Tesis 2015-Roy Scavino & Claudio Saldaña PDF

“UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA AMAZONIA PERUANA”
FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
“EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA In Vitro DEL EXTRACTO

ETANÓLICO DE LA CORTEZA DE Byrsonima crassifolia (Indano) FRENTE A
Cándida albicans Y Trichophyton rubrum, POR EL MÉTODO DE
MACRODILUCIÓN”
TESIS PARA OPTAR EL TITULO DE
QUÍMICO FARMACÉUTICO
PRESENTADO POR:
Bach. Scavino Doñez, Roy Roger
Bach. Saldaña Sanjurjo, Claudio Andre
ASESORES:
Ing. Alenguer Gerónimo Alva Arévalo. Dr.
Blga. Jessy Patricia Vásquez Chumbe
Q.F. Henry Vladimir Delgado Wong
IQUITOS – PERÚ
2015
UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA AMAZONIA PERUANA
FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
TESIS:

MACRODILUCIÓN”
Página de Aprobación:
Miembro del Jurado Asesores:
---------------------------------- --------------------------------
M.C.CHARLES OCAMPO ING. ALENGUER G.
FALCON (PRESIDENTE) ALVA AREVALO
---------------------------------- --------------------------------
ING. GLADYS CARDENAS BLGA. JESSY P.
DE REATEGUI (1ER MIEMBRO) VASQUEZ CHUMBE
---------------------------------- --------------------------------
ING. CLETO JARA Q.F. HENRY V.
HERRERA (2DO MIEMBRO) DELGADO WONG
INDICE:
Titulo……………………………………………………………………………… 08
Resumen…………………………………………………………………………...09
Dedicatoria………………………………………………………………..………. 11 y 12
Agradecimiento……………………………………………………………...…….13
I. INTRODUCCIÓN…………………………………..……………. 14
II. OBJETIVOS…………………………………………………...…. 17
2.1 General……………………………………………………...… 17
2.2 Específico…………………………………………………….. 17
CAPITULO N° 01………………………………………………………………….18
III. MARCO REFERENCIAL...............................................................19

3.1 Antecedentes………………………………………………..... 19
3.2 Clasificación taxonómica…………………………………….. 23
3.3 Sinonimia……………………………………..……………… 24
3.4 Descripción botánica…………………………..……………... 24
3.5 Distribución y producción…………………………………… 26
3.6 Usos del Indano……………………………………………… 26
3.7 Composición química………………………………………... 27
3.8 Farmacología………………………………………………….28
3.9 Metabolitos principales………………………………………. 29
IV. MÉTODO DE MACRODILUCIÓN PARA HONGOS……….…. 30
a. Principios del método………………………………………….. 30
4.1 CARACTERÍSTICAS DE LAS CEPAS EN ESTUDIO…….. 31
A. Fenotipo de la cepa Candida albicans……………. 31
B. Fenotipo de la cepa Trichophyton rubrum………. 32
V. DEFINICIONES OPERACIONALES…………………………… 33
a. Variables……………………………………………………… 33
I. Independiente……………………………………... 33
II. Dependiente…………………………………... 33
VI. INDICADORES…………………………………………………... 33
a. Independiente (X): Concentración del extracto…………....33
3
SCAVINO DOÑEZ, ROY ROGER & SALDAÑA SANJURJO, CLAUDIO ANDRE
VII. OPERACIONALIZACIÓN DE LAS VARIABLES……………... 34

CAPITULO N° 02…………………………………………………………………36
VIII. METODOLOGÍA………………………………………………… 37
a. Tipo de investigación………………………………………… 37
IX. DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN…………………………….. 38
a. Procedimiento experimental……………………... 38
a. Recolección de la muestra vegetal……………….. 38
b. Identificación de la muestra vegetal……………… 38
c. Obtención del extracto etanólico…………………. 38
X. TAMIZAJE FITOQUÍMICO………………………………………. 41
a. Ensayos de identificación de los metabolitos secundarios….. 41
1.Identificación de Alcaloides………………………………….. 41
Ensayo de Dragendorff……………………………………….. 41
2.Identificación de Triterpenos y Esteroides……………………. 41
Ensayo de Liebermann-Buchard……………………………… 41
3.Identificación de Quinonas……………………………………. 42
Ensayo de Borntrager…………………………………………. 42
4.Identificación de Cumarinas…………………………………... 42
Ensayo de Baljet………………………………………………. 42
5.Identificación de Saponinas…………………………………… 42
Ensayo de la Espuma………………………………………….. 42
6. Identificación de Fenoles y Taninos…………………………... 42
Ensayo de Cloruro Férrico……………………………………. 43
7. Identificación de Aminoácidos y Aminas…………………….. 43
Ensayo de Ninhidrina…………………………………………. 43
8. Identificación de Flavonoides…………………………………. 43
Ensayo de Shinoda…………………………………………….. 43
XI. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA POR EL
MÉTODO DE MACRODILUCIÓN PARA HONGOS……………. 44
A. Preparación de los antifúngicos: Ketoconazol y
Fluconazol………………………………………………... 44
4
B. Controles positivos y negativos………………………….. 44

C. Cepas de hongos empleadas para estudio………………… 45
D. Crecimiento y preparación de la solución madre de los hongos
en estudio……………………………………………......... 45
I. Candida albicans……………………………………… 45
II. Trichophyton Rubrum………………………………… 45
E. Preparación del inóculo………………………………..….. 46
F. Interpretación de los resultados…………………………… 46
G. Lectura de los resultados de la concentración mínima
inhibitoria (CMI)…………………………………………. 46
XII. POBLACIÓN Y MUESTRA………………………………………. 47
a) Población vegetal…………………………………. 47
b) Muestra vegetal…………………………………… 47
c) Población microbiológica………………………… 47
d) Muestra microbiológica…………………………... 47
e) Criterios de inclusión……………………………... 47
f) Criterios de exclusión…………………………….. 47
XIII. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS………………………. 48
a. Material de vidrio…………………………………. 48
b. Material de metal………………………………….. 48
c. Otros materiales…………………………………... 48
d. Equipos……………………………………………. 49
e. Reactivos………………………………………….. 49
f. Medios de cultivo………………………………… 49
g. Material de bioseguridad………………………….. 49
XIV. NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGÍA…………………………………………………50
XV. CUESTIONES ÉTICAS EN LA EXPERIMENTACIÓN…………. 51
CAPITULO N° 03………………………………………………………………52
5
XVI. RESULTADOS…………………………………………………….. 53
a) Tamizaje fitoquímico……………………………… 55
b) CIM encontrado de candida albicans……………… 55
c) CIM encontrado de trichophyton rubrun………….. 55
XVII. DISCUSION…………………………………………………….... 57
XVIII. CONCLUSIONES………………………………………………... 60
XIX. RECOMENDACIONES………………………………………….. 61
XX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS…………………………… 62
XXI. ANEXOS…………………………………………………………. 68
1. ANEXO Nº 01……………………………………. 68
Imagen satelital de la ubicación geográfica de la reserva
natural ALLPAHUAYO – MISHANA
2. ANEXO Nº 02……………………………………. 69
Ficha de especies de las plantas medicinales en estudio
3. ANEXO Nº 03......................................................... 70
Muestra botánica
4. ANEXO Nº 04......................................................... 71
Descripción de cepas en estudio
5. ANEXO N° 05......................................................... 72
Secado y molienda de la muestra vegetal
6. ANEXO N° 06……………………………………. 73
Obtención de la extracto etanólico
7. ANEXO Nº 07......................................................... 74
Tamizaje fitoquimico
8. ANEXO N° 08……………………………………. 75
Certificación INS – Hongos
9. ANEXO N°09…………………………………….. 76
Incubación de Hongos
Periodo de crecimiento de los hongos
10. ANEXO N°10…………………………………….. 77
Preparación de antifúngicos
11. ANEXO N°11…………………………………….. 78
6
Resultados de la actividad antifungica

12. ANEXO N°12…………………………………….. 79
Resultado de controles positivos
13. ANEXO Nº13…………………………………….. 80
Metodología de macrodilución para hongos
14. ANEXO N°14…………………………………….. 81
Diluciones de controles positivos:
15. ANEXO Nº15…………………………………….. 82
Preparación del estándar (0,5 mc. farland) para el inóculo
16. ANEXO N° 16……………………………………. 83
Esterilización de materiales
17. ANEXO N° 17……………………………………. 83
Medios de cultivo utilizados
XXI. INDICE DE CUADRO

Cuadro N°01………………………………………. 53
Cuadro N°02………………………………………. 53
Cuadro N°03………………………………………. 53
Cuadro N°04………………………………………. 55
XXII. INDICE DE GRAFICOS
Grafico N° 01……………………………………... 54
Grafico N° 02……………………………………... 54
Grafico N° 03……………………………………... 55
Grafico N° 03……………………………………... 56
XXIII. INDICE DE ESQUEMAS

Esquema N° 01…………………………………… 39
Esquema N° 02…………………………………… 40
7
XXIV. INDICE DE FICHA

Ficha N° 01……………………………………….. 69
Ficha N° 02……………………………………….. 80
XXV. INDICE DE IMÁGENES
Imagen N°01……………………………………….71
Imagen N°02……………………………………….71
Imagen N°03……………………………………….71
Imagen N°04……………………………………….80
Imagen N°05……………………………………….80
Imagen N°06……………………………………….81
Imagen N°07……………………………………….81
XXVI. INDICE DE FOTOS
Foto N°01…………………………………………..70
Foto N°02…………………………………………..72
Foto N°03…………………………………………..73
Foto N°04…………………………………………..74
Foto N°05…………………………………………..75
Foto N°06…………………………………………..76
Foto N°07…………………………………………..76
Foto N°08…………………………………………..76
Foto N°09…………………………………………..77
Foto N°10…………………………………………..77
Foto N°11…………………………………………..77
Foto N°12…………………………………………..77
Foto N°13…………………………………………..77
Foto N°14…………………………………………..78
Foto N°15…………………………………………..78
Foto N°16…………………………………………..79
Foto N°17…………………………………………..79
Foto N°18,19, 20, 21, 22 y 23…………………….. 83
8
TITULO:

MACRODILUCIÓN”
9
“EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA In Vitro DEL

EXTRACTO ETANÓLICO DE LA CORTEZA DE Byrsonima crassifolia (Indano)
FRENTE A Cándida albicans Y Trichophyton rubrum, POR EL MÉTODO DE
MACRODILUCIÓN”
Bach. Roy Roger, Scavino Doñez & Bach. Claudio Andre, Saldaña Sanjurjo*
RESUMEN:
El objetivo del presente estudio fue evaluar la actividad antifúngica In Vitro mediante el
Método de macrodilución para hongos, con el extracto etanólico de la corteza de
Byrsonima crassifolia (Indano). La muestra fue recolectada en la Zona Reservada
Allpahuayo -Mishana; la muestra se identificó taxonómicamente en el Herbarium
Amazonense de la Universidad Nacional de la Amazonía Peruana (UNAP) y fue
depositada para su conservación en la xiloteca de la Facultad de Ingeniería Alimentarias
– UNAP. La determinación del screening fitoquímico se realizó en el laboratorio de la
Facultad de Ingeniería de Industrias Alimentarias - UNAP. Las dosis del extracto fueron
50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.5625, 0.78125, 0.39063 y 0.1953 mg/mL, se utilizó como
control positivo ketoconazol obteniendo un CIM de 2.5 ug/mL y fluconazol obteniendo
un CIM de 3.12 ug/mL. El screening fitoquímico del extracto etanólico de la corteza de
Byrsonima crassifolia (Indano) evidenció la presencia de Taninos, flavonoides,
lactonas y azucares reductores; para el estudio de la actividad antifúngica In Vitro
mediante el Método de macrodilución para hongos se utilizó cepas de Candida albicans
ATCC 90028 y Trichophyton rubrum ATCC 28188. El extracto etanólico de la corteza
de Byrsonima crassifolia (Indano) permitió evaluar la actividad antifungica Candida
albicans ATCC 90028 que evidenció un CIM de 1.5625 mg/mL en comparación con la
otra cepa en estudio Trichophyton rubrum ATCC 28188 que evidenció como resultado
un CIM de 0.39063 mg/mL.
PALABRAS CLAVES: Byrsonima crassifolia (Indano), Método de macrodilución,

hongos, Candida albicans, Trichophyton rubrum.
10
"EVALUATION OF IN VITRO ANTIFUNGAL ACTIVITY OF ETHANOL

EXTRACT OF BARK nanche (indane) against Candida albicans and
Trichophyton rubrum, by the method macrodilution"
Bach. Roy Roger Scavino Doñez& Bach. Claudio Andre, Saldaña Sanjurjo *
ABSTRACT:
The aim of this study was to evaluate the antifungal activity in vitro by the method
macrodilution for fungi, with the ethanol extract of the bark of nanche (indane). The
sample was collected in Allpahuayo -Mishana Reserved Zone; the sample is
taxonomically identified in the Amazonian Herbarium of the National University of the
Peruvian Amazon (UNAP) and was deposited for preservation in the xiloteca of the
Faculty of Food Engineering - UNAP. Determining the phytochemical screening it was
conducted in the laboratory of the Faculty of Engineering of Food Industries - UNAP.
Extract doses were 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.5625, 0.78125, 0.39063 and 0.1953 mg /
mL, was used as positive control to obtain a CIM ketoconazole 2.5 ug / mL and obtaining
a MIC of fluconazole 3.12 ug / mL. The phytochemical screening of the ethanol extract
of the bark of nanche (indane) showed the presence of tannins, flavonoids, lactones and
reducing sugars; for studying the in vitro antifungal activity by macrodilution method of
fungal strains Candida albicans ATCC 90028 and Trichophyton rubrum ATCC 28188.
The ethanol extract of the bark of nanche (indane) was used to evaluate allowed antifungal
activity Candida albicans ATCC 90028 which showed a MIC of 1.5625 mg / mL
compared with other strain ATCC 28188 Trichophyton rubrum study that showed results
in CIM 0.39063 mg / mL.
KEYWORDS: Nanche (indane), Macrodilution method, fungi, Candida albicans,

Trichophyton rubrum.
11
“DEDICATORIA”
“A Dios sobre todas las cosas y por cada cosa que nos regala en la vida… ”
Roy Roger Scavino Doñez:

Dedico este trabajo a mi angelito que desde el
cielo me cuida y guía siempre, mi PADRE
ROGER CONSTANTE SCAVINO GONZALES
y a mi otra inspiración, aquella mujer que nunca
me ha dejado, luchadora incansable, que es
también mi guerrera invencible, y siempre tendrá
sus brazos abiertos para mi MAMÁ ROSITA
EMERITA DOÑEZ PIZANGO.
A mi gran inspiración, de hacer todo día a
día de la mejor manera, el pilar más grande
que tengo, mi pequeña hija: CAMILA
LUCIANA SCAVINO MENDOZA, quien
es todo para mí, es el regalo más grande
que Dios me pudo dar.
A mi hermana, la única persona que siempre

estuvo para mí, que a pesar de estar muy lejos, es
decir en otro país, siempre influenció en mí, desde
la manera de pensar y actuar, para formar y ser
profesional, la cual es y siempre será una gran
inspiración para mi ELLEN CRISTINA
SCAVINO RIVERA.
A mis hermanos CESAR REAÑO, Q.F.
WALTER POZO,Q.F. JESSY
GUERRA,Q.F. LIMBERGH ARBILDO,
Q.F. PERCY GUERRA,Q.F. JESSYCA
MAITA, KAREN FLOREANO, MIJAIL
SHAPIAMA, JULIO TELLO,Q.F. NERIO
MORI, EDSON CURITIMA,Q.F.
MARCK RODRIGUEZ, CAMILA
SCAVINO, CYNHTIA PAOLA, MARY
AYALA, MARTIN RIOS y a mi otra
angelita que me cuida mucho desde el cielo
PAOLA MELISSA RUIZ GONZALES, y
al gran Prof. JUAN ELISEO RIOS DEL
AGUILA, por todas las cosas, la amistad y
enseñanzas, que me han transmitido, en el
transcurso de mi formación como
profesional.
12
Claudio André, Saldaña Sanjurjo:
Dedico este trabajo de tesis a mis queridos

padres Isabel Sanjurjo Vilchez y Rusbel
Saldaña Saldaña, por el apoyo
incondicional que me brindaron a lo largo
de toda mi formación profesional,
logrando así que uno de mis más grandes
sueños se haga realidad.
A mis hermanos Fatima Cecilia y Bruno que

son mi motivación y la razón para seguir
adelante siendo un ejemplo constante para
ellos.
A toda mi familia sin excepción; mis

queridos tíos Manuel, Marjorie, Carolina,
Martin, mis abuelitos que siempre han
estado pendientes de mi durante esta etapa
de mi vida.
A Tatiana, una persona muy especial en mi

vida, gran amiga y compañera, que me
apoyo y estuvo a mi lado en los buenos y
malos momentos durante toda esta etapa.
13
“AGRADECIMIENTO”
“Que mejor que escalar la montaña, si te detienes, puedes

ver todo, pero a la vez te puedes caer, mejor es llegar a la
cima y verlo todo, más tranquilo, sintiendo deleite de un
logro más…”
Dedicamos este trabajo de investigación especialmente a todas aquellas

personas que de una u otra forma estuvieron compartiendo con nosotros, tanto
en el ámbito profesional como en el personal, conocimientos, experiencias,
anécdotas e intercambios de opinión.
La culminación de esta presente tesis no habría sido posible sin la ayuda de

las siguientes personas:
Al Ing. ALENGUER GERONIMO, ALVA ARÉVALO DR, por la

ayuda inconmensurable. Por ello queremos expresarle nuestra gratitud por
habernos aceptado en su sitio de trabajo. Gracias a sus ganas de querer
empezar pero siempre con la mira de culminar y su crítica rápida pero
acertada nos llenaron de entusiasmo y al querer hacer.
Al Blga. JESSY PATRICIA. VASQUEZ CHUMBE, por haber

dedicado una importante parte de su tiempo en compartir sus conocimientos,
por abrirnos las puertas de su centro laboral.
A la Ingeniera TANY, por habernos apoyado de manera desinteresada

en la parte microbiológica durante el desarrollo de la tesis.
Al Q.F. HENRY VLADIMIR DELGADO WONG, por su apoyo

durante la redacción y culminación de la tesis.
Al Q.F. JEAN PIERRE LOPEZ MESIA, por su ayuda en puntos muy

críticos de la tesis, y ayudarnos con ello a lograr un objetivo de ser Químico
Farmacéutico.
A todas aquellas personas que de una y otra forma colaboraron en la

realización de la presente tesis.
....Muchas gracias!!!
14
I. INTRODUCCION:
Durante las últimas décadas la utilización de las plantas medicinales y

productos que se originan de ellas se han extendido en el mundo y han
ganado una gran popularidad, sin embargo, muy pocas especies y
productos se han estudiado con fines médicos y un número menor
cuenta con estudios realizados sobre su seguridad eficacia y calidad.1
Se calcula que cerca del 10 por ciento de las más de un cuarto de millón
de especies de plantas que se conocen en la actualidad tienen
propiedades medicinales, es decir, para el año 2020 la población
mundial, habrá alcanzado la cifra de 7,5 mil millones de habitantes, de
los cuales el 75% vivirá en países de vía de desarrollo que hoy
consumen menos de 15% del mercado farmacéutico.2
El Perú lleno de riquezas naturales en donde las mismas han sido la

base para el desarrollo de generación tras generación, las
investigaciones científicas son un gran aporte para la población, gracias
a la valiosa información brindada los recursos naturales son mejor
aprovechados.3
El incremento en las infecciones fúngicas invasoras se ha mantenido

constante en el ambiente hospitalario, debido fundamentalmente a un
mayor número de pacientes con patologías de riesgo, tales como
leucemias, cáncer con neutropenia inducida, pacientes con trasplante
de precursores hematopoyéticos sometidos a terapias
inmunosupresoras y pacientes con SIDA. 4 Los dermatofitos son un
grupo de hongos filamentosos taxonómicamente relacionados que
tienen la capacidad de producir infecciones en la piel, el pelo y las uñas
tanto del ser humano como de los animales.5
15
Los dermatofitos son hongos queratinolíticos; es decir, tienen la capacidad

6
de digerir y utilizar la queratina como sustrato. Las infecciones
producidas por estos hongos se denominan dermatofitosis, aunque
comúnmente también son llamadas tiñas, término que procede del latín
tinea y que significa gusano o polilla. Esta palabra se usa de forma
descriptiva dado el aspecto de serpentina o anular que presentan las
lesiones cutáneas con una apariencia de gusano enterrado en la piel.7
Las infecciones por Candida son un problema de salud pública, que

abarcan desde alteraciones en la flora normal hasta infecciones sistémicas
graves en pacientes inmunodeprimidos. Candida es parte de la flora
normal del tracto gastrointestinal pero es un patógeno oportunista capaz de
causar infecciones que comprometen la vida de los pacientes infectados.8
La micosis es una enfermedad que provoca a escala mundial entre 300

a 500 millones de casos clínicos cada año. Esto se debe a que la mayoría
de la población mundial está distribuida en zonas altamente endémicas
correspondientes a zonas subtropicales y tropicales.9
Algunas dermatofitosis son también llamadas “tiñas”, y según su

distribución corporal se clasifican en tiña de la cabeza, tiña del cuerpo,
tiña de la mano, tiña de los pies, tiña de la ingle, tiña del área del pañal
y tiña de las uñas.10 Trichophyton rubrum es el agente causal más
frecuente en tiñas del cuerpo, de la ingle, de los pies, así como de las
uñas.11
La prevalencia de Tinea capitis varía de 0,4% a 30% en las diferentes

partes del mundo.11 En Estados Unidos, en un estudio multicéntrico
realizado entre 1999 y 2002, encontró también que Trichophyton
rubrum fue el hongo patógeno más prevalente entre su población.
Además, hicieron notar que la incidencia de este patógeno ha
16
aumentado en los últimos años como causa de tiña de las uñas, tiña del
cuerpo, tiña de la ingle, tiña de la mano y tiña del pie. 12
Al igual que en otros estudios, se ha observado que la piel lampiña

suele afectarse fácilmente; el cuero cabelludo, en cambio, rara vez se
13
ve afectado por este dermatofito. En Europa, la afección por hongos
del cuero cabelludo se ha descrito con una incidencia menor al 1%.
Generalmente se asocian a esta entidad clínica otros dermatofitos, como
Mycrosporum canis, Trichophyton mentagrophytes y Trichophyton
tonsurans. Este último dermatofito es el más prevalente en las tiñas de
la cabeza en Estados Unidos.14
En el Perú, los microorganismos aislados con mayor frecuencia son

Trichophyton tonsurans, de 54 a 78%, y Microsporum canis, de 7 a
26%.6 Sin embargo, Cárdenas et al. en un estudio realizado en la ciudad
de Trujillo, Perú, encontraron mayor frecuencia de Microsporum canis
(84,7%) que de Trichophyton mentagrophytes (9,1%) y Trichophyton
rubrum (3,1%).12 Otro estudio realizado por el Instituto de Medicina
Tropical de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos (UNMSM
- 2000), resalta que en el grupo de hongos dermatofitos, el
Trichophyton mentagrophytes es la especie de mayor incidencia
(38.06%), seguido de Trichophyton rubrum (6.71%). En el mismo
estudio se resalta que la frecuencia de dermatofitos y levaduras es
mayor en el sexo masculino (62.68%) que en el femenino (37.33%). 13
En la Región Amazónica, el elevado porcentaje de humedad y las altas

temperaturas, condicionan en los lugareños a una alta prevalencia a
infecciones cutáneas producidas por dermatofitos (epidermofitos,
tricofitos, microsporosis) entre otras dermatomicosis (levaduras),
constituyendo una de las causas importantes de consultas en Hospitales
y Centros de salud en toda la región amazónica, ocupando el 10 mo y el
14vo lugar dentro del perfil epidemiológico regional.14
17
II. OBJETIVOS:
a. General
 Evaluar la actividad antifúngica del extracto etanólico de la corteza de

Byrsonima crassifolia (Indano), por el método de macrodilución In Vitro
frente a Cándida albicans y Trichophyton rubrum
b. Específicos
 Obtener el extracto etanolico de la corteza de Byrsonima crassifolia (Indano)
 Realizar el tamizaje fitoquímico de la corteza de Byrsonima crassifolia,

(Indano)
 Determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) del extracto etanólico

obtenido de la corteza de Byrsonima crassifolia, (Indano), por el método de
macrodilución In Vitro frente a Cándida albicans
 Determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) del extracto etanólico

obtenido de la corteza de Byrsonima crassifolia, (Indano), por el método de
macrodilución In Vitro frente a Trichophyton rubrum
 Comparar la actividad antifúngico de la corteza de Byrsonima crassifolia,

(Indano), contra Cándida albicans frente a Ketoconazol y Trichophyton
rubrum frente a Fluconazol respectivamente usándolos como control
positivo
18
CAPITULO 1
19
III. MARCO REFERENCIAL:

3.1 ANTECEDENTES:
El hombre amazónico a través de toda su historia, ha logrado identificar

y utilizar una buena cantidad de especies vegetales, llegando a conocer
y usar unas dos a tres mil plantas medicinales. Pocos estudios químicos
y farmacológicos sobre las propiedades medicinales y tóxicas de estas
plantas han sido realizados. De las 1516 especies (distribuidas en 145
familias y 594 géneros), un 50% tienen alguna investigación y la
mayoría han sido examinada por su utilidad como maderas, para la
confección de pulpa de papel o por sus aplicaciones en la alimentación
humana o en la industria.14
La importancia de los conocimientos etnobotánicas y de la medicina

tradicional se confirma cuando se ha encontrado que de los 119
fármacos derivados de plantas en uso actual, hay 88 (74%) que fueron
descubiertos como resultado de estudios químicos para el aislamiento
de las sustancias activas que motivaron el empleo de las plantas de
origen en la medicina tradicional.15
BRACK (1995), estimo el número total de especies vegetales en el Perú

en 25 000 especies; de éstas, se utilizan no menos de 3 140 especies
nativas, de las cuales 1005 especies son utilizadas para diversos fines,
como la artesanía.14
BRAKO y ZARUCCHI (1993), reporta para el Perú un total de 17 mil

144 especies conocidas, de las 150 000 que se conocen en el neo trópico
y las 450 000 que se han identificado en el mundo, agrupadas en 2 mil
458 géneros y 224 Familias, con 5 mil 354 especies endémicas. 15
GENTRY (1988), basado en inventarios de árboles con diámetros

mayores a 10 cm y de lianas, identifica en el Perú, en el Departamento
20
de Loreto, uno de los bosques tropicales más diversos del mundo, como
los de Yanamono con 300 especies, por su parte Ha y Mishana con 289
especies maderables.16
La corteza de Byrsonima crassifolia se utiliza en el tratamiento de

llagas, vaginitis y tiña. Se ha demostrado que es activa contra entero
19
bacterias , levaduras y dermatofitos además de ser astringente,
cicatrizante e antiinflamatorio. Los compuestos responsables de la
actividad son proanticiadinas y heterosidos.16
El nanchi se distribuye desde México hasta Brasil en los bosques secos,

bosques húmedos y sabanas, desde los 0 a los 2000 msnm; diversas
partes de la planta se emplean para tratar diarreas e infecciones de la
piel, mientras que su fruto se recomienda contra la fiebre.17
CACERES, A. (1996): En un estudio de tres grupos de personas con

lesiones confirmadas de candidiasis oral, agrupadas y tratadas
aleatoriamente, se demostró mejoría negativización del exámen
microscópico en 70% de los tratados con trociscos a base del extracto
etanólico de corteza, 90% de los tratados con un enjuague a base de
tintura de corteza y 83% en el grupo tratado con clotrimazol.18
MARTINEZ M, GONZÁLEZ R, CAZARES L, MORENO M,

GARCÍA A. (1999): Se realizaron extractos con diferentes tipos de
solventes de Byrsonima crassifolia encontrando que el extracto de la
raíz con acetato de etilo fue el que presento mayor poder
antimicrobiano, teniendo efecto sobre K. pneumoniae, P. aeruginosa,
S. typhi, S. flexneri, S. aureus, S. epidermidis, S. pneumoniae y M.
luteus.19
RIVERO F.(2009): el Departamento de Farmacia y el Departamento de

Bioquímica de la Facultad de Química de la Universidad Autónoma de
21
México en un esfuerzo conjunto con el Laboratorio de Investigación

Química y Farmacológica de Productos Naturales de la Universidad
Autónoma de Querétaro, desarrollaron el proyecto de investigación
denominado “Antibacterial Compounds Isolated From “Byrsonima
crassifolia” en cuyo resultado se logró el aislamiento de ocho
compuestos conocidos, β-amirina, betulina, ácido betulínico, ácido
oleanolico, quercetina, (-)-epicatequina, ácido gálico y β-sitosterol de
la fracción de diclorometano derivada del extracto metanólico de
Byrsonima crassifolia Todos los compuestos aislados se evaluaron para
determinar su actividad antibacteriana contra un panel de doce bacterias
y Cándida albicans. Los compuestos aislados inhibieron el crecimiento
de las bacterias a concentraciones en el rango de 64 a 1088 μg/mL. 20
MORALES J. (2011): Los extractos utilizados fueron: Acalypha

pseudoalopercuroides, Bourreria huanita, Byrsonima crassifolia,
Cassia grandis, Cornutia pyramidata, Lippia graveolens, Phlebodium
pseudoaureum, Piper aduncum, Piper jacquemontianum, Rhizophora
mangle, Smilax domingensis, Solanum nigrescens, Ternstroemia
tepezapote, Valeriana prionophylla y Wigandia urens var. Caracasana.
El ensayo se realizó basándose en la metodología descrita por Brancato
y Golding modificado por McRae adaptado a las condiciones de
crecimiento de Nocardia brasiliensis (incubación a 37ºC durante 3-5
días). La validación del método se realizó por medio de una
concentración inhibitoria mínima (CIM) del tratamiento de elección,
trimetoprim sulfametoxazole, contra los tres aislamientos clínicos de
Nocardia brasiliensis utilizando concentraciones dos puntos por debajo
y por arriba del punto de corte (2/38mg/mL) obteniendo resultados
satisfactorios que validan el presente estudio. Los extractos que
presentaron actividad significativa (p = 0.0312), en la fase de tamizaje
fueron el etanólico de corteza de C. grandis, etanólico de hoja de C.
pyramidata, metanólico de hoja de P. jacquemontianu y, metanólico de
raíz de V. prionophylla. A los extractos con actividad significativa se les
22
determinó la CIM mostrando C. grandis la mejor actividad

(0.25mg/mL). Los extractos de C. pyramidata, P. jacquemontianum y
V. prionophylla presentaron actividad de 1 mg/mL. Aunque se
esperaban mejores resultados, una CIM de 0.25 mg/mL puede ser
considerada como aceptable para futuros ensayos para validar el uso
popular de la raíz de C. grandis en afecciones subcutáneas causadas por
N. brasiliensis, L. graveolens, P. pseudoaureum, P. aduncum, R.
mangle, y W. urens var. caracasan presentaron actividad contra al
menos uno de los tres aislamientos clínicos. Esta variabilidad puede ser
debida a la procedencia de las Nocardias ya que se tratan de
aislamientos clínicos. 21
MONROY R. (2011): Evalué la actividad antimicótica in vitro de extractos

de las plantas Byrsonima crassifolia, Cassia reticulata, Gliricidia sepium,
Lippia graveolens, Litsea glaucescens y Psidium guajava contra los
hongos dermatofitos Microsporum canis, Microsporum gypseum y
Tricophyton mentagrophytes; y la actividad antilevadura In Vitro contra las
levaduras Candida albicans y Malassezia pachydermatis; estos
microorganismos se obtuvieron del cepario del Laboratorio de
Microbiología de la Facultad de Medicina Veterinaria, dichos
microorganismos fueron aislados de casos clínicos de perros provenientes
del hospital veterinario de la misma casa de estudios. En la CIM el extracto
etanólico de Byrsonima crassifolia y Gliricidia sepium presentaron
actividad contra Malassezia pachydermatis a la concentración de 500
μg/ml. El extracto etanólico de Cassia reticulata presento actividad contra
Malassezia pachydermatis a la concentración de 1000 μg/ml, siendo estos
los extractos que obtuvieron mayores valores CIM.22
PIO LEON J., DIAZ S., LOPEZ M., URIBE M., LOPEZ G.,
DELGADO F. (2013): Nanchi (Byrsonima crassifolia), arrayán
(Psidium sartorianum) y ayale (Crescentia alata) son plantas silvestres
subutilizadas de México. En este trabajo se determinó, ensayo de micro-
23
dilución en caldo, la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y

Concentración Mínima Bactericida (CMB), de los extractos de frutos
(hexánico, EH; clorofórmico, EC; y metanólico, EM) contra 21
bacterias patógenas humanas. Los EH de Arrayán y Ayale mostraron la
mayor actividad (CMI 0.25-2 mg/mL; CMB 0.5-16 mg/mL) contra
enterobacterias (Escherichia coli, Salmonella spp. y Shigella spp.). El
EM de arrayán fue el más activo contra bacterias Gram positivas,
presentando Staphylococcus aureus la mayor sensibilidad (CMI 2
mg/mL; CMB 2-4 mg/mL).23
QUIÑÓNEZ Y. (2014): Se utilizaron seis cepas de hongos dermatofitos

los cuales fueron, Epidermophyton floccosum, Microsporum canis,
Microsporum gypseum, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton
rubrum y Trichophyton tonsurans, un hongo filamentoso el cual fue
Aspergillus flavus y dos levaduras de la especie Cándida albicans.
Estos hongos fueron aislados de muestras clínicas provenientes de
ceparios de Micología, Candelaria e Instituto de Dermatología y
Cirugía de la Piel (INDERMA). Los resultados indicando con los
extractos activos, el extracto etanólico de Byrsonima crassifolia
(Corteza), para las dos cepas de Cándida albicans las cuales
presentaron un CIM de 0.0312 y 0.0625 mg/mL y Trichophyton
metagrophytes una CIM de 0.0625 mg/mL; y el extracto etanólico de
Smilax domingensis (Rizoma), presentó actividad inhibitoria solamente
para las dos cepas de Cándida albicans con una CIM de 0.312 y 0.0078
mg/mL. Según el diseño estadístico, se realizó la prueba de hipótesis
binomial (p=0.0312).24
24
3.2 Clasificación taxonómica:
LA CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA ES LA SIGUIENTE 25
Reino : Plantae
Subreino : Embryobionta
División : Magnoliophyta.
Clase : Magnoliopsida
Orden : Polygalales.
Familia : Malpighiaceae
Género : Byrsonima
Especie : Byrsonima crassifolia.
N. científico: Byrsonima crassifolia L.
N. común : Nanche
3.3 Sinonimia:
La sinonimia de Byrsonima crassifolia (L) H.B.K es amplia, los que más

se emplean son: Byrsonima cumingana Juss.; Byrsonima fendleri
Turkz.; Byrsonima panamensis Beurl.; Byrsonima pulcra Sesé.;
20
Malpighia crassifolia L.; Malpighia pulcra Sesé. Byrsonima
cotinifolia Kunth, Byrsonima cubensis Juss; Byrsonima Karwinskiana;
Byrsonima lanceolada dc., Byrsonima rufescens Bertol. Byrsonima
cynerea Dec., y Byrsonima ferruginea, entre otros.25
3.4 Descripción botánica:
Árbol caducifolio de 2 a 15 metros de altura, con tapa abierta redonda

o extendida, a veces irregular; el tronco es cilíndrico con diámetro
normal de 30 a 40 cm con ramas ascendentes, la parte externa de la
corteza tiene escamas, que se desprende en fracciones rectangulares, es
color café oscuro a moreno claro; corteza interna de color crema rosado,
25
que cambia a pardo rosado, fibrosa y amarga; grosor total de la corteza

de 12 a 25 mm, y de madera, dura, rojiza, flexible, fuerte y pesada; la
albura es de color más claro (crema amarillento) con vasos grandes,
radios numerosos y estrechos; no toman un acabado lisio y natural.25
Las ramas cuando jóvenes son de color gris pardo, con cicatrices
anulares de las hojas y estipulas caídas; lenticelas escasas, pubescentes
en las hojas más jóvenes. Las hojas generalmente son alargadas,
decusadas, simples; láminas de 5 por 2 hasta 15 por 7.5 cm, de forma
elíptica, margen entero, ápice agudo o redondeado y base aguda, color
verde oscuro y casi glabras en el haz y verde amarillento grisáceos con
abundantes tricomas en el envés; peciolos pubescentes de 5 a 25 mm de
largo; las yemas miden de 3 a 7 mm agudas y cubiertas por dos estipulas
ferruginosas.25
Presenta flores en racimos terminales de hasta 12 cm de largo; cáliz con

23
cinco sépalos de forma oval – triangular , cada uno con dos
prominentes glándulas en la base. Son pubescentes; los pedicelos de 7
a 15 mm de largo. Las flores son de 1.5 cm de diámetro con cáliz de 5
mm de largo, cupular en la base, con cinco lóbulos ovados, agudos o
redondeados, pubescentes en la superficie externa, con 10 glándulas
grandes, oblongas, glabras en la base de la superficie externa. La corola
consta de cinco pétalos amarillos anaranjados, libres, alternos respecto
a los lóbulos del cáliz, de 1 cm de largo, orbiculares o reniformes, con
la parte superior cóncava, con márgenes ondulados o dentados,
unguiculados y glabro.26
El limbo circular, cóncavo, con la base unguiculada. Gineceo con

ovario súpero, formado por tres carpelos, lóbulos uniovulares, ovoides
y glabros. Presenta tres estilos de 3 a 4 mm. El androceo consta de 10
estambres de 5 mm de largo, filamentos amarillos, pilosos en la parte
26
inferior. Anteras pardas, alargadas, basifijas con filamentos glabros,

insertados en un torus hirsuto.25
Los frutos presentan infrutescencias péndulas de 10 a 15 cm de largo;

son drupas globosas de 1.2 a 2 cm de diámetro. El exocarpio es delgado,
de color amarillo, verde o rojizo cuando el fruto está maduro; el
mesocarpio (la parte comestible) es de consistencia pastosa, de color
amarillos y de unos 5 mm de espesor; el endocarpio es redondeado u
oval, rígido y reticulado.26
La semilla se encuentra encerrada en el endocarpio que es duro y

leñoso; de forma ovoide o subglobosa arrugada, gruesa o ligeramente
comprimida, de 4 a 4.5 mm de diámetro; la testa es de color café claro,
lisa, lustrosa, membranosa, muy delgada. El embrión es curvo,
enrollado, color amarillo verdoso y ocupa toda la cavidad de la semilla.
Las semillas contienen dos cotiledones grandes, largos, planos,
carnosos, frecuentemente desiguales, enrollados a manera de espiral; la
radícula es corta, superior, oblonga, endospermo nuclear escaso o
ausente.26
3.5 DISTRIBUCIÓN Y PRODUCCIÓN:
El género Byrsonima, se distribuye desde México hasta el Norte de

Sudamérica debido a la tolerancia de los arboles a un amplio rango de
condiciones ambientales.26 La especie se distribuye en altitudes
comprendidas entre los cero y 1600 metros, pero preferentemente de los
ceros a los 500 metros.26
3.6 USOS DEL INDANO:

Se consume como fruta fresa, en bebidas refrescantes, bebidas
alcohólicas embotelladas, helados, paletas y pasteles.27
27
El fruto es nutritivo y complementa la dieta de la población local, por

su alto contenido de vitamina A y C (más de 369 g/ 100 g y 650 mg.g-
1, respectivamente).28
En medicina tradicional es importante su uso; la infusión de hojas y

corteza funciona como eficaz anti diarreico, antipirético, astringente,
antiinflamatorio y expectorante; es un excelente antídoto para
mordedura de víbora, corrige la dismenorrea, ayuda a expulsar la
placenta, atenúa las contracciones durante el parto y es eficaz en casos
29
de colitis aguda , además es útil en las afecciones renales y en la
diabetes.30
El cocimiento de corteza y flores se usa por vía oral para tratar

afecciones respiratorias (amigdalitis, bronquitis, fiebre, tos), digestivas
(cólicos, diarrea, disentería, estreñimiento, indigestión), dolor de
muelas, hemorragias, parásitos, y favorece el parto y la expulsión de la
placenta.31
El fruto se usa para tratar fiebre y las semillas para disentería. Por vía
tópica se usa para tratar afecciones dermatomucosas (estomatitis,
leucorrea, piodermia, tinea, ulcera, vaginitis), tumores.32
3.7 Composición química:
La corteza contiene taninos (20-30%), ácido oxálico (2.7%),

glucósidos, flavonoides, saponinas, sesquiterpenlactonas y triterpenos
(β-amirina). 33
El tamizaje fitoquímico de hojas indica la presencia de saponinas,

esteroles insaturados, cardenòlidos, bufadienólicos, flavonoides,
leucoantocianinas, taninos, polifenoles y triterpenoides (birsonimol);
28
contiene terpenos (betulinaldehido, betulina, ácido betulínico, lupeol,

ácido oleanólico, ursenaldehido), esteroles (β sisterol y su glucósido).33
Las hojas contienen 6% de grasa, β-sisterol, ácido maslínico y elágico,

flavonoides (catequina, epicatequina, guayaverina, hiperina,
quercetina, y galoilgalactosido), ésteres aromáticos (metil galato),
amino ácidos (alanina, ácido aspártico, prolina, valina, ácido pipecolico
y 5-hidroxipipecólico) y sulfonoglicolipido. La raíz contiene
flavonoides, glucósidos cardiotónicos, sesquiterpenlactonas, taninos y
triterpenos.33
3.8 Farmacología:
Estudios antimicrobianos demuestran que el extracto acuoso de hojas,

corteza y raíz es activo contra Escherichia coli, Staphylococcus
aureus. La tintura de corteza es activa contra Shigella flexceri,
Salmonella typhi, Vibrio cholerae.33
La decocción de la corteza tiene actividad contra Epidermophyton

floccosum, Microsporum canis, Microsporum gipseum, Trichophyton
mentagrophytes y Trichophyton rubrum, Concentración Mínima
Inhibitoria (CMI) de 200 mg/ml .La corteza es la más activa contra
bacterias y el etanol es el mejor disolvente por bioactividad y
rendimiento (6.8%); las bacterias más sensibles son Pseudomonas
aeruriginosa, Staphylococcus aureus, Shigella flexceri y
Streptococcus pyogenes, el extracto de la planta completo no tiene
actividad insecticida. El extracto etanólico tiene buena actividad
nematicida.34
29
3.9 Metabolitos principales:
Los metabolitos principales son los taninos, especialmente en corteza.

Los responsables de la actividad farmacológica son los galatos de
proantocianidinas ß2, que en este caso se utilizan como antifúngicos,
antiinflamatorios y nematicidas. 33
Estudios recientes en España han mostrado que los galatos de

proantocianidinas ß2, encontrados en otras plantas como ruda y mirtilo,
mejoran la irrigación coronaria, aumentan la tolerancia miocárdica a la
deficiencia de oxígeno, disminuyen la resistencia vascular periférica y
mejoran la función cardiaca en general.35
30
IV. MÉTODO DE MACRODILUCIÓN PARA HONGOS
En 1998 el National Committee for Clinical Laborator y Standards

(NCCLS) publicó el Método de macrodilución para hongos
filamentosos.35 donde se describe un método provisional para la
realización de pruebas de sensibilidad antifúngica a los hongos
filamentosos formadores de conidias.36
A pesar de todo, las pruebas de sensibilidad a los antifúngicos no están

tan desarrolladas como las de los antibacterianos. Los puntos de corte y
los criterios de sensibilidad y resistencia de las levaduras para los
antifúngicos fluconazol, itraconazol y 5-fluorocitosina, sólo están
determinados para las micosis orofaríngeas de enfermos con SIDA. Por
lo tanto, estos datos pueden variar en el futuro y hay que prestar
atención a las nuevas normas que vayan publicando los comités de
estandarización de ensayos In Vitro, tanto europeos (EUCAST) como
americanos (NCCLS). 36
a. Principios del método
Básicamente consisten en cuantificar la inhibición de crecimiento

producida por el antifúngico, comparada con el crecimiento del moho
en el mismo medio pero sin antifúngico (control). Teniendo en cuenta
que el medio de cultivo, pH, tampón, inoculo, tiempo y temperatura de
incubación deben ajustarse estrictamente a lo recomendado en dicho
protocolo puesto que cualquier variación en estos parámetros puede
afectar los resultados.36
31
4.1 Características de las cepas en estudio:
A. Fenotipo de la cepa Cándida albicans:
Cándida albicans es considerada un hongo patógeno oportunista en

mamíferos, entre ellos el hombre, que puede causar varias formas de
candidiasis, desde infecciones superficiales en mucosas hasta
37
enfermedades sistémicas que comprometen la vida.
predominantemente, en individuos con el sistema inmune debilitado.
Cándida albicans al igual que otros patógenos tiene la capacidad de
adherirse y formar biopelículas en aparatos implantados, especialmente
catéteres intravasculares lo que les confiere mayor resistencia a
antifúngicos.38
Cándida albicans es capaz de sobrevivir como comensal en distintas

localizaciones, y por ello está sometido a distintas presiones
medioambientales. Esta habilidad amplía el espectro de enfermedades
causadas por Cándida albicans y otras especies de Cándida, siendo su
incidencia mayor que la de otros microorganismoscomensales. 37
Cándida albicans es una levadura comensal, presente en las mucosas

de los de seres humanos y los animales de sangre caliente, siendo
habitualmente aislada de la cavidad oral, 38 el tracto gastrointestinal y
urogenital, y su conversión en agente patógeno depende principalmente
de la alteración del equilibrio entre la micro biota y el sistema
inmunitario del hospedador. Es considerada por ello un patógeno
oportunista. El estado fisiológico del hospedador es el primer factor que
gobierna la etiología de las candidiasis, variaciones de este estado
pueden desencadenar que las levaduras comensales se conviertan en
patógenas, causando infecciones.40
32
B. Fenotipo de la cepa Trichophyton rubrum
Trichophytum rubrum es un hongo dermatofito moniliaceo, hialino,

con estructuras de fructificación que infecta a tejidos queratinizados
como uñas, pelo y estrato córneo de la piel. 41
Macroscópicamente, las colonias son de color blanco algodonoso y de

consistencia dura.40 La cepa granular se caracteriza por colonias planas
que carecen de micelio aéreo, y semejan polvo de azúcar. 41
El reverso de la colonia suele tener un color rosado a rojo, pero en

ocasiones puede ser amarillo a marrón, rojo a vino o violeta e, incluso,
puede carecer de pigmento. Si se realiza un examen del cultivo se
observan hifas largas, delgadas, abundantes microconidias de
piriformes a redondeadas de 3,0-5,5 x 2,0-3,5 μm, rara vez hay
macroconidias, en forma de puro o cigarrillo, de tamaño variable de
pared delgada y multiseptadas. 41
33
V. DEFINICIONES OPERACIONALES:
a. Variables:
I. Independiente:
Extracto etanólico de la corteza de Byrsonima

crassifolia, (Indano)
II. Dependiente:
Actividad Antifúngica
VI. INDICADORES:
a. Independiente (x): concentración del extracto
 Concentración alta: 50 mg/mL*
 Concentración media: 3.125mg/mL*
 Concentración baja: 0.1953mg/mL*
34
VII. OPERACIONALIZACIÓN DE LAS VARIABLES:
Variable Independiente Definición Definición Operacional Indicador Índices Escala de Tipo de

Conceptual Medición Variable
 Concentración
Tipos de metabolitos
Extracto etanólico de la Producto que se Concentración baja:
secundarios presentes
corteza de Byrsonima obtendrá mediante Inhibitoria 0.1953 mg/ml
en el extracto obtenidos
crassifolia (Indano) el método de Minina del  Concentración
mediante extracción en
extracción con extracto media: Nominal Cualitativa
rotavapor a una
etanol por etanólico de la 3.125mg/ml
temperatura de 70° C
rotavapor. corteza de  Concentración
durante 3 horas
Byrsonima alta:
crassifolia. 50 mg/ml
(Indano)
35
Variable Definición Definición Indicador Índices Escala de Tipo de Variable

Dependiente Conceptual Operacional Medición
Constituida por el Consiste en

cambio en la pared y cuantificar la Grado de turbidez
membrana celular inhibición del que presentan los
Actividad de los hongos crecimiento micótico medios de cultivos Nominal Cualitativa
antifúngica Cándida albicans y producido por el inoculados con Presencia o ausencia
Trichophyton extracto etanólico en Cándida albicans y de turbidez en los
rubrum causado por estudio, comparada Trichophyton cultivos de las cepas
agentes químicos con el crecimiento rubrum expuesta al ensayadas
externos del hongo en el extracto.
produciendo una mismo medio pero
inhibición en el sin el extracto.
crecimiento del
mismo.
36
CAPITULO 2
37
VIII. METODOLOGÍA
a. Tipo de investigación
Se empleara el Diseño descriptivo, longitudinal y prospectivo:
 Descriptivo: Porque el estudio se realizó en forma clara y detallando los hechos

obtenidos en la investigación.
 Longitudinal: Porque permitió la recolección sistemática de las variables

involucradas en función del tiempo.
 Prospectivo: Porque se desarrolla a través del tiempo.
38
IX. DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN:
Se agregó 2 g del extracto etanólico total de corteza de Byrsonima

crassifolia. (Indano) en 10 ml de Dimetilsulfóxido (DMSO), para obtener
una concentración de 200 mg/ml. Posteriormente se procederá a realizar
el método de las diluciones dobles seriadas aditivas, para obtener
diferentes concentraciones del mismo. 42
I. Procedimiento experimental:
a. Recolección de la muestra vegetal:
Las muestras de corteza de Byrsonima crassifolia. (Indano) fueron

recolectadas en la Reservada Natural Allpahuayo - Mishana, Iquitos,
PERÚ.
b. Identificación de la muestra vegetal:

Parte de la muestra vegetal de corteza de Byrsonima crassifolia,
(Indano) fue estudiada en la xiloteca de la Facultad de Ingeniería
Forestal, de la Universidad Nacional de la Amazonía Peruana (UNAP)
la materia prima restante fue transportado al laboratorio de Ingeniería de
Alimentos ubicado en la Planta Piloto de la misma universidad ubicado
en la Av. Freyre N° 610 – Iquitos. La identificación taxonómica de la
especie vegetal fue otorgada por el Herbarium Amazonense de la
Universidad Nacional de la Amazonia Peruana.
c. Obtención del extracto etanólico

Para cada extracción se maceró 663.15 g de materia prima (Indano), en
1500 ml de etanol, durante 7 días. La concentración del extracto se
realizò por eliminación del disolvente a presión reducida en un rotavapor,
a una temperatura de 60ºC y a una presión de 690 mmHg.
39
ESQUEMA N° 01
Flujograma del Procedimiento Experimental de la Obtención del Extracto Etanólico del
corteza de Byrsonima crassifolia (Indano)
Recolección de Muestras
Identificación Taxonómica
Preparación de la extracto etanólico de la corteza de

Byrsonima crassifolia
ScreeningFitoquímico
Obtención del Extracto Etanólico
Evaluación actividad antifúngica In Vitro
Test de Macrodilución
Cándida albicans cepa ATCC 90028
Trichophyton rubrum cepa ATCC 24953
40
ESQUEMA N°02
OBTENCION DEL EXTRACTO ETANOLICO
MATERIA
SELECCIÓN SECADO (EN
PRIMA
(CORTEZA SIN ESTUFA A 37 °C)
(CORTEZA) HONGOS NI
BACTERIAS)
MACERACION MOLIENDA
(ETANOL 96 %)
CONCENTRACION
(ROTAVAPOR A 40°C)
EXTRACTO
ETANOLICO
(POLVO)
SCREENING
ACTIVIDAD FITOQUIMICO
ANTIFUNGICA
41
X. TAMIZAJE FITOQUÍMICO
a. Ensayos de identificación de los metabolitos secundarios
1. Identificación de Alcaloides
Ensayo de Dragendorff.- A 2g de la muestra disolver en 1 ml. de
solución de ácido clorhídrico al 1%, en ausencia de solvente orgánico se
mezcla con una gota de reactivo, si hay opalescencia se considera (+),
turbidez definida (++), precipitado (+++) de color rojo ladrillo. Si el
extracto es acuoso, a la alícuota se le añade 1 gota de ácido clorhídrico
concentrado y se procede de la misma forma.
2. Identificación de Triterpenos y Esteroides

Ensayo de Liebermann-Buchard.- A 2g de la muestra disolverán 1ml
de anhídrido acético y mezclar bien. Por la pared del tubo de ensayo se
dejan correr 2 o 3 gotas de ácido clorhídrico concentrado, sin agitar: Un
ensayo positivo se tiene por un cambio rápido de coloración:
 Rosado a azul muy rápido

 Verde intenso a visible aunque rápido
 Verde oscuro a negro final de la reacción
A veces el ensayo queda en fases o desarrollo de color. Muy pocas veces

puede observarse el primer cambio. El tercer cambio ocurre
generalmente cuando el material evaluado tiene cantidades importantes
de estos compuestos.
Esta reacción se emplea también para diferenciar las estructuras

esteroidales de los Triterpenoides; las primeras producen coloración azul
o azul verdosa, mientras que en las segundas se observa rojo, rosado o
púrpura.
Estas coloraciones pueden variar por interferencias producidas por

carotenos, xantofilas y esteroides saturados que pueden estar presentes.
42
3. Identificación de Quinonas
Ensayo de Borntrager.- La fracción disuelta en 1 ml de cloroformo se
agita con 1 ml de solución de hidróxido de sodio, hidróxido de potasio o
hidróxido de amonio al 5% en agua. Si la fase acuosa alcalina (superior)
se colorea de rosado o rojo, el ensayo se considera positivo (naftaquinona
y antraquinona).
Un ensayo no excluye la presencia de quinonas, ya que pueden

encontrarse en forma de glicósidos, siendo necesaria la hidrólisis previa
de los mismos para su posterior detección.
4. Identificación de Cumarinas
Ensayo de Baljet.- Permite reconocer en un extracto la presencia de
compuestos con agrupamientos lactónicos, en particular cumarinas,
aunque otros compuestos lactónicos pueden dar positivo el ensayo: como
las lactonas sesquiterpénicas, cardiotónicos, etc.
Para ello, si la alícuota del extracto no se encuentra en alcohol, debe

evaporarse el solvente en baño maría y disolverse en la menor cantidad
de alcohol (1 ml).En estas condiciones se adiciona 1ml de reactivo,
considerándose un ensayo positivo la aparición de coloración o
precipitado rojo.
5. Identificación de Saponinas
Ensayo de la Espuma.- Permite reconocer la presencia de saponinas
tanto del tipo esteroidal como triterpénica. De modo que si la alícuota se
encuentra en alcohol, se diluye con 5 veces su volumen en agua y se agita
la mezcla fuertemente durante 2 minutos. El ensayo se considera positivo
si aparece espuma de 2mm de altura en la superficie del líquido y persiste
por más de 2 minutos.
43
6. Identificación de Fenoles y Taninos

Ensayo de Cloruro Férrico.- A la fracción disuelta en 1 ml de etanol se
añade 0.5 ml de una solución de cloruro férrico al 5% en solución salina.
La aparición de un color o precipitado verde oscuro indica la presencia
de fenoles y/o taninos. En el extracto acuoso se adiciona acetato de sodio
previo al ensayo.
7. Identificación de Aminoácidos y Aminas

Ensayo de Ninhidrina.- Se toma una alícuota de extracto en alcohol. Si
el extracto se encuentra en otro solvente orgánico, éste se evapora a
sequedad. En ambos casos, se mezclan con 2 ml de solución al 0.2% de
ninhidrina en alcohol. La mezcla se calienta de 5 a 10 minutos en baño
de agua. Este ensayo se considera positivo cuando se presenta un color
azul violáceo.
8. Identificación de Flavonoides
Ensayo de Shinoda.- A 2 ml de la fracción acuosa o el residuo disuelto
en 2ml de agua, se le adiciona 1ml de ácido clorhídrico concentrado y
una lámina pequeña de magnesio metálico o zinc. Cuando la reacción
termina, se añade 1 mL de alcohol amílico y se agita. El ensayo se
considera positivo cuando el alcohol amílico se colorea de amarillo,
naranja, carmelita o rojo; color intenso en todos los casos.42
44
XI. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA POR

EL MÉTODO DE MACRODILUCIÓN PARA HONGOS:
Esta técnica fue utilizada para determinar la sensibilidad antifúngica del

extracto etanólico obtenido de la corteza de Byrsonima crassifolia.
(Indano) frente a Cándida albicans y Trichophyton rubrum. 43
El método ensayado fue realizado según los procedimientos establecidos

en el Protocolo M38 - P, elaborado por la NCCLS y modificado por
Espinoza et al (2007). En el ensayo se utilizó como control negativo
dimetilsulfóxido (DMSO) y como control positivo se utilizó el
Ketoconazol y Fluconazol.43
A. Preparación de los antifúngicos: Ketoconazol y Fluconazol
El antifúngico usado y recomendado en el estudio se combinó con

DMSO, posteriormente se procedió a realizar el método de las diluciones
dobles seriadas aditivas, para obtener diferentes concentraciones, siendo
para Ketoconazol 1280ug/mL la más alta hasta y 1.25ug/mL la más baja.
Y para Fluconazol las concentraciones fueron 1600 ug/mL y la más baja
3.12 ug/mL. Posteriormente se procedió a repartir en alícuotas de 0.5 ml
en el primer tubo, y luego 0.5 ml a tubos restantes, siendo un total de 10
tubos usados. 43
B. Controles positivos y negativos:
Extracto Control positivo Control negativo

Etanólico Ketoconazol Dimetilsulfóxido (DMSO)
Etanólico Fluconazol Dimetilsulfóxido (DMSO)
Pueden emplearse otras sustancias adecuadas para los controles

positivos. En dichos controles deberá considerarse la utilización de
sustancias de clases químicas afines, cuando sea posible.
45
C. Cepas de hongos empleadas para estudio:
Se emplearon dos (02) cepas, Cándida albicans y Trichophyton rubrum,

las cuales fueron proporcionadas por el Instituto Nacional de Salud (INS-
Perú), se realizó el control de calidad de la solución madre y se
comprobaron de igual manera otras características fenotípicas de las
cepas.
D. Crecimiento y preparación de la solución madre de los hongos en

estudio:
XII. Cándida albicans:

Se dejó crecer la cepa de Cándida albicans agar glucosado de sabouraud
por 24 horas hasta obtener levaduras, para luego ser estudiadas. 44
XIII. Trichophyton Rubrum:

Se prepara a partir de un cultivo de 7 días de crecimiento a 35 °C en agar
glucosado de patata (PDA), medio que induce la formación de conidias
o esporangiosporas. 44
Para las especies del género Trichophyton Rubrum se parte de un cultivo
de 48 a 72 h a 35 °C y posteriormente a 25-28 °C hasta completar siete
días, en PDA
1. Para facilitar la recogida de conidias, introducir el asa de cultivo en
Tween 20 y pasarla por encima de las conidias; después suspender en
solución salina.
2. Dejar sedimentar las partículas durante 3-5 min, transferir el
sobrenadante a otro tubo y agitar vigorosamente durante 15 segundos.
3. Debido a que el tamaño de los conidios es distinto para cada especie,
para obtener una concentración de 1-5x106 variará con la especie.42
46
E. Preparación del inóculo
A partir de la solución madre, se tomara varias colonias y se deposita en

un tubo conteniendo 9 ml de solución salina estéril al 0.9%; de esta
suspensión ajustada a la escala 0,5 de Mc Farland 43 se diluye en medio
Caldo RPMI 1640 (concentración 0,4 a 5x104 UFC/ml).43
F. Interpretación de los resultados:

El procedimiento experimental, se realizó 3 veces, para poder
compararlos CMI, encontrados en los resultados diversos. La lectura se
realizó visualmente a las 24 horas de incubación para Cándida albicans
y 72 horas de incubación para Trichophyton Rubrum comparando la
turbidez de los tubos con la del control. 45
G. Lectura de los resultados de la concentración mínima inhibitoria (CMI):

La concentración más baja a la que se produzca el cambio de turbidez se
tomó como el valor de la CMI. El promedio de tres valores fueron
calculados y se reportaron como la CMI. (Veces que repite el
experimento)Para una correcta lectura se siguió las recomendaciones de
Wiegand I. y col. 45
Se consideró que los extractos tenían una actividad antifúngica

significativa cuando el CMI ≤ 1600 μg/mL. La actividad significativa se
clasifica así:
 Débil actividad antifúngica: CMI de 500 a 1600 μg/mL
 Moderada actividad antifúngica: CMI de 100 a < 500 μg/mL
 Buena actividad antifúngica: CMI < 100 μg/mL
En cuanto a los controles de Fluconazol y Ketoconazol la interpretación

se realizó teniendo en cuenta la normativa del CLSI M27-A2. 45
47
XII. POBLACIÓN Y MUESTRA:
a) Población vegetal
La población vegetal en estudio estaba constituido por la especie vegetal
de Byrsonima crassifolia (Indano)
b) Muestra vegetal
Corteza de Byrsonima crassifolia (Indano)
c) Población microbiológica
La población microbiológica lo constituyen los hongos
d) Muestra microbiológica
Las muestras microbiológicas están constituidas por los hongos del
género:
 Cándida albicans cepa ATCC 90028
 Trichophyton rubrum cepa ATCC 28188
e) Criterios de inclusión
Sólo serán empleadas hongos jóvenes
f) Criterios de exclusión
Cepas que presentarán contaminantes u otro defecto
48
XIII. MATERIALES,EQUIPOS Y REACTIVOS:
a) Material de vidrio
 Embudos GERMANY
 Erlenmeyers de 250 y 500 ml GERMANY
 Frasco ámbar con tapa rosca TYREX
 Matraz 1000 ml GERMANY
 Micro pipeta Pasteur DIFCO
 Pipetas de 1, 2, 5 y 10 ml ANUX
 Probetas de 10, 100, 250 y 1000 ml ANUX
 Tubos con tapa rosca (75 x 120 mm.) GERMANY
 Tubos de ensayo de 5 y 7 ml DEX
 Vasos de precipitado de 5, 10, 20, 50 y 100 ml GERMANY
 Bagueta GERMANY
b) Material de metal
 Asa de Kolle para siembra bacteriológica STAN
 Cuchillo mediano STINLES
 Escobillas lava tubos DEX
 Espátulas medianas STINLES
 Gradilla metálica MERCK
 Pinza estéril DIFCO
c) Otros materiales
 Algodón INKAFARMA
 Detergente ARIEL PODER LIMON
 Guantes quirúrgicos INKAFARMA
 Hisopos para medios de cultivos NENITOS
 Mascarillas QUALITY
 Papel de despacho WHON
 Papel secante ELITE
 Papel tissue ELITE
 Plumón marcador FABER CASTELL
49
d) Equipos
 Autoclave AUTESTER
 Balanza analítica SARTORIUS
 Baño termostático SELECTA PRECISTERM
 Cámara de flujo laminar POLIANRE CLASS II
 Cámara fotográfica profesional SONY
 Centrifuga CHRIST
 Estufa SELECTA
 Potenciómetro - pH meter CORNING PR 15
 Refrigeradora FRIOLUX
 Rotavapor BÜCHI
e) Reactivos:
 Q.P. Ketoconazol AVANTOR
 Q.P. Fluconazol AVANTOR
 Ácido Sulfúrico 0.2M AVANTOR
 Agua destilada MEDIFARMA
 Carbonato de sodio ALDRICH
 Dimetilsulfóxido (DMSO) AVANTOR
 Etanol 96º INKAFARMA
f) Medios de cultivo
 Agar Glucosado de Sabouraud OXOID
 Agar Papa Dextrosa MERCK
 Caldo RPMI 1640 DIFCO
g) Material de bioseguridad
 Mandiles MEINZ
 Guantes quirúrgicos descartables Nº7 ½ QUALITY
 Lentes de protección LENZ
50
XIV. NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE

MICROBIOLOGIA:
El área de microbiología donde se realizan los ensayos experimentales,

constituye un medio ambiente de trabajo especial que puede presentar
riesgos de enfermedades infecciosas para las personas que trabajan en el
laboratorio o cerca de él. Por ello se contará con estrictas medidas de
bioseguridad.46
Normas generales
La peligrosidad de un agente está directamente relacionada con el tipo de
manipulación a la que es sometido. Por ello es básico:
1. Conocer los agentes, sustancias y productos peligrosos que existen en el
laboratorio.
2. Conocer la metodología de trabajo de cada sección del laboratorio.
3. Conocer el equipamiento del laboratorio.
4. Conocer las medidas a tomar en caso de emergencia
Las rutas de transmisión más comunes en el laboratorio son la aérea y la

inoculación directa, muy por encima de todas las demás, aunque la oral, la
percutánea y el contacto directo con la piel o las mucosas también son
posibles.
Medidas a aplicar
• El acceso al laboratorio estará limitado al personal autorizado.
• El personal del laboratorio debe implicarse en el cumplimiento de las
normas de seguridad.
• Todas las áreas estarán debidamente marcadas con la señal de riesgo
biológico y su nivel de contención.
• Tras quitarse los guantes, se realizará un lavado de manos.
• Se usarán gafas protectoras y mascarillas faciales si existe riesgo de
salpicaduras y/o aerosoles.46
51
XV. CUESTIONES ÉTICAS EN LA EXPERIMENTACIÓN
El experimento se realizó siguiendo los principios de las 3 R (Reducción,

Refinamiento, Reemplazo), en la cual se pudo Reducir a cero el número
de animales; se refinaron las pruebas experimentales por un método
alternativo de mayor sensibilidad (permite ensayar mayor concentración
de muestra, hasta 75% V/V) y se reemplazaron por un método
alternativo In Vitro.47
52
CAPITULO 3
53
XVI. RESULTADOS:
A. Rendimiento de la droga en estudio:
Se obtuvo de la siguiente manera
R x 100%
𝑥=
w
R= Peso de muestra inicial – peso del extracto concentrado

W= Peso seco (después de haberlo puesto en estufa)
(1200g − 500g) x 100%
𝑥=
1050g
𝑥 = 66.6 %
Equivalente a 799.2 gramos de muestra.
B. Tamizaje fitoquímico del extracto etanólico de la corteza de

Byrsonima crassifolia “Indano”
Cuadro N°01
Byrsonima crassifolia"INDANO"
PRUEBAS PARA RESULTADOS
Alcaloides -
Saponinas -
Esteroides -
Triterpenos -
Taninos +++
Fenoles -
Flavonoides +++
Quinonas -
Lactonas +++
Aminas y Aminoácidos -
Cumarinas fijas -
Azúcares Reductores +++
Leyenda: (-) Ensayo Negativo; (+) Ensayo positivo, Contenido: (+++)

Abundante; (++) mediano; (+) poco
54
Se encontraron los siguientes metabolitos secundarios en el extracto

etanolico de la corteza de Byrsonima crassifolia “Indano” taninos,
flavonoides, lactonas y azucares reductores.
C. Descripción de la actividad mostrada por el extracto etanólico de la

corteza de Byrsonima crassifolia “Indano” en relación al tiempo contra
el hongo en estudio “Cándida albicans”
Cuadro N°03
N° VECES HORAS N° DE CIM

REALIZADAS TUBO ENCONTRADO
1 REPETICION 24 06 1.5625 mg/mL
Grafico N°01
Grafico N°02
RESULTADO DE CIM: Candida albicans
40
3 REPETICION
20 2 REPETICION
1 REPETICION
0
ENCONTRADO
HORAS N° DE TUBO CIM
1 REPETICION 2 REPETICION 3 REPETICION
55
Se compararon los CMI encontrados en 3 repeticiones realizadas al mismo

tiempo, al hongo Cándida albicans, teniendo como resultado 1.5625 mg/
mL
D. Descripción de la actividad mostrada por el extracto etanólico de la
corteza de Byrsonima crassifolia “Indano” en relación al tiempo con el
hongo en estudio “Trichophyton Rubrum”
Cuadro N°04
N° VECES HORAS N° DE CIM
REALIZADAS TUBO ENCONTRADO
Grafico N°03
Se compararon los CMI encontrados en 3 repeticiones realizadas al mismo

tiempo, al hongo Trichophyton Rubrum, teniendo como resultado 1.56
mg/ mL
56
Cuadro N°05
HONGO N(VECES) MEDIA

Cándida albicans 3 1,5625 mg/ml
Trychophyton rubrum 3 0.39063mg/ml
Resumen de los CMI encontrados a los hongos en estudio en el mismo

tiempos y 3 repeticiones.
Grafico N°04
CIM
50
40
30
20
10 Trichophyton rubrum
0 CONCENTRACIONES mg/Ml
1 2 3 4 5 6 7 8 9
CONCENTRACIONES mg/Ml Candida albicans Trichophyton rubrum
57
XVII. DISCUSION:
Los resultados del tamizaje fitoquímico de la corteza de Byrsonima
crassifolia “Indano”, se realizó en el laboratorio de Fitoquimica de la
Facultad de Ingeniería de Industrias Alimentarias, siguiendo el
procedimiento de acuerdo a los protocolos estandarizados del área de
fitoquímica del Laboratorio de Investigación de Productos Naturales
Antiparasitarios - LIPNAA de la UNAP los resultados obtenidos fueron
los siguientes: taninos, flavonoides, lactonas y azúcares reductores.
Los resultados aportados por muchos autores, han atribuido la actividad
antifúngica a los flavonoides identificados en varias especies vegetales,
de las cuales se afirmó que poseen actividad antifúngica y actividad
antibacteriana.
Para el control positivo se usó Ketoconazol y Fluconazol, que son

antifungicos de primera línea según las especies de hongos en estudio,
además son antifungicos más usados para diferentes pruebas de
sensibilidad, presentando para Cándida albicans un CIM de 2.5 µg/mL
encontrado en el tubo n° 10 y para Trychophyton rubrum un CIM de 3.12
µg/mL encontrado en el tubo n° 10 respectivamente dentro de este estudio.
El rendimiento del extracto de la corteza de Byrsonima crassifolia

“Indano” (aproximadamente 66.6 %), para obtener el máximo posible de
extracto bruto.
En el estudio del extracto etanólico de la corteza de Byrsonima crassifolia

“Indano”, se demostró que presenta actividad antifúngica contra hongos
levaduriformes (Cándida albicans) a una concentración de 1,5625
mg/mL, al igual que CACERES A. (1996) con la misma especie de planta,
presentó actividad antifúngica contra Cándida albicans realizadas en
personas, distribuidas en 3 grupos, teniendo como resultado 90% de
efectividad, al igual que RIVERO F. (2009) aislando 8 compuestos de
Byrsonima crassifolia encontró muy buena actividad antifúngica del
extracto etanólico contra Cándida albicans. MONROY R. (2011), evaluó
58
una actividad antimicótica In Vitro de 6 extractos de plantas, encontrando

un CIM de 500 ug/mL Cándida albicans, con el extracto etanólico de
Byrsonima crassifolia. QUIÑONEZ Y. (2014) que con la misma especie
de planta, presentó actividad antifúngica contra dos especies de Cándida
albicans, aisladas de muestras clínicas provenientes del Instituto de
Dermatología y Cirugía de Piel (INDERMA), encontrado un CIM 0.312
mg/mL y 0.0078mg/mL
La corteza de Byrsonima crassifolia “Indano” macerado en etanol

mostraron buena actividad antifúngica, frente al hongo dermatofito
Trychophyton rubrum, 0.39063 mg/mL, en el caso de MONROY R. (2011)
evaluó una actividad antimicótica In Vitro de 6 extractos de plantas, donde
se obtuvo un extracto etanólico de Byrsonima crassifolia y de Malassezia
pachydermatis encontrando un CIM de 500 ug/mL respectivamente,
QUIÑONEZ Y. (2014) que con la misma especie de planta, presentó
actividad antifúngica contra Trichophyton metagrophytes con un CIM
encontrado de 0.0625 mg/mL, aisladas de muestras clínicas provenientes
del Instituto de Dermatología y Cirugía de Piel (INDERMA).
En el presente estudio se mostró que el extracto etanólico de la corteza de

Byrsonima crassifolia “Indano” presentaron efecto antifúngico,
inhibiendo el crecimiento in vitro de los hongos Cándida albicans y
Trychophyton rubrum por el método de macrodilución, estos resultados se
acercan a los encontrados, RIVERO F. (2009) aislando 8 compuestos de
Byrsonima crassifolia encontró muy buena actividad antifúngica del
extracto etanólico contra Cándida albicans. MONROY R. (2011), evaluó
una actividad antimicótica In Vitro de 6 extractos de plantas, encontrando
un CIM de 500 ug/mL Cándida albicans, con el extracto etanólico de
Byrsonima crassifolia, también evaluó una actividad antimicótica In Vitro
de 6 extractos de plantas, encontrando un CIM de 500 ug/mL Malassezia
pachydermatis, con el extracto etanólico de Byrsonima crassifolia,
QUIÑONEZ Y. (2014) que con la misma especie de planta, presentó
actividad antifúngica contra dos especies de Cándida albicans, encontrado
59
un CIM 0.312 mg/mL y 0.0078mg/mL, también demostró actividad

antifúngica contra Trichophyton metagrophytes con un CIM encontrado
de 0.0625 mg/mL, aisladas de muestras clínicas provenientes del Instituto
de Dermatología y Cirugia de Piel (INDERMA).
Teniendo en cuenta todos esto resultados podemos afirmar que el extracto

etanólico de la corteza Byrsonima crassifolia presenta metabolitos
secundarios como lactonas, flavonoides, taninos y azucares reductores,
los flavonoides pueden ser responsables de la actividad antifúngica In
Vitro.
60
XVIII. CONCLUSIONES:
o El análisis fitoquímico del extracto etanólico de la corteza de Byrsonima

crassifolia. “Indano”, presentó los siguientes metabolitos secundarios:
taninos, alcaloides, lactonas y azucares reductores.
o La concentración inhibitoria mínima de la Ketoconazol fue de 2.5µg/mL

tanto para Cándida albicans y Fluconazol fue de 3.12µg/mL
o El extracto etanólico de la corteza de Byrsonima crassifolia. “Indano”,

presentó actividad antifúngica In Vitro sobre Cándida albicans y
o Existen diferencias significativas entre los promedios del crecimiento de

los hongos Cándida albicans y Trichophyton rubrum con relación al
extracto etanólico de la corteza Byrsonima crassifolia. “Indano”; esto en
comparación con el control positivo de cada hongo evaluado.
61
XIX. RECOMENDACIONES:
 Se debería desarrollar el ensayo antifúngico con los extractos macerados

en diferentes solventes
 Se recomienda realizar diseños de ensayos antifúngico con diferentes

controles positivos y cepas de hongos a esta especie vegetal con el objetivo
de profundizar su estudio.
 Desarrollar otros ensayos como disco difusión, micro dilución, E – test,

para corroborar la sensibilidad antifúngica de esta especie y así validar los
resultados obtenidos en este estudio.
 Las pruebas de sensibilidad antifúngica son influenciadas por un gran

número de factores como el tamaño del inóculo, temperatura, composición
del medio y tiempo de incubación, por ello se debe controlar
adecuadamente durante el desarrollo de la evaluación de sensibilidad
antifúngica, para evitar la contaminación de otros hongos ambientales que
puedan interferir en el ensayo.
 Realizar pruebas para identificación de flavonoides, buscando que

flavonoide le da la propiedad antifúngica al extracto estudiado
62
XX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
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Recomendaciones de la.15. Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas
y Microbiología Clínica, Cap 1016.
68
XXI. ANEXOS:
ANEXO Nº 01
IMAGEN SATELITAL DE LA UBICACIÓN GEOGRÁFICA DE LA RESERVA
NATURAL ALLPAHUAYO – MISHANA
IMAGEN Nº 01: ubicación geográfica deZona Reservada Allpahuayo - Mishana
69
ANEXO Nº 02
DATOS DE PASAPORTE DE COLECCIÓN DE ESPECIES DE LAS

PLANTAS MEDICINALES EN ESTUDIO
Nº de Ficha: ……………….
FICHA DE CAMPO
DATOS GENERALES:
Lugar de colección:……………..…..Distrito:……………..…….Provincia:…………...….…
Fecha:………………………………..Tipo de Bosque:………………………………………..
Coordenadas UTM: (X)…………………..………… (Y)…………………………………..…..
Tipo de Suelo:……………………………..Otras características:…………………………....
Nombre del Colector:……………………………………………..Nº Colección:……………..
TAXONOMÍA:
Familia Vegetal:………………..……………Nombre Científico:………………….………….

Nombre Vulgar:…………………………………………………………………………………..
CARACTERÍSTICAS VEGETALES:
Hábitat:…………………………..Estadio Productivo………………………………….……..
Posición de Hojas:……………….Presencia de Órganos Accesorios en Hojas:………….
Forma del Tallo:………………….Órganos Accesorios en Tallo:……………………………
Características de la Corteza:………….…Látex:………….Color de Látex:………….…....
Tipo de Inflorescencia:………….Posición de Inflorescencia:…………..............................
Tipo de Flor por Sexo:.................Nº de Pétalos:................Unión de Sépalos:…….……..
N de Estambres:..........................Posición de Estambres:…….........................................
Posición de Ovarios:…………....................Nº de Carpelos:…………………….…..………
Tipo de Fruto:…………………….Consistencia:…………..…..Dehiscencia:…….……..….
DATOS ETNOFARMACOLÓGICOS:
Uso Medicinal 1:………………………….…Parte Usada:……………………..................

Cantidad Usada .:…………………………… Forma de Preparación:………….................
Uso Medicinal 2:………………………….…Parte Usada:……………………..................
Uso Medicinal 3:…………………………… Parte Usada:……………………...................
COLECTA DE MATERIAL BIOLÓGICO:
Peso:……………………………………………………………………………………...
Parte Colectada:………………………………………………………………………...
Observaciones:……………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………
Ficha N°01
70
ANEXO Nº 03
MUESTRA BOTÁNICA
FOTO Nº 1: Ramas terminales y hojas de Indano
71
ANEXO Nº 04
DESCRIPCIÓN DEL FENOTIPO DELAS CEPAS ESTUDIADAS
IMAGEN Nº 02: Imagen de colonias pertenecientes a Cándida albicans
IMAGEN Nº 03: Imagen de colonias pertenecientes a Trichophyton rubrum
72
ANEXO N° 05
SECADO Y MOLIENDA DE LA MUESTRA VEGETAL
FOTO Nº 02: Corteza de secado y listo para moler en el laboratorio de Ingeniería de

Alimentos ubicado en la Planta Piloto de la Facultad de Ingeniería en Industrias
Alimentarias de la Universidad Nacional de la Amazonia Peruana (UNAP)
73
ANEXO N° 06
OBTENCIÓN DE LA EXTRACTO ETANÓLICO
FOTO Nº 03: Obtención del extracto etanólico de la corteza de Byrsonima crassifolia

“Indano” realizados en el laboratorio de Ingeniería de Alimentos ubicado en la Planta
Piloto de la Facultad de Ingeniería en Industrias Alimentarias de la Universidad Nacional
de la Amazonia Peruana (UNAP)
74
ANEXO Nº 07
TAMIZAJE FITOQUIMICO
FOTO Nº 04: Resultados del tamizaje fitoquímico del extracto etanólico del extracto
etanólico de la corteza de Byrsonima crassifolia “Indano”, realizados en el Laboratorio
de Fitoquimica de la Facultad de Ingeniería Alimentarias (F.I.A.) de la Universidad
Nacional de la Amazonia Peruana (UNAP)
75
ANEXO N° 08
CERTIFICACION INS – HONGOS
FOTO Nº 05: Cepas certificadas de hongos proporcionados por el Instituto Nacional de

Salud (INS) – Perú.
76
ANEXO N°09
INCUBACION DE HONGOS
FOTO 06: Se incubaron a 37 °C
PERIODO DE CRECIMIENTO DE LOS HONGOS
07
08
FOTO 07: Por 2 días para Cándida albicans
FOTO 08: A los 14 días de crecimiento de Trichophyton rubrum
77
ANEXO N°10
PREPARACION DE ANTIFUNGICOS
(Ketoconazol y Fluconazol)
09
11
10
13
11
12
11
FOTO N°09: Preparación de controles positivos

FOTO N°10: Disolución de muestra
FOTO N°11: Preparación de baterías para pruebas
FOTO N°12: Preparación de caldo RPMI 1640
FOTO N°13: Comparación con el parámetro de Mc Farland
78
ANEXO N°11
RESULTADOS DE LA ACTIVIDAD ANTIFUNGICA DEL
EXTRACTO ETANOLICO DE LA CORTEZA DE Byrsonima crassifolia
“Indano”
FOTO Nº 14: Resultado de la evaluación de la actividad antifúngica del extracto

etanólico de la corteza de Byrsonima crassifolia “Indano” frente a Cándida albicans, el
CIM encontrado es 1.5625 mg/mL en el tubo numero 06
FOTO Nº 15: Resultado de la evaluación de la actividad antifúngica del extracto

etanólico de la corteza de Byrsonima crassifolia “Indano” frente a Trichophyton
rubrum, CIM encontrado es 0.39063 mg/mL en el tubo numero 08
79
ANEXO N°12
RESULTADO DE CONTROLES POSITIVOS
FOTO Nº 16: Resultado de la evaluación de la actividad antifúngica del Ketoconazol

frente a Cándida albicans, obteniendo un CIM = 2.5 ug/mL encontrado en el tubo
numero 10
FOTO Nº 17: Resultado de la evaluación de la actividad antifúngica del Fluconazol

frente a Trichophyton rubrum, obteniendo un CIM de 3.12 ug/mL encontrado en el
tubo numero 10
80
ANEXO Nº13
METODOLOGIA DE MACRODILUCION PARA HONGOS
IMAGEN N°04: De la solución standard se pasa 0.5 ml del tubo n°02 al tubo n° 10, del
tubo n° 10, se extrae 0.5 ml y es desechado, quedando todos los tubos con 0.5 ml
IMAGEN N°05: De la suspensión de hongos, que previamente fue comparada de manera

visual con el parámetro de turbidez de Mc Farland, se extrae 0.5 ml para agregar a cada
tubo en estudio, que contiene muestra diluido en DMSO y caldo RPMI 1640, con esto
cada tubo tiene un volumen final de 1ml.
81
ANEXO N°14
Esquema de diluciones de controles positivos:
IMAGEN N°06: Ketoconazol (disoluciones en ug/ mL)
IMAGEN N°07: Fluconazol (disoluciones en ug/ mL)
82
ANEXO Nº15
Ficha N°02
PREPARACIÓN DEL ESTÁNDAR (0,5 MC. FARLAND) PARA EL INÓCULO
1. Preparación del estándar de turbidez.
a. Agregar 0,5 ml de una solución de BaCl2 0,048 M (BaCl22H2O al

1,175% P/V) a 99,5 mL de una solución de H2SO4 0,18 M (0,36 N) (1%
V/V) en constante movimiento para mantener la suspensión.
b. Verificar la densidad correcta del estándar usando un fotocolorímetro

o espectrofotómetro, cuya absorbancia a 625 nm es 0,08 a 0,10 para el
estándar 0,5 de Mc. Farland..
c. Ajustar bien las tapas o tapones y conservarlos en la oscuridad a

temperatura ambiente y anotar la fecha de preparación.
d. Verificar mensualmente la densidad de los estándares de sulfato de

bario, y reemplazarlo cuando sea necesario.41
Se extrae las colonias de los hongos en estudio, hasta llegar a la turbidez de Mc Farland
83
ANEXO N° 16
ESTERILIZACION DE MATERIALES
18 19
20 21
FOTO N°18 y 19: Esterilizando materiales de vidrio (tubos y placas)

FOTO N°20 y 21: Esterilizando caldo y agar
ANEXO N° 17
MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS
22 FOTO N°22: Agar Glucosado de Sabouraud

23
FOTO N°23: Caldo RPMI1640
84

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“UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA AMAZONIA PERUANA”

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

“EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA In Vitro DEL EXTRACTO

TESIS PARA OPTAR EL TITULO DE

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

“EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA In Vitro DEL EXTRACTO

Miembro del Jurado Asesores:

III. MARCO REFERENCIAL...............................................................19

VII. OPERACIONALIZACIÓN DE LAS VARIABLES……………... 34

B. Controles positivos y negativos………………………….. 44

Resultados de la actividad antifungica

Metodología de macrodilución para hongos

14. ANEXO N°14…………………………………….. 81

Diluciones de controles positivos:

15. ANEXO Nº15…………………………………….. 82

Preparación del estándar (0,5 mc. farland) para el inóculo

16. ANEXO N° 16……………………………………. 83

17. ANEXO N° 17……………………………………. 83

Medios de cultivo utilizados

XXI. INDICE DE CUADRO

XXIII. INDICE DE ESQUEMAS

XXIV. INDICE DE FICHA

“EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA In Vitro DEL EXTRACTO

“EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA In Vitro DEL

PALABRAS CLAVES: Byrsonima crassifolia (Indano), Método de macrodilución,

"EVALUATION OF IN VITRO ANTIFUNGAL ACTIVITY OF ETHANOL

KEYWORDS: Nanche (indane), Macrodilution method, fungi, Candida albicans,

Roy Roger Scavino Doñez:

A mi hermana, la única persona que siempre

Claudio André, Saldaña Sanjurjo:

Dedico este trabajo de tesis a mis queridos

A mis hermanos Fatima Cecilia y Bruno que

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A Tatiana, una persona muy especial en mi

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Dedicamos este trabajo de investigación especialmente a todas aquellas

La culminación de esta presente tesis no habría sido posible sin la ayuda de

Al Ing. ALENGUER GERONIMO, ALVA ARÉVALO DR, por la

Al Blga. JESSY PATRICIA. VASQUEZ CHUMBE, por haber

A la Ingeniera TANY, por habernos apoyado de manera desinteresada

Al Q.F. HENRY VLADIMIR DELGADO WONG, por su apoyo

Al Q.F. JEAN PIERRE LOPEZ MESIA, por su ayuda en puntos muy

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Durante las últimas décadas la utilización de las plantas medicinales y

El Perú lleno de riquezas naturales en donde las mismas han sido la

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Al igual que en otros estudios, se ha observado que la piel lampiña

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 Evaluar la actividad antifúngica del extracto etanólico de la corteza de

 Obtener el extracto etanolico de la corteza de Byrsonima crassifolia (Indano)

 Realizar el tamizaje fitoquímico de la corteza de Byrsonima crassifolia,

 Determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) del extracto etanólico

 Determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) del extracto etanólico

 Comparar la actividad antifúngico de la corteza de Byrsonima crassifolia,

III. MARCO REFERENCIAL:

El hombre amazónico a través de toda su historia, ha logrado identificar

La importancia de los conocimientos etnobotánicas y de la medicina