31-03-2019

Técnicas de
Espectrofotometría
UV-Visible
Dr. Joel Asenjo

Room: Bioq215c1
Apellido, Nombre

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Métodos Ópticos

Espectroscopia: es la ciencia que estudia la relación de la

radiación electromagnética y la materia

Los métodos espectroscópicos se fundamentan en medir

la cantidad de radiación que producen o absorben los
compuestos o elementos de interés

Otros Métodos Ópticos

Espectroscopia:
Absorbancia
Emisión
Fluorescencia
IR
Emisión atómica a la llama
Chispa
Arco
Plasma de argón

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Radiación electromagnética

La radiación electromagnética es una forma de energía que se transmite a una

gran velocidad en el espacio, llamada LUZ a aquella que se encuentra en el
espectro UV-Visible y el IR cercano.
Esta se puede describir como una onda con propiedades de longitud de onda,
amplitud, frecuencia y velocidad.

Onda: la radiación tiene 2 componentes 1) Campo magnético

2) Campo eléctrico

Amplitud: corresponde al valor máximo de campo eléctrico alcanzado por la

radiación electromagnética, tiene relación con la energía de la radiación
Periodo: es el tiempo en segundos para el paso de un máximo o mínimo sucesivos
en pasar por un punto fijo en el espacio.
Frecuencia: es el número de oscilaciones del vector de campo eléctrico por unidad
de tiempo

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¿Todas las fuentes de luz son iguales?

¿Emiten de la misma manera?

La frecuencia está determinada por la fuente de emisión

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Longitud de onda: es la distancia lineal entre máximos o mínimos

sucesivos de una onda

= longitud de onda
v = frecuencia

La velocidad de la luz en el vació alcanza su valor máximo

¿Cambia las características de la luz al

pasar a través de un cuerpo transparente?

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Cuando la luz pasa por un medio distinto al aire, la longitud de onda es alterada

Número de onda: corresponde al número de ondas por centímetro, es

igual al reciproco de la longitud de onda.

Espectro electromagnético

Las variaciones del espectro electromagnético tienen relación con las

transiciones en los niveles de energía de las especies en estudio

El espectro electromagnético abarca un amplio rango de frecuencias y por lo

tanto de longitudes de onda

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La luz visible, a la cual es

sensible el ojo humano,
corresponde a una fracción
del espectro
electromagnético (380 a 780).

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Cambio mínimos

• La medida de la emisión y la absorción de la luz por parte de las

sustancias se denomina espectrofotometría.

•Los términos absorción y emisión tienen el mismo significado que el

de su uso cotidiano: absorción significa tomar, y emisión significa dar.

• Existe una tercera forma de espectrometría, la luminiscencia que se

subdivide en fluorescencia y fosforescencia, que se diferencian
principalmente en el tiempo que perdura la emisión de luz

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Los espectros de emisión:

• Todos los cuerpos emiten energía a ciertas temperaturas.

• El espectro de la radiación energética emitida es su espectro de

emisión.

• Todos los cuerpos no tienen el mismo espectro de emisión.

• En realidad, cada uno de los elementos químicos tiene su propio

espectro de emisión.

Como se genera un espectro de emisión

Fotones emitidos

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Como es un espectro de EMISION

Los espectros de absorción:

• Los cuerpos absorben la radiación emitida desde otros cuerpos,

eliminando del espectro de radiación que reciben aquellas bandas
absorbidas, que quedan de color negro. Son lo que se llaman “rayas
negras” o simplemente “rayas” del espectro.

• También ocurre con la absorción, que unos cuerpos absorben la

radiación de unas determinadas longitudes de onda y no absorben la
radiación de otras longitudes de onda, por lo que cada cuerpo, cada
elemento químico en realidad, tiene su propio espectro de absorción,
correspondiéndose con su espectro de emisión, cual si fuera el
negativo con el positivo de una película.

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Como se genera un espectro de absorción

Fotones absorbidos

Como es un espectro de ABSORCION

Absorbancia ≠ Transmitancia

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¿Un espectro de
absorbancia de
un analito es
invariable, nada lo
puede alterar?

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¿Qué condiciones
o elementos
pueden hacer
variar un espectro
de absorbancia?

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Grupo fenol ionizable

10.2 IP

6.9 IP

La naturaleza polar del medio líquido en que se encuentra el

cromóforo altera el máximo de emisión de un espectro de absorbancia

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¿Se puede usar

esta estrategia
para cuantificar
la concentración
de un analito en
solución?

Como es un espectro de ABSORCION

Absorbancia ≠ Transmitancia

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TRANSMITANCIA (T):

T = I /I0 A = −log T

LEY DE LAMBERT-BEER
Rige para luz monocromática. Se considera la siguiente situación:

c = concentración (M) l = camino óptico (cm)

I = I0 10–εlc ley de Lambert-Beer (forma exponencial)

ε = coeficiente de extinción molar (M-1cm-1)

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FORMA LINEAL DE LA LEY DE LAMBERT-BEER

De la ecuación exponencial se deduce:

log (I0/I) = ε l c

Se define:

A = log (I0/I)

A = absorbancia, extinción o “densidad óptica” (D. O.)

Luego:

A=εlc Ley de Lambert-Beer

Otros coeficientes de extinción:

e mM
A 0,1%, 1 cm

Relación de la Absorbancia y la concentración del cromóforo

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Gráfico de A en función de la Concentración, a longitud de

onda y camino óptico fijos, según la ley de Lambert-Beer:

La pendiente
depende de ε l

Ejercicio
Tras las diluciones adecuadas una disolución patrón dio las concentraciones de
hierro que se muestran a continuación. El complejo de hierro (II)/1,10-
fenantrolina se desarrolló entonces en alícuotas de 25,0 mL de estas
disoluciones, a continuación cada una de ellas se diluyó a 50,0 mL. Se leyeron
las siguientes absorbancias a 510 nm (color rojo-anaranjado);
Concentración de Fe(ll) en las disoluciones iniciales,

Ppm Absorbancia
2,00 0,164
5,00 0,425
8,00 0,628
12,00 0,951
16,00 1,260
20,00 1.582

(cubetas de 1 cm)

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(a) Construir una curva de calibrado a partir de estos datos.,

(b) El método desarrollado en el problema anterior se aplica a la
determinación rutinaria de hierro en alícuotas de 25,0 mL de aguas
naturales, la preparación de la muestra fue igual al procedimiento anterior.
Determinar la concentración (en ppm) de muestras que dieron los datos
de absorbancia que siguen (en celdas de 1,00 cm):
(a) 0,107 (b) 0,721 (c) 1,538

Curva de Calibración

Software estadístico
1,8 • Excel
• open office
1,6
• Sigma plot
1,4 • Prisma

1,2
A510 nm

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
2+
Fe (ppm)

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Curva de Calibración

1,8

1,6

1,4

1,2

A510 nm 1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
2+
Fe (ppm)

Curva de Calibración

1,8

1,6

1,4

1,2
A510 nm

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
2+
Fe (ppm)

b= 0,0148
e= 0,0781
r ²= 0,99957

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Curva de Calibración

1,8
Interpolando los
1,6 valores
1,4 (a) 0,107
1,2
(b) 0,721
A510 nm 1,0
(c) 1,538
0,8

0,6

0,4

0,2

0,0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
2+
Fe (ppm)

b= 0,0148
e= 0,0781
r ²= 0,99957

Curva de Calibración

1,8
Interpolando los
1,6 valores
1,4 (a) 0,107
1,2
(b) 0,721
A510 nm

1,0
(c) 1,538
0,8

0,6

0,4

0,2

0,0
0 5 10 15 20 25
2+
Fe (ppm)

b= 0,0148
e= 0,0781
r ²= 0,99957

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Curva de Calibración

1,8
Interpolando los
1,6 valores
1,4 (a) 0,107
1,2
(b) 0,721
A510 nm 1,0
(c) 1,538
A = elc 0,8

0,6

A 0,4
=c
el 0,2
0,107 = 1,37 ppm
0,0
0,0781
0 5 10 15 20 25

Fe 2+
(ppm) 0,721 = 9,23 ppm
0,0781
b= 0,0148 1,538 = 19,7 ppm
e= 0,0781 0,0781
r ²= 0,99957

Gracias por su asistencia

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