PRÁCTICA N°05

SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS

NOMBRE: CHERO NUNURA ANDY NÚMERO: #12

I. INTRODUCCIÓN

En la naturaleza, los microorganismos se encuentran formando poblaciones

mixtas con otros tipos de microorganismos. Los cultivos de estas mezclas se
llaman por ello cultivos mixtos.
Sin embargo, el conocimiento de los microorganismos se consigue mediante el
estudio de cepas aisladas, cultivadas en el laboratorio en cultivos puros (o
axénicos). En ocasiones el estudio molecular conduce a la caracterización de los
microorganismos, aún en poblaciones mixtas. Sin embargo, la identificación
bacteriana y la caracterización completa solo es posible tras el aislamiento de la
bacteria y la obtención de cultivos puros.
Por ello el primer problema al estudiar una bacteria es su aislamiento del resto de
los microorganismos presentes (en una muestra patológica, de agua, de suelo, de
alimentos, etc.). Una vez que se ha logrado el aislamiento es posible obtener la
bacteria de interés en cultivo puro.

II. OBJETIVOS

 Realizar una siembra por agotamiento en superficie sólida o aislamiento

en estría simple.
 Realizar una siembra por difusión en placa o placa vertida.
 Obtener un cultivo puro de bacterias.
III. METODOLOGÍA
 Siembra por agotamiento en superficie sólida o aislamiento en estría
simple

Con este procedimiento se puede conseguir una buena separación de las

colonias y aislarlas fácilmente. Para ello se funde el medio de cultivo, se
vuelca en caja de Petri y se deja solidificar. Con el asa previamente
esterilizada se toma material de un cultivo heterogéneo y se descarga
sobre la superficie del medio formando estrías. Esto puede realizarse de
varias formas:

a) Al comienzo se coloca el inoculo, luego se continúa con las estrías.

Cuando se quiere obtener colonias muy separadas se puede utilizar
dos o tres placas de Petri, para lo cual se repite la operación sin
tomar con el asa nuevo material.
b) Se puede dividir la placa de Petri en cuatro cuadrantes; una vez
depositado el material en el primero, siguiendo el sentido de las
agujas del reloj, se hace una estría luego en el segundo, tercero y
cuarto cuadrante sin cargar nuevamente el asa; en el último
cuadrante aparecerán las colonias aisladas
c) El inóculo se extiende sobre una pequeña zona de la placa,
próxima al borde, se esteriliza el asa y se traza otra estría a partir
del depósito y así sucesivamente.
 Siembra por difusión en placa o placa vertida.

Consiste en colocar 0.1 ml de inoculo en el centro de una placa de Petri

con medio de cultivo. Se extiende con una espátula de Drigalsky o una
varilla de cristal estéril hacia delante y atrás, mientas se hace girar la
placa, se tapa, se invierte y se lleva a incubar.

 Obtención de cultivo puro de bacterias.

a) Tratamiento de la muestra

Para estudiar las bacterias se necesita poder cultivarlas en

condiciones de laboratorio y por lo tanto inicialmente deben ser
aisladas.
Por ello, se debe disponer de muestras biológicas que pueden ser
de varios tipos:
 Muestras que contienen abundante número y tipo de
microorganismos en las que previamente se deben realizar
diluciones en solución salina fisiológica estéril. Ejemplo,
suelo.
 Muestras que no contienen superficie cantidad del
microorganismo que se desea investigar, por lo que
previamente se deben enriquecer para incrementar el
número del microorganismo requerido y disminuir el de
los contaminantes. Ejemplo, leche.
 Muestras que naturalmente no presentan bacterias
(incluyendo el microorganismo investigado y los
contaminantes) y que se siembra sin ningún pre-
tratamiento. Ejemplo, sangre.

b) Aislamiento primario

Una vez que la muestra ha recibido o no tratamiento se procede al

aislamiento primario a través de la siembra en placa de Petri
mediante la técnica de estría en la superficie de medios
enriquecidos (agar sangre), medios selectivos (agar Champan) o
medios selectivos diferenciales (agar Mac Conkey). Después de
un periodo de incubación de 24 horas (puede variar en función del
microorganismo), se observarán las colonias de bacterias (masas
constituida por millones de bacterias que se aprecian a simple vista
y que han sido originadas a partir de una célula). Se observará el
tamaño y el aspecto de cada colonia que generalmente son
constantes para cada género y especie bacteriana, por lo que se les
utiliza como característica diferencial.
 A continuación, se realizará una tinción de Gram para determinar
la morfología y reacción tintorial de las bacterias constituyentes de
la colonia.

 Reconocimiento de la muestra biológica: Jugo de cebada diluido.

 Esterilizamos mesa y manos con alcohol.

 Esterilizar el asa a la llama del mechero y dejamos enfriar muy cerca de la llama.
 Con el asa cogemos 1 gota de la muestra para luego poder sembrarla.

 Sembramos la muestra en una placa de Petri con agar con la técnica de agotamiento
y estría.

 Acondicionamos la placa de Petri y la llevamos a incubar en una estufa a 30°C por

24 horas.
 Luego de la incubación, observaremos que se han formado colonias.

a) Aislamiento secundario

En caso que la morfología y reacción a la tinción de Gram de las

células bacterianas coincidan con el microorganismo que se desea
investigar se realizará el aislamiento secundario a través de una
siembra para trasplante o transferencia de una pequeña porción de
la colonia hacia un tubo medio de cultivo inclinado que permitirá
el desarrollo bacteriano o cultivo puro bacteriano (población de
bacterias que procede de una célula) y que a su vez puede ser
mantenido e identificado merced a sus propiedades culturales y
fisiológicas.

 Esterilizamos un asa y agarramos una pequeña porción de una colonia.

 Sembramos en un vial con agar previamente esterilizado utilizando la técnica de
agotamiento y estrío.

 Acondicionamos el vial y lo llevamos a incubar en una estufa a 30°C por 24 horas.

 Transcurrido el tiempo tendremos un cultivo puro de bacterias, se debe mantener el

cultivo puro en refrigeración.
 IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS
Las colonias de bacterias tienen una medida, forma y textura y en algunos casos color
característicos, que, aunque puede variar de acuerdo al medio en que se encuentren,
es constante bajo condiciones controladas y depende de la especie bacteriana que la
forme.

A. ESTUDIO MORFOLÓGICO DE LAS COLONIAS BACTERIANAS:

Determina el tamaño, forma, borde, elevación, consistencia, aspecto y color

de la colonia bacteriana.

 Observamos dos placas de Petri con diferentes colonias y determinamos su

morfología.

Aspectos morfológicos

Tamaño
Forma
Bordes
Elevación
Aspecto
Color
 B. PRUEBA DE CATALASA

La catalasa es una enzima que poseen la mayoría de las bacterias aerobias.

Descomponen el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno. El
desprendimiento de burbujas procedentes del oxígeno indica que la prueba es
positiva.

 Con ayuda de un asa esterilizada colocar en un porta objeto (previamente

desengrasado) una pequeña muestra de la colonia.

 Colocar una gota de peróxido de hidrógeno sobre la muestra bacteriológica en el porta

objeto.
 Observamos e indicamos si la prueba de catalasa es positiva o negativa.

IV. CONCLUSIONES

 La identificación de la morfología de las colonias es de suma importancia

ya que gracias a ellas nos podemos dar una idea al taxón que pertenece
dicha muestra bacteriológica.
 Al utilizar la técnica de agotamiento y estrío conseguimos que en cada
estrío sea menor el número de células arrasadas con el asa bacteriológica.
 Se considera que hemos obtenido un cultivo puro, cuando al realizar el
proceso de aislamiento secundario, todas las colonias obtenidas presentan
las mismas características.

V. BIBLIOGRAFÍA
Tortora. G, Funke. B y Case. C. (2007). Introducción a la Microbiología (9ª.ed.). Buenos
Aires, Argentina. Editorial Médica Panamericana.
Prats. G. (2006). Microbiología Clínica. Madrid, España. Editorial Médica
Panamericana.