FASE ANALÍTICA:

1.- COLORACION DE RETICULOCITOS:

1. Mezclar inmediatamente después de la toma de muestra (sangre
entera), 1 parte de colorante azul brillante de cresil al 1% (diluir
con sn. fisiológica) con 1 parte de sangre anticoagulada con EDTA.
2. Incubar en baño maría a 37 ºC durante 30´y realizar un
extendido.
3. Proceder a realizar el recuento en forma idéntica al recuento
indirecto de plaquetas.

Todas las siguientes pruebas siempre deben ser acompañadas por un

patrón normal que se largará en idénticas condiciones a las del paciente

2.- PRUEBA DE FRAGILIDAD OSMÓTICA:

Prueba sin incubación:
Se procederá de la manera indicada a continuación en la misma mañana de
obtenida la muestra.
Prueba con incubación:
Se procederá de igual manera pero con la muestra tomada en tubo estéril.
La muestra se colocará inmediatamente en estufa de 37 º o en baño
termostatizado a igual temperatura y permanecerá allí durante 24 hs. antes
de procesar la prueba incubada, la cual se realizará únicamente en el caso
que la prueba sin incubar otorgare resultados dudosos.

Muestra: Sangre c/ heparina

Solución: Cloruro de Sodio al 1%

ClNa ClNa gr
Tubo N° 1% H20 Abs.Pac %Hem.p % Abs.Cont. %Hem.c
1 5 0 1,00
2 4,75 0,25 0,95
3 4,50 0,50 0,90
4 4,25 0,75 0,85
5 4,00 1,00 0,80
6 3,75 1,25 0,75
7 3,50 1,50 0,70
8 3,25 1,75 0,65
9 3,00 2,00 0,60
10 2,75 2,25 0,55
11 2,50 2,50 0,50
12 2,25 2,75 0,45
13 2,00 3,00 0,40
14 1,75 3,25 0,35
15 1,50 3,50 0,30
16 1,25 3,75 0,25
17 1,00 4,00 0,20
18 0,50 4,50 0,10

1
Homogeneizar.
Agregar a cada tubo 1 gota o 50 ul.de sangre heparinizada.
Incubar 30 min. A T ambiente
Centrifugar 5-10 min. a 2000-2500 rpm.
Leer a 540 nm., utilizar como blanco el tubo 1.
Graficar: %Hem / ClNa gr%

Sin Con
Valores de Referencia: incubación: Incubación:
FCM 0,40 - 0,45 gr % ClNa 0.48-0.58
Hem. Inc. 0,45 - 0,50 gr % ClNa 0.58-0.68
Hem.Com. 0,30 - 0,33 gr % ClNa 0.10-0.38

3.- ELECTROFORESIS DE HEMOGLOBINA:

Preparacion del buffer tris-glicina (ph:8,9):

Tris-----------------------------7.05 gr.
Glicina--------------------------11.3 gr.
Llevar a 1000 ml con H2O

Peparación del colorante: (Negro Amido 10B)

H2O destilada------------------47,5 ml.

Metanol-------------------------47,5 ml.
Ac. Acético---------------------5,0 ml.
Negro Amido-------------------0,5 gr.

Peparación del decolorante:

H2O destilada------------------475 ml.

Metanol-------------------------475 ml.
Ac. Acético---------------------50 ml.

Preparación del transparentizador:

Metanol------------------------85 ml.
Acido Acético------------------14 ml.

Hemolizado:

Lavar los eritrocitos del paciente 3-4 veces con Sn. Fisiológica. Al paquete
globular resultante agregarle igual volumen de agua destilada y la mitad de

2
volumen de tolueno. Dejar en la heladera de 2-24 horas, centrifugar 5 min.
A alta velocidad, extraer la fase de tolueno y estromas.

Electroforesis:

Tomar las tiras de acetato de celulosa y quitar el excedente de metanol

colocándolas entre papel de filtro.
Incubar las tiras durante por lo menos 15 minutos en el buffer de corrida
previamente colocado en la cuba electroforética, teniendo la precaución de
que los electrodos queden bien cubiertos por el mismo.
Quitar el excedente de buffer colocándolas entre papel de filtro.
Colocar las tiras en el puente y sembrar los bemolizados en el polo negativo.
Tapar la cuba y encender la fuente de poder a 200 voltios durante
aproximadamente una hora.
Observaciones:
A fin de ahorrar insumos, las tiras pueden cortarse al medio y utilizar
puentes dobles de papel de filtro para llegar al buffer de corrida.
Tener la precaución de conectar correctamente los cables en los polos
correspondientes de la cuba y fuente de poder respectivamente.
Una vez encendida la fuente de poder, controlar que esté pasando
electricidad, lo que se manifestará mediante el humedecimiento de la tapa
en la parte interior.
Cortar la electricidad cuando el frente de corrida haya atravesado
aproximadamente las ¾ partes de la tiras. En caso de ver en el frente
mucho arrastre cortar un poco antes.

Coloración:
Realizar algún corte identificatorio en la tira y sumergirla durante 5
minutos en colorante negro amido.
Observaciones: reciclar el colorante..

Decoloracion:
Realizar un primer enjuague con agua de canilla para sacar el grueso de
colorante impregnado.
Luego colocar las tiras en decolorante y con movimientos de vaivén realizar
múltiples lavados.
Cuando la tira esté bastante decolorada dejar en decolorante limpio y con el
recipiente tapado.
Observaciones: el decolorante se recicla y se va conservando en frascos con
el decolorante con distintos grados de uso (color).

Transparentización:

3
Colocar la tira en metanol puro durante 1 a 2 minutos.
Luego sumergirla durante 1 minuto en el transparentizador.
Apoyar la tira sobre un portaobjetos bien limpio, sin que queden burbujas.
Colocar durante 5 a 10 minutos en estufa a 80ºC

4.- TEST de FALCIFORMACIÓN:

Reactivo:
Metabisulfito de Na......................2 gr.
Agua destilada................................100 ml.
Procedimiento:
Mezclar 2 gotas de reactivo con ½ gota de sangre.
Colocar entre cubre y porta.
Sellar con esmalte para uñas.
Observar en 40 x a los 15´, 60´y 24 hs.
Interpretación:
Positivo: eritrocitos en hoz.
Negativo: eritrocitos en disco
Largar en paralelo una muestra normal.

5.- PRUEBA DE COOMBS:

PRUEBA DE COOMBS DIRECTA ( PCD )

Muestra: Sangre entera

Reactivo: Suero de Coombs ( suero anti-humano poliespecífico)

Procedimiento:
Lavar los hematíes 3 veces con solución fisiológica teniendo la precaución de
descartar completamente el sobrenadante y resuspender el precipitado luego
de cada lavado
Preparar una suspensión de GR al 3% con solución salina

Tubo Paciente

Susp . GR. 3% pac. 1 gota

Lavar 3 veces (último lavado descartar completamente el sobrenadante )

Tubo Paciente

4
SAGH ( poliespecífico ) 2 gotas

--Centrifugar 15 seg. a 3.500 rpm

--Leer ( Anotar resultado lectura inmediata ( Li ) )
--Incubar 10 min. a T ambiente
--Centrifugar 15 seg. a 3.500 rpm
--Leer ( Anotar resultado 10 min. )

Informe de los Resultados: (+) positivo , (-) negativo

-Control del reactivo SAGH :

A todos los tubos de pacientes ,cuyos resultados son (-), agregar 1 gota de
células control débilmente sensibilizadas con Ig G, mezclar, centrifugar y leer.
Se deberá obtener una reacción débilmente (+) con campo mixto. De esta
forma podemos considerar los resultados (-) obtenidos como válidos.
Si luego de agregar las células control los resultados (-) se mantienen, indica
que el SAGH no ha sido agregado ,y si fue agregado no reaccionó. Esto se
puede deber a:
1) el reactivo esté deteriorado
2) el reactivo esté contaminado con suero, neutralizando la actividad
Anticuerpo.
3) las células han sido insuficientemente lavadas y residuos de suero ó plasma
han neutralizado el SAGH.

Toda PCD (+) debe ser testeada con SAGH monoespecífico anti-IgG y anti-
C3d, para evaluar si la sensibilización in vivo se debe a IgG, C3d, ó a
ambos.

PRUEBA DE COOMBS INDIRECTA (PCI)

Muestra: suero del paciente
Fuente de Ags.: sangre entera (GR a probar)
Reactivo: Suero de Coombs (suero anti-humano) poliespecífico
Procedimiento:
Lavar los GR 3 veces con solución fisiológica y preparar una suspensión de GR al
3%

Tubo Paciente
Suero pac. 2 gotas
Susp. GR 3 % 1 gota
-Mezclar e incubar 3-60 0 min. a 37ºC
-Centrifugar 15 seg. A 3.500 rpm
-Leer ( Anotar el resultado )

5
-Lavar 3 veces ( descartar completamente en el último lavado la Sn. salina )

Tubo Paciente
SAGH 2 gotas

-Mezclar
-Centrifugar 15 seg. a 500 g.
-Leer ( Anotar el resultado)

-Control del reactivo SAGH, idem PCD.

6.- TITULACION DE CRIOAGLUTININAS

Muestra : suero
Metodología:
El suero del paciente debe haber sido separado previamente a 37ºC. Esto
se
logra dejando la muestra en un baño a 37ºC durante 30-60 min. Una vez
retraído el coágulo , sin sacar el tubo del baño, aspirar el suero y
centrifugarlo para eliminar las cells aspiradas conjuntamente ( para evitar
resultados F(-) ).

- Los GR de prueba deben provenir de una muestra anticoagulada de grupo

‘0’ I y de una ‘0’ i , lavados y suspendidos en Sn. salina normal al 1 %(o
PBS ) .
- Diluir el suero 1/5 con Sn salina ( o PBS ).
- Preparar dos baterías de diluciones dobles seriadas del suero ya diluído
1/5, con volúmenes de 0,5 ml de sn. salina (o PBS), hasta el tubo nº 12
(1/20480).
- Añadir a cada tubo de dilución de una batería un volúmen de 0,5 ml de la
suspensión globular ‘0’ I al 1% y a la otra la susp. ‘0’ i.
-Mezclar e incubar a 4ºC durante 24 hs.

Interpretación:
-Se considera como título obtenido la mayor dilución del suero en la que fue
observada aglutinación.
-Los títulos inferiores a 1/40 son considerados normales.
-Un título mayor de 1/40 no es necesariamente Dx. de AH por crioaglutininas,
pero puede estar asociado a muchos agentes infecciosos (ej. Mycoplasma
neumoníae).
-Títulos mayores de 1/640 se observa en la hemólisis debida a crioaglutininas
con especificidad anti-I y menores de 1/640 cuando la especificidad es anti-i

6
7.- TEST DE DONATH-LANDSTEINER

Objetivo: Prueba diagnóstica de la entidad llamada Hemoglobinuria

Paroxística a ‘Frigore’ ( por frío). Se deberá sospechar de esta enfermedad,
cuando estén asociados los siguientes parámetros:
- No se encontraron auto-anticuerpos fríos en el suero del paciente.
- El paciente tiene hemoglobinemia y/o hemoglobinuria.
- Los GR tienen una PCD (+) sólo para C3d.
- El eluído de los hematíes es no reactivo.
Metodología:
- El suero del paciente se obtiene de la misma manera que la técnica
anterior.
- Preparar una susp. de GR ‘0’ P+ al 50% en sn. salina.
- Suero humano normal ( 4ml. ) recién obtenido como fuente de C'.
- Rotular 3 series de 3 tubos cada una:

Tubos A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Suero pac. 10 g. 10 g. 10 g. 10 g. 10 g. 10 g.
Suero N 10 g. 10 g. 10 g. 10 g. 10 g. 10 g.
GR 50% 1 g. 1 g. 1 g. 1 g. 1 g. 1 g. 1 g. 1 g. 1 g.

Baño de hielo molido Baño de hielo Baño a 37ºC durante

30 min., luego 60 molido durante 90 90min.
min. a 37ºC min.
Centrifugar todos los tubos y observar la presencia o no de hemólisis.

Interpretación:
El resultado de la prueba es (+) cuando los tubos A1 y A2 presentan hemólisis.
El tubo A1 puede no presentar hemólisis debido a una hipocomplementemia de
paciente.

8.- PRUEBA DE HAM

Muestra:
Paciente: Extraer suero ( 2.5 ml ) y sangre entera ( con citrato de sodio
3.8% (9:1)
Control: Debe ser ABO –Rh compatible con el paciente a estudiar.
Extraer suero y sangre entera con citrato de sodio 3,8% (9:1)

7
Procedimiento
Muestras:
 Lavar los hematíes del paciente y control 3 veces con solución

fisiológica y finalmente preparar una suspensión al 50%

 Inactivar una porción del suero control - 10 min a 56 ªC

Reactivos
Acido Clorhídrico (HCl) 0,2 N
Para preparar 10 ml de HCl 0,2 N:

Tubos 1 2 3 4 5
Suero Control 0.5 0.5 0.5 0.5 (*) ------
( ml )
Suero Paciente ------ ------ ------ ------ 0.5
( ml )
HCl (0.2N) ------ 0.05 0.05 0.05 0.05
( ml )
Suspensión GR paciente al 50% 0.05 0.05 0.05 ------ 0.05
( ml )
Suspensión GR control al 50% ------ ------ ------ 0.05 ------
( ml )
(*) Suero control inactivado

Incubar 60 min a 37 ª C
Centrifugar los tubos y observar la presencia o no de hemólisis. Y si hubo
hemolisis en que grado.
( El tubo Nª 2 es el tubo prueba, los demás son controles)
Interpretación de los Resultados
Una HPN dará la siguiente interpretación
Tubo 2: positivo
Tubo 5: positivo o vestigios
Tubo 1: negativo o vestigios
Si aparte de los tubos 2 y 5 aparece hemólisis franca en el 1 y/o en el 3 ,
no dar diagnostico de HPN y sugerir realización de la Prueba de Coombs,
PFO, etc.

9.- COLORACIÓN DE PERLS:

1. Fijar el extendido durante 5 min. En metanol.
2. Lavar por inmersión 2 a 3 veces con agua destilada.
3. Sumergir en acido de ferrocianuro durante 30 min.
4. Lavar con agua destilada alcalinizada con bicarbonato (pH=7,5-8)
5. Controlar al microscopio, si hiciera falta colocar 30 min. Más en
ferrocianuro.
6. Lavar el extendido con agua bicarbonatada.

8
 7. Escurrir y sin lavar agregar eosina al 0,5% durante 5-10 min.

Acido de ferrocianuro de Potasio:

Ferrocianuro de Potasio al 2% ……………………………………………….1 Vol
HCl excento de Fe al 2 % ………………………………………………………..1 Vol