabolitos y NO2 (Zoe & Neil, 2006).

2.3 Microorganismos Degradadores de TNT

2.3.1 Aislamiento

Numerosos estudios reportan que los microorganismos nativos de ambientes

contaminados con explosivos, son los microorganismos que presentan mejor
potencial degradador de compuestos nitrogenados como el TNT.

Debido a la complejidad química que caracteriza a todos los compuestos

xenobióticos, la búsqueda de estos microorganismos implica la localización
de áreas de contaminación histórica, que son aquellos lugares en los que el
compuesto ha permanecido presente durante largos periodos de tiempo; con
el objetivo de encontrar microorganismos que han conseguido adaptarse a
su presencia, desarrollando potencial degradador, que les permite
aprovecharlo en su metabolismo como única fuente de carbono o nitrógeno
(Zaripov et al., 2004; Oh et al., 1998).

Varias investigaciones reportan que el TNT es tomado por los

microorganismos como fuente única de nitrógeno (Zaripov et al., 2004; Oh et
al., 1998). Por ese motivo, necesitan la presencia adicional de compuestos
que puedan consumir como fuente de carbono, bien sea materia orgánica
presente naturalmente en el suelo o carbohidratos simples de fácil
degradación como glucosa, succinato y acetato (Gonnison et al., 1993)

13 
 
2.3.1.2 Medios de Cultivo

El aislamiento de microorganismos con este potencial degradador, requiere

de un medio de cultivo que le brinde las condiciones nutricionales para
efectuar este metabolismo. En la Tabla No 3, se muestra el contenido de
cinco medios de cultivo diferentes, utilizados en estudios realizados con
microorganismos degradadores de compuestos nitroaromáticos. En términos
generales, además del explosivo, los microorganismos deben contar con una
fuente de carbono, una solución mínima de sales, fósforo, vitaminas y
elementos traza.

Tabla No 3: Medios de cultivo más reportados para el aislamiento de

microorganismos degradadores de TNT.

FUENTE AÑO MEDIO DE CULTIVO

FC: -
FN: 100ppm DNT
Medio Base: K2HPO4, 0.7g/L; KH2PO4,0.3
g/L;(NH4)2S04, 0.5 g/L; NaCl, 0.5 g/L; MgSO4 -
Spanggord R., et al. 1991 7H20, 0.05 g/L; CaCl2.2H20, 0.1 g/L; FeSO4
7H20, 0.003 g/L.
Elementos Traza: H3BO3, 0.1g/L; CaSO4 5H20,
0.05 g/L; ZnSO4. 7H20, 0.05 g/L; Na2MoO2
6H20, 0.05 g/L.
FC: Lactato o Piruvato 30mM
FN: TNT 100ppm
Medio Base: KH2PO4, 2.94 mM; K2HPO4, 1.15
Boopathy R., et al. 1993
mM; NH4Cl, 9.35 mM; NaCl, 10.27 mM; MgCl2,
0.5 mM; CaCl2, 0.34 mM; Na2SO4, 20.0 mM;
Na2S, 0.5 mM; Resarsurina 0,003 mM.
FC: 2,5g/L Glucosa
FN: 300ppm TNT; 1g/L Sulfato de Amonio
Kim H., et al. 2002
Medio Base: 0,1g/L MgSO4; 3,5g/L K2HPO4;
1,5g/L KH2PO4; 1g/L Extracto Levadura
FC: Glucosa 5g/L
FN: TNT 12-200 g/L
Zaripov S., et al. 2003 Medio Base: 0,25g/L MgSO4; 4,5 g/L Na2HPO4;
3 g/L KH2PO4; 1 g/L (NH4)SO4; 0,05 g/L
Extracto de Levadura
Agar Nutritivo Standard
Claus H., et al. 2007
Con adición de 10mg/L TNT

14 
 
Como se muestra en la tabla anterior (Tabla No 3), la concentración de TNT
óptima para estimular la degradación del compuesto por parte de los
microorganismos, varía en las investigaciones en un rango muy amplio, pues
abarca concentraciones que van desde 50ppm, hasta 200g/L (200.000ppm).
Sin embargo algunos estudios reportan que concentraciones por encima de
los 100ppm ejercen un efecto inhibidor sobre el crecimiento de los
microorganismos con potencial degradador (Gonnison et al., 1993).

2.3.2 Evaluación del Potencial Degradador

La evaluación del potencial degradador de los microorganismos crecidos en

un medio, se da generalmente mediante el control de consumo del sustrato,
en este caso TNT. Los métodos más utilizados para esto son la
cromatografía de gases y la cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC)
(Núñes et al., 2001), el objetivo es determinar la disminución de la
concentración inicial de TNT presente en el medio en un determinado
intervalo de tiempo.

En el análisis por HPLC, un gran número de estudios reportan el etanol

(Lachance et al., 2004; Collie et al., 1995; Park et al., 2003) como la fase
líquida más utilizada, sin embargo también se usan compuestos como
metanol y acetona. Aunque esta técnica es la más reportada para el estudio
de la degradación de compuestos nitroaromáticos, Bruns-Nagel y col (1996)
reportan que la cromatografía de gases fue el método más rápido y eficiente
para la detección de compuestos como TNT, 4-ADNT y 2-ADNT en muestras
provenientes de suelos contaminados.

Por otra parte, existen técnicas más específicas, en cuanto a que son útiles
para detectar uno de los posibles productos de la degradación. La detección
de nitratos, mediante la técnica colorimétrica de Nessler, es una alternativa
viable cuando se evalúa la degradación de TNT por parte de un

15 
 
microorganismo que lleva a cabo el metabolismo aeróbico en el que se
produce el complejo de Meisenheimer (Vorbeck et al., 1994).

3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN

El uso de TNT ha incrementado con el desarrollo de la industria militar que

inició su progreso en la Primera Guerra Mundial. En Colombia, este
compuesto se utiliza en diversas actividades que incluyen la excavación, la
minería y la milicia. De la mano de su utilización, ha incrementado la
contaminación producida por la acumulación de este compuesto en diversos
ambientes. La toxicidad de su composición química y las propiedades
mutagénicas y carcinogénicas que le son atribuidas, ha incentivado la
búsqueda de soluciones efectivas y económicas, capaces de disminuir la
concentración de este compuesto sin trasladarlo de un ambiente a otro.

Actualmente, la biorremediación se perfila como una de las mejores

alternativas para remediar regiones contaminadas con compuestos
explosivos como TNT, debido a que es una solución ambientalmente
amigable que requiere una baja inversión económica. Sin embargo, en
Colombia no se reporta ninguna investigación orientada a la biorremediación
de explosivos y esto ha impedido el aprovechamiento de sus ventajas en
nuestro país.

La biorremediación, es una herramienta biológica que busca la degradación

de compuestos químicos persistentes, por medio de organismos vivos que
son capaces de metabolizarlos. Esta alternativa exige el conocimiento previo
de microorganismos (en este caso) con una capacidad metabólica para
degradar compuestos de naturaleza química similar al contaminante. Esta
necesidad y el hecho de que no existen estudios similares en Colombia, ha
motivado esta investigación, cuyo objetivo principal fue aislar
microorganismos nativos de suelos contaminados con explosivos, capaces
de degradar TNT.

16 
 
4. OBJETIVOS

4.1 OBJETIVO GENERAL:

Aislar microorganismos degradadores de TNT, a partir de ambientes

contaminados con explosivos.

4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

• Identificar sitios contaminados en los que posiblemente se encuentren

microorganismos con potencial degradador de TNT.
• Evaluar si el TNT es utilizado por los microorganismos degradadores
como fuente de carbono y/o nitrógeno, utilizando otras fuentes
adicionales fácilmente asimilables.
• Realizar una caracterización macro y microscópica de los
microorganismos degradadores de TNT aislados.
• Comprobar la degradación de TNT por parte de los microorganismos
aislados mediante la técnica de HPLC.

17 
 
5. MATERIALES Y MÉTODOS

Las muestras de suelo, agua y lodos contaminados con residuos explosivos,

entre los que se encontraban grandes cantidades de TNT, fueron recogidas
en sitios aledaños a una de las principales plantas colombianas fabricadoras
de productos explosivos comerciales. Alrededor de sus instalaciones, se
definieron doce puntos de muestreo, que fueron elegidos por su proximidad
con las áreas de manipulación del compuesto de interés y las áreas de
desechos y manejo de residuos resultantes de los procesos de producción
físicos y químicos (Tabla 4). Las muestras se almacenaron en bolsas
estériles que se mantuvieron en refrigeración hasta su análisis en el
laboratorio de USBA (Unidad de Saneamiento y Biotecnología Ambiental).

Tabla No 4: Puntos de muestreo seleccionados

No Área Muestreada
1 Exterior
2 Canal Exterior
3 Trampa Taller Multiplicador
4 Canal de la Trampa
5 Caneca
6 Tanque de Transporte
7 Ex Caja de Captación
8 Concentración Tensoactivos
9 Campo de Prueba
Lodos de Planta Tratamiento
10
de Aguas Residuales (PTAR)
11 Fitorremediación
12 Caño PTAR

5.1 Análisis Físico-Químico

Inicialmente, se realizó una caracterización preliminar de las muestras

determinando pH y salinidad, estas propiedades se calcularon siguiendo los
POE’s del laboratorio de USBA de la Universidad Javeriana. Estas
propiedades se eligieron por la facilidad y economía con la que pueden ser
calculadas y por ser las más importantes a la hora de guiarnos en la

18 
 
preparación del medio de cultivo. A la muestra número 6, correspondiente a
los trozos de producto comercial tomados del tanque transportador de la
planta no se le midieron estas variables, debido a que por su composición se
recomendó evitar al máximo su manipulación.

Incluir cálculos sobre la concentración inicial de explosivo y la presencia de

fuentes de carbono y nitrógeno, habría permitido realizar una caracterización
completa de las muestras, arrojando datos importantes para definir cuál de
los sitios funcionaría mejor como fuente de aislamiento de microorganismos
degradadores, sin embargo estos ensayos no se incluyeron en este proyecto
por limitantes de tiempo y presupuesto.

5.2 Aislamiento

La preparación de los medios de cultivo que se utilizaron fueron tomadas de

estudios que reportaron aislamientos exitosos de microorganismos
degradadores de TNT (Zaripov et al., 2004; Kim et al., 2002). Para realizar el
aislamiento a partir de las muestras tomadas, se evaluó el crecimiento de
microorganismos en tres tratamientos diferentes. La diferencia entre estos
tratamientos, fue básicamente la presencia de carbono y nitrógeno, con el fin
de determinar si el TNT era metabolizado por los degradadores como una
fuente de carbono o nitrógeno. El medio de cultivo base para los tres,
contenía una solución mínima de sales, buffer fosfato, trazas, vitaminas y
TNT.

Tabla No 5: Tratamientos Utilizados en el aislamiento

de microorganismos degradadores de TNT

Características
Tratamiento
Fuente Carbono Fuente Nitrógeno
T1 - -
T2 + -
T3 - +

19 
 
Como fuente de carbono se utilizó una mezcla de glucosa, glicerol, citrato y
acetato a una concentración final de 25 ppm, y como fuente de nitrógeno 10
ppm de nitrato de amonio (NH4NO3). El explosivo se adicionó a los tres
tratamientos en solución con acetona a una concentración final de 50 ppm,
concentración que fue seleccionada por ser la más reportada en diversas
investigaciones, como una concentración óptima para evaluar la
biodegradación de este compuesto.

El proceso que se llevó a cabo para el aislamiento de microorganismos

degradadores, se dividió en tres etapas, cada una con una duración
aproximada de diez días.

5.2.1 Etapa I: Preenriquecimiento:

Se montaron en total 36 preenriquecimientos, tres tratamientos por cada una

de las 12 muestras, utilizando frascos de vidrio estériles (100 mL).

El montaje se realizó colocando inicialmente 1 g o mL de muestra y 125 µL

de solución de explosivo en acetona, solvente que se dejó evaporar en la
cabina de flujo laminar durante dos horas, con el objetivo de volatilizar la
acetona y disminuir los residuos que pudieran interferir en los ensayos y
evitar que fuera utilizado como una fuente de carbono adicional para los
microorganismos, o ejerciera un efecto tóxico sobre los mismos.
Posteriormente, se agregaron 4 g o mL de muestra y 45 mL del medio de
cultivo correspondiente a cada tratamiento.

Los preenriquecimientos se mantuvieron a temperatura ambiente (21,0 ± 0,9

o
C) y agitación constante de 115 rpm durante 10 días. Los frascos utilizados
para mantener estos microcosmos no se sellaron completamente, para
garantizar la presencia de oxígeno en el ambiente.

20 
 
 5.2.2 Etapa II: Aislamiento en Medio de Cultivo Sólido

A partir de los preenriquecimientos, se realizaron diluciones seriadas (10-2, a

10-5) en solución salina al 0,85% p/v, utilizando la metodología estandarizada
por Latorre (2007) en el laboratorio de USBA. Todos los preenriquecimientos,
fueron sembrados en superficie por duplicado en tres medios de cultivo
sólidos, correspondientes a T1, T2 y T3 (Tabla 5).

Adicionalmente se realizó un ensayo en una de las réplicas del Tratamiento1

(T1) que consistía en adicionar el explosivo en la superficie del medio ya
solidificado, mientras que en los otros tratamientos se manejó disolviendo la
solución de explosivo y acetona en el medio líquido estéril justo antes de
servir las cajas.

Todos los cultivos fueron incubados a temperatura ambiente (21,0 ± 0,9 oC)
en condiciones aeróbicas, durante aproximadamente dos semanas.

5.2.3 Etapa III: Segundo cultivo y selección macroscópica de colonias.

La etapa III inició con la selección de todas las colonias que crecieron en los
tratamientos y presentaron diferencias macroscópicas, esperando tomar el
mayor número de posibles degradadores. El segundo cultivo se realizó en
medio sólido de cada uno de los tratamientos con concentración doble de
TNT (100ppm) para generar mayor presión selectiva sobre los
microorganismos. Para llevar a cabo el aislamiento de estas colonias se
utilizaron cajas de petri marcadas con una cuadrícula de 22 espacios (uno
para cada colonia).

Cada colonia seleccionada se repicó con un palillo de madera estéril en los

tres tratamientos, el cual se introdujo finalmente en un tubo para centrífuga
(50 mL) con 10 mL de T2 (100 ppm de TNT), medio de cultivo elegido para el

21 
 
análisis mediante HPLC, debido a que es reportado como el medio más
favorable para la degradación del compuesto evaluado.

Estos cultivos fueron incubados a temperatura ambiente (21,0 ± 0,9 oC)

durante 10 días. Finalizado este periodo, se evaluaron las características
macroscópicas y microscópicas de todas las colonias. Se definió como
primer criterio de selección el crecimiento positivo en T1, debido a que por
sus condiciones nutricionales este medio podría ser el más selectivo.

Posteriormente se evaluaron las colonias crecidas en T2 y se seleccionaron

aquellas que presentaran morfologías macro y microscópicas diferentes.

5.2.4 Etapa IV: Métodos Analíticos: HPLC

El TNT residual de los tubos sembrados en la etapa anterior, fue evaluado

mediante cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC), basándose
principalmente en el método 8330 descrito por la EPA (EPA, 1994). Para su
desarrollo se tomaron 1.2 ml de cada cultivo y se centrifugaron a 1200 rpm
durante 10 min; el sobrenadante obtenido se pasó a través de un filtro de
membrana 0.2 µm (Advantec) de nitrato de celulosa. Posteriormente se
inyectaron 100 µL de cada muestra al equipo de HPLC marca Shimatzu
prominence, que consta de un detector de diodos y una columna Restek C-
18. Se utilizó una solución Metanol:Agua (50:50 v/v) como fase móvil con un
flujo de 1 ml/minuto y una temperatura de 35ºC. La longitud de onda
empleada para la detección de los picos de TNT fue 254 nm.

Una solución estándar de TNT fue utilizada para validar el tiempo de

retención de este compuesto y se procesó bajo las mismas condiciones.

22 
 
Para poder cuantificar la concentración de TNT presente en los cultivos, se
elaboró una curva patrón, utilizando soluciones estándar preparadas con
concentraciones conocidas de TNT (12,5 ppm, 25 ppm, 50 ppm, 100 ppm).

Se definieron dos controles diferentes. El control No 1 correspondió al medio

de cultivo del Tratamiento 2 sin ser inoculado, el cual permitió cuantificar la
concentración inicial de TNT presente en el medio. El segundo control fue
tomado del medio de cultivo T2 contenido por un palillo de madera estéril,
igual a los que se utilizaron para inocular las cepas. Esto con el objetivo de
visualizar su efecto en el medio.

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Se realizó una caracterización preliminar físico-química de las muestras y se

obtuvieron los siguientes valores de pH y conductividad.

Tabla 6: Caracterización físico-química de las muestras

Conductividad
Muestra No pH Dilución
(deciSiemens/metro)
1 7,11 0,34 1:1
2 7,34 0,22 1:1
3 6,58 0,17 -
4 7,14 1,15 -
5 2,11 1,47 -
7 7,54 0,44 -
8 7,20 14,96 -
9 7,88 0,63 -
10 8,73 1,57 1:1
11 7,42 0,47 1:1
12 8,95 0,44 1:1

La conductividad de los ambientes muestreados se determinó con el objetivo

de tener un indicio a cerca de las propiedades salinas de los mismos, para
así orientar la preparación de los medios de cultivo. En general, los valores
de todas las muestras estuvieron entre 0 y 2 dS/m, valores entre los que se

23 
 
consideran ambientes normales de baja salinidad. Sin embargo, la muestra
No. 8, procedente del tanque de concentración de tensoactivos, obtuvo una
conductividad superior de 14,96 dS/m indicando características de fuerte
salinidad (Tabla No. 6). Este fenómeno, puede deberse a la presencia de
compuestos como carbonatos, cloruros y sulfatos, que junto con los
tensoactivos, pueden ser compuestos residuos de la producción de los
explosivos comerciales.

Como se puede visualizar en la Tabla No 6, la mayoría de las muestras

presentaron un pH cercano a la neutralidad, sin embargo algunas de ellas
arrojaron valores extremos de acidez y alcalinidad. Aunque es difícil pensar
que a partir de muestras con un pH de 2,11 se logren obtener
microorganismos nativos que puedan desarrollarse en un medio de cultivo
con pH neutro, no se considera una variable que pueda influir en el
aislamiento de microorganismos degradadores de TNT, ya que como lo
reportan Zaripov (2004) y Kim (2002) en sus estudios, la degradación
biológica de compuestos nitroaromáticos ha sido posible en amplios rangos
de pH.

6.1 Etapa I: Pre-enriquecimiento

Todos los pre-enriquecimientos presentaron turbidez lo cual podía ser

considerado como indicador de crecimiento. Se comprobó la presencia de
microorganismos mediante coloración de Gram y se observaron
principalmente tres morfotipos: cocos Gram positivos, bacilos Gram positivos
(GP) y bacilos Gram negativos (GN), siendo las dos últimas las morfologías
más predominantes. Un estudio realizado por Fuller y col (1996) demostró
que las bacterias Gram positivas son muchos más sensibles al TNT que las
bacterias Gram negativas, las cuales tienden a tolerar concentraciones más
altas de este compuesto y presentar velocidades de degradación mucho más

24 
 
eficientes. Sin embargo, en la evaluación microscópica que se hizo de los
pre-enriquecimientos, fue más común la presencia de bacterias GP que GN
(Tabla 7), lo que puede deberse a la ventaja que representa para estas
bacterias (GP) la esporulación.

A pesar de que los pre-enriquecimientos preparados presentaban una

concentración considerable de TNT (50 ppm), la presión selectiva que este
ejerció sobre los microorganismos no fue tan alta, debido a la posibilidad de
que las muestras (suelos, lagos y aguas) contuvieran algunas trazas de
carbono y nitrógeno fácilmente asimilables. Aunque habría sido bastante útil
determinar la presencia de estas trazas y la concentración inicial de TNT en
cada una de las muestras para conocer con certeza las condiciones
nutricionales bajo las cuales se desarrollaban los microorganismos nativos,
esta determinación no se realizó por limitantes de tiempo y presupuesto.

En algunas muestras se observó la presencia de bacilos Gram negativos

curvos y en forma de “S”, muy similares a las bacterias características del
ciclo del azufre (Tabla 7). En un estudio realizado por Kulkarni y Chaudhari
(2007) se presentó una revisión general de los microorganismos capaces de
degradar compuestos nitroaromáticos, donde encontraron que Desulfovibrio
sp y en general bacterias sulfato reductoras, presentan la capacidad de
degradar TNT. La morfología característica de estas bacterias se encontró en
los Tratamientos 1 y 2 (Tabla 7), los cuales tienen en común la ausencia de
una fuente adicional de nitrógeno. El estudio mencionado, reporta que estas
bacterias utilizan el TNT como única fuente de nitrógeno, convirtiéndolo en
triaminotolueno (TAT) y algunos otros compuestos no identificados.

Es importante tener en cuenta que al abrir los frascos de los pre-

enriquecimientos, el sonido y los olores percibidos evidenciaron la
acumulación de gases, los cuales sugieren un metabolismo activo por
microorganismos dentro de los mismos.

25 
 
Aunque inicialmente las condiciones de los microcosmos fueron aeróbicas,
es probable que al finalizar el periodo de incubación, la disponibilidad de
oxígeno haya disminuido y las condiciones finales fueran favorables para el
crecimiento de microorganismos anaerobios. La degradación de TNT se
puede llevar a cabo en cualquiera de estas condiciones, de hecho
microorganismos estrictamente anaeróbicos como Clostridium sp.y
Acetobacterium sp han sido reportados como potenciales degradadores de
compuestos nitroaromáticos como TNT (Neal & Arnett, 2004; Kutty &
Bennett, 2005).

Tabla 7: Morfología microscópica de los microorganismos desarrollados en

los pre-enriquecimientos.

Bacilos Bacilos Cocos

Otra
Mtra. Tto Gram Gram Gram
Morfología
Positivos Negativos Positivos
T1 x - x -
BGN en
1 T2 x - x
forma de S
T3 x - - -
T1 x - x -
2 T2 x - x BGN curvo
T3 x x - -
T1 x x x -
3 T2 x - x -
T3 x - x -
BGN en
T1 x - x
forma de S
4 BGN en
T2 x - x
forma de S
T3 x - x -
T1 x x - -
5 T2 x - - -
T3 - - x -
T1 x - x -
6 T2 x - x -
T3 x - x -

26 
 
 Bacilos Bacilos Cocos
Otra
Mtra. Tto. Gram Gram Gram
Morfología
Positivos Negativos Positivos
T1 x - x -
BGN en
7 T2 x x x
forma de S
T3 x - - -
T1 x - - -
8 T2 x - - BGN curvo
T3 x - - -
T1 x x - -
9 T2 x - - -
T3 x - - -
T1 - - - -
10 T2 x - - -
T3 - - - -
T1 x x - -
11 T2 x x - -
T3 - x - -
BGN en
T1 x - -
forma de S
12
T2 x x x -
T3 x - - -

6.2 Etapa II: Aislamiento en medio de cultivo sólido

El crecimiento de colonias en los medios de cultivo correspondientes a los

tres tratamientos fue muy diverso, sin embargo no se observó ninguna
característica particular de las colonias conocidas de los microorganismos
degradadores de TNT que son descritas en estudios anteriores.

Nyanhongo y col (2008) por ejemplo, realizaron un estudio en el que lograron

identificar el potencial degradador de microorganismos como Pseudomonas
putida y Bacillus SF en medio de cultivo sólido, gracias a las características
macroscópicas y el viraje del color del medio provocado por las colonias.
Según los resultados de esta investigación, cuando los microorganismos
degradan los cristales de TNT, forman colonias color rojo oscuro y viran el
color del medio a rojo o amarillo, dependiendo del metabolito que produzcan.

27 
 
Con el objetivo de evidenciar un efecto parecido, se realizaron dos ensayos
sobre la forma de adicionar el explosivo al medio de cultivo, en superficie y
en solución. Aunque se encontraron diferencias importantes en el
crecimiento de microorganismos adicionando la solución de TNT en la
superficie del medio, es necesario estandarizar la concentración de TNT bajo
la cual se logra opacidad en el medio de cultivo, de tal forma que se puedan
observar los halos de degradación, o se logre visualizar el cambio de color
provocado por la producción de metabolitos como 2-aminodinitrotolueno y
sus isómeros.

En este ensayo, en el que el TNT fue adicionado en la superficie del medio

una vez solidificado, el número de colonias obtenidas fue mucho más
pequeño y la diversidad morfológica que se apreció en estas cajas fue
menor, probablemente debido a que la concentración final de TNT que se
consiguió sobre la superficie del medio fue mayor que la que resultó con la
disolución del explosivo en el medio líquido, ensayos en los que el número
de colonias fue mucho mayor y con una distribución en el medio mucho más
homogénea.

La adición del explosivo en la superficie, formó una mancha blanca opaca

sobre el medio, que se difuminó al adicionar el inóculo. Sin embargo, en una
de las cajas fue posible observar el crecimiento de dos colonias circulares,
pequeñas, blancas, convexas y de borde regular sobre la mancha de TNT.
Alrededor de las colonias se identificó la formación de una zona de
aclaramiento, que sin ser totalmente translúcida, fue posible diferenciarla en
la superficie del medio. Aunque no se puede afirmar que dicha zona
corresponde a un halo de degradación, es importante tener en cuenta, que
estas dos colonias además de presentar la morfología más abundante
encontrada en los diferentes ensayos, fueron seleccionadas para pasarlas al
subcultivo de la Etapa III. De igual forma presentaron un crecimiento
abundante en el Tratamiento 2, que según la teoría se ha reportado como el

28 
 
medio de cultivo óptimo para el crecimiento de los microorganismos con
potencial degradador de TNT.

Diversos estudios (Gonnison et al., 1993; Zaripov et al., 2003; Stenuit et al.,
2006; Kulkarni M. & Chaudhari A., 2007), han demostrado que dichos
microorganismos utilizan el explosivo como única fuente de nitrógeno, por lo
cual recomiendan agregar al medio de cultivo una fuente adicional de
carbono fácilmente asimilable como la glucosa o el acetato (Gonnison et al.,
1993), para generar un balance de nutrientes favorable para la degradación.
En este estudio, el tratamiento con estas características (T2) no solo
presentó el mayor número de colonias, sino que fue donde mayor diversidad
morfológica se observó.

Como parte de los resultados, se esperaba que el crecimiento en los otros

tratamientos, en los que no se adicionaba ninguna fuente de carbono, fuera
bajo; sin embargo en T3, por ejemplo, la mayoría de las muestras
presentaron crecimiento masivo de una colonia puntiforme, trasparente y
regular. Mientras que en T1, a pesar de ser el tratamiento con menor
recuperación de biomasa, fue bastante diverso.

Es posible suponer que todos los microorganismos capaces de desarrollarse

bajo las condiciones nutricionales de estos medios, son potenciales
degradadores de TNT, sin embargo es importante tener en cuenta, que al ser
muestras procedentes de suelos y lodos, las suspensiones inoculadas,
podrían contener algunas trazas importantes de carbono orgánico y
nitrógeno fácilmente asimilable, suficientes para permitir su desarrollo; razón
por la cual se realizaron pases sucesivos de las colonias en medios de
cultivo con mayor concentración de explosivo (100ppm), esperando ejercer
una presión selectiva sobre los microorganismos no degradadores de TNT.

29 
 
 Tabla 8: Número de colonias seleccionadas
a partir de cada muestra.

Muestra Origen No Colonias

1 Exterior 22
2 Canal Exterior 22
3 Trampa Taller Multiplicador 20
4 Canal de la Trampa 18
5 Caneca 16
6 Tanque de Transporte 14
7 Ex Caja de Captación 14
8 Concentración Tensoactivos 8
9 Campo de Prueba 15
10 Lodos de PTAR 6
11 Fitorremediación 4
12 Caño PTAR 5

El crecimiento de microorganismos fue muy diferente en todas las muestras.

Aunque en términos generales, fue positivo para todas, se obtuvo un mayor
número de colonias potencialmente degradadoras, a partir de los cultivos
procedentes de las muestras 1, 2 y 3 (Tabla 8). Estas muestras se
caracterizaron por estar constituidas de lodo y agua procedentes del pantano
que rodeaba la planta de cristalización del explosivo (Muestra No 1) y los
canales de desagüe ubicados alrededor de ella (Muestras No 2 y 3). La
carga microbiana puede deberse a la alta disponibilidad de nutrientes de
estos ambientes y la lejanía de los mismos con fuentes de contaminación por
sustancias químicas que puedan ejercer algún efecto tóxico.

La muestra No 10 y la Muestra No 12, presentaron el pH más alto de todas

las muestras obtenidas, 8,73 y 8,95, respectivamente (Tabla 6). La primera
corresponde a los lodos de la Planta de Tratamiento de Aguas Residuales
(PTAR) caracterizados por contener altas concentraciones de aluminio, y la
segunda al caño ubicado alrededor de ésta. Probablemente el pH alto,
influyó en que a partir de estas muestras la recuperación de colonias no haya
sido muy abundante, pues como se muestra en la Tabla 8 fueron las

30 
 
muestras a partir de las cuales se seleccionaron menos colonias
aparentemente degradadoras de TNT. El impacto químico característico de
estas zonas es la causa de la carga microbiana reducida presente en estos
ambientes.

Contrario a esto, la Muestra No 5, que también se caracterizó por tener un

pH extremo, pero en este caso ácido con un valor de 2,11, presentó en
comparación con las muestras 10 y 12, un crecimiento abundante. Mientras
en T2 se obtuvo gran diversidad morfológica (Figura 5), en T1 y T3, las
colonias, aunque abundantes fueron todas muy similares: trasparentes,
pequeñas, convexas y circulares. Debido a que el pH del medio utilizado se
encontraba cercano a la neutralidad, no se esperaba crecimiento microbiano
a partir de estas muestras, pues se dio un cambio drástico en las condiciones
ambientales, y se esperaría que esto generara estrés en los
microorganismos inhibiendo su crecimiento. Estos resultados abren dos
nuevos interrogantes, el primero dirigido a la razón por la cual a partir de una
muestra con un pH extremadamente ácido como lo es 2,11, lograron aislarse
un gran número de microorganismos en un medio con condiciones
nutricionales especiales y un pH cercano a la neutralidad. Y el segundo,
dirigido hacia la evaluación de la eficiencia de microorganismos acidófilos
para degradar compuestos nitroaromáticos como los explosivos.

Es probable que la diferencia existente entre la recuperación de la biomasa

que se logró en las muestras con pH básico y ácido, no se deba
necesariamente a la influencia del pH sobre la capacidad degradadora de los
microorganismos, sino que es importante tener en cuenta que las muestras
de pH básico fueron tomadas de zonas que con el objetivo de eliminar
residuos del contaminante, habían sido sometidas a diversos tratamientos
por los cuales podrían estar presentes algunas sustancias químicamente
tóxicas, afectando directamente la carga microbiana de estos ambientes.

31 
 
 Figura
a 5: Diversid
dad de colo
onias obten
nidas en T2 de la Muestra No 5

En cuanto a la Mue
estra No 6,
6 que corresponde al bloque de produccto
c
comercial tomado
t dirrectamente del tanque de transsporte, no se esperab
ba
e
encontrar crecimiento
c o. Sin emb
bargo, a pa
artir de estta muestra
a se lograro
on
i
identificar 14
1 morfolog
gías diferen
ntes (Tabla
a No 8). Au
unque el crrecimiento no
n
f
fue tan ab
bundante como
c en la
as Muestra
as 1 y 2, hubo creciimiento y se
s
l
lograron ide
entificar má
ás coloniass diferentess que a parttir de muesstras con alto
i
impacto químico como
o la 10 y la 12.

Por otra pa
arte, en las Muestras 8 y 11, tom
madas del ta
anque de concentració
c ón
d
de tensoa
activos y el camp
po de tra
atamiento por fitorrremediació
ón,
r
respectivam
mente, el crecimientto fue mu
uy bajo; probablemente por la
c
concentrac
ción de aluminio provveniente de
e la PTAR y la conccentración de
d
c
compuesto
os tensoacttivos, los cuales
c adem
más de se
er molécula
as complejas
d
difíciles de degradar, tienen un efecto emu
ulsionante, que puede
e provocar la
f
floculación de los nutrrientes, hacciendo más difícil su assimilación.

e 14 y 16 colonias co
A partir de las Muesttras 4, 7 y 9 se obtuvvieron entre on
a
aparente potencial de
egradador, cifra
c muy próxima
p a la
a que se ob
btuvo a parrtir
d las primeras muesttras (Tabla 8).
de

32 
 
6 Etapa III:
6.3 I Subculttivo y selec
cción de colonias
c

En total se
e seleccion
naron a pa
artir de lass 12 muestras, 165 colonias
c qu
ue
p
presentaron morfolog
gías apare
entemente diferentess. Estas colonias se
s
s
subcultivaro
on en los tres medioss de cultivo
o y se coloccaron en su
uspensión en
e
T con con
T2 ncentración
n doble de TNT (100
0ppm), med
dio que fue
e elegido por
p
f
favorecer la
a degradacción del exp
plosivo.

Después del periodo de incubacción, todos los tubos eppendorf

e e los que se
en s
s
sembraron las colonia
as presenta
aron turbide
ez y un color amarillo más intensso
q el del medio de cultivo
que c iniciial (Figura 6). Investig
gaciones re
ealizadas por
p
Nyanhongo
o y col (200
08), mostra
aron que essta coloraciión se pressenta cuand
do
s acumulan en el medio subproducto
se os de la degradació
ón como 2-
A
Aminodinitr
rotolueno y 4-Aminod
dinitrotoluen
no, los cuales son pro
oducidos por
p
B
Bacillus, Desulfovibrio
o sp. (Kulka
arni et al., 2007), Pse
eudomonass sp. (Park et
a 2002) y algunos consorcioss microbian
al., nos de baccterias Gram Negativas
(
(Kulkarni ett al., 2007)..

Figu
ura 6: Subc
cultivo en medio líqu
uido corres
spondiente
e a T2.

33 
 
A
Aunque la mayoría de
d las colo
onias que se sometie
eron a este subcultivvo,
l
lograron re
ecuperarse en T2, no todas pressentaron crecimiento
c en T1 y T3.
T
Por este motivo,
m se utilizó el crecimiento
o en T1 como prime
er criterio de
d
s
selección para elegirr las colon
nias de los cultivos que sería
an evaluado
os
m
mediante HPLC,
H debido a que la presión selectiva a la que se
e sometiero
on
e
estos micro
oorganismo
os fue muccho más altta al increm
mentar la concentració
c ón
d TNT.
de

L
Las coloraciones de Gram que se realiza
aron a los subcultivoss líquidos de
d
c
colonias qu
ue se analizzaron mediante HPLC
C, revelaron
n que en su mayoría, los
m
microorgan
nismos capa ecer en un medio de cultivo con
aces de cre n condiciones
a
altamente selectivas
s c
como las de
d T1, son bacterias GN,
G las cua
ales son más
r
resistentes a conce
entraciones altas de TNT y poseen una tasa de
d
d
degradació
ón mucho más
m rápida que
q la de bacterias
b GP
P (Zaripov et al., 2004
4).

F
Figura 7: Coloracion
C nes de Gram
m de las colonias T1, T100, T54
4 y T137

34 
 
Finalmente tras diez días de incubación de los subcultivos, fueron
seleccionadas 31 colonias, a las cuales les fue evaluada la capacidad
degradadora de TNT, mediante la técnica de HPLC.

6.4 Etapa IV: Métodos Analíticos: HPLC

Para evaluar la degradación de TNT por parte de las cepas seleccionadas,

se realizó una curva patrón preliminar con una solución estándar de TNT de
concentración conocida, que permitiera trazar un punto de comparación para
determinar si la concentración del explosivo en los diferentes cultivos había
disminuido o no (Cromatograma, Figura 8). Como se muestra en la Tabla No
9, no fue posible realizar una relación del área bajo la curva, con la
concentración de explosivo, debido a que la curva, además de contener muy
pocos puntos, no fue del todo precisa. La zona sombreada en las tablas que
acompañan todos los cromatogramas, representa los datos correspondientes
a TNT. Como es posible verlo en la Tabla No 9, el tiempo de  retención para
el TNT fue de 5,9 minutos con un área correspondiente a 100ppm de
aproximadamente 14678057,9 mm2.

Adicional a esto, se analizaron dos controles diferentes que permitieron

evaluar la presencia de TNT en el medio de cultivo T2 sin ser inoculado. El
primer control, correspondió únicamente al medio de cultivo y arrojó un
tiempo de retención para el TNT de 6,2 minutos (Cromatograma, Figura 9;
Tabla No 10). El segundo control se analizó diez días después de introducir
en el medio un palillo con los cuales se estaba inoculando cada muestra.
Como se puede observar en el Cromatograma correspondiente a la figura 10
(Tabla no 11), es probable que el control se haya contaminado y la
concentración de TNT haya disminuido, pues el área bajo la curva
correspondiente al tiempo 6,2, que es proporcional a la concentración del

35 
 
explosivo, es diez veces más pequeña que la de los estándares, lo que
sugiere que la concentración de TNT presente fue mucho menor a 100ppm.

mAU

/76.301
210nm,4nm (1.00)

400

350

300

250

200

150

100
/17.410
RT3.320/1.925
RT2.365/0.995
/1.619

50
/1.661
/0.049
/0.040

-50

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 min

Figura 8: Cromatograma Estándar 100ppm TNT

36 
 
 Tabla 9: Cromatografía Curva de Calibración de TNT

ABS 254 nm
T. RETENCIÓN ÁREA ALTURA
12,5 ppm
1,307 33432,4 2159,3
1,631 133276,8 12081,8
1,755 225116,9 15220,5
2,358 438400,4 16521,1
3,371 65185,9 1824,7
5,954 1728559,7 21870,3
9,197 100731,7 1307
25 ppm
1,331 21065,7 1319,1
1,765 265919,5 16862,5
2,348 947950,5 32981,3
5,949 3421050,0 45787,6
50 ppm
0,162 14685,5 2534
0,523 1029,3 170
0,797 1809,8 141,7
2,138 2037,3 145,5
2,549 4070,1 270,6
3,406 64397,5 1899,4
100 ppm
1,463 21826,7 1962,3
1,765 62188,5 4901,7
2,318 4221569,5 207254
4,183 2284,6 133,3
5,914 14678057,9 308678,2

37 
 
 mAU

/24.798
/17.033
210nm,4nm (1.00)
325

/55.858
300

275

250

225

200

175

150

125

100
RT2.365/0.457

75
RT3.320/0.448

50

/0.763
/0.315
/0.220

25
/0.108

-25

-50
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 min

Figura 9: Cromatograma Control No 1

Tabla 10: Cromatografía Control No 1

ABS 254 nm
T. RETENCIÓN ÁREA ALTURA
1,694 2839784,9 115919,4
2,426 3458913,2 318677,4
3,408 5395,8 403
4,075 20630,8 1239,7
4,382 34827,2 1504,8
6,227 7966096,8 207288,9

38 
 
 mAU

/96.315

RT2.365/1.968
210nm,4nm (1.00)

350

300

250

200

150

100

/0.978
50

/0.068

/0.179

/0.493
0

-50

1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 min

Figura 10: Cromatograma Control No 2

Tabla 11: Cromatografía Control No 2

ABS 254 nm
T. RETENCIÓN ÁREA ALTURA
1,818 11441883,7 1004096,7
2,417 6378743,2 363018,5
6,159 140842,1 4185,1
7,322 366834,7 9964,6
7,986 225687,2 5188,2

El resultado para todas las cepas analizadas fue muy similar a los
cromatogramas que se muestran a continuación, correspondientes a las
cepas T1 y T100. Las curvas de mayor altura que aparecen en el extremo
izquierdo de las gráficas (Figuras 11 y 12), antes del tiempo de retención del
explosivo, corresponde quizás a la presencia de azúcares simples como
glucosa, acetato, glicerol y citrato, los cuales fueron la fuente de carbono

39 
 
adicionada al medio y se caracterizan por tener tiempos de retención
pequeños.

Para los dos casos, la curva que corresponde al TNT (probablemente situada
entre los tiempo 6-6,1) es mucho más pequeña que la del control No 1, el
cual puede considerarse la concentración inicial de TNT en el medio, antes
de ser inoculado.

Las curvas que aparecen en el extremo derecho de los cromatogramas,

mostrando tiempos de retención más altos, indican la presencia de
compuestos menos polares que el TNT, pues la fase móvil utilizada fue
metanol y éste al ser un compuesto polar, hace que los compuestos no
polares, con los cuales no tiene afinidad, se demoren más en atravesarla y
muestren un tiempo de retención más alto.

Diversos estudios en los que han caracterizado el metabolismo de los

microorganismos degradadores de TNT, se ha encontrado la producción de
metabolitos menos polares como el 4-Amino-2,6-Dinitrotolueno, su isómero
2-Amino-4,6-Dinitrotolueno (Stenuit et al., 2006) y el Triainotolueno (TAT), el
cual es producido junto con otros subproductos desconocidos, pero se
resumen como la ruta más eficiente en la degradación del TNT (Kulkarni et
al., 2007).

El área bajo la curva correspondiente a la concentración de TNT presente en

el medio disminuyó en todas las cepas analizadas. Aunque aparentemente,
todas tienen un potencial degradador de TNT, para poder concluir esto con
certeza es necesario hacer un seguimiento en intervalos de tiempo más
cortos, para evaluar la reducción del compuesto en el medio.

En vista que el control No 2 no pudo ser utilizado como un blanco de

comparación por la presencia de contaminantes, podría evaluarse otro

40 
 
material diferente a la madera para inocular los medios de cultivo y así
eliminar una posible fuente de contaminación.

mAU

/97.069

RT2.365/1.879
210nm,4nm (1.00)
400

350

300

250

200

150

100
/0.089

50
/0.021

/0.443

/0.452
/0.035

/0.010

/0.003
0

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 min

Figura 11: Cromatograma Cepa T1

Tabla 12: Cromatografía Cepa T1

ABS 254 nm
T. RETENCIÓN ÁREA ALTURA
1,789 11971153,5 932139,5
2,427 5137177,1 318568
3,706 71319,2 4202,9
4,619 27899,9 1403,1
5,323 4478,1 205
6,133 2960,3 130,4
7,313 150230,8 4256,9
8,054 187625,3 3853,2

41 
 
 mAU

/45.513
210nm,4nm (1.00)

RT2.066/10.834
350

300

/5.441
250

RT2.365/8.546
RT2.365/25.756
200

150

100

50

/1.538

/0.571
/0.979
/0.633
/0.099

/0.039
/0.052

-50
1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 min

Figura 12: Cromatograma Cepa T100

Tabla 13: Cromatografía Cepa No 100

ABS 254 nm
T. RETENCIÓN ÁREA ALTURA
1,746 3479490 316794,9
2,003 357736 46789
2,418 3380758 194810,4
4,088 16003,7 1061,7
4,593 13040,4 686,2
6,077 167444,4 4817,9
7,28 196788 5403,3

42 
 
7. CONCLUSIONES

‐ Los sitios ubicados alrededor de la planta de cristalización de TNT, a

partir de los cuales se tomaron sedimentos, fueron los ambientes a
partir de los cuales se logró aislar un mayor número de
microorganismos (colonias) potencialmente degradadores de TNT.

‐ La mayor variabilidad de morfotipos se obtuvo a partir del tratamiento

2, indicando la importancia de adicionar al medio una fuente de
carbono, para favorecer la degradación.

‐ La mayoría de las cepas que presentaron potencial degradador de

TNT son bacilos Gram negativos.

‐ La degradación de TNT por parte de los microorganismos aislados se

comprobó mediante la técnica de HPLC, la cual permitió comprobar la
disminución de la concentración de TNT presente en el medio y la
aparición de otros metabolitos, posiblemente subproductos de la
degradación del explosivo.

43 
 
8. RECOMENDACIONES

‐ Es necesario estandarizar la forma de adicionar el explosivo al medio

de cultivo, de tal forma que resulte más fácil visualizar la degradación
del compuesto y así realizar el seguimiento del metabolismo.

‐ Debido a que el control No 2 (Medio de cultivo + Palillo estéril)

presentó contaminación, es importante probar materiales diferentes
para realizar esta siembra, con el objetivo de eliminar una posible
fuente de contaminación.

‐ Es necesario conseguir estándares de HPLC para diferentes

subproductos del metabolismo de TNT como aminodinitrotolueno y
triaminotolueno. Y evaluar cuál sería la mejor técnica para identificar
estas sustancias.

‐ El aislamiento de microorganismos degradadores de TNT requiere la

elaboración de pases sucesivos en medios de cultivo con explosivo,
para eliminar trazas de compuestos orgánicos de fácil asimilación
provenientes de la muestra, y ejercer una presión selectiva importante
sobre los microorganismos no degradadores.

‐ La concentración de explosivo adicionada al medio de cultivo debe ser

superior a 50 ppm, ya que bajo esta concentración no hay una presión
selectiva importante sobre los microorganismos nativos.

44 
 
 8. REFERENCIAS

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Negative Bacteria exhibit diferential sensitivity to and transformation of
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Trinitrotoluene by Klebsiella sp. Isolated from activated sludge.
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47 
 
 ANEXOS

ANEXO 1: Características macro y microscópicas de las colonias

seleccionadas para el análisis mediante HPLC
# Origen Caract. Macroscópicas Caract. Microscópicas
Regular, mucosa, convexa
T4 Muestra 1 BGN
color crema
Irregular, cóncava, seca, color
T9 Muestra 1 BGN
amarillo claro
Circular, cóncava, bordes
T17 Muestra 1 regulares y claros, color BGN
amarillo
Irregular, cóncava, cremosa,
T12 Muestra 1 color amarillo pálido con el BGN largos
centro más oscuro
Irregular, cremosa, cóncava,
T21 Muestra 1 BGN y levaduras
color amarillo oscuro
Regular, ovalada, plana,
T24 Muestra 2 BGP
cremosa, amarillo pálido.
Regular, cóncava, cremosa y
T27 Muestra 2 BGP
blanca
Irregular, cremosa, bordes
T39 Muestra 2 BGP
dentados, cóncava, blanca.
Regular, convexa, cremosa,
T40 Muestra 2 amarillo pálido con centro BGP
oscuro.
Irregular, plana, blanca con
T42 Muestra 2 BGN
bordes oscuros.
Regular, convexa, mucosa,
T43 Muestra 2 amarilla pálida y centro BGN
oscuro.
Irregular, convexa, cremosa y
T50 Muestra 3 BGN cortos
amarilla
Regular, cóncava, cremosa
T52 Muestra 3 BGN delgados
color beige.
Irregular, plana, cremosa de
T58 Muestra 3 BGP
centro más oscuro.
Irregular, convexa, cremosa,
T62 Muestra 3 BGN delgados y levaduras.
blanca con bordes oscuros.
Regular, convexa, cremosa,
T63 Muestra 3 BGN cortos
opaca y de centro oscuro.
Regular, cóncava, cremosa,
T64 Muestra 3 BGN cortos y levaduras
amarillo pálido.
Regular, cóncava, cremosa,
T65 Muestra 4 BGN cortos.
beige de centro oscuro.
Irregular, cremosa, plana y
T68 Muestra 4 BGN cortos.
blanca

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 # Origen Caract. Macroscópicas Caract. Microscópicas
Circular, bordes irregulares,
T69 Muestra 4 BGN cortos.
cremosa, convexa, blanca.
Circular, regular, cóncava,
T73 Muestra 4 BGN cortos y levaduras.
cremosa, beige.
Irregular, convexa, cremosa,
T74 Muestra 4 BGP y BGN cortos
blanca con centro oscuro.
Irregular, seca, plana, opaca,
T87 Muestra 5 BGN cortos
transparente.
Circular, convexa, cremosa,
T89 Muestra 5 BGN
brillante, color crema.
Regular, cóncava, cremosa,
T96 Muestra 5 BGN
blanca.
Circular, convexa, cremosa,
T98 Muestra 5 amarillo pálido con centro BGN y BGP
oscuro.
Regular, plana, cremosa,
T99 Muestra 6 CGP y BGN
opaca, blanca
Irregular, convexa, brillante,
T100 Muestra 6 BGN
cremosa, blanca
Circular, regular, convexa,
T105 Muestra 6 BGP
cremosa y brillante
Circular, cóncava, cremosa,
T107 Muestra 6 BGP
blanca
Regular, convexa, cremosa,
T111 Muestra 6 BGP
brillante, blanca, traslúcida.

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