Cromatografia Líquida de Alta Resolución (HPLC)

En la cromatografía líquida la fase móvil es un líquido.

El gran poder de la cromatografía líquida radica en la

combinación de un amplio intervalo de propiedades para
la fase móvil junto con la elección de numerosos tipos de
fase estacionaria.
Según el tipo de interacción que se produce entre la fase
estacionaria y el soluto se tiene:
• Cromatografía de fase normal
• Cromatografía de fase reversa
• Intercambio iónico
•Filtración o permeación en gel
Esquema de un cromatógrafo líquido de alta resolución.

Detector
Control y
procesamiento
Desechos
de datos

Colector de fracciones

Bomba Auto muestreador Columna

 Tipos de Separación en HPLC

Fase normal Fase reversa

HPLC

Intercambio Quiralidad
iónico
Exclusión Bio afinidad
por tamaño

Acidos, Enantiómeros
bases, iones Polímeros,
inorgánicos proteínas, Proteínas y
ácidos enzimas
nucléicos
La separación por LC no se produce por un único tipo de interacción
entre los analitos y la fase estacionaria normalmente una
separación es el producto de más de un tipo de interacción.

Por esto para que la cromatografía líquida sea eficaz es necesario

manejar todos los equilibrios que afectan las interacciones
analito:fase móvil: fase estacionaria:

Analito (fase móvil) analito (fase estacionaria)

No es fácil establecer normas generales para predecir el sistema

cromatográfico que mejor separa una mezcla particular, sin
embargo, mucha información está recogida en catálogos, que son
un buen lugar para comenzar a buscar las condiciones adecuadas
para un análisis.
Clasificación de las fases estacionarias:
• Cromatografía líquido-líquido
• Cromatografía de fase unida químicamente:
• De fase normal
•De fase inversa

Cromatografía líquida en fase normal

En la cromatografía en fase normal, la fase

estacionaria es más polar que la fase móvil. Las
fases estacionarias son normalmente polímeros
inorgánicos con área superficial grande.

En este tipo de cromatografía el componente

menos polar eluye primero debido a su
solubilidad en la fase móvil
 Cromatografía líquida en fase reversa
En la cromatografía en fase inversa o reversa, la
fase estacionaria es no polar (con frecuencia se
trata de un hidrocarburo) y la fase móvil es
relativamente polar (agua, metanol, acetonitrilo).

En este tipo de cromatografía los componentes

más polares eluyen primero debido a su afinidad
por la fase móvil
 Las columnas están rellenas de partículas
resistentes, uniformes y porosas de sílice con
diámetros de 3, 5 o 10 µm. La superficie de sílice
hidrolizada está constituida por grupos silanol
químicamente reactivos.

Las recubrimientos de fase unida químicamente más

utilizados son los siloxanos que se forman por reacción
de la superficie con un organocloro silano donde R es
un grupo alquilo lineal o un grupo alquilo sustituido.
Los grupos R mas usados son el C8 (n-octilo) o una
cadena C18 (n-octadecilo)
Las cadenas más largas dan origen a mayor retención,
además a mayor longitud de la cadena mayor la
cantidad de muestra inyectada.

La cromatografía de exclusión molecular, también
llamada de Filtración en Gel CFG, separa las
moléculas en función de su tamaño.

Se originó en el Biochemical Institute en Uppsala,

Suecia, en 1959

Se realiza empleando unas matrices formadas por

unas esferas porosas. El volumen de los poros es
muy elevado y su diámetro está determinado.

Empaque de las columnas
◦ Dextranas con enlaces cruzados Sephadex G
◦ Poliacrilamidas Bio-
Bio-Gel P

A) Dextranas:
Dextranas

Son polisacáridos de Glucosa, en forma de esferas

Peso molecular entre 10 a 300 millones

Producidos por bacterias : Leuconostoc mesenteroides

Muy Hidrofílicos

B) Poliacrilamidas

Son polímeros de acrilamida

Naturaleza porosa

Sintéticos
Materiales y Equipos
Pack de 10 columnas Columnas Rellenas

Columnas Metálicas

Fraccionamiento de:
◦ Proteínas
◦ Lípidos
◦ Hormonas
◦ Vitaminas
◦ Pequeñas moléculas orgánicas
•Las moléculas pequeñas penetran en los
pequeños conductos que presentan las
esferas de gel, donde la velocidad de flujo
de solvente es menor

•Las moléculas grandes, incapaces de

penetrar en los pequeños conductos, de las
esferas de gel, se mueven entre ellas donde
la velocidad de flujo de solvente es mayor.

•Como consecuencia, las moléculas de

mayor peso molecular son eluidas antes
que las de menor peso molecualr.
Proceso
 Fase Estacionaria (3): Acido sulfónico

Intercambio Iónico: RSO2- H+

Catiónicas
Acido carboxílico
RCO2- H+
Resinas
Ión amonio cuaternario
R3NR+
Aniónicas OH-
Grupo amina

R3NH3+ OH-
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 Establecimiento del método en cromatografía líquida

Debido a la gran interacción que existe de la muestra tanto con la fase

estacionaria como con la fase móvil, es más complejo establecer un método de
análisis en HPLC.

En cromatografía de reparto la polaridad de la fase estacionaria debe ser

bastante similar a la de los analitos y para la elución se emplea una fase móvil de
polaridad distinta.
Elección del Solvente
Características:
•Disponible comercialmente
•Precio
•Pureza y Estabilidad. En la actualidad contamos con productos
de calidad de pureza cromatográfica. Bajo contenido de
impurezas.
•Disolver la muestra
•Miscible con otros solventes para formar mezclas útiles
•No degradar o disolver la fase estacionaria
•Tener baja viscosidad para reducir las caídas de presión
•Ser compatible con el detector utilizado. Transparencia óptica
(cuando se usan detectores UV)
 Filtración y Desgasificación de solventes

En la actualidad HPLC ha llegado a ser una de las Técnicas del Laborario

Moderno más importantes como herramienta analítica para separar y detectar
compuestos químicos. Como en todas las técnicas analíticas, los pequeños
problemas a la larga pueden llegar a tener un mayor impacto en la exactitud y
durabilidad del sistema. Aún con la evolución de los cromatógrafos líquidos en la
era de la computadora, hay aún problema que ésta no puede resolver.

Los solventes para HPLC, todos filtrados cuidadosamente en la fábrica, pueden

acumular partículas en suspención que pueden ser perjudicales a los
componentes del sistema. Las partículas pueden ocasionar costosos daños a la
bomba HPLC, al guarda columnas, y en general causar desgaste del sistema. Los
fabricantes de los instrumentos tienen en cuenta éste problema y recomiendan
que se filtre y desgasifique los solventes HPLC antes de usarlos.
En el instante que se abre una nueva botella de solvente para HPLC se expone el
interior del solvente a la atmósfera y empieza a acumular gases disueltos que se
encuentran en la atmósfera. El oxígeno disuelto que constituye el 21% de la
atmósfera puede producir mayor interferencia en los detectores de fluorescencia y
electroquímicos. El Nitrógeno disuelto es el otro componente de la atmósfera que
puede producir burbujas en la columna de HPLC y cuando el solvente entra al
detector produce picos falsos y desviaciones de la línea base. El dióxido de
carbono disuelto algunas veces puede ser la causa de los cambios de pH en el
sistema de solvente.

Métodos de Desgasificación de Solventes en HPLC

Existen cuatro(4) métodos comunes usados para desgasificar solventes en HPLC

previos a su uso:
•Sonificación
•Burbujear Helio
•Desgasificación electrónica en la línea del flujo
•Desgasificación al vacío en línea
Bombas

Requisitos o aspectos más importantes que debe

reunir una bomba o sistema de bombeo:
• Debe producir presiones estables hasta 6000
psi.
• Mantener el flujo libre de pulsaciones
• Generar intervalos de caudales de flujo (0,1 a
10 ml/min)
• Control y reproducibilidad del flujo de solvente
• Componentes de la bomba resistentes a la
corrosión
Programación del Solvente

Existen dos métodos de programación de Solvente en HPLC:

•Isocrático
•Gradiente de Elución. Es un término que se utiliza para describir el proceso
mendiante el cual se cambia la composición de la fase móvil.

Cuando se desarrolla un análisis usando el método de gradiente se debe tener

presente dos objetivos:
•Obtener la mejor resolución de los componentes de la muestra en el
menor tiempo posible.
•Asegurar alta presición y exactitud.

Para obtener buenos resultados con el método de gradiente debemos seguir 5

pasos fundamentales:
•Determinar la composición inicial y final del solvente
•Ajustar el tiempo del gradiente
•Determinar la forma del gradiente (lineal, concava o convexa)
•Ajustar la velocidad del flujo para mejorar la resolusión
•Regresar a las condiciones iniciales la columna.
Comparación entre un análisis por HPLC isocrático y con gradiente
que muestra como optimizando el gradiente es posible hacer la
misma separación en mucho menos tiempo con excelente
resolución.
Los Inyectores…
En cromatografia líquida el método más ampliamente
utilizado para la introducción de la muestra utiliza los
llamados bucles que son simplemente capilares
intercambiables que permiten inyectar volúmenes
fijos de muestra de 5 a 500 μL con una alta precision.
Válvula de Inyección:

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Las columnas más usadas son las de 25 cm de largo y
4.6 mm de diámetro interno y rellenas con partículas de
5 μm.
Hoy en día existen en el mercado las llamadas
microcolumnas (3 a 7.5 cm de largo y diámetros
internos de 1 a 4.6 mm) que se están volviendo muy
populares ya que por sus características es posible
hacer análisis muy rápidos con un gasto muy bajo de
solventes que disminuye considerablemente el costo de
los análisis.
Con el fin de proteger y extender la vida útil de las costosas
columnas analíticas es usual usar las precolumnas que son
sencillamente columnas de 5 cm de largo con el mismo tipo
de relleno de la columna, mucho más económicas y que se
utilizan para atrapar impurezas o componentes de la muestra
que una vez se adhieren a la fase estacionaria es imposible
eluirlas con ningún tipo de solvente.
La temperatura de la columna en HPLC no es un factor tan
crítico como en Cromatografia de Gases aunque para ciertas
aplicaciones el control de la temperatura es importante. Hay
hornos que controlan la temperatura desde la temperatura
ambiente hasta 50 C
Detectores en HPLC…
Hay dos tipos de detectores: los que responden a la
medida de una propiedad del efluente (índice de
refracción, densidad, constante dieléctrica) y los que se
basan en la medida de una propiedad del soluto
(absorbancia en el UV, fluorescencia, espectrometria de
masas, etc)
Un detector ideal para HPLC debe tener las siguientes
características…
• Alta sensibilidad
• Bajo nivel de ruido
• Rápida respuesta
• Insensibilidad a cambios de solvente o cambios de
flujo y temperatura del solvente.
• Sencillez de manejo y confiabilidad
• No destructivo
Los detectores más usados en HPLC son:
• Detector de absorbancia
• Detector de Fluorescencia
• Detector de Indice de Refracción
• Detector de Conductividad
• Detector de Espectrometría de Masas
• Detector de Infrarrojo
Detector Ultravioleta (1)

Celda de flujo:
0.5 cm de camino óptico
y 10 µL de capacidad

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 Detector Ultravioleta (2)

Es el detector más utilizado, porque muchos solutos

absorben dicha radiación y es bastante sensible a ella

El sistema más simple emplea la emisión a 254 nm de una

lámpara de mercurio y detección a una sola longitud de
onda.
También se utilizan una lámpara de deuterio y un
monocromador para mediciones a longitud de onda
variable.
El intervalo lineal comprende cinco órdenes de magnitud
de concentración de soluto
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 Detector de Índice de Refracción

Es casi universal, responde a casi cualquier soluto.

La sensibilidad es unas mil veces menor que la de un

detector ultravioleta, y no es útil en gradiente.
Detector Electroquímico
Es bastante selectivo, porque sólo cientos analitos se oxidan o
se reducen con facilidad.
Pueden detectarse por oxidación: fenoles, aminas
aromáticas, peróxido y mercaptanos. Y por reducción:
cetonas, aldehídos y nitrilos.
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 Otros detectores:

Límite de ¿Útil con

Detector detección gradiente?

ultravioleta 0.1 – 1 si
índice de refracción 100 – 1000 no
electroquímico 0.01 - 1 no
fluorescencia 0.001 - 0.01 si
conductividad 0.5 – 1 no
espectrofotometría de masa 0.1 – 1 si
infrarrojo de Transformada de Fourier 1000 si

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