Journal of Biotechnology 300 (2019) 70-77

listas de contenidos ofrecidos en ScienceDirect

Journal of Biotechnology

revista Página de inicio: www.elsevier.com/locate/jbiotec

Evaluación de la entrega mediada por AAV de shRNA para apuntar vulnerabilidades genéticos de cáncer de mama
basal-al igual

Catarina Pinto una , segundo , Gabriela Silva una , Ana S. Ribeiro do , re , Mónica Oliveira do , re , Manuel Garrido una ,
Vanessa S. Bandeira una , André Nascimento una , Ana Sofia Coroadinha una , segundo , Cristina Peixoto una , segundo ,
Ana Barbas una , do , Joana Paredes re , mi , Catarina Brito una , segundo , Paula M. Alves una , segundo , •
una IBET, Instituto de Biología Experimental e Tecnológica, Apartado 12, 2780-901 Oeiras, Portugal
segundo Instituto de Tecnología Química Biológica e António Xavier, la Universidad Nova de Lisboa, Av. da República, 2780-157 Oeiras, Portugal
do Bayer Portugal, Carnaxide, Portugal
re I3S, Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, Universidade do Porto, Rua Alfredo Allen, 208, 4200-135 Oporto, Portugal
mi IPATIMUP, Instituto de Patología Molecular e Inmunología de la Universidad de Oporto, Rua Dr. Roberto Frías s / n, Oporto, Portugal

INFORMACIÓN DEL ARTÍCULO RESUMEN

palabras clave: vectores virales adeno-asociados (AAV) para aplicaciones de terapia génica están ganando impulso, con más terapias en movimiento en etapas posteriores
Terapia de genes de desarrollo clínico y hacia la aprobación de mercado, a saber, para la terapia del cáncer. El desarrollo de vectores citotóxicos menudo se ve obstaculizada
vectores virales adenoasociados Basal-como por los efectos secundarios que surgen cuando se infectan las células no diana, y su producción se pueden obstaculizados por los efectos tóxicos del
la producción de AAV cáncer de mama
transgén en las líneas celulares que producen. En este estudio, se evaluó el potencial de suministro mediado por rAAV de los ARN de horquilla corta
(ARNhc) para apuntar vulnerabilidades genéticos de cáncer de mama basales-similares. Nuestros resultados muestran que mediante la optimización de la
estequiometría de los plásmidos después de la transfección y la hora de la cosecha, es posible aumentar los títulos virales y calidad. Todos los vectores
rAAV-shRNA obtenidos transducen eficientemente las líneas celulares BLBC MDA-MB-468 y HCC1954. PSMA2 se asoció con una disminución significativa
en la viabilidad celular y la inducción apop- tosis. Es importante destacar que, rAAV2-PSMA2 también se ralentizó el crecimiento tumoral en un modelo de
xenoinjerto BLBC ratón, así potencialmente representa una estrategia terapéutica contra este tipo de cáncer.

1. Introducción
La terapia génica tiene la oportunidad de expandirse más allá de terapias basadas drogas
convencionales y entregar un tratamiento dirigido a través ulación REG de genes endógenos ( Naldini,
2015 ). A medida que nuestro conocimiento sobre cancer's inicio y la progresión evoluciona, las
características fenotípicas específicas de tumores se descubren que puede ser explorado en este
contexto, para lograr una mayor especificidad y potencia de las terapias desarrolladas ( Miest y
Cattaneo, 2013 ). cáncer de mama (BLBC) pacientes de tipo basal pueden beneficiarse en gran
medida del desarrollo de este tipo de terapias. A pesar de que este subtipo representa hasta el 20%
del cáncer de mama en todo el mundo (BC) inci- dencia, es responsable de un número
desproporcionado de muertes, ya que a menudo conduce a la recaída con metástasis a distancia ( Schneiderinterfiriendo (siRNA) para identificar las vulnerabilidades genéticos selectivos causar letalidad en este
et al., 2008 ). La falta de marcadores moleculares y caracterización deficiente, alteradas por una
presentación molecular heterogéneo, conduce a la falta de terapias dirigidas y deja los clínicos con
fármacos quimioterapéuticos citotóxicos
como la única opción de tratamiento ( Caldas Lopes et al., 2009 ; Schneider et al., 2008 ). El tratamiento
estándar para estos pacientes, a saber, la cirugía, la radiación y la quimioterapia, a menudo no
erradicar completamente la enfermedad, es incapaz de mantener una protección sostenida, y se
acompaña de efectos secundarios graves, tales como la citotoxicidad para las células no cancerosas ( Luo
et al., 2015 ; Santiago-Ortiz y Schaffer, 2016 ). Por lo tanto, existe una fuerte necesidad médica no
satisfecha de terapias dirigidas para BLBC con im- me demostraron la eficacia clínica, efecto con
menores efectos secundarios, y los tiempos de supervivencia del paciente más largos dirigidos ( Carey
et al., 2010 ; Santiago-Ortiz y Schaffer, 2016 ). Una gran cantidad de esfuerzo se ha llevado a cabo
hacia el descubrimiento de dianas moleculares accionables para esta enfermedad ( Bianchini et al.,
2016 ). Recientemente, Petrocca et al realizaron un genoma de pantalla ancha pequeños ARN
subtipo de cáncer de mama ( Petrocca et al., 2013 ). Aunque prometedores, estos cables todavía se
enfrentan a retos considerables que llegan a la clínica debido a la ineficacia de las plataformas de
entrega ( Kacsinta y

• El primer autor en: IBET, Apartado 12, 2780-901 Oeiras, Portugal.

Correos electrónicos: cpinto@ibet.pt (C. Pinto), gabrielasilva@ibet.pt (G. Silva), aribeiro@ipatimup.pt (AS Ribeiro), monicao@ipatimup.pt (M. Oliveira),
manuel.garrido@ibet.pt (M. Garrido), vbandeira@ibet.pt (VS Bandeira), un ascimento@ibet.pt (A. Nascimento), avalente@ibet.pt (AS Coroadinha),
peixoto@ibet.pt (C. Peixoto), ab@ibet.pt (A. Barbas), jparedes@ipatimup.pt (J. Paredes), anabrito@ibet.pt (C. Brito), marques@ibet.pt (PM Alves).

https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2019.05.016
Recibido el 1 de de agosto de de 2018; Recibido en forma 24 de mayo 2019 revisado; Aceptado el 27 de de mayo de 2019

Disponible en línea del 28 de mayo de 2019

0168-1656 / © 2019 Publicado por Elsevier

C. Pinto, et al.
Dowdy, 2016 ).
Recombinante viral adeno-asociado (rAAV) vectores se han in- creasingly éxito como
plataformas de entrega de terapia de genes y han demostrado ser un enfoque prometedor para tratar
una variedad de enfermedades humanas ( Brimble et al., 2016 ; Kaplitt et al., 2007 ; Testa et al., 2013 ).
El número de pliegues in- de los estudios preclínicos y ensayos clínicos humanos ha demostrado su
perfil favorable de seguridad, administración de genes eficaz, y la expresión transgénica resistente y
persistente en vivo, con la respuesta inmune manejable y efectos adversos menores tras la inyección ( Samulski
SHC016.
y Muzyczka, 2014 ; Santiago-Ortiz y Schaffer, 2016 ; Snyder y Moullier de 2011 ). De hecho, un vector
basado en rAAV1 para el tratamiento de una deficiencia de lipoproteína lipasa se convirtió en el
primer producto de terapia génica comercialmente-aprobado para aplicaciones clínicas por la Misión
de com- ( Bryant et al., 2013 ).
potencial de vectores rAAV para aplicaciones de cáncer también se ha de- monstrated en varios
in vitro estudios de cáncer, i n vivo modelos preclínicos de cáncer, y los ensayos clínicos, con una
amplia variedad de enfoques, tales como la entrega de factores anti-angiogénesis (PEDF,
endostatina 34, Kringle
5, Kallistatin), genes suicidas (sistema HSV-TK y poliomavirus antígeno T medio),
moléculas inmunoestimuladoras (TRAIL, interferones,
Las interleuquinas), pequeñas moléculas de ARN de ADN codificada para la regulación cional
post-transcriptasa de oncogenes, moléculas de superficie celular inmunogénicas y antígenos tumorales
( Ledford, 2015 ; Luo et al., 2015 ; Santiago-Ortiz y Schaffer, 2016 ).
Aquí se describe un enfoque terapéutico basado en rAAV para apuntar BLBC. Firma
dependencias genéticas identificadas previamente para este subtipo de cáncer de mama (es decir, MCL
1, PSMA2 y PSMB4) ( Petrocca et al., 2013 ) Fueron objeto usando suministro mediado por rAAV de
shRNA. Con- downregulation Sist de los genes diana condujo a una disminución en la viabilidad
celular y la apoptosis inducida en líneas celulares de BLBC. Además, las inyecciones tratumoral in-
de vectores de rAAV de orientación PSMA2 resultado en el crecimiento del tumor ralentizó en un
modelo de xenoinjerto BLBC. Además, nuestros resultados indican que la optimización del plásmido
tras la transfección estequiometría y el tiempo de la cosecha debe hacerse de una manera
dependiente de transgén, con el objetivo de eludir los posibles efectos citotóxicos de los transgenes
en la línea celular productora y el rendimiento de los lotes de rAAV de mayor calidad .
2. Materiales y métodos
2.1. Cultivo de células
HEK293 T (ATCC CRL-3216 ™) y las células HT1080 (ATCC ® células CCL121) se cultivaron
en alta glucosa (4,5 g / L) DMEM suplementado con 10% (v) de suero v / bovino fetal (FBS). Las
líneas celulares de cáncer de mama basales HCC1954 y MDA-MB-468, amablemente
proporcionados por el profesor Judy Lieberman (Medicina de Harvard Scholl, EE.UU.) se cultivaron
en medio RPMI 1640 suplementado con 10% (v / v) de FBS, 6 mM de HEPES y 5? M 2 -
mercaptoetanol. Medios y reactivos de cultivo celular fueron de Gibco Life Technologies. Las células
se incubaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada con 5% de CO 2 en aire.
2.2. Construcción de plásmidos pAAV-shRNA
Un plásmido de AAV2 vector que lleva un CMV-promotor del gen de GFP impulsado flanqueado
por ITRs, y un gen de resistencia a puromicina bajo el control de un promotor HEF1 fuera de la
casete de expresión de AAV2 sin shRNA (pAAV-Puro) se generó basándose en el AAV2
construcción de vector pAAV - MSC-CMV-eGFP-CytbAS (especie de regalo del profesor U. Michel,
Universidad de Medicina de Göttingen, Alemania), después de la eliminación de la moter pro
adicional CMV. Para construir los vectores pAAV2-shRNA, fragmentos de ADN que con- tienen el
promotor H1, gen específico o control de mezcla aleatoria shRNA conse- Se-, y los sitios de
restricción BstBI y HindIII, en los 3'extremities 5 'y, respectivamente, se sintetizaron químicamente (
GenScript) y se clonó en el sitio BstBI / HindIII de pAAV-Puro dentro de la caja de expresión de
AAV2. Los plásmidos generados pAAV-shRNA fueron am- plified en células de E. coli Stbl3
(Invitrogen),
71
Journal of Biotechnology 300 (2019) 70-77
y la orientación se confirmaron por análisis de restricción y secuenciación. shRNA secuencias
específicas de genes se obtuvieron de la base de datos consorcio con- RNAi ( http://www.broadinstitute.org/rnai/publ
). Las secuencias de ARNhc control de mezcla aleatoria, no hay una orientación a los genes
humanos o de ratón conocidas, fueron de Sigma. Los números de catálogo shRNA son:
PLK1shRNA: TRCN0000006247; MCL1shRNA: TRCN0000196390; PSMA2shRNA:
TRCN0000003879; PSMB4shRNA: TRCN0000003914; Ctrl1shRNA: SHC202; y Ctrl2shRNA:
2.3. Producción, purificación y determinación de títulos de vectores de rAAV-shRNA
vectores rAAV-shRNA fueron producidos en células HEK293 T mediante sistema de transfección 2- o
3- plásmido utilizando 5 g de ADN / 1 x 10 6 células, con polietilenimina lineal (PEI; Polysciences) o con
CaPO 4 como reactivos de transfección. En las células HEK293 T del sistema 2-plásmido (se sembraron a
4-5 x 10 4 células / cm 2
20-24 h antes) fueron co-transfectadas a 70-80% de confluencia con dividual in- plásmidos
pAAV-shRNA, generado arriba, más el plásmido pDG ( Grimm et al., 2003 ), Que codifica la reps y gorra
genes y los productos de adenovirus que codifica esenciales para la producción del vector AAV,
utilizando diferentes proporciones de plásmido como se indica a continuación. 3-plásmido transfec-
ción se realizó con plásmidos: pAAV-shRNA, pAAV-Helper - que codifican productos génicos de
adenovirus requeridos para la producción de partículas de AAV fective in-, y pAAV-RC - que codifican
los genes rep y cap (necesaria trans 1:: elementos para la replicación y empaquetamiento del
genoma viral) (todos de Stratagene / Agilent), a una relación molar plásmido de 1-actuando 1. Todos
los plásmidos, excepto pAAV-ARNhc, se amplificaron en células E. coli DH5a (Invitrogen). El ADN de
plásmido se purificó con el kit de plásmido Qiagen EndoFree de, según las instrucciones del
Proveedor. Las transfecciones con la cejilla 4 método se realizaron usando el fosfato de calcio
Transfección Kit de Sigma (CAPHOS) según las instrucciones kit's. Las transfecciones de células
HEK293 T con PEI se realizaron según los protocolos Dard dares utilizando ADN optimizada:
relación de PEI de 1: 1,8 (g), como pre viamente descrito ( Merten y Al-Rubeai, 2011 ). 48-72 h post
trans- fection, las células se lisaron con 0,1% de Triton-X100 (Sigma), la liberación de los vectores
intracelulares en el sobrenadante. Se recogieron los medios con las células lisadas y se incubó con
30 unidades / ml Benzonase ® nucleasa (Merck Millipore) y estéril 2mMMgCl 2 ( Sigma) durante 1 h a
37ºC, para la eliminación de la célula huésped y ADN desempaquetado. La solución se clarificó por
centrifugación (4000 XG / 30min / 4 0 C) y el sobrenadante que contiene el vector (mary de stock viral
pri-) se filtró a través de filtros de tamaño de poro de 0,45 m (Merck Millipore). La purificación de los
diferentes vectores de rAAV-shRNA se per- formada por cromatografía de afinidad utilizando la
resina de alto rendimiento AVB Sepharose (GE Healthcare), de acuerdo con ins- trucciones del
fabricante. La pureza se controló por SDS-PAGE seguido de In- stantBlue ™ y contenido de
endotoxina evaluó con el kit de prueba de LAL cromogénico (Endosafe-PTS). Todos los vectores
usados ​en este estudio pasaron la prueba dotoxin es-.
productividades virales fueron evaluados en las poblaciones virales primarios y vectores ficados
PUR. partículas (vp) de titración viral se realizó usando el kit de AAV titulación ELISA (PROGEN
Biotechnik GmbH), según las instrucciones del fabri- cante. Para rAAV-shRNA genoma de vector (vg)
cuantificación, se extrajo el ADN viral y se purificó con el kit de alta puro viral de ácido nucleico
(Roche). Vg título se cuantificó por tiempo real cuantificación PCR (qPCR) de fragmento de ADN
promotor de CMV encapsidado que dirige la expresión del transgén GFP, en al menos 3 diluciones
en serie diferentes de las existencias de ADN viral extraído, en contra de un plásmido de ADN pAAV-
Ctrl1shRNA curva estándar linealizado . Ocho diluciones en serie del estándar plásmido (que
contiene 10 8, 10 7, 10 6, 10 5, 10 4, 10 3, 10 2, y 10 1
copias de ADN de plásmido) se utilizaron para generar una curva estándar para la cuantificación
absoluta de las muestras de vectores. Todas las reacciones se realizaron por triplicado utilizando
cebadores específicos de CMV (adelante: 5'-GCGCCTCTTAT ACCCACGTAG-3 'e inverso:
5'-TAACACCGCCCCGGTTT-3') y la mezcla I Master SYBR Green (Roche). Análisis de los resultados
qPCR se llevó a cabo con el software LC480. partícula infecciosa (ip) de titración se per- formado en
las células de fibrosarcoma HT1080 como se ha descrito previamente ( Merten
C. Pinto, et al.
y Al-Rubeai, 2011 ). Brevemente, las células se transdujeron a 50% de confluencia con diluciones
seriadas de los stocks virales para 2 h. Después de 48 h de incubación en las células de los medios
completos se recogieron y el porcentaje de GFP + / células fected in- se cuantificó por citometría de
flujo (Cyflow Espacio, Partec).
2.4. pAAV-shRNA plásmido transfección
células HEK293 T en 60-70% de confluencia fueron transfectadas transitoriamente con individuo
pAAV-shRNA construye en 5 g de ADN por 1 × 10 6 células utilizando PEI como reactivo de transfección, en
una relación ADN: PEI de 1: 2 (g). Después de 8 h de incubación, el medio se reemplazó, y las células se
cultivaron adicionalmente. Después de 24-48 h, las células fueron imágenes por microscopía de
fluorescencia para la expresión de transgén de GFP y se cosechan para la extracción de ARN para
estudios de expresión génica y GFP + la cuantificación de células por citometría de flujo (Cyflow Espacio,
Partec).
2.5. rAAV-shRNA vector de transducción y activadas por fluorescencia clasificación de células
HCC1954 y las células MDA-MB-468 a 60-70% de confluencia fueron transducidas con vectores
individuales rAAV2-shRNA a una multiplicidad de infección (MOI) de 4 × 10 4 vg / célula en 2% de suero
de medios que contienen. Después de 8 h de incubación, el medio se sustituye por medio completo y
trans células zamiento fueron seleccionadas mediante FACS para la expresión GFP 24 h y 48 h después
de allí-. Después del aislamiento FACS, las células se utilizaron inmediatamente para la extracción de
ARN para estudios de expresión génica o se cultivaron adicionalmente para los ensayos de viabilidad y la
apoptosis. Ordenando se llevó a cabo en las instalaciones del Instituto Gulbenkian de Ciencia citometría
de flujo en MoFlo (Beckman Coulter) y FACSAria (Becton Dickinson) citómetros.
2.6. La expresión de genes
El ARN total de las células se extrajo con Qiagen RNeasy Mini Kit según instrucciones del
fabricante con la digestión con ADNasa. cDNA fue sintetizado, a partir de cantidades iguales de ARN,
por transcripción inversa usando el Advantage RT-para-PCR kit (Clontech Laboratories, Mountain
View, CA), o la alta fidelidad Kit de Síntesis de ADNc (Roche), según la fabri- Instrucciones de Türer.
La expresión génica se cuantificó en Roche LightCycler 480 (LC480) utilizando cebadores
específicos de genes y la mezcla I Master SYBR Green (Roche). Todos los experimentos se
realizaron en plicate tri- y se recogieron los datos de curva de fusión para comprobar la especificidad
del producto. transcritos de ARNm se normalizaron a ambos hipoxantina fosforribosiltransferasa 1 ( HPRT1) pAAV, co-ex presionando un gen reportero eGFP para facilitar el seguimiento de la transducción de
y los niveles de proteína ribosomal L22 (rpl22) de ARNm en la misma muestra, y los resultados se
calcularon como el cambio veces en relación con células de control utilizando el método de
cuantificación relativa avanzado desde el software LC480. Los cebadores usados ​fueron (directo e
inverso, respectivamente): HPRT1: 5'-CCTGGCGTCGTGATT AGTGAT-3 'y
5'-AGACGTTCAGTCCTGTCCATAA-3'; MCL1: 5'-TGC TTCGGAAACTGGACATCA-3 'y 5'-3'
TAGCCACAAAGGCACCAAAAG-; Plk1: 5'-AAAGAGATCCCGGAGGTCCTA-3 'y 5'-GGCTGCGGTG
AATGGATATTTC-3'; PSMA2: 5'-GAGCGCGGGTACAGCTTTT-3 'y
5'-ACCACACCATTTGCAGCTTTA-3; PSMB4: 5'-CGC GAAGCGTTTTTGGGGT-3 'y
5'-GAGTGGACGGAATGCGGTA-3; Rpl22: 5'-CACGAAGG AGGAGTGACTGG-3 'y
5'-TGTGGCACACCACTGACATT-3'.
2.7. La viabilidad celular y la apoptosis
Para investigar los efectos de los vectores de rAAV-shRNA sobre la viabilidad celular, las células
transducidas con ordenados se sembraron en placas de 96 pocillos a diferentes densidades de células
y se incubaron durante 48-120 h. Después de cada período de incubación de 24 h, la viabilidad celular
se evaluó utilizando el reactivo de la viabilidad celular PrestoBlue ™ (Life Technologies), de acuerdo
con ins- trucciones del fabricante. Para los ensayos de apoptosis Se sembraron células transducidas
en placas de 24 pocillos, a diferentes densidades de células, y el número de células apoptóticas se
determinó por citometría de flujo usando el kit de apoptosis FLICA (inmunoquímicos Technologies)
según
del fabricante
72
Journal of Biotechnology 300 (2019) 70-77
instrucciones.
2.8. entrega xenoinjertos y de ratón del vector
Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las Directrices para el
Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, la Directiva 86/609 / CEE. modelo BLBC humano fue
establecida en N: NIH (s) II: nu / nu ratones desnudos con células MDA-MB-468. Brevemente, 2 × 10 6 células
MDA-MB-468 se inyectaron en la almohadilla de grasa mamaria de Mujer N: NIH (s) II: nu / nu ratones
desnudos. De tres a cuatro ratones se mantuvieron por jaula, con alimento y agua
ad libitum, y se examinan diariamente. peso ratones y el volumen del tumor se midieron dos veces a
la semana hasta que los tumores alcanzaron un volumen promedio de 100- 150 mm 3. Los ratones se
distribuyen a continuación en diferentes grupos experimentales, con el volumen tumoral promedio
igual, para la iniciación del tratamiento. rAAV2-shRNA inyecciones intratumorales se realizaron dos
veces por semana, durante 3-4 semanas. Los tumores se midieron en dos dimensiones
perpendiculares y el volumen se calculó por la fórmula [volumen = (longitud) x (anchura) 2 / 2] para
aproximar el volumen de un elipsoide.
3. resultados
3.1. Desarrollo de vectores de VAAr que expresan eGFP y un shRNA orientación vulnerabilidades
genéticas BLBC
3.1.1. Diseño y validación de plásmidos rAAV-shRNA
Sobre la base de la representación excesiva de la maquinaria del proteasoma conduce identificado como
BLBC vulnerabilidades intrínsecas en un estudio previo ( Petrocca et al., 2013 ), Dos subunidades del
proteasoma fueron elegidos como objetivos potenciales
- proteasoma subunidad alfa 2 (PSMA2) y la subunidad del proteasoma beta 4 (PSMB4). Otra
susceptibilidad persistente identificado fue MCL1, BCL2 regulador de la apoptosis de la familia
(MCL1), una proteína anti-apoptótica que fue el tercer objetivo elegido para el presente estudio.
secuencias de ARNhc Tar geting estos genes (MCL1sh, PSMA2sh y PSMB4sh) se obtuvieron de una
base de datos a disposición del público ( https://www.broadinstitute.org/ ARNi / TRC ). Una orientación
polo shRNA como quinasa 1 (Plk1), una proteína quinasa Ser / Thr altamente expresado durante la
mitosis ( Zitouni et al., 2014 ), También se obtuvo. La inhibición de esta proteína se ha demostrado
previamente para reducir la proliferación e inducir la apoptosis en células de cáncer ( Bhola et al.,
2015 ; Liu et al., 2017 ), Así PLK1sh se utilizó como control positivo. Además, dos scramble shRNA
(Ctrl1sh y Ctrl2sh), sin objetivos conocidos en las células humanas o de ratón, sirvieron como
controles negativos. Todas las secuencias de ARNhc fueron clonados en un vector de expresión
células diana. Validación de shRNA eficiencia desmontables de los dife- rentes construcciones de
plásmidos se evaluó mediante transfección transitoria de células HEK293 T. Se obtuvieron
eficiencias desmontables gen diana que van desde 40 a 90%, dependiendo del shRNA ( Figura 1 ),
Mostrando que las secuencias diseñadas causados ​potente y específico de silenciamiento del gen
diana.
3.1.2. implementación de la plataforma para la producción de vectores rAAV-shRNA libre de endotoxina
Los procesos de producción basados ​en la transfección transitoria de células T HEK293
constituyen una plataforma versátil, que permite una pantalla de actuación rápida de múltiples
vectores de rAAV para el plomo (más prometedor Snyder, 2016 ; Snyder y Moullier de 2011 ; van der
Loo y Wright, 2016 ). Por lo tanto, para la producción de vectores de rAAV-shRNA, 2 y 3-transfección
del plásmido utilizando CaPO _ 4 o PEI como agente de transfección, se pusieron a prueba.
La evaluación inicial de la productividad vector se realizó utilizando rAAV- Ctrl1sh para eludir
efectos derivados de knockdown gen diana en la línea celular de producción (HEK293 T), lo que
podría enmascarar los resultados. Como se observa en Figura 2 - A, no hubo diferencias significativas
en la productividad (vg / célula) obtenida con los dos reactivos de transfección ensayadas. Mientras
que las altas tasas de transfección bajo costo y pueden hacer con CaPO 4 la opción obvia para
producciones a pequeña escala, los rendimientos similares obtenidos en estas preparaciones nos
llevó a seguir con PEI transfección, para facilitar la escalabilidad y resultados más consistentes ( van
der Loo y Wright, 2016 ).
C. Pinto, et al. Journal of Biotechnology 300 (2019) 70-77

tabla 1
Optimización de la relación de plásmido y el tiempo de cosecha de vectores rAAV-shRNA.

tiempo de cosecha pDG: pAAVshRNA vg / célula ip / célula vp / vg

48 h post TF 1: 1 1.3E + 04 7.3E + 01 94

1: 3 2.9E + 04 9.9E + 01 29
1: 9 2.1E + 04 6.0E + 01 26
72 h post TF 1: 1 1.2E + 04 5.2E + 01 130
1: 3 1.4E + 04 8.3e + 01 105
1: 9 9.1e + 03 6.0E + 01 87

Figura 1. Validación de AAV-shRNA plásmidos para la regulación a la baja de las vulnerabilidades genéticas
BLBC. QRT-PCR análisis de la PLK1, MCL1, PSMA2, gen PSMB4 ex pression 24 h post-transfección de
células HEK293 T con las diferentes construcciones de plásmido. los niveles de mRNA se normalizaron contra
los niveles de limpieza rpl22 de ARNm dentro de la misma muestra y se muestran como el cambio veces en
relación con los respectivos niveles en células de control transfectadas con control negativo scramble Ctrl1sh
plásmido. El gráfico representa los valores + desviación media estándar (SD) de dos experimentos
independientes, con tres repeticiones técnica cada uno.
Fig. 3. caracterización purificada vector rAAV-shRNA. Purificación de diferentes vectores de
rAAV-shRNA se realizó por cromatografía de afinidad utilizando la resina de alto rendimiento AVB
Sepharose. Seis vectores rAAV-shRNA (dos controles revueltos negativos, un control positivo, y tres
vectores de rAAV-shRNA Tar geting tres genes de dependencia BLBC diferentes) se obtuvieron. La
pureza de vectores rAAV- shRNA se controló por SDS-PAGE seguido de tinción con azul de
instantánea. M: patrón de proteína; VP1, VP2, VP3: AAV proteínas estructurales.

En cuanto a los sistemas de transfección, como se observa en Figura 2 - B, sistema de transfección

2-plásmido entregado rendimientos de producción significativamente más elevados. En promedio, el título de

vector viral, como por vg / célula, fue hasta 5 veces superior con el sistema de 2-plásmido en relación con el consistentemente disminución del cociente vp / vg. Además, aumentar la proporción de pAAV en la

3-plásmido. mezcla de transfección disminuido aún más cápside vacía produc- ción. El protocolo optimizado final

El control de calidad de cada preparación de vector AAV en términos de partículas virales totales, se fijó en pDG: pAAV = 1: 3 y toh = 48 hpt para el rendimiento ip superior.

genomas virales envasados ​y partículas infecciosas es tical cri- antes se llevan a cabo ensayos de
potencia, ya que diferentes rAAV variantes producidas potencialmente tener diferentes relaciones de los Seis vectores rAAV-shRNA, dos de control de codificación scramble shRNA (rAAV-Ctrl1sh,

parámetros mencionados. métodos aguas arriba estándar para rAAV producción de vectores combinan rAAV-Ctrl2sh) y cuatro gen diana shRNA (rAAV- PK1sh, rAAV-MCL1sh, rAAV-PSMA2sh,

el plásmido que lleva el transgén (pAAV) y el plásmido helper / embalaje (PDG) en una relación 1: rAAV-PSMB4sh) se produjeron y se purificaron por cromatografía de afinidad. SDS-PAGE seguido

equimolar 1, y el tiempo de conjunto de la cosecha (TOH) a las 72 h después de la transfección (hpt). de tinción InstantBlue ™ reveló altos niveles de pureza para todos los lotes ( Fig. 3 ). Los títulos

Como se observa en tabla 1 , Esta combinación dio lugar a una alta relación / vg vp. obtenidos después de la purificación (10 13 VP / ml; 0.4-1 × 10 12 vg / ml; 10 10 ip / ml - Tabla 2 ) Están
dentro de rangos reportados ( Kotin de 2011 ; Samulski y Muzyczka, 2014 ). la calidad del lote, en
términos de vp / vg / IP, se man- contenido dentro de un pequeño rango, lo que sugiere que el

Con el fin de disminuir esta proporción y, en consecuencia, disminuir cápsidas vacías producidas, protocolo optimizado superar los posibles efectos secundarios que surgen de la activación de la

se ensayaron diferentes combinaciones de los parámetros mencionados. tabla 1 muestra que la maquinaria de RNAi

disminución de tiempo de la cosecha a 48 hpt

Figura 2. implementación de la plataforma para la pro- ducción de rAAV-shRNA vector.

Evaluación de rAAV productividad vector después de la transfección de células HEK293 T
utilizando UNA) diferentes agentes de transfección (CaPO4 vs. PEI) y SEGUNDO) diferentes
condiciones de transfección (2- vs. sistema 3-plásmido). Los gráficos muestran datos (media ±
SD) de al menos dos experimentos independientes. *, P <0,05, se determinó la significación
estadística utilizando la prueba t de Student de dos colas.

73
C. Pinto, et al. Journal of Biotechnology 300 (2019) 70-77

Tabla 2 impacto en BLBC potencial tumorigénico, se evaluaron los efectos de su caída en términos de
rendimientos purificadas vector rAAV-shRNA. impacto sobre la viabilidad celular y la apoptosis in- ducción en HCC1954 y líneas de células
MDA-MB-468. En MDA-MB-468, una disminución generalizada en la viabilidad de alrededor del 30%
rAAV-shRNA vp / mL vg / ml ip / mL
se observó después de la entrega mediada por rAAV de PLK1sh, MCL1sh, PSMA2sh y PSMB4sh,
control de mezcla aleatoria Ctrl1sh 1.3E + 13 1.1E + 12 2.1E + 10 en comparación con células transducidas con el control scramble ( Fig. 6 - UNA). Estos resultados
Ctrl2sh 4.0E + 13 9.3E + 11 3.4E + 10
indican que incluso un nivel moderado de knockdown gen puede ofrecer el efecto deseado. Por lo
control positivo PLK1sh 2.7E + 13 3.6E + 11 2.0E + 10
tanto, una mayor optimización de las secuencias de ARNhc para las vulnerabilidades genéticas aquí
vulnerabilidades genéticas BLBC MCL1sh 3.3E + 13 4.3E + 11 1.7E + 10
PSMA2sh 4.3E + 13 1.8E + 12 4.3E + 10 explotados podría estar justificada, en un intento de aumentar gen desmontables para potenciar el
PSMB4sh 3.6E + 13 4.7E + 11 1.6E + 10 efecto funcional. En términos de la inducción de apoptosis en estas células, un aumento significativo
tistically esta- se logró con rAAV-PSMA2sh, con hasta un aumento de 2 veces en el porcentaje de
células apoptóticas en comparación con el control de mezcla aleatoria ( Fig. 6 - B). Esto está en
en células HEK293 T. Sin embargo, rAAV-shRNA orientación nerabilities vul- genéticos mostró una consonancia con la eficiencia mostrada caída del vector referido. En HCC1954 células, se observó
tendencia a tener relaciones vp / VG superiores. una disminución significativa de la viabilidad celular sólo para vector viral rAAV-PLK1sh, y no hubo
ningún efecto significativo sobre la inducción de apoptosis por cualquiera de los vectores virales
3.2. downregulation PSMA2 disminuye la viabilidad celular e induce la apoptosis en líneas celulares de BLBC probados en estas células (datos no presentados). Las diferentes actividades biológicas de los
vectores virales entre MDA-MB-468 y HCC1954 podrían ser debido a sus diferentes firmas
moleculares y el estado oncogénico ( Grigoriadis et al., 2012 ).
3.2.1. eficiencia gen diana rAAV-shRNA desmontables
rAAV-shRNA eficiencia vector de transducción se evaluó en dos líneas celulares BLBC
-HCC1954, una línea celular epitelial pobremente diferenciado derivado de un carcinoma ductal sin
invasión de los ganglios linfáticos; y MDA-MB-468, una línea celular con morfología epitelial derivado
de un sitio metastásico. Todos los vectores desarrollados tenían niveles comparables de eficiencia
ducción trans- para cada una de las líneas de células - alrededor de 60% para MDA-MB- 468 y 3.3. Efecto de rAAV-PSMA2sh inyecciones intratumorales en BLBC xenoinjertos de ratón
aproximadamente el 80% para HCC1954 ( Fig. 4 ).

También se evaluó Target knockdown de genes después de la entrega mediada por rAAV de
shRNA a HCC1954 y líneas de células MDA-MB-468. rAAV- PSMA2sh mostró una regulación a la
baja constante del gen diana en ambas líneas celulares, de la eficiencia knockdown alrededor de
80% ( Fig. 5 ). Sin embargo, los otros vectores rAAV-shRNA evaluados mostraron o bien no
desmontables detectable gen (rAAV-MCL1sh), o niveles que no sobrepasan 50% de eficiencia
desmontables (rAAV-PLK1sh, rAAV-PSMB4sh). Estos resultados difieren significativamente de los
niveles obtenidos después de HEK293 T transfección transitoria, probablemente refleja las
diferencias en el sistema de suministro de shRNA y célula diana. Sin embargo, dado que el nivel del
gen desmontables que se traduce en un fenotipo observable es probable que dependa de la gen de
interés y sobre el resultado esperado, es difícil predecir si la eficiencia de la precipitación observada
tendrá un efecto funcional.
3.2.2. En la actividad biológica in vitro
Para evaluar si la regulación a la baja de los genes diana tiene una
Para evaluar si las vulnerabilidades genéticas pronosticadas pueden ser aprovechadas para la
terapia del cáncer de mama utilizando la tecnología desarrollada, se evaluó si PSMA2 knockdown
podría suprimir el crecimiento tumoral en vivo usando BLBC xenoinjertos de ratón. Cuando los tumores
eran alrededor de 100 mm 3,
ratones fueron tratados con rAAV-PSMA2sh, rAAV-PLK1sh, rAAV-Ctrl1sh o PBS, utilizando dos
dosis de vector, por inyecciones intratumorales. progresión tumoral pro- se monitorizó cada 3 días
midiendo el volumen del tumor en cada condición.
Como un modelo de tumor agresivo, el crecimiento de la masa tumoral fue rápida, especialmente
para los grupos de control tratados con PBS o con los controles revueltos, en ambas dosis de vectores
probados ( Fig. 7 ). Sin embargo, los ratones tratados con rAAV-PSMA2 mostraron una reducción en el
crecimiento del tumor con el tiempo, evidentes después de día 13 del tratamiento ( Fig. 7 ). Curiosamente,
para rAAV- PLK1sh, una reducción en el crecimiento del tumor sólo es aparente para la dosis más alta,
posiblemente reflejando la baja regulación a la baja de genes conseguido con este constructo y la
consiguiente menor impacto sobre la viabilidad celular.

Fig. 4. La eficacia de transducción de vectores virales de rAAV-shRNA en líneas celulares BLBC. Crecimiento exponencial MDA-MB-468 y no fueron transducidas HCC1954 células (NT) o transducidas con los vectores virales indicados
(4.6E + 4 vg / células cada uno). rAAV eficiencia vector de transducción se controló 48 h después de transducción por citometría de flujo de detección de eGFP. Gráficos muestran datos representativos obtenidos para cada línea celular.
Gráficos representan porcentaje de células transducidas (media ± DE) de tres experimentos independientes.

74
C. Pinto, et al. Journal of Biotechnology 300 (2019) 70-77

Fig. 5. eficiencia desmontables del gen diana de los vectores de

rAAV-shRNA en la celda BLBC líneas.

crecimiento exponencial UNA) MDA-MB-468 y SEGUNDO)

HCC1954 células se transdujeron con los vectores virales in-

dicated (4.6E + 4 vg / células cada uno). Veinticuatro o
cuarenta y ocho horas después fueron ordenados y se
procesan células ducción trans. El ARN total se extrajo y los
niveles de ARNm de la PLK1, MCL1, PSMA2 y PSMB4 se
DE- termined mediante qRT-PCR. niveles de mRNA se
malized nor- contra HPRT1 limpieza y genes rpl22 dentro de
la misma muestra y se muestran como el cambio veces en
relación con los respectivos niveles en las células
transducidas con rAAV-Ctrl1sh vector (media + SD) de tres
periments ex independientes.

Fig. 6. efectos funcionales de rAAV-shRNA tores por vectores en las

líneas celulares BLBC. Crecimiento exponencial células
MDA-MB-468 se transdujeron con los vectores virales indicados
(4.6E + 4 vg / células cada uno). Veinticuatro y cuarenta y ocho
horas después, se clasificaron las células transducidas y más rado
cul-. UNA) La viabilidad celular se midió utilizando el ensayo
fluorométrico Presto azul en diferentes puntos de tiempo de cultivo.
La viabilidad celular fue calcu- lada como un porcentaje respecto a
las células trans- ducidas con rAAV-Ctrl1sh vector. Que se muestra
es porcentaje de viabilidad de las células transducidas significa a las
72 h después de la transducción + SD de 3 experimentos in-
dependientes. SEGUNDO) Las células clasificadas se sembraron, y
la apoptosis determinados por kit apoptosis FLICA por citometría de
flujo. Los gráficos muestran apoptosis promedio de células (+ SD) de
tres experimentos independientes, en el día 5 post-ducción trans-. *,
P <0,05 frente a los valores en las células trans- ducidas con control
de mezcla aleatoria

(Ctrl1sh).
La significación estadística se determinó usando el Student de
dos colas t- prueba.

No se observaron diferencias significativas en la ganancia o pérdida de peso ratones. Por otra
parte, no se observaron alteraciones importantes macroscópicos en el hígado de ratones tratados
con vector, lo que sugiere que las inyecciones virales rAAV2- ARNhc no incitaron a efectos
secundarios significativos ni patotoxicity él-.
4. Discusión
entrega para la regulación a la baja de los genes necesarios para la supervivencia de las células BLBC.
Nuestros resultados indican que los métodos de aguas arriba estándar para la producción de rAAV, a
partir de la transfección transitoria de células HEK293 T, conducen a alto título de la cápside vacía en la
formulación final de los vectores de rAAV que codifican constructos shRNA. Hemos demostrado que
aumentando la relación de plásmido de gen / embalaje trans- en la mezcla de transfección, que duces
probable re- la probabilidad de formación de la cápsida vacía, la relación / vg vp se mejoró y los títulos
de IP se incrementaron ligeramente. Además, la combinación de la relación óptima con una disminución
en el tiempo de la cosecha a

Este estudio evalúa el potencial de shRNA rAAV mediada

Fig. 7. Efecto de vectores rAAV-shRNA en la tasa de crecimiento

tumoral de xenoinjertos de BLBC. UNA) y SEGUNDO) Doblar el
cambio en la progresión del volumen del tumor en ratones
inyectados con los vectores virales que se indican a 2 × 10 9 y 2 ×
10 8 vg / tumor / inyección, respectiva- mente. Los datos son la
media ± error estándar de la media de 10 animales inyectados
con PBS, de 5 animales inyectados con 2 x 10 8 virus / tumor, y de
7 animales inyectados con 2 x 10 9 virus / tumor. La diferencia
estadística entre los grupos se determinó por ANOVA de dos vías
usando el Graphpad 6 (Prism ®) software (** p <0,01, * p <0,05 en
comparación con los ratones de control inyectados con el control
de mezcla aleatoria RAA-Ctrl1sh, para cada dosis vector
probado).

75
C. Pinto, et al.
48 hpt, baja más títulos de vector virales vacías. Una relación / vg vp inferior es instrumental para el
empleo con éxito de la terapia génica se acerca como cápsidas vacías disminuirán potencia terapia y
aumentar las respuestas inmunes a la cápside proteínas.
El éxito de la terapéutica contra el cáncer utilizando el enfoque que se refiere, o incluso la
interrogación correcta como a la posible utilidad clínica, es de- pendiente en el desarrollo de sistemas
de administración adecuados para la introducción segura y eficiente de las moléculas de ARNhc en
células tumorales. AAV ha demostrado ser una opción viable, como vectores de rAAV están entre los
productos de terapia génica más prometedores desarrollados hasta la fecha. Después de numerosas
secundarios adversos, y con frecuencia no restringen toda la función de una proteína, resultando en
aplicaciones exitosas en el tratamiento de enfermedades monogénicas por la sustitución de genes ( Cideciyan
et al., 2009 ; Nathwani et al., 2014 ; Valori et al., 2010 ), Arsenal AAV se ha ampliado para comprender
varias terapias contra el cáncer ( Luo et al., 2015 ) Y diferentes modalidades clínicas que incluyen
estrategias de ingeniería del genoma, tales como CRISPR RNAi y / Cas9 ( Valdmanis y Kay, 2017 ).
La baja capacidad de transgén de carga, a menudo deteriorando la terapia génica mediada por VAAr,
no es un problema con estos enfoques, y hace que tales pequeñas moléculas de ARN a ADN
codificado transgenes ideales para estos vectores.
También crucial para una terapia exitosa es maximizar la producción de vector mientras se
mantiene la consistencia lote. Sin embargo, llegar a títulos elevados durante el procesamiento aguas
arriba implica una alta expresión del transgén en células productoras. Mientras surgen algunas
preocupaciones cuando se trata de productos génicos inertes, que generalmente establece el estándar
de oro para el título de vector produc- ción, la actividad biológica de transgenes citotóxicos para la
terapia del cáncer en las líneas celulares productoras pueden afectar su capacidad de síntesis de
proteínas, tabolism me- y viabilidad, o montaje vector impacto en sí ( Maunder et al., 2017 ). En cuanto a
aplicaciones de ARNhc, la activación de la maquinaria de RNAi en células HEK293 T durante la
producción de rAAV, combinado con la carga adicional de la producción de proteínas heterólogas,
disminución de la viabilidad celular en el tiempo (que era inferior a 72 hpt - datos no mostrados), y
deteriora la calidad de preparaciones de vector. Nuestros resultados se suman a un creciente cuerpo de
literatura sobre las estrategias para eludir esos efectos secundarios. Estos incluyen la adición de
proteínas adicionales y extensa manipulación genética del transgén ( Maunder et al., 2017 ), La adición
de AP- domadores ( Strobel et al., 2015 ), La inhibición de la expresión del transgen en células
productoras a través de siRNA o por activación de genes tóxicos sólo a través de la escisión de ADN
espaciador por Cre-recombinasa entregado a través de un segundo vector ( Lee y Jameson, 2002 ). La
estrategia más simple aplicado aquí es lo suficientemente flexible como para permitir la optimización del
transgén dependiente si es necesario, mientras que llegar a rendimientos comparables a las plataformas
de producción de rAAV (actual Kotin de 2011 ; Snyder, 2016 ).
Para evaluar el potencial de esta estrategia para ser utilizado como enfoque apeutic un BLBC
ter-, transduced líneas celulares BLBC con vectores de VAAr que expresan shRNA contra
vulnerabilidades genéticas previamente identificados de este subtipo de cáncer de mama.
transducción de rAAV-PSMA2 causó una disminución específico y potente en PSMA2 expresión en
ambas líneas celulares sometidas a prueba, en comparación con células transducidas con rAAV que
lleva un scramble shRNA. La expresión reducida de PSMA2 resultado en una disminución de la
viabilidad y el aumento de la apoptosis en células MDA-MB-468. Además, rAAV2-PSMA2
inyecciones intratumorales en BLBC xenoinjertos de ratón condujo a una disminución en el
crecimiento tumoral con el tiempo, en comparación con PBS o controles revueltos. Estos resultados
son consistentes con Petrocca et al, que indican que las proteínas de la maquinaria del proteasoma
son fundamentales para la viabilidad celular BLBC ( Petrocca et al., 2013 ), Y sugieren que esto podría
ser un vector terapéutico potencial contra este tipo de cáncer, en estudios adicionales.
Aunque los ensayos clínicos llevados a cabo anteriormente han conducido a la aprobación
reglamentaria de los inhibidores del proteasoma para el tratamiento de diversas enfermedades,
incluyendo el mieloma múltiple y linfoma de células del manto, adquirido mecanismos re- sistencia
comúnmente surgen y socavan eficacia de la terapia ( Manasanch y Orlowski, 2017 ). También, la
eficacia preclínica de estos inhibidores para tumores sólidos no podía ser traducida a la clínica, lo
que indica la importancia para el desarrollo de plataformas de administración adecuados, ya que
incluso el más potente terapéutico puede fallar en la clínica debido a la entrega ineficiente ( Manasanch
y Orlowski, 2017 ). Terapéutico
76
Journal of Biotechnology 300 (2019) 70-77
silenciamiento génico post-transcripcional vía shRNA pueden dirigirse a ARNm de cada gen, así
como el genoma undruggable considerado ( Kacsinta y Dowdy, 2016 ). En contraste con inhibidores
del proteasoma, este enfoque de- fers la posibilidad de evolucionar de una manera específica de la
secuencia, lo que podría superar los mecanismos de resistencia derivados de mutaciones genéticas.
Además, posee ventajas superiores sobre otras estrategias con eficacia clínica probada, incluyendo
inhibidores de molécula pequeña, tales como imatinib para el tratamiento de la leucemia mieloide
crónica ( Druker et al., 2006 ), y anticuerpos monoclonales, tales como trastuzumab para el cáncer de
mama precoz HER2 positivo ( Smith et al., 2007 ). inhibidores de molécula pequeña tienen un bajo
grado de especificidad cuando se trata de destino de modulación, que puede conducir a efectos
efectos anti-oncogénicos ineficientes ( Kikani et al., 2005 ; Lim et al., 2008 ; Pecot et al., 2011 ; Weihua
et al., 2008 ). Por otro lado, los anticuerpos monoclonales se restringen a membrana o proteínas
culating cunstancias ( Pecot et al., 2011 ).
Tomados en conjunto, este estudio mostró evidencia de que además ción optimización de
plataformas de producción rAAV aguas arriba estándar, basado en tran- transfección sient de células
HEK293 T, tiene el potencial de superar citotoxicidad transgén en las células productoras de
vectores. Por otra parte, nuestros resultados proporcionan una prueba de concepto de que el
transporte mediado por shRNA rAAV de Tar Consiguiendo genes de dependencia BLBC puede ser
un enfoque prometedor para el tratamiento de esta enfermedad. La estrategia aquí desarrollado
representa una mejora en el empleo tradicional de la terapia génica suicida para el cáncer. enfoques
de genes suicidas clásicos matarán las células de forma indiscriminada y confiar únicamente en la
ejecución selectiva de especificidad. terapia con genes de dependencia específicos del cáncer
Directivo conferirá un mayor grado de especificidad y seguridad para el tratamiento. Sin embargo, Chen
et al., 2017 ; Sayroo et al., 2016 ). Esta estrategia también podría ser adecuado para el tratamiento de
otros tumores malignos. El shRNA se puede personalizar para cualquier dependencia tumor y
adaptar a diferentes subtipos o diferentes tumores. También, una combinación de lotes de rAAV que
codifican diferentes transgenes se puede utilizar para disminuir la aparición de resistencia tumor.
Finalmente, dada la indicación para el potencial terapéutico de estos Tar consigue, la evaluación
de la eficacia clínica en los modelos más relevantes de igenesis de tumor debe estar justificada.
Aunque una disminución en el crecimiento del tumor con el tiempo se observó en modelos de
xenoinjerto de ratón BLBC, estos ratones son inmunodeficientes y, por tanto, no retratan la
inmunogenicidad de la terapia desarrollada. Ahora se ha establecido que varios agentes terapéuticos
anticancerígenos que inducen apoptosis en las células tumorales pueden desencadenar una
respuesta inmune específica de antígeno ( Galluzzi et al., 2016 ). Esto, a su vez, re- activa el sistema
inmune contra las células tumorales, la mejora de la respuesta terapéutica. En consecuencia, la
evaluación de medicamentos contra el cáncer está desplazando hacia el uso de ratones
inmunocompetentes para evalua- ción adecuada del resultado terapéutico ( Galluzzi et al., 2016 ). Por
otra parte, con el desarrollo de in vitro modelos humanos que incorporan células MUNE im-, pruebas
de pistas prometedoras en un entorno humano también pueden ser posibles ( Nyga et al., 2016 ; Rebelo
et al., 2018 ).
Declaraciones de interés
Ninguna.
Expresiones de gratitud
Los autores reconocen el Dr. Judy Lieberman para el apoyo científico. El trabajo fue apoyado
por el subsidio FCT PTDC / BBB-BIO / beca 1240/2012 y Doctor PD / BD / 52202/2013 a C. Pinto.
iNOVA4Health - UID / Multi / 04462/2019, un programa financiado por la Fundación para a Ciência e
Tecnologia / Ministério da Educação e Ciência, a través de fondos nacionales y co-financiado por el
FEDER en el marco del Acuerdo de Asociación PT2020 es reconocido.
C. Pinto, et al. Journal of Biotechnology 300 (2019) 70-77

referencias KA, Farley, DC, 2017. Los títulos Mejorando de vectores virales terapéuticas utilizando la represión de transgenes en el
sistema de producción de vectores (TRIP). Nat. Commun. 8, 14834.
https://doi.org/10.1038/ncomms14834 .
Bhola, NE, Jansen, VM, Bafna, S., Giltnane, JM, Balko, JM, Estrada, MV, Meszoely,
Los vectores virales para la terapia génica, los métodos de la biología molecular. En: Merten, O.-W., Al-
I., Mayer, I., Abramson, V., Ye, F., Sanders, M., Dugger, TC, Allen, EV, Arteaga,
Rubeai, M. (Eds.), Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, Nueva Jersey. https: //
CL, evaluación funcional de 2015. Kinome en todo identifica papel de Plk1 en, el cáncer de mama ER-positivo
doi.org/10.1007/978-1-61779-095-9 .
dependiente de hormonas en ejercicio. Cancer Res. 75, 405-414. https://doi.org/10. 1158 / 0008-5472.CAN-14-2475 .
Miest, TS, Cattaneo, R., 2013. Los nuevos virus para la terapia del cáncer: necesidades clínicas de reuniones.
Nat. Rev. Microbiol. 12, 23-34. https://doi.org/10.1038/nrmicro3140 .
Bianchini, G., Balko, JM, Mayer, IA, Sanders, ME, Gianni, L., 2016. Triple-negativo
Naldini, L., 2015. La terapia génica vuelve al centro del escenario. Naturaleza 526, 351-360. https: // doi.
cáncer de mama: desafíos y oportunidades de una enfermedad heterogénea. Nat. Rev. Clin. Oncol. 13,
org / 10.1038 / nature15818 .
674-690. https://doi.org/10.1038/nrclinonc.2016.66 .
Nathwani, AC, Reiss, UM, Tuddenham, EGD, Rosales, C., Chowdary, P., McIntosh, J.,
Brimble, MA, Reiss, UM, Nathwani, CA, Davidoff, AM, 2016. Nuevo y mejorado
Della Peruta, M., Lheriteau, E., Patel, N., Raj, D., Riddell, A., Pie, J., Rangarajan, S., Bevan, D., Recht, M., Shen,
AAVenues: estado actual de la terapia génica de la hemofilia B. Expert Opin. Biol. El r. 16, 79-92. https://doi.org/10.1517/14712598.2015.1106475
Y. -M., Halka, KG, Basner-Tschakarjan, E., Mingozzi, F., High, KA, Allay, J., Kay, MA, Ng, CYC, Zhou, J.,
.
Cancio, M., Morton, CL , Gris,
Bryant, LM, Christopher, DM, Giles, AR, Hinderer, C., Rodríguez, JL, Smith, JB,
JT, Srivastava, D., Nienhuis, AW, Davidoff, AM, seguridad 2014. a largo plazo y ficacy EF- de la terapia de gen
Traxler, Ea, Tycko, J., Wojno, AP, Wilson, JM, 2013. Las lecciones aprendidas del desarrollo clínico y la
del factor IX en la hemofilia BN New England J. Med. Surg. Collat. Ramas Sci. 371, 1994-2004. https://doi.org/10.1056/NEJMoa14
autorización de comercialización de Glybera. Tararear. Gene Ther. Clin. Prog. 24, 55-64. https://doi.org/10.1089/humc.2013.087
.
.
Nyga, A., Neves, J., Stamati, K., Loizidou, M., Emberton, M., Cheema, U., 2016. El siguiente
Caldas Lopes, E., Cerchietti, L., Ahn, JH, Clemente, CC, Robles, AI, Rodina, A., Moulick,
nivel de modelos de tumores en 3D: inmunocompetencia. Discov drogas. Hoy en día 21, 1421-1428.
K., Taldone, T., Gozman, A., Guo, Y., Wu, N., Stanchina De, E., Blanco, J., Gross, SS, Ma, Y., Varticovski, L.,
https://doi.org/10.1016/j.drudis.2016.04.010 .
Melnick, A., Chiosis, G., 2009. inhibidor de Hsp90 PU-H71, un inhibidor multimodal de malignidad, induce
Pecot, CV, Calin, GA, Coleman, RL, López-Berestein, G., Sood, AK, 2011. ARN in-
respuestas completas en modelos de cáncer de mama triple negativo. PNAS 106, 8.368-8.373 .
a interferencias en la clínica: desafíos y direcciones futuras. Nat. Rev. cáncer 11, 59-67.
https://doi.org/10.1038/nrc2966 .
Carey, L. mama, Winer, E., Viale, G., Cameron, D., Gianni, L., 2010. triple negativo
Petrocca, F., Altschuler, G., Tan, SM, Mendillo, ML, Yan, H., Jerry, DJ, Kung, AL,
cáncer: entidad de la enfermedad o el título de conveniencia? Nat. Rev. Clin. Oncol. 7, 683-692.
Hide, W., Ince, Ta, Lieberman, J., 2013. Una pantalla de siRNA de todo el genoma identifica adicción proteasoma
https://doi.org/10.1038/nrclinonc.2010.154 .
como una vulnerabilidad de las células de cáncer de mama triple negativo basales-similares. Cancer Cell 24, 182-196. https://doi.org/10.1016
Chen, M., Maeng, K., Nawab, A., Francois, RA, Bray, JK, Reinhard, MK, Boye, SL,
.
Hauswirth, WW, Kaye, FJ, Aslanidi, G., Srivastava, A., Zajac-Kaye, M., 2017. entrega eficiente del gen y
Rebelo, SP, Pinto, C., Martins, TR, Harrer, N., Estrada, MF, Loza-Alvarez, P.,
expresión en el páncreas y tumores pancreáticos por capsid- vectores AAV8 optimizados. Tararear. Gene Ther.
Cabeçadas, J., Alves, PM, Gualda, EJ, Sommergruber, W., Brito, C., cultura 2018. 3D-3-: una herramienta para
Métodos 28, 49-59. https://doi.org/10. 1089 / hgtb.2016.089 .
dar a conocer la plasticidad de los macrófagos en el microambiente tumoral. Biomateriales 163, 185-197. https://doi.org/10.1016/j.biom
.
Cideciyan, AV, Hauswirth, WW, Alemán, TS, Kaushal, S., Schwartz, SB, Boye, SL,
Samulski, RJ, Muzyczka, N., 2014. terapia génica mediada por AAV para la investigación y ter-
Windsor, EAM, Conlon, TJ, Sumaroka, A., romano, AJ, Byrne, BJ, Jacobson,
apeutic propósitos. Annu. Rev. Virol. 1, 427-451. https://doi.org/10.1146/annurev- virología-031.413 a 085.355 .
SG, 2009. Visión 1 año después del la terapia génica para la amaurosis congénita de Leber. N. Engl.
J. Med. 361, 725-727. https://doi.org/10.1056/NEJMc0903652 .
Santiago-Ortiz, JL, Schaffer, DV, 2016. virus (AAV) vectores adenoasociados en el cáncer
Druker, BJ, Guilhot, F., O'Brien, SG, Gathmann, I., Kantarjian, H., Gattermann, N.,
terapia de genes. Control de J.. Liberar 240, 287-301. https://doi.org/10.1016/j.jconrel.
Deininger, MWN, plata, RT, Goldman, JM, Piedra, RM, Cervantes, F., Hochhaus,
2016.01.001 .
A., Powell, BL, Gabrilove, JL, Rousselot, P., Reiffers, J., Cornelissen, JJ, Hughes,
Sayroo, R., Nolasco, D., Yin, Z., Colon-Cortes, Y., Pandya, M., Ling, C., Aslanidi, G., 2016.
T., Agis, H., Fischer, T., Verhoef, G., Shepherd, J., Saglio, G., Gratwohl, A., Nielsen,
Desarrollo de vectores AAV novela serotipo 6 base con tropismo selectivo para las células cancerosas humanas.
JL, Radich, JP, Simonsson, B., Taylor, K., Baccarani, M., Tan, C., Letvak, L., Larson,
Gene Ther. 23, 18-25. https://doi.org/10.1038/gt.2015.89 .
RA, 2006. Cinco años de seguimiento de los pacientes tratados con imatinib para la leucemia mieloide crónica.
Schneider, BP, Winer, EP, Foulkes, WD, Garber, J., Perou, CM, Richardson, A.,
N. Engl. J. Med. 355, 2408-2417. https://doi.org/10.1056/ NEJMoa062867 .
Trineo, GW, Carey, Los Ángeles, 2008. El cáncer de mama triple negativo: los factores de riesgo para po- tenciales objetivos.
Clin. Cancer Res. 14, desde 8.010 hasta 8.018. https://doi.org/10.1158/1078-
Galluzzi, L., Buqué, A., Kepp, O., Zitvogel, L., Kroemer, G., 2016. muerte celular inmunogénica
0432.CCR-08-1208 .
en el cáncer y las enfermedades infecciosas. Nat. Rev. Immunol. 2-5. https://doi.org/10.1038/ nri.2016.107 .
Smith, I., Procter, M., Gelber, RD, Guillaume, S., Feyereislova, A., Dowsett, M.,
Goldhirsch, A., Untch, M., Mariani, G., Baselga, J., Kaufmann, M., Cameron, D., Bell,
Grigoriadis, A., Mackay, A., Noel, E., Wu, P., Natrajan, R., Frankum, J., Reis-Filho, JS,
R., Bergh, J., Coleman, R., Wardley, A., Harbeck, N., López, RI, Mallmann, P., Gelmon, K., Wilcken, N., Wist, E.,
Tutt, A., 2012. Caracterización molecular de modelos de línea celular para los cánceres de mama triple negativo.
Sánchez Rovira, P., Piccart-Gebhart, MJ, 2007. 2- años de seguimiento de trastuzumab después de la
BMC Genomics 13, 619. https://doi.org/10.1186/1471-2164-13-619 .
quimioterapia adyuvante en el cáncer de mama HER2 positivo: un ensayo controlado aleatorio. The Lancet 369,
Grimm, D., Kay, MA, Kleinschmidt, JA, 2003. ayudante, ópticamente controlable libre de virus,
29-36. https://doi.org/10.1016/ S0140-6736 (07) 60028-2 .
y la producción de vectores de virus adeno-asociados de los serotipos 1 a-dos plásmidos basados
6. Mol. El r. 7, 839-850. https://doi.org/10.1016/S1525-0016(03)00095-9 .
Snyder, RO, 2016. Una visión general del desarrollo de productos vector de rAAV para la terapia génica.
Kacsinta, AD, Dowdy, SF, 2016. Los puntos de vista actuales sobre la inducción de ARNi sintético letal re-
En: Childers, MK (Ed.), Biología de células madre y la medicina regenerativa. Springer, Nueva York, Nueva York,
sponses en el tratamiento de cáncer. Expert Opin. Biol. El r. 16, 161-172. https: // doi. org / 10.1517 /
Nueva York, pp. 21-37. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-3228-3_2 .
14712598.2016.1110141 .
Virus adeno-asociado. En: Snyder, RO, Moullier, P., Methods in Molecular (Eds.)
Kaplitt, MG, Feigin, A., Tang, C., Fitzsimons, HL, Mattis, P., Lawlor, PA, Bland, RJ,
Biología. Humana Press, Totowa, Nueva Jersey. https://doi.org/10.1007/978-1-61779-370-7 .
Young, D., Strybing, K., Eidelberg, D., Durante, MJ, 2007. La seguridad y tolerabilidad de la terapia génica con un virus
Strobel, B., Klauser, B., Hartig, JS, Lamla, T., Gantner, F., Kreuz, S., 2015. Riboswitch-
adeno-asociado (AAV) transmitidas gen GAD para la enfermedad de Parkinson: un estudio abierto, de fase I de ensayos
atenuación mediada de la citotoxicidad transgén aumenta el rendimiento de vector de virus adeno-asociados en las
. The Lancet 369, 2097-2105. https://doi.org/10. 1016 / S0140-6736 (07) 60982-9 .
células HEK-293. Mol. El r. 23, 1582-1591. https://doi.org/10.1038/ mt.2015.123 .

Kikani, CK, Dong, LQ, Liu, F., 2005. “nuevas” funciones -CLEAR de PDK1: más allá de un maestro
Testa, F., Maguire, AM, Rossi, S., Pierce, EA, Melillo, P., Marshall, K., Banfi, S., Surace,
quinasa? J. Cell. Biochem. 96, 1157-1162. https://doi.org/10.1002/jcb.20651 .
EM, Sun, J., Acerra, C., Wright, JF, Wellman, J., High, KA, Auricchio, A., Bennett,
Kotin, RM, la producción de virus adeno-asociado recombinante 2011. gran escala. Tararear.
J., Simonelli, F., 2013. Tres años de seguimiento después unilateral subretiniana Entrega de virus
Mol. Gineta. 20, R2-R6. https://doi.org/10.1093/hmg/ddr141 .
adeno-asociado en pacientes con amaurosis congénita de Leber Tipo 2. Oftalmología 120, 1283-1291. https://doi.org/10.1016/j.oph
Ledford, H., 2015. Los virus que combaten el cáncer ganar su aprobación. Naturaleza 526, 622-623. https: //
.
doi.org/10.1038/526622a .
Valdmanis, PN, Kay, MA, 2017. El futuro de la terapia génica rAAV: plataforma para RNAi, gen
Lee, EJ, Jameson, JL, 2002.-Cell específica activación cre-mediada de la difteria
edición, y más allá. Tararear. Gene Ther. 28, 361-372. https://doi.org/10.1089/hum.
gen de la toxina en las células tumorales de pituitaria: potencial para la terapia génica citotóxica. Tararear. Gene Ther. 13,
2016.171 .
533-542. https://doi.org/10.1089/10430340252809829 .
Valori, CF, Ning, K., Wyles, M., Mead, RJ, Grierson, AJ, Shaw, PJ, Azzouz, M., 2010.
Lim, ST, Mikolon, D., Stupack, DG, Schlaepfer, DD, control 2008. FERM de FAK
El suministro sistémico de scAAV9 expresar SMN prolonga la supervivencia en un modelo de atrofia muscular
Función: implicaciones para la terapia del cáncer. Ciclo Celular 7, 2306-2314. https://doi.org/
espinal. Sci. Trad. Medicina. 2 https://doi.org/10.1126/scitranslmed.
10.4161 / cc.6367 .
3.000.830. 35ra42-35ra42.
Liu, Z., Sun, P., Wang, X., 2017. Plk1, un objetivo potencial para la terapia del cáncer. Trad.
van der Loo, JCM, Wright, JF, 2016. Avances y dificultades en fabri- vector viral
Oncol. 10, 22-32. https://doi.org/10.1016/j.tranon.2016.10.003 .
fabri-. Tararear. Mol. Gineta. 25, R42-R52. https://doi.org/10.1093/hmg/ddv451 .
Luo, J., Luo, Y., Sun, J., Zhou, Y., Zhang, Y., Yang, X., 2015. a virus adeno-asociado
Weihua, Z., Tsan, R., Huang, WC, Wu, Q., Chiu, CH, Fidler, IJ, Hung, MC, 2008.
terapia génica del cáncer mediada: situación actual. Cancer Lett. 356, 347-356. https: // doi. org / 10.1016 /
La supervivencia de las células cancerosas es mantenida por EGFR independiente de su actividad quinasa. Cancer
j.canlet.2014.10.045 .
Cell 13, 385-393. https://doi.org/10.1016/j.ccr.2008.03.015 .
inhibidores Manasanch, EE, Orlowski, RZ, 2017. proteasoma en la terapia del cáncer. Nat. Rdo.
Zitouni, S., Nabais, C., Jana, SC, Guerrero, A., Bettencourt-Dias, M., 2014. Polo-como
Clin. Oncol. 5, 101-110. https://doi.org/10.1038/nrclinonc.2016.206 .
quinasas: variaciones estructurales conducen a múltiples funciones. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 433-452. https://doi.org/10.1038/nr
Maunder, HE, Wright, J., Kolli, BR, Vieira, CR, Mkandawire, TT, Tatoris, S.,
.
Kennedy, V., Iqball, S., Devarajan, G., Ellis, S., Lad, Y., Clarkson, NG, Mitrophanous,

77