Cromatografía en Columna

Isabbella Martínez Gonzales, Eyder Adres Espinosa Acosta

Grupo3, Subgrupo 7.
Facultad de Ingeniería Química y Ambiental, Universidad Nacional de Colombia
Bogotá, Colombia
eaespinosaa@unal.edu.co
ismartinezgo@unal.edu.co

I. DIAGRAMA DE FLUJO

figura1. Montaje cromatografía de columna. 1. Soporte

universal, 2. Pinzas y nuez, 3. Bureta, 4. Vaso de
precipitados, 5. Sílica (fase estacionaria), 6. Solvente
(fase móvil)
  Colorantes patrón

SUDAN III
Propiedad Dato

Estructura

Aspecto Rojo oscuro

Olor Inodoro
Punto de
195 - 199 °C
fusión (°C)
Número CAS 85-86-9
Solubilidad Insoluble
Masa
352,4
Molecular
Tabla 2: Propiedades fisicoquímicas del Sudan III

P-NITROFENOL
Propiedad Dato

Estructura
figura 2. Montaje de cromatografía de capa fina para
análisis posterior de la muestra problema separada.
Aspecto Cristales
II. DATOS DE ENTRADA Olor --
Color amarillo
 Fase estacionaria (Sílica gel) Punto de ebullición (°C) 306°C
Punto de fusión (°C) 114°C
Propiedad Dato
Temperatura de
--
inflamación (°C)
Estructura Presión de vapor 0.005Pa a 25°C
Densidad 1,4 g/cm3
Solubilidad en agua 0.089g/100 ml
Aspecto Granulos blancos
Masa Molecular 138,1
Olor Inodoro
Tabla 3: Propiedades fisicoquímicas del p-nitrofenol
Punto de ebullición (°C) No reportado
Punto de fusión > 1000 °C  Fases móviles
Temperatura de
823 °C Las fases móviles utilizadas en la practica se pueden
descomposición (°C)
Toxicidad No toxico ordenar en la serie elutrópica:
pH 4-5
Tolueno < Metanol
Solubilidad Inmiscible en agua
Tipo de adsorbente Polar TOLUENO
Alta absorción, Propiedad Dato
Funcionamiento termal
estable, característica
Otras Propiedades
física estable , fuerza
Estructura
mecánica relativamente
alta, etc
Tabla 1: Propiedades fisicoquímicas de la Sílica gel
Aspecto Liquido incoloro
Olor Característico
Color Incoloro
 Punto de ebullición 110.6°C selección del tolueno se hace en base a la práctica anterior
Punto de fusión -95°C de cromatografía de capa fina en donde al trabajar con la
Punto de ignición 535°C muestra problema se ve la necesidad de usar un solvente
Punto de con una polaridad intermedia entre acetato de isopropilo y
4°C
inflamación éter de petróleo, donde como se suponiendo que con este
Inflamabilidad La sustancia es inflamable se logre una separación efectiva (véase figura 3c).
Peligro de explosión Combustible
Presión de vapor 29hPa a 20°C
Densidad 0.87 g/cm3
Solubilidad en agua 0.53g/L
Masa Molecular 92.14
Solubilidad en Ethanol benceno , dietil
disolventes éter, cloroformo, acido
orgánicos acético glacial
Disolvente No polar
Tabla 4: Propiedades fisicoquímicas del tolueno

METANOL
Propiedad Dato

Estructura

Aspecto Líquido
Olor Característico
Color Incoloro (b)
(a)
Punto de ebullición 65°C (c)
Punto de fusión -98°C
Punto de inflamación 12°C figura 3. Proceso de separación por cromatografía de
La sustancia es columna
Inflamabilidad
inflamable Luego por acción de la gravedad se
Peligro de explosión Combustible procede separar las dos sustancias
Presión de vapor 12.3kPa que conforma la muestra problema
Densidad 0.79g/cm3
como muestra la figura 4 para
Solubilidad en agua Miscible
después evaporar el solvente y
Masa Molecular 32
posteriormente analizar con el
Solubilidad en Etanol, acetona éter
cloroformo, benceno colorante patrón e identificar que
disolventes orgánicos
Disolvente polar sustancia es tal como se muestra en
Tabla 5: Propiedades fisicoquímicas del metanol la figura 5a y 5b. Por ultimo cabe
destacar que para extraer la
III. RESULTADOS sustancia de color amarillo claro (C1
figura 3c) de la columna fue
Con las columnas ya preparadas se extrae el solvente hasta
necesario usar metanol para arrastrar
que quede un milímetro del mismo, esto con el fin de evitar
la sustancia por la fase estacionaria,
que se seque la Sílica. Luego con ayuda de una pipeta
pero que su análisis con
Pasteur se introduce la muestra problema dentro de la
cromatografía de capa fina se hizo
columna, de tal manera que no salpique y quede
con tolueno.
homogénea, esto garantiza un correcto proceso de
separación, tal y como se muestra en la figura 3a. Luego
(a)
se coloca un trozo pequeño de algodón para agregar el
solvente escogido (tolueno) (véase figura 3b) y evitar que figura 4. (a) recolección
existan puntas de colorante dentro de la columna. La de la primera sustancia
(b) Solvente evaporado

(b)

(b)
(a)
figura 5. Prueba posterior de cromatografía fina, (a)
Cromatografía con sudanIII (P1), (b) Cromatografía con
p-nitrofenol (P2). Fase móvil: Tolueno
CARACTERIZACION DE SUSTANCIAS.
El proceso de caracterización se efectúa a partir del
índice de retención, este valor es una relación entre la
velocidad de la muestra y la fase móvil. Esto último tiene
estrecha relación con la polaridad de la muestra respecto a
la fase móvil y estacionaria. Se expresa mediante:
𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑙𝑎 𝑚𝑎𝑛𝑐ℎ𝑎
𝑅𝑓 =
𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑒𝑙 𝑒𝑙𝑢𝑦𝑒𝑛𝑡𝑒
En nuestra practica consideraremos el cálculo del índice
de retención para el caso en que el frente se halla a 10 cm.
La ecuación usada es:
𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎(𝑐𝑚)
ℎ𝑅𝑓 = 𝑥100
10𝑐𝑚
Con la información previa es posible realizar un conjunto
de cálculos para cada una de las muestra y solventes. La
tabla 6 muestra una recopilación de los resultados
obtenidos.
Corrida Muestra Distancia (mm) Rf (%)
M1 20,0 38,83
Placa N° 1 P1 21,5 41,75
FS 51,5 -
M2 5,0 15,15
Placa N° 2 P2 3,5 10,61
FS 33,0 -
Tabla 6: Índices de retención para los compuestos
separados.
IV. ANALISIS DE RESULTADOS
Con anticipación fue preparada la columna con la
respectiva fase estacionaria. El proceso inicial presenta
varios aspectos importantes. En primer lugar, la adición de
la muestra colorante debía hacerse con sumo cuidado, ya
que la fase estacionaria no puede presentar ningún tipo de
grietas o imperfecciones. Esto ultimo puede provocar una
interacción inadecuada con el eluyente, generando una
mala separación.
Del mismo modo la adición del Tolueno debe tener
especial cuidado, aun cuando usamos un algodón con el
fin de apaciguar el flujo, agregar altas cantidades a la
columna provocaba una fluctuación en la parte superficial
de la sílice. Así pues, se observaron partículas suspendidas
en el eluyente mientras se hacía su adición, por lo tanto,
puede tener un efecto en el proceso de separación o los
tiempos requeridos para efectuar la práctica.
Dado que el solvente tenía que fluir en un caudal
aproximadamente constante, la forma en la que se
agregaba y se reponían las pérdidas de Tolueno obligo a
estar observando frecuentemente la cámara. Aunque no
observamos momentos en los que la sílice presentar
resequedad, es posible que unas fracciones de segundo esta
situación se halla presentado.
Una vez se observó que la fase móvil empezaba a
interactuar y transportar la fase móvil se inició el proceso.
Este ultimo estado fue el tiempo cero de la corrida.
Aproximadamente 15 minutos después se observaba una
gran mancha roja a lo largo de la columna, ver Figura 3(b).
Esta imagen tuvo predominancia hasta 10-12 minutos
después. Lo anterior puede estar relacionado con la forma
en la fue agregado el eluyente.
Por otro lado, según los datos obtenidos la práctica
previa, gran parte de la solución colorante era tonalidad
roja y por ende, el color amarillo solo pudo ser visible
hasta un largo tiempo después, aproximadamente 25
minutos. El análisis anterior puede resaltarse como una
desventaja clara, ya que los tiempos obtenidos en la
cromatografía de capa fina fueron menores.
La figura 3(c) ilustra una diferenciación un poco mas
clara entre los constituyentes de la muestra. La capa 1 y 2,
de color amarillo y rojo respectivamente, son indicio claro
de lo descrito en el párrafo anterior: el componente de
tonalidad roja está presente en mayor cantidad que su
acompañante. En la misma figura, se observa un color
lecho que se encuentra intermedio a los colorantes, esto
corresponde a la sílica gel.
Una vez lograda la identificación de los colorantes, se
dio paso a la recolección de la muestra C2, ver Figura 4(a),
este paso tuvo una duración de aproximadamente 15-20
minutos. También fue necesario reponer en varias
ocasiones el eluyente. Conforme se agregaba el eluyente,
la columna se tornaba de un color característico al gel de
sílice, de un modo mas practico, el eluyente limpiaba la
columna. Adicionalmente, se observaba un paso muy lento
de la mancha amarilla, comparado con el primer colorante.
Con se menciono previamente, el flujo de colorante
amarillo era demasiado lento. En este punto, y teniendo
retirado completamente la muestra roja (figura 4b), fue
necesario agregar un eluyente con polaridad mas alta:
Etanol. El cambio en el proceso disminuyó el tiempo de
elución.
Por último, se realizó una cromatografía de capa fina con
el objetivo de analizar las muestras obtenidas frente al
patrón respectivo. Inicialmente, nuestra hipótesis esta
basada en los resultados de la practica anterior, en los
cuales se afirmó que las muestras corresponden a Sudán
III y p-nitrofenol. Esta hipótesis se tuvo en cuenta a la hora
de seleccionar los patrones. La figura 5 (a) y (b) muestra
los resultados. Se observa que las distancias recorridas son
aproximadamente iguales, lo que concuerda con lo
esperado.
V. CONCLUSIONES
El mecanismo de separación por cromatografía en
columna tiene ventajas frente a la cromatografía en capa
fina. Una de ellas, son los grandes volúmenes que pueden
ser separados con la primera, ya que para la CCF, solo era
posible realizar una separación de cantidades mínimas.
Sin embargo, los resultados obtenidos de la practica
anterior fueron usados. Adicional a esto, debido al proceso
descrito, es posible concluir que la cromatografía en
columna requiere de los resultados obtenidos previamente
por capa fina, ya que necesariamente se requiere hacer una
estimación inicial de los posibles componentes de la
mezcla.
Los índices de retención para las muestras de colorantes
fueron: 38,83% y 15,15%. Según los patrones usados,
concuerdan con las sustancias Sudán III y p-nitrofenol
respectivamente.
VI. CUESTIONARIO
1. Un colorante desconocido se piensa que puede
ser azul de metileno, ¿Cómo se podría comprobar
esta suposición utilizando un procedimiento
basado en una técnica cromatográfica?
Se puede utilizar azul de metileno y la muestra
problema y enfrentarlo de la misma manera a
procesos cromatográficos con diferentes eluyentes; Si
la muestra es inequívocamente azul de metileno
tendrá el mismo Rf del patrón en todas las pruebas
que se realicen.
2. ¿Qué debe hacerse para encontrar el eluyente
adecuado para una sustancia en una
cromatografía en columna?
Escoger al eluyente en base a la polaridad que tenga
la sustancia es decir que sus polaridades sean afines para que el
adsorbente como la sílica gel que es muy polar
no retenga a la muestra. Para esto se hacen pruebas de
cromatografía en capa fina.
3. La recuperación cuantitativa del producto
principal de la práctica sería más completa si se
recogieran fracciones mayores o menores de 8ml,
¿Por qué?
Entre más grande sea la fracción existe más
posibilidad de tener la muestra contaminada; que algo
de la segunda sustancia haya pasado y se encuentre
con el componente de interés; por ende un volumen
menor podría ser más adecuado.
4. Indique algunas aplicaciones de la cromatografía
de adsorción en columna y capa fina.
- La identificación de los componentes en una mezcla
según su polaridad
- Determinación de la concentración de un compuesto
químico en una mezcla
- En columna es posible separar las sustancias
presentes en la mezcla
5. Escriba una lista de eluyentes utilizados en
cromatografía en columna y en orden de
polaridad decreciente (anote bibliografía)

- Acetato de etilo
- Ácido acético
- Benceno
- Ciclohexano
- Cloroformo
- Diclorometano
- Etanol
- Éter de petróleo
- Metanol
- Piridina
- Tetracloruro de carbono
- Tolueno
6. ¿Cuál es la diferencia entre la cromatografía en
columna y cromatografía en capa fina?
La cromatografía en papel solo usa como fase
estacionaria a el papel filtro; no se trata de afinidad
entre fase móvil o estacionaria; sin embargo sigue el
mismo funcionamiento de la cromatografía en capa
fina.
7. Indique la toxicidad de las sustancias que utilizo y
como se podrían desechar
TOLUENO
o La toxicología de este producto es similar a la del
benceno, sin embargo el tolueno no genera los
trastornos crónicos a la sangre que se han presentado
con el uso del primero. Su toxicidad es moderada.
 Su principal metabolito es el ácido benzoico, el cual
se conjuga con la glicina en el hígado y se excreta por
medio de la orina como ácido hipúrico. El
seguimiento de este último producto, sirve para
determinar niveles de exposición de trabajadores. El
abuso de este producto provoca daño al hígado,
pulmones y disfunción cerebral
 Inhalación: Exposiciones a niveles mayores de 100
ppm provocan pérdida de coordinación por lo que
aumenta la probabilidad de accidentes. Los efectos
tóxicos del tolueno son potencializados por la
ingestión de drogas que interfieren con la actividad
enzimática cromosoma, por ejemplo el diazepam.
 Si las exposiciones son a niveles mayores de 500 ppm,
los efectos son narcosis, náusea, dolor de cabeza,
adormecimiento y confusión mental. Estos efectos se
potencializan con la presencia de otros disolventes,
especialmente con el benceno, el cual se encuentra en
el tolueno como impureza.
 Contacto con ojos: Causa irritación y quemaduras de
cuidado si no se atiende a la víctima inmediatamente.
 Contacto con la piel: Causa irritación, resequedad y
dermatitis. En algunas personas puede generar
 Sensibilización de la zona afectada. Es absorbido a
través de este medio. Ingestión: Causa náusea, vómito
y pérdida de la conciencia.
 Mutagenicidad: Se tienen evidencias de ruptura e
intercambio de cromátidas con este producto químico.
PARA NITRO- FENOL: TOXICIDAD AGUDA
 Observaciones: conducta: somnolencia (depresión
general de la actividad) Conducta: convulsiones o
efectos en el umbral de colapso. Pulmones, Tórax o
respiración: disnea.
Inhalación Sensación de quemazón, tos, vértigo,
debilidad.
 Ojos Enrojecimiento, dolor.
 Explosión Las partículas finamente dispersas forman
mezclas explosivas en el aire
PELIGROS QUIMICOS
 Puede explotar por calentamiento intenso. La
sustancia se descompone al calentarla intensamente o
al arder, produciendo humos tóxicos, incluyendo
óxidos de nitrógeno, causando peligro de incendio y
explosión. La
 sustancia es un oxidante fuerte y reacciona
violentamente con materiales combustibles y
reductores. Las mezclas con hidróxido de potasio son
explosivas.
Consideraciones relativas a la eliminación de desechos
 Producto: ofertar el sobrante y las soluciones no-
aprovechables a una compañía de vertidos acreditada.
Para la eliminación de este producto, dirigirse a un
servicio profesional autorizado. Disolver o mezclar el
producto con un solvente combustible y quemarlo en
un incinerador apto para productos químicos provisto
de postquemador y lavador.
8. ¿Qué fenómenos físicos-químicos intervienen en
una separación cromatográfica?
Los principales fenómenos que se tienen en cuenta son la
solubilidad y la adsorción de las sustancias involucradas.
9. ¿Qué es una serie eluotrópica, que utilidad tiene
en una cromatografía de columna?
Usa serie eluotrópica es una clasificación de solventes
organizada por solubilidad; La importancia en un proceso
como la cromatografía del uso de dicha lista es apreciable
debido a que la solubilidad de los compuestos está
determinada por la polaridad, por lo cual se utiliza para
llevar a cabo la determinación de las fases adecuadas en
el procedimiento.
10. Realice un cuadro comparativo entre la
cromatografía de columna y la cromatografía de
capa delgada.

Cromatografía de Cromatografía
Comparación
capa fina de columna
Fase
Sólida (sílica gel) Sólida (sílica)
estacionaria
Fase móvil Liquida Liquida
Aceleración
Fuerza motriz Capilaridad
Gravitacional
Sitio de fijación
de fase Placa de vidrio Bureta
estacionario
Sitio de fijación Parte inferior de Parte superior de
de muestra placa (2 cm) bureta (1mm)
*Luz ultravioleta
(UV 245)
Visualización *Vapores de yodo
No tiene
de manchas *Reactivos
específicos en
aerosol

VII. BIBLIOGRAFIA
Guerrero, A; Polania,W; Parra,J. (2015). Principios de
Química Orgánica. Guías de Laboratorio: Guías de
Trabajo. Editorial Reverte.
Dupont,P.Gokel,W. (2007). Química Orgánica
Experimental. Editorial S.A. Barcelona, España.