Informe N°10

Nombre: Milton Paúl Márquez Cadena

NRC: 5682

Fecha: 12/07/2018

Título: Recuento bacteriano en el laboratorio.

Palabras clave: Colonias aisladas, estrías, proliferación bacteriana.

Resumen: La realización del conteo bacteriano es una técnica realizada para calcular la
concentración microbiana en una solución mediante diferentes técnicas las cuales pueden
ser realizarse ante una observación en el microscopio o un conteo directo de las UFC
presentes. En estas técnicas se relaciona la cantidad de colonias observable y la cantidad
aproximada de célula visibles, respectivamente, con el volumen de la solución en la
solución usada o en instrumento para llegar a la concentración microbiana original de la
muestra problema.

Introducción:

Antecedentes: En la Universidad de Buenos Aires Argentina, en la Facultad de Ciencias

biológicas realizaron un estudio acerca del crecimiento masivo de colonias con diluciones
desde 1/10 hasta 1/100000 mediante bacterias recolectadas desde el suelo. En esta técnica
usaron un Agar Nutritivo como medio de cultivo y una triangulo para la extensión de la
muda por toda la placa. Más tarde encubaron las cajas Petri a 37°C durante dos días y
procedieron a realizaron un conteo con la ayuda de un aparato electrónico que mide la
UFC existentes en la caja Petri (López & Torres, 2006).

En la Universidad Autónoma de Buenos Aires se realizó un conteo Bacteriano mediante

el uso de la cámara Petroff-Hausser, en este estudio se realizó un registro de las células
observables en la caja ante el microscopio. Con la muestra realizada se efectuó un cálculo
de la concentración de microrganismo por mL de solución. En este estudio realizaron tres
veces dicho procedimiento (Olivas & Alarcon, 2011).
Justificación: El conteo bacteriano es una técnica de laboratorio que ayuda a calcular el
valor aproximado de la concentración que tiene un tubo de ensayo o una solución con
microrganismos y así realizar datos cuantitativos sobre dicha muestra. En la observación
de UFC (unidad formadora de colonias) se debe realizar un conteo de las colonias que
surgieron y este proceso relaciona las UFC con la dilución hecha en la muestra. En el caso
del conteo por la cámara Petroff-Hausser es directo con el microscopio y relaciona las
medidas del instrumento con el número de microrganismos visibles.

Objetivo general: -Realizar un recuento bacteriano en el laboratorio.

Objetivo específico: - Ejecutar diluciones en tubos de ensayo de la muestra.

- Realizar una extensión en caja Petri de cada dilución.

-Efectuar un conteo de las colonias formadas.

-Registrar el número de células observables en la cámara Petroff-

Hausser.

Hipótesis: En la caja Petri que tiene el factor de dilución menor será posible de contar el
número de colonias debido a poco crecimiento masivo.

Marco Teórico: Un recuento bacteriano es una técnica para calcular la concentración

microbiana de una solución. Existe dos variantes en la realización de esta técnica ya sea
en superficie o en profundidad. En el método que es en superficie se realiza una siembra
por extensión es realizada en una caja Petri y posteriormente encubada para el conteo de
colonias visibles (Sánchez, 2012). El conteo en caja Petri de las UFC es un método que
determina la concentración de una muestra de microrganismos a partir de cuantas
bacterias viables para crecimiento existieron al momento de realizar la extensión
(Sánchez, 2012). En la caja de siembra por profundidad es realizado por un vertido en
una placa, la placa en la que se puede observar se llama cámara Petroff-Hausser y
relaciona directamente las medidas del instrumento, como área de cada cuadrado visible
y volumen de instrumento, con el número de microorganismos visibles en el microscopio
(Sánchez, 2012).

Materiales y métodos:

Tomar un ml de la muestra problema y diluirlo procediendo a poner nueve ml de

soluciones con la muestra luego se realiza este procedimiento cuatro veces hasta llegar a
una dilución de 10-5 (1/100000). Posteriormente tomar 0.1 ml de cada dilución y realizar
la extensión de cada tubo de ensayo en una caja Petri, respectivamente. Esta extensión se
realizó con un triángulo previamente esterilizado con etanol al 70%. Finalmente poner a
encubar en posición invertida a 37° C durante 24 horas, después proceder a la revisión de
las Cajas Petri en el conteo (Koch, 2017).

Para este método se utiliza la siguiente formula:

1/𝑡𝑎𝑠𝑎 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑡𝑢𝑏𝑜 𝑑𝑒 𝑒𝑛𝑠𝑎𝑦𝑜

# 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑙𝑛𝑖𝑎𝑠 ∗ = # 𝑈𝐹𝐶/𝑚𝑙
𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑎 𝑒𝑛 𝑒𝑙 𝑙𝑎 𝑐𝑎𝑗𝑎 𝑃𝑒𝑡𝑟𝑖 (𝑚𝑙)

En la técnica de conteo directo en el microscopio por la cámara Petroff-Hausser se realizó

la extensión de la muestra en la placa para el conteo de los microrganismos visible por
cuadro, se utilizó la siguiente formula

# 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠/4𝑥10−6 𝑚𝑙 = # 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠/𝑚𝑙

*4𝑥10−6 𝑚𝑙 𝑒𝑠 𝑢𝑛𝑎 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛 𝑒𝑛𝑡𝑟𝑒 𝑙𝑜𝑠 16 𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟𝑎𝑑𝑜𝑠 𝑦 𝑙𝑎 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑑𝑎𝑠 𝑞𝑢𝑒 𝑡𝑖𝑒𝑛𝑒 𝑒𝑙 𝑒𝑞𝑢𝑖𝑝𝑜

Resultados: Dependiendo del procedimiento se dividió en dos diferentes:

*Por conteo en cajas Petri realizando extensión de la muestra.

1. En PDA
En la caja con dilución de 10-1 se observa un crecimiento masivo por los costados
y no es posible contar las colonias en el (fig1). En el experimento con dilución de
10-2 se observa un crecimiento masivo y no es posible contar las colonias (fig2).
En la caja Petri con dilución de 10-3 se observa tanto crecimiento masivo como
colonias aisladas, pero en menor proporción visible que le crecimiento masivo
(fig3). En el procedimiento con la dilución de 10-4 se observa crecimiento masivo
y ninguna colonia observable (fig4). En la última caja Petri con la dilución de
10-5 se observa colonias aisladas en los bordes de la caja mientras que el centro
existe crecimiento masivo(fig5). En ninguna es posible realizar el conteo.
2. En agar-EMB
En la caja con dilución de 10-1 se observa un crecimiento masivo por los costados
y no es posible contar las colonias en el (fig6). En el experimento con dilución de
10-2 se observa solamente crecimiento masivo y no es posible contar las colonias
(fig7). En la caja Petri con dilución de 10-3 se observa colonias aisladas, pero en
gran cantidad (fig8). En el procedimiento con la dilución de 10-4 se observa
colonias aisladas en menor cantidad que en la caja ocho (fig9). En la última caja
Petri con la dilución de 10-5 se observa colonias aisladas en menor cantidad de la
caja nueve (fig.10). Se procede a realizar el conteo de la caja diez.
a

Para la caja 10 se realizó el conteo y se utilizó la siguiente formula:

1/𝑡𝑎𝑠𝑎 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑡𝑢𝑏𝑜 𝑑𝑒 𝑒𝑛𝑠𝑎𝑦𝑜

# 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑙𝑛𝑖𝑎𝑠 ∗ = # 𝑈𝐹𝐶/𝑚𝑙
𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑎 𝑒𝑛 𝑒𝑙 𝑙𝑎 𝑐𝑎𝑗𝑎 𝑃𝑒𝑡𝑟𝑖 (𝑚𝑙)

1/10−5
333 ∗ = # 𝑈𝐹𝐶/𝑚𝑙
0.1 𝑚

# 𝑈𝐹𝐶/𝑚𝑙 = 3.33 x 108

* En el conteo en el microscopio por la cámara Petroff-Hausser con la muestra del tubo

de ensayo con algas se realizó el siguiente resultado usando la siguiente formula.

# 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠/4𝑥10−6 𝑚𝑙 = # 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠/𝑚𝑙

41/4𝑥10−6 𝑚𝑙 = # 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠/𝑚𝑙

# 𝑎𝑝𝑟𝑜𝑥. 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠/𝑚𝑙 = 1.025𝑥107

Discusión: En el caso del conteo por las colonias aisladas visibles se realiza diluciones
para bajar la concentración bacteriana de una solución y así poder llegar a la
concentración inicial. Al bajar la concentración en la caja Petri se observa cómo va
decreciendo el número de colonias visibles para realizar un conteo. En la caja de conteo
por Petroff-Hausser se realiza una relación del volumen del instrumento con la cantidad
de cuadrados que existen en la observación de la muestra (Tortora, Funke, & Case, 2007).

Conclusiones: -La dilución de 10-5 con agar EMB fue posible realizar el conteo ya que
tiene menor concentración microbiana.

-En la cámara de Petroff-Hausser el conteo se debe relacionar con el volumen del

instrumento y cantidad de cuadros para llegar a la concentración.

Bibliografía:

Koch, A. (2017). Manual de Laboratorio. Obtenido de Universidad de las Fuerzas Armadas

"ESPE".
López, L., & Torres, C. (2006). Estudio cuantitativo de bacterias . Obtenido de biologia.edu.ar:
http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/tp5.pdf
Olivas, E., & Alarcon, L. (2011). Conteo microscópico directo en cámara de Petroff-Hauser.
Obtenido de bivir.uacj.mx: http://bivir.uacj.mx/Reserva/Documentos/rva2011297.pdf
Sánchez, I. (2012). Recuento Bacteriano. Obtenido de diversidadmicrobiana.com:
https://www.diversidadmicrobiana.com/index.php?option=com_content&view=article&
id=467&Itemid=523
Tortora, G., Funke, B., & Case, C. (2007). Introducción a la microbiología. Mexico:
Panamericana.