Guia de Practicas Control Microbioogico de Medicamentos Farmac 2016 I 33 0

3B-2
GUÍA DE PRÁCTICAS
Unidad académica: EAP DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
CONTROL MICROBIOLOGICO DE LOS MEDICAMENTOS
Autores: Mg. Ana María Chávez Fernández

Dr. Q.F. Víctor H. Guerra del Águila
Mg. Q.F. Marilú Jaramillo Briceño
F-CV3-3B-2 Rev. Abril 2016

INTRODUCCIÓN
La Microbiología es una ciencia que estudia a los organismos microscópicos denominados
microorganismos los cuales se definen como aquellos seres vivos unicelulares o pluricelulares
carentes de organización tisular y que no pueden ser visualizados al ojo humano necesitando
para ello el microscopio.
Para el estudio de este tipo de seres vivos se necesita el conocimiento de técnicas únicas
denominadas técnicas microbiológicas. Estas técnicas han permitido el conocimiento de las
diferentes estructuras y composición bacteriana pudiendo comprenderse como muchas bacterias
se relacionan con el hombre ya sea como integrantes de la flora normal o como agresoras para el
mismo. Así mismo, el conocimiento, manejo y utilización de los principales equipos,
instrumentos y materiales utilizados en el laboratorio de microbiología es indispensable para la
ejecución y desarrollo de estas técnicas microbiológicas que permitirán al alumno, futuro
profesional de la salud aplicar estos conocimientos en el control microbiológico de los
medicamentos, por lo cual se aplicaran y desarrollaran en una primera etapa de las practicas.
La posibilidad de acceder a medicamentos seguros, eficaces y de calidad es un derecho esencial de

la población que siempre debe ser garantizado. El aseguramiento de la calidad implica un conjunto
de metodologías y procedimientos que exceden el control del producto terminado, e involucran
todos los aspectos que intervienen en el proceso de elaboración.
Entre estos aspectos puede mencionarse la forma y el modo en que se recibe la materia prima en el
establecimiento elaborador, los procesos de producción del medicamento, las características de los
espacios donde se llevan adelante esos procesos, los modos en que se depositan y tratan los
productos una vez terminados, y el funcionamiento del laboratorio de control de calidad de la
planta, entre otros. Estos controles se fundamentan en orientaciones técnicas que se basan en el
conocimiento exacto de la información contenida en las principales obras de referencia en general y
las consideraciones microbiológicas que aplican a la industria farmacéutica en particular, en la
preparación y el control de los medios de cultivo, las cepas de prueba, los equipos, los indicadores
biológicos para esterilización y los desinfectantes empleados en la industria farmacéutica, en el
aprendizaje de la metodología del análisis microbiológico del agua y la aplicación de los criterios e
interpretación de resultados en la industria farmacéutica y de la evaluación microbiológica de
cuartos limpios y ambientes controlados.
Además de ello deben conocerse las pruebas previas a la evaluación microbiológica de un producto
farmacéutico no estéril y estéril, las pruebas de aptitud de los métodos así como entender y
aplicar los criterios de validación de los métodos de análisis microbiológico.
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Bioseguridad en el laboratorio
Desde hace tiempo la Organización Mundial de la Salud (OMS) reconoce que la seguridad y, en particular, la
seguridad biológica son importantes cuestiones de interés internacional. En 1983, la OMS publicó la primera
edición del Manual de bioseguridad en el laboratorio; en la que se alentaba a los países a aceptar y
aplicar conceptos básicos en materia de seguridad biológica, así como elaborar códigos nacionales de
prácticas para la manipulación sin riesgo de microorganismos patógenos en los laboratorios que se
encuentran dentro de sus fronteras nacionales.
La tercera edición del Manual de bioseguridad en el laboratorio de la OMS (2005) proporciona la

información más actualizada para abordar los aspectos de la seguridad y la protección biológica que se
plantean en el nuevo milenio. Asimismo, subraya la importancia de la responsabilidad personal. Además,
hace reflexionar sobre los recientes acontecimientos mundiales que hacen evidente los peligros para la
salud pública derivados de la liberación o el uso indebido de agentes y toxinas microbianos.
Como profesionales de estas disciplinas, es importante conocer los principios básicos de seguridad en el
trabajo con microorganismos, considerando los peligros relativos que implican su manejo. De acuerdo con
el potencial que tienen los microorganismos para infectar al ser humano y los animales, se les ha clasificado
en grupos de riesgo, que se presentan en la Tabla 1.
Tabla 1. Clasificación de microorganismos infecciosos por grupos de riesgo.
Grupo de riesgo 1 Microorganismos que tienen pocas probabilidades de provocar

(riesgo individual y poblacional escaso o nulo) enfermedades en el ser humano o los animales.
Agentes patógenos que pueden provocar enfermedades

humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades
Grupo de riesgo 2
de entrañar un riesgo grave para el personal de laboratorio, la
(riesgo individual moderado, riesgo
población, animales o el medio ambiente. La exposición en el
poblacional bajo)
laboratorio puede provocar una infección grave, pero existen
medidas preventivas y terapéuticas eficaces y el riesgo de
propagación es limitado.
Agentes patógenos que suelen provocar enfermedades
Grupo de riesgo 3
humanas o animales graves, pero que de ordinario no se
(riesgo individual elevado, riesgo poblacional bajo)
propagan de un individuo a otro. Existen medidas preventivas
y terapéuticas eficaces.
Agentes patógenos que suelen provocar enfermedades graves

Grupo de riesgo 4 en el ser humano o los animales y que se transmiten con
(riesgo individual y poblacional elevado) facilidad de un individuo a otro, directa o indirectamente. Por
lo regular no existen medidas preventivas y terapéuticas
eficaces
La OMS y los National Institutes of Health (NIH) de los Estados Unidos, han propuesto las bases para la
jerarquización de los laboratorios en función del grupo de riesgo al que pertenecen los microorganismos que
manejan, indicando las condiciones de acceso, tipo de personal, equipo especial y diseño específico de las
instalaciones.
En el trabajo de laboratorio es fundamental la seguridad e integridad física de las personas involucradas; por
ello, no podrá realizarse ninguna práctica o actividad experimental si el ejecutante no cuenta con los
elementos de protección indispensables para su desarrollo o no cumple con las disposiciones normativas
aplicables, para lo cual se deberán cumplir siempre las siguientes reglas.
1. El uso de bata en el laboratorio es obligatorio cuando se realizan experimentos. Es recomendable vestir ropa
sencilla, que proteja la mayor parte del cuerpo, de preferencia de algodón, zapatos cerrados, con suelas
gruesas y sin tacones o plataformas, así como traer el pelo recogido.
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2. No introducir ni consumir alimentos o bebidas en el laboratorio. No fumar, ni tocarse la cara o los ojos con
las manos.
3. Lavarse de manera meticulosa las manos con jabón y agua antes de salir del laboratorio, incluso cuando salgan
por breves periodos.
4. Al manipular sustancias químicas corrosivas o peligrosas se utilizarán guantes, lentes protectores y/o
mascarillas. No se deberá pipetear oralmente ningún tipo de solución o cultivo microbiano. Siempre se
utilizarán propipetas adecuadas para este fin.
5. No se admitirán visitas personales ni el uso de aparatos que distraigan la atención y pongan en riesgo la
seguridad en el trabajo.
6. Evitar la acumulación de materiales innecesarios en las mesas de trabajo. Realizar las actividades de manera
ordenada y en silencio para evitar accidentes.
7. Localizar extintores, botiquín y salidas de emergencia.
Sobre los procedimientos
1. Antes y después de cada sesión práctica, los alumnos limpiarán las mesas de trabajo con el desinfectante que
se le proporcionará.
2. Cuando se utilice el mechero, este será colocado en un lugar alejado del microscopio y otros equipos.
3. En el caso de derrame de cultivos o ruptura de recipientes con cultivos activos, tratar de conservar la calma,
inmediatamente informar al profesor y/o realizar el siguiente procedimiento:
a. Colocar toallas de papel sobre el material derramado para evitar su
dispersión. b. Agregar abundante solución desinfectante sobre las
toallas.
c. Dejar transcurrir al menos 15 minutos, retirar las toallas y tirarlas en el receptáculo destinado a la
eliminación de materiales contaminados.
4. Al concluir cada sesión práctica, el estudiante se asegurará de que los materiales de desecho u objetos
contaminados sean colocados en recipientes específicos para ello, así como en lugares apropiados. Deberán
esterilizarse tal y como indique el profesor.
Sobre el uso de instalaciones y equipos de laboratorio
1. Operar un instrumento o aparato solamente cuando se sabe hacerlo, de otra manera, solicitar la ayuda
del profesor, del ayudante o del técnico del laboratorio, para adquirir la destreza necesaria.
2. Una vez concluido el uso de un aparato o instrumento, seguir el procedimiento adecuado para apagarlo,
desconectarlo, guardarlo y entregarlo al responsable de su custodia.
3. Siempre dejar perfectamente limpios todos los equipos utilizados (microscopios, balanzas analíticas,
autoclave, potenció- metros, etc.) y reportar al maestro cualquier irregularidad en el funcionamiento.
4. Verificar que las tomas de agua, gas y aire en el lugar de trabajo estén bien cerradas. Dejar limpias y secas
las mesas de trabajo.

I- PRACTICA Nº 1. Introduccion al laboratorio de microbiología.
Reconocimiento y manejo de los principales equipos e instrumentos, preparación de material de
vidrio, material auxiliar y su forma de esterilización.
1.1 Marco teórico
En el laboratorio de Microbiología es necesario utilizar material limpio, sin trazas de detergente
y estériles para el aislamiento y posterior identificación de los gérmenes que se está investigando,
se entiende por:
Limpieza al proceso físico utilizado en los objetos en uso del laboratorio para eliminar materia
orgánica y residuos, mediante el lavado con agua con o sin detergente.
Desinfección es un proceso por el cual se elimina la mayor parte de microorganismos indeseables y en
el que se utilizan principalmente agentes químicos sobre superficies.
Esterilización que viene a ser la destrucción de toda forma de vida, ésta puede ser por
vapor saturado (autoclave) o por calor seco ( horno ).
Métodos de esterilización
húmedo vapor a presión (autoclave)
aire caliente (horno)
calor
seco flameado
incineración
discos de membranas o filtros absolutos
filtración
Métodos físicos flujo laminar
rayos ultravioleta
no ionizantes
rayos infrarrojos
radiaciones rayos X
ionizantes rayos (cobalto-60)
radiación electrónica de alta energía
gases óxido de etileno
Metodos Químicos formaldehído
líquidos
β-propiolactona
1.2 Competencias
Identifica y utiliza equipos y materiales en el Laboratorio de microbiología
Conoce y hace uso de los conceptos de desinfección y esterilización.
Prepara el material de vidrio y metal para su esterilización.
1. 3 Materiales y equipos
Equipos e instrumentos tales como: Autoclave, horno, incubadora, baño María,
refrigeradora, equipo para luz ultravioleta , equipo de esterilización por filtración, cámara
de flujo laminar, centrifuga y microscopio compuesto,
Portaobjetos y cubreobjetos
Papel para lente
Torundas de algodón
Gasa
Asa de Kolle
Cultivo bacteriano
Papel kraft
Tubos de prueba
Placas Petri
Balones, vaso de precipitados, pipetas y matraces
F-CV3-3B-1 5 de vidrio REV. ABRIL 2016
1. 4 Procedimiento
1. Examina cada uno de los siguientes equipos e instrumentos del laboratorio: autoclave, horno,
incubadora, cámara de flujo laminar, baño maría, equipo de esterilización por filtración,
centrifuga y microscopio e identifica sus componentes, su aplicación y utilización en el
laboratorio.
2. Preparación de material de vidrio y material auxiliar
Confecciona tapones de algodón para el material de vidrio proporcionado, estos deben ser
consistentes y de un tamaño apropiado que permita su manipulación.
Empaqueta este material con papel kraft, en igual forma también se procede
con todo el material auxiliar que se use en el laboratorio para someterlo a un proceso
de esterilización y luego conservar su esterilidad un tiempo adecuado
Las placas Petri y los tubos de prueba (previamente taponados) se envuelven formando
paquetes de tres y seis unidades respectivamente. Debe tenerse especial cuidado en que
el papel utilizado se encuentre íntegro y sin orificios. Para las torundas e hisopos se
procede de igual forma.
En el caso de las pipetas, se cortan bandas largas (tiras) de papel kraft y se las envuelve
en forma diagonal y empezando por la punta, colocando un refuerzo de papel en esta
sección, de esta forma la pipeta quedará íntegramente cubierta por el papel. Al final de la
envoltura se dejará una porción en la que se escribirá en números la capacidad de volumen
de la pipeta.
 Llevar a esterilizar el material preparado al horno a 180oC por dos horas.
5 Resultados
Registrar detalladamente cada una de las observaciones hechas y realizar los esquemas y dibujos
necesarios: Equipo de laboratorio (indicando sus componentes). Procede de igual forma con el
material de laboratorio empleado
6 Cuestionario.
1 .-¿Con qué propósito se envuelve totalmente el material a esterilizar?

2. ¿Por qué se emplean diferentes formas de esterilización?. Ejemplos
3.-A qué se debe la diferencia de tiempo en los procesos de esterilización por calor húmedo y
seco.
Bibliografia
Madigan Michael T., Martinko John M., Parker Jack; Brock Biologia de los Microorganismos. 10a Ed.
2000
Jawetz E., Melnick y Adelberg. Microbiología médica. 25ed. México, DF: Editorial Mc Graw Hill
Interamericana Editores, S.A. de C.V., 2011.

II.- PRACTICA Nº 2.- Preparación de medios de cultivo y su forma de esterilización.
Técnicas de siembra y estudio del desarrollo bacteriano.
2.1 Marco teórico
Es importante aislar y observar el crecimiento de un microorganismo para su identificación, por

lo que se utilizan materiales alimenticios artificiales preparados en el laboratorio llamados
medios de cultivo y su desarrollo es el cultivo.
Sus requerimientos varían considerablemente algunos sólo requieren sustancias simples
(bacterias no exigentes ) y otros requieren de sustancias complejas ( bacterias exigentes )
Medios de Cultivo
Son sustancias o compuestos nutritivos estériles que permiten el crecimiento y
multiplicación de los microorganismos en el laboratorio, este medio debe cumplir una
serie de condiciones como son temperatura, grado de humedad, y presión de oxígeno
adecuados, además de nutrientes y factores de crecimiento y estar exento de todo
microorganismo contaminante con el objeto de aislar las diferentes especies bacterianas y
proceder a su identificación mediante estudios complementarios.
Clasificación de los medios de cultivo: Segùn su composición;

-Medios empíricos.- Extraìdos de alimentos naturales
-Medios semi-sintèticos.- Son medios de cultivo empíricos enriquecidos de ciertos compuestos
químicos
-Medios sintéticos.- Medios químicamente definidos
Según su estado físico: Medios líquidos, medios semisólidos (con 0,3 a 0,5% de agar), medios
sólidos (con 1 a 2% de agar).
Según su aplicación:
- Medios comunes o simples: permiten el desarrollo de la mayoría de bacterias, sobre todo las no
exigentes.
- Medios especiales: Medios de enriquecimiento, medios enriquecidos, medios de conservación y
transporte medios selectivos y medios diferenciales.
Preparación de medios de cultivo:

Es preciso ejercer un cuidado meticuloso en su preparación los que deberán ser
esterilizados inmediatamente. una vez preparados
- Los tubos de ensayo que contienen los medios se tapan con tapones de algodón o tapas
metálicas o plásticas con el fin de evitar la penetración de microorganismos extraños, luego se
esterilizan Las placas Petri se esterilizan por separado y luego los medios se vierten
asépticamente en ellas.
. Técnicas de siembra:
En microbiología las muestras a analizar pueden presentar poblaciones microbianas mixtas, por
esta razón se utilizan diversas técnicas para separar un microorganismo de otro y obtener así un
cultivo puro que permita identificar al microorganismo aislado. Las técnicas microbiológicas se
basan en el aislamiento de microorganismos a partir de una muestra, por lo que es indispensable
tener en cuenta las máximas condiciones de asepsia, desde la toma de muestra hasta la siembra,
la cual debe efectuarse lo más rápido posible.
Términos
importantes:
Siembra
Inóculo
Cultivo puro
Cepa
Se denomina “técnica de siembra” al procedimiento mediante el cual se pone en contacto a los
microorganismos con un medio de cultivo y después de un período de incubación se produce el
desarrollo de colonias bacterianas. Existen varios tipos de siembra , entre los cuales están los
siguientes:
- Siembra por dispersión y agotamiento
- Siembra por puntura
- Siembra por estría
- Siembra por inoculación
- Siembra por incorporación, en placa vertida, en masa o en todo el medio
- Siembra por diseminación o en superficie o con cayado
Desarrollo bacteriano
Algunas veces las especies bacterianas se pueden identificar basándose en el aspecto que
tienen sobre o dentro de los distintos medios de cultivo , es así que la observación de las
características de crecimiento de las colonias de microorganismos en medio sólido (agar) y líquido
(caldo), puede ser de gran utilidad.
Estudio bacteriano en medio líquido:
- Velocidad de desarrollo (crecimiento): lento, moderado, rápido.
- Aspecto: turbio, claro o transparente, difuso, granulado. Se registran las observaciones como:
presencia o ausencia de: turbidez, sedimento y “película”.
- Producción de gas: formación de burbujas.
Estudio bacteriano en medio semisólido:
- Movilidad
- Cambios metabólicos
Estudio bacteriano en medio sólido:
- Características morfológicas de las colonias en cuanto a: elevación, forma, borde,
superficie, tamaño, consistencia y color de pigmentación.
2.2Competencias
- Reconoce los principales medios de cultivo y su aplicación.
- Prepara y esteriliza diversos medios de cultivo.
- Aplica diversas técnicas de siembra para su cultivo y aislamiento hasta la obtención de
cultivos puros
- Describe e interpreta sus observaciones usando la terminología técnica apropiada.
-
Preparacion de medios de cultivo y esterilizacion
2.3 Materiales y equipos
- Balanza, espátulas, algodón y papel kraft
- Probetas de 500 ml, frascos y/o beakers de 500 ml.
- Agua destilada.
- Trípodes con rejilla metálica
- Tubos estériles y placas Petri estériles ,baguetas, beakers
- Medios de cultivo deshidratados:
- Solido: Agar: Tripticase de Soya (TSA), Agar MacConkey para placas petri
- Agar SIM (Azufre – Indol – Motilidad) y TSA para tubos
- Liquido: Caldo: Tripticase de Soya (TSB) y/o Caldo peptonado.
2.4 Procedimiento
- Disolver en agua destilada los medios comerciales proporcionados, según la indicación del
envase, a los que contengan agar será necesario someterlos a ebullicion para su completa
disolución.
- Enfriar este preparado hasta aproximadamente 50ºC.
- Mide el pH del medio, con la cinta indicadora.
- Si es necesario, ajusta el pH empleando NaOH 1N o HCL 1N.
- Envasa, rotula, señalando el tipo de medio8y la fecha de preparación.REV. ABRIL 2016
F-CV3-3B-1
- Esteriliza por autoclave a 15 lb de presión es decir a 121 C por 15 minutos.
- Controla la esterilidad del medio, por incubación del mismo a 37ºC por 24 horas.
2. 5 Resultados
Mencione los criterios y consideraciones importantes a tener en cuenta para la preparación de

medios de cultivo
2.6 Cuestionario:
1. ¿Que importancia tiene el uso de los medios sólidos?

2. ¿Como controlaría si el medio de cultivo preparado esta listo para realizar una siembra?
Técnicas de Siembra y estudio del desarrollo en Medios de cultivo:

1. Medios de cultivo:
- Placas petri con agar TSA y Agar MacConkey
- Tubos con agar SIM y TSA en agar inclinado
- Tubos con caldo TSB
- Cultivos de: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis y Pseudomonas
aeruginosa
2. Desarrollo bacteriano:
- Utilizar los medios de cultivo preparados en la práctica anterior y proceder a
realizar los sembrados en los distintos medios según técnicas
Procedimiento:
1. Técnicas de Siembra en Medios Líquidos, Semisólidos y Sólidos:
Siguiendo la metodología descrita según los esquemas anexos, proceder tal como sigue:
- Con el asa en aro previamente esterilizada, tomar una asada del cultivo de
microorganismos, y sembrar por el método de dispersión y agotamiento en las placas de
TSA y MacConkey
- Con el asa en punta previamente esterilizada, tomar el inóculo del cultivo de bacterias y
sembrar en agar SIM, por el método de puntura.
- Con el asa en aro, toma el inóculo del cultivo bacteriano y siembra en el tubo con agar
en pico de flauta o plano inclinado, por el método de estría .
- Con el asa en aro previamente esterilizada tomar una asada del cultivo, y sembrar por el
método de inoculación en el tubo con caldo TSB.
2. Desarrollo bacteriano:
- Efectuar la lectura, observación e interpretación de los resultados para cada uno de los
medios y cepas empleadas.
3 Resultados:
Reportar y describir l a composición y el fundamento de las diferentes clases de medios de

cultivo utilizados en la practica.
Observar y describir el crecimiento microbiano en cada medio de cultivo y la morfología de las
colonias.
Bibliografia
2000
III.- PRACTICA 3: CULTIVO, AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACTERIAS GRAM (+) DE
IMPORTANCIA MEDICA E INDUSTRIAL: COCOS Y BACILOS GRAM (+).
3. 1 Marco teórico
1. Estudio de los estafilococos

La patogenicidad de una especie de Estafilococo, se determina por producción de
hemolisina,fermentación del manitol y producción de las enzimas coagulasa y
desoxiribonucleasa.
2. Estudio de los estreptococos

Agrupados originalmente por su capacidad para producir lisis de los hematíes, así
tenemos los estreptococos alfa, beta y gama hemolíticos, según sea la lisis parcial, total o
nula. Existen varias pruebas específicas para el estudio de estos microorganismos como son:
- Prueba de la bacitracina, que se usa para la diferenciación de un estreptococo Beta
hemolítico del Grupo A, de los Beta hemolíticos del Grupo No A.
- Prueba de CAMP, que se usa para la diferenciación de un estreptococo beta hemolítico
Grupo A, del estreptococo beta hemolítico grupo B.
- Prueba de la catalasa, para evidenciar la presencia de esta enzima sobre el peróxido de
hidrógeno.
- Prueba de Optochin, para evidenciar la sensibilidad del S. pneumoniae al Optochin
y la resistencia del S. viridans
3. 2
Competencias
- Cultiva, aisla e identifica especies representativas del género Staphylococcus y
Streptococcus.
3. 3 Material y métodos
Placas con agar sangre
Placas con agar manitol salado
- Placas con agar DNA
- Cultivo de: Staphylococcus aureus y S. epidermidis; Streptococcus viridans, S.
pyogenes, S. pneumoniae y S. agalactiae
- Set de colorantes Gram
- Reactivo de coagulasa
- Solución HCl 1N
- Solución de peróxido de hidrógeno al 3%
- Discos de Bacitracina
- Discos de Optochin
3 . 4 Procedimiento
1.Estudio de los
estafilococos
Coloración y morfología
- Efectúa frotices en láminas portaobjetos con cada una de las cepas.
- Después de fijarlas al calor, realiza coloraciones de Gram.
- Observa al microscopio con lente de inmersión y anota las características morfológicas.
- Toma una placa de agar sangre y lo divide en dos sectores.
- Inocula cada sector correspondiente con cada una de las cepas de estafilococos: S.
aureus y S. epidermidis.
- Incuba a 37ºC por 24
horas.
Segundo día
- Observa el crecimiento en agar sangre.
-
Crecimiento en agar manitol salado

Primer día
- Toma una placa de agar manitol salado y divídelo en dos sectores.
- Inocula cada sector correspondiente con las mismas cepas del ejercicio anterior.
- Incuba a 37ºC por 24 horas.
Segundo día
- Observa el crecimiento en agar manitol salado y describe la morfología de las colonias.
- Observa el viraje del color del indicador rojo de fenol, debido a la acidez
Prueba de la coagulasa
Primer día
- Toma dos tubos que contienen 0.5 mL de plasma de conejo (reactivo de coagulasa).
- Inocula cada uno de ellos con 0.1 mL de cada una de las dos cepas de estafilococos.
- Incuba a 37ºC.
- Observa cada hora la aparición de coágulos, por espacio de 4 horas.
- De ser negativo el resultado, se deja incubando y se hace una lectura final a las 24 horas.
- Si aparece un coágulo, la bacteria posee la enzima coagulasa.
-
Acción de la DNAsa
Primer día
- Toma una placa de agar DNA y la divide en dos sectores.
- Inocula en una mitad con el cultivo de S. aureus y la otra mitad con S. epidermidis.
- En ambos casos, la siembra la realiza con un solo trazo lineal perpendicular a la línea
divisoria.
- Incuba a 37ºC por 24 horas
Segundo día
- Agrega a la superficie del agar 1 ml de HCl 1N y espera unos minutos.
- El HCl 1N precipita el DNA contenido en el medio de cultivo, enturbiándolo.
- Observa la presencia de la enzima DNAsa, por la aparición de un halo transparente
alrededor de la siembra, que indica la ausencia de DNA.
-
Prueba de la catalasa
- Toma una asada de cada cultivo de S. aureus y S. epidermidis y lo coloca sobre un
portaobjetos limpio.
- Añade 1 a 2 gotas de H2O2 al 3%.
- Observa si se forman burbujas o no inmediatamente después que se añade el reactivo.
- Descarta la lámina en un recipiente con desinfectante.
2. Estudio de los estreptococos

- Efectúa frotis en laminas portaobjetos con cada una de las cepas.
- Después de fijarlas al calor, realice coloraciones de Gram.
- Observa al microscopio con lente de inmersión y anota las características morfológicas.
- Toma una placa de agar sangre y la divide en dos sectores.
- Inocula cada sector correspondiente con cada una de las cepas de estreptococos: S.
viridans (alfa hemolítico) y S. pyogenes (beta hemolítico).
Segundo día
- Observa las diferencias de hemólisis en agar sangre.
Prueba de la bacitracina
Se usa para la diferenciación de un estreptococo Beta hemolítico del Grupo A, de los Beta
hemolíticos del Grupo No A. Primer día
- Toma una placa de agar sangre y divíde en dos sectores.

- Inocula cada sector correspondiente con cada una de las cepas de estreptococos:
S.agalactiae y S.pyogenes y coloca cuidadosamente y en forma estéril con ayuda de una
pinza, un disco de Bacitracina en cada mitad. Incuba a 37ºC por 24 horas.
Segundo día
- Observa el halo de inhibición, indicando la susceptibilidad a la Bacitracina del S. pyogenes.
-
Prueba de CAMP
Se usa para la diferenciación de un estreptococo beta hemolítico Grupo A, del
estreptococo beta hemolítico grupo B.
Primer día
- Inocula con trazo lineal en una placa de agar sangre, una colonia de S. aureus.
- Luego perpendicular al trazo anterior, inocula las cepas de estreptococos: S.
agalactiae y S. pyogenes en cada mitad de la placa sin tocar la cepa de estafilococo.
Segundo día
- Observa los resultados obtenidos.
- El estreptococo beta hemolítico Grupo B (S.agalactiae), produce una sustancia (factor
CAMP), que agranda la zona de hemólisis producida por el estafilococo, factor que no
posee el estreptococo beta hemolítico Grupo A (S. pyogenes).
-
- Toma una asada del cultivo de Streptococcus pyogenes y coloca sobre un portaobjetos
limpio.
- Añada 1 a 2 gotas de H2O2 al 3%.
Prueba de Optochin
Primer día
- Toma una placa de agar sangre y la divíde en dos mitades.
- Inocula una mitad de la placa con S. viridans y la otra mitad con S. Pneumoniae
y coloca cuidadosamente y en forma estéril con ayuda de una pinza, un disco de Optochin
en cada mitad.
8. 5 Resultados
Observar, interpretar y reportar los resultados para cada una de las pruebas.
8.6 Cuestionario
¿Qué factores condicionan la patogenicidad del S. aureus en comparación con otras
especies de estafilococos?
1. ¿Qué enfermedades produce el S. epidermidis y el S. saprophyticus?
2. Es recomendable en un paciente que presenta un cuadro de faringoamigdalistis, hacerse un
examen de secreción faríngea a fin de descartar la presencia de Streptococcus pyogenes
Bibliografia
2000

GENERO Bacillus
El genero Bacillus, agrupa microorganismos aerobios y anaerobios facultativos, Gram

positivos, caracterizados por su capacidad de producir endoesporas y que pueden sobrevivir en el
ambiente por mucho tiempo y son de importancia medica e industrial.
2 Competencias
- Cultiva, aisla e identifica especies representativas del género Bacillus.
3 Materiales y equipos
- Cultivo de:Bacillus subtilis
- Tubos con gelatina
- Placas con agar sangre
- Tubos con caldo tioglicolato
- Tubos con TSA
- Peróxido de hidrógeno
- Set de coloración de esporas
- Set de coloración Gram
4 Procedimiento
1. Grupo Bacillus
- Prepara frotices del cultivo de Bacillus subtilis y colorea por la tinción de Gram.
- Observa al microscopio con lente de inmersión.
- Observa los bacilos dispuestos en cadenas largas con los extremos rectos. Las esporas se
localizan generalmente en la parte subterminal del bacilo y aparecen como áreas no
teñidas.
Inoculación en agar sangre

Primer día
- Siembra la cepa de B.subtilis en agar sangre por el método de dispersión – agotamiento.
Segundo día
- En el agar sangre, observa la beta – hemólisis producida por B.subtilis.
-
Inoculación en TSA
Primer día
- Siembra la cepa de B.subtilis en TSA por el método de dispersión – agotamiento.
Segundo día
- Observa las características de la colonia, gris blanquecina, grande, extendida, de bordes
irregulares.
-
Hidrólisis de la gelatina
Primer día
- Siembra por el método de puntura en el tubo con gelatina.
Segundo día
- Enfria el tubo y observa la hidrólisis de la gelatina.
-
- Toma una asada del cultivo de B.subtilis y lo coloca sobre un portaobjetos limpio.
- Añade 1 a 2 gotas de H2O2 al 3%.
-
Movilidad
- Toma una asada del cultivo de B.subtilis y lo coloca sobre un portaobjeto limpio.
- Coloca una laminilla encima del portaobjetos y observa la movilidad del B.subtilis
utilizando el objetivo de 40x.
5 Resultados
Esquematizar, reportar e interpretar los resultados obtenidos en cuanto a su morfología
microscópica y las características de cada uno de los microorganismos trabajados en la practica.
Cuestionario
. Porque se dicen gérmenes anaerobios obligatorios

. Cual es la importancia medica e industrial de los generos Bacillus y Closridium.
Bibliografia
2000
PRACTICA 4.- Lectura, interpretacion y discusión de los

resultados. Identificación de una muestra problema.
Redaccion y presentación de Informe de la practica.

V.- PRACTICA 5: CULTIVO, AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACTERIAS GRAM (-) DE
IMPORTANCIA MEDICA E INDUSTRIAL: BACILOS GRAM ( - ) FERMENTADORES Y NO FERMENTADORES.
5 .1 Marco teórico
1. Bacilos Gram negativos Fermentadores. Grupo Enterobacterias
Las diferentes especies de enterobacterias se identifican por su actividad metabólica en
diferentes medios de cultivo que contienen carbohidratos, proteínas, aminoácidos, etc. Estos
microorganismos no producen citocromo – oxidasa, lo que las diferencia de las Pseudomonas,
Alcalígenes, Aeromonas y Vibrios.
2. Bacilos Gram negativos no Fermentadores. Grupo Pseudomonas
Algunas especies son patógenas oportunistas para el hombre, siendo la mas importante
Pseudomonas aeruginosa por ser la especie mas frecuentemente asociada con enfermedad
humana. P.aeruginosa desarrolla fácilmente en los medios de cultivo, la mayoría de las especies
son identificadas en base a su olor característico, morfología colonial, pigmentos y otros.
3. Oxidasa Positivos. Grupo Vibrios
En el género Vibrio se describen dos grupos: un grupo comprende a Vibrio cholerae, causante del
cólera y los Vibrio no aglutinantes que pueden producir diarreas no epidémicas. Otro grupo, lo
conforman las especies halofilicas, que tienen afinidad por el cloruro de sodio. Entre estos, V.
parahaemoliticus, que puede producir enfermedades similares al cólera pero sin ser tan severas.
5. 2 Competencias
- Cultiva, aisla e identidica bacterias Gram ( - ) fermentadoras y no fermentadoras de
importancia medica e industrial.
5. 3 Materiales y métodos
Bacilos Gram negativos Fermentadores. Grupo Enterobacterias
- Placas con agar: Mc Conkey, SS, EMB, TSI, Citrato de Simmons
- Tubos con agar: Urea, SIM
- Tubos con caldo: VP – RM, peptonado,
lactosado
- Campanas de
Durham
- Cultivo de: E.coli, Salmonella tiphy, Shigella, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter
aerogenes, Proteus vulgaris
- Set de colorantes
Gram
- Reactivos de: Kovac´s, Rojo de Metilo, Voges – Proskauer: (alfa – naftol al 5% y KOH – creatina
al 40%), oxidasa
- Láminas porta y cubreobjetos
Bacilos Gram negativos no Fermentadores. Grupo Pseudomonas

- Tubos con: TSA y TSI
- Tubos con TSB
- Cultivo de Pseudomonas
aeruginosa
- Set de coloración
Gram
- Reactivo de
oxidasa.
Oxidasa positivos. Grupo Vibrio

- Cultivo de Vibrio cholerae
- Cultivo de Vibrio parahaemolyticus
- Placas con agar TCBS
- Tubos con agar TSI
- Reactivo de oxidasa
- Set de coloración Gram
- Desoxicolato de sodio
5. 4 Procedimiento
1. Bacilos Gram negativos Fermentadores. Grupo Enterobacterias
- En su mesa encontrará una cepa representativa de los siguientes grupos: Proteae,
Escherichiae, Salmonellae, Shigellae, y Klebsiellae; con la cual trabajará durante toda la
práctica.
- Prepara frotices de la cepa del cultivo proporcionado y colorea por tinción de Gram.
-
Movilidad
- Toma una asada de la cepa del cultivo proporcionado y lo coloca sobre un portaobjetos limpio.
- Coloca una laminilla encima del portaobjetos y observa la movilidad del
microorganismo utilizando el objetivo de 40x.
-
Inoculación en agar Mc Conkey
Primer día
- Siembra la cepa proporcionada por el método de dispersión – agotamiento la placa con agar
Mc Conkey.
Segundo día
- La degradación de la lactosa a ácidos se manifiesta por el viraje de color a rojo del indicador
de pH rojo neutro; siendo estas colonias, lactosa – positivas.
- Las colonias que son lactosa – negativas son incoloras
-
Inoculación en agar EMB (Eosina – Azul de Metileno)
Primer día
- Siembra la cepa proporcionada por el método de dispersión –agotamiento en la placa con agar
EMB.
- Incuba a 37ºC por 24 horas. Segundo día
- En el medio EMB observa colonias negruzcas con brillo metálico verdoso, cuando
metabolizan la lactosa o sacarosa y translúcidas o de color ámbar si son lactosa – negativas.
-
Inoculación en agar SS (Salmonella – Shigella)
Primer día
- Siembra la cepa proporcionada por el método de dispersión – agotamiento en la placa con agar SS.
- Incubar a 37ºC por 24 horas.
Segundo día
- En el medio SS, la detección de coliformes se comprueba cuando hay degradación a ácido
mediante el indicador de pH rojo neutro y observará colonias negras, si las bacterias
producen sulfuro de hidrógeno.

Diferenciación metabólica del grupo de Enterobacterias
Primer día
- Con la cepa asignada, procede a inocular por los métodos de siembra adecuados, los
siguientes medios:
- Caldos: Lactosado, peptonado y MR VP
- Agar: Urea, TSI, SIM, Citrato
Segundo día
El alumno anotará los resultados de este ejercicio y efectuará la identificación de
la cepa proporcionada. Comparará los resultados con la tabla proporcionada: Ver tabla: 10-1.
a) Caldo Lactosado: después del período de incubación, observe el resultado obtenido
(cambio de coloración, presencia de gas) y compare con los resultados de los demás alumnos
de la clase.
b) Agar Urea: la prueba es positiva si el medio presenta un color rosado en la superficie o
en todo el tubo y es negativa, si el medio permanece del color original. Observe el
resultado obtenido y compare con los resultados de los demás alumnos de la clase.
c) Agar TSI: es indispensable que la lectura en el plazo establecido y observe:
- Producción de H2S: ennegrecimiento en el fondo del tubo.
- Fermentación de la glucosa únicamente (rojo/amarillo).
- Fermentación doble o triple de carbohidratos (amarillo/amarillo).
- No fermentación de carbohidratos (rojo/anaranjado).
- Producción de gas: formación de burbujas, grietas o desplazamiento del medio.
d) Agar SIM (Azufre – Indol – Movilidad):
- Detecta la producción de hidrógeno sulfurado por medio de la observación de un
precipitado negro en el medio.
- Realiza la prueba de producción de indol como en (e)
- Observa la movilidad del microorganismo, y realiza un examen macroscópico del medio
por una zona de desarrollo difuso que parte de la línea de inoculación.
e) Caldo peptonado: después del período de incubación:
- Agrega en zona 4 gotas del reactivo de Kovac´s, en cada tubo que presenta desarrollo
bacteriano, luego agitar suavemente.
- La reacción es positiva, si se forma un anillo de color rojo fucsia brillante en la zona
superior del tubo, pocos segundos después de haber agregado el reactivo y es negativa si
no hay cambio alguno.
f) Caldo MR –VP (reacción de Rojo de Metilo):
- Agrega 4 ó 5 gotas del indicador rojo de metilo a cada tubo, cuyo rango de viraje esta
entre pH 4.4 (ROJO) y 6.0 (AMARILLO).
- La prueba es positiva si se mantiene un color rojo estable y negativa si da una coloración
amarillo – naranja.
g) Caldo MR – VP (reacción de Voges – Proskauer): agregar a cada tubo:
- 10 a 12 gotas de la solución de alfa-naftol y 4 gotas de la solución de KOH – creatina.
- Agita después de agregar las soluciones por 1 minuto y deja en reposo durante 15
minutos.
- La reacción es positiva, si aparece una coloración rosada localizada en la mitad superior o
en todo el tubo dentro de los primeros 15 minutos (presencia de acetil-metil-carbinol) y
negativa, si el color inicial del medio de cultivo no cambia.
h) Agar Citrato:
- La prueba es positiva si observa crecimiento bacteriano y un color azul intenso del agar
en 24 a 48 horas y negativa si no hay crecimiento ni cambio de color.
Nota: para la lectura se recomienda hacer uso de las tablas de identificación
bioquímica que describen las reacciones de diagnóstico clave para identificar los géneros de
las bacterias entéricas
.
Reacción de la Citocromo
Oxidasa
- Con el asa de siembra en punta, picar el crecimiento del tubo con la cepa proporcionada,
y transferir el inóculo a una tira del reactivo de oxidasa.

- Considerara la prueba positiva cuando los cultivos dan una coloración azul violáceo
intensa en la tira, en un máximo de 5 segundos
2. Bacilos Gram negativos no Fermentadores. Grupo Pseudomonas

- Prepara frotices de la cepa del cultivo proporcionado y colorea por la tinción de Gram.
-
Inoculación en TSA
Primer día
- Siembra la cepa de Pseudomonas aeruginosa en TSA por el método de dispersión –
agotamiento.
Segundo día Observa las características de la colonia y presencia de pigmentación
- .
Inoculación en agar TSI
Primer día
- Con el asa de siembra, inocula en el centro del tubo y estría la superficie del pico de
flauta.
- Rotula e incuba a 37ºC por 24
horas. Segundo día
Realiza la lectura tal como se indica para las enterobacterias
.
Reacción de la Citocromo Oxidasa, proceder tal como se indica para las enterobacterias
Cultivo a 42ºC
Primer día
- Siembra la cepa de P. aeruginosa en los tubos de TSB por la técnica de inoculación.
Segundo día
- Observa la presencia o no de crecimientomicrobiano a 42 ºC, en los tubos
3. Oxidasa Positivo Grupo Vibrio
- Prepara frotices de la cepa del cultivo proporcionado y colorea por tinción de Gram.
-
Inoculación en agar TCBS (Tiosulfato – Citrato – Sales biliares –Sacarosa)
Primer día
- Divide la placa de TCBS por la mitad y sembrar en cada mitad las cepas de Vibrio por el
método de dispersión – agotamiento.
Segundo día
- Las colonias de Vibrio cholerae que desarrollan en TCBS son circulares, con el borde
ligeramente opaco, con un halo claro alrededor y son amarillas por que metabolizan la
sacarosa.
- Las colonias de Vibrio parahaemolyticus que desarrollan en TCBS son circulares,
pegajosas, con halo claro alrededor, y son de color verde porque no degradan la sacarosa
Inoculación en agar TSI

Primer día
- Con el asa de siembra, inocula en el centro del tubo y estría la superficie del pico de
flauta.
- Rotula e incuba a 37ºC por 24
horas.

Segundo día
Realiza la lectura tal como se indica para las enterobacterias.
Reacción de la Citocromo Oxidasa, proceder tal como se indica para las enterobacterias.
Prueba del filamento o “String Test”
- Deposita una gota de la solución de desoxicolato de sodio al 0.5% sobre una lamina
portaobjeto.
- Emulsiona en ella una colonia de V.cholerae o V. Parahaemolyticus con el asa de siembra.
- Detecta la presencia de filamento al levantar el asa
5 Resultados
Observar e interpretar los resultados obtenidos, identificando en cada caso la especie problema.
6 Cuestionario
Describa el fundamento de las pruebas realizadas
7 Fuentes de informacion
Koneman, E. W.; Allen, S. D.; Dowell Jr., V. R.; Janda, W. M.; Sommers, H. M.; Winn Jr, W. C.:
Color, Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. J. B. Lippincott Company. Third Edition.
Philadelphia, 1997.
2000
PRACTICA 6.- Lectura, interpretacion y discusión de los

resultados. Identificación de una muestra problema.
Redaccion y presentación de Informe de la practica.

VII. PRÁCTICA Nº 7.- TOMA DE MUESTRA Y ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DEL
AGUA CRITERIOS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS EN LA INDUSTRIA
FARMACÉUTICA. USP 38; CAP 1231.
Marco teórico
El agua se usa ampliamente como materia prima, ingrediente y disolvente en el procesamiento,
formulación y fabricación de productos farmacéuticos, ingredientes farmacéuticos activos
(API), productos intermedios, artículos farmacopeicos y reactivos analíticos.
Para asegurar el cumplimiento de determinadas normas de calidad microbiologica y química
mínimas, el agua usada en la producción de fármacos o la que usa como fuente de alimentación
para la preparación de distintos tipos de aguas purificadas debe cumplir los requisitos de las
reglamentaciones básicas relativas al agua potable (USP 38, CAP 1231).
3.2 Competencias
- Reconoce la importancia y adquiere destreza en la realización de controles microbiológicos
del agua.
- Aplica y experimenta la metodología existente para el análisis de agua en la industria
farmacéutica.
- Distingue los requerimientos de los tipos de agua en la industria farmacéutica.
3.3 Materiales y equipos
- Materiales
o 4 Frascos estériles x 500 mL con 0,5 mL de Tiosulfato de Sodio al 3%
o 4 Frascos x 500 mL con 300 mL de agua destilada estéril
o 4 Mecheros Bunsen
o 4 Mecheros de alcohol
o 8 Pipetas bacteriológicas de vidrio estériles x 10 mL con algodón
o 4 Equipos de filtración estériles (embudo y porta membrana) dos para agua potable y
otro dos para agua purificada
o 4 Bombas de vacío
o 4 Kitasatos estériles x 1 L
o 30 Membranas filtrantes de 0,45 μm de diámetro con cuadrículas, estériles
o 8 Pinzas estériles
o 10 Placas petri con agar recuento de placa (plate count) o agar de recuento de placa
de métodos estándar o TGYA.
o 4 Frascos con 100 mL de Agar Recuento de Placa (Plate Count) o Agar de Recuento de
Placa de Métodos Estándar o TGYA licuado
o 12 Pipetas estériles x 1 mL ó x 2 mL
o 24 Placas Petri estériles
o 4 Placas con Agar Mac Conckey.
o 4 Placas con Agar Cetrimide.
- Medios de Cultivo
o Agar de Recuento de Placa (plate count) o Agar de Recuento de Placa de Métodos
Estándar (TGYA): 4,125 g para 150 mL para 6 placas con medio solidificado.
o Agar de Recuento de Placa (plate count) o Agar de Recuento de Placa de Métodos
Estándar (TGYA) 2,35 g por cada 100 mL de medio licuado.
o Agar Mac Conckey, 8 g para 160 mL de medio.
o Agar Cetrimide, 7,2 g para 160 mL de medio.
3.4 Procedimiento
- Toma de muestra:
o Desinfectar el grifo o punto de salida del agua, flameando con un mechero de alcohol.

o Dejar correr 1 o 2 minutos el agua y proceder a la toma de muestra de 300 mL a 500
mL.
o Si se trata de aguas de cisterna o pozos, se sumergirá el frasco sin tapa, permitiendo
el ingreso del agua.
o Utilizar un frasco estéril de boca ancha con tapa rosca para la toma de muestra; si se
trata de agua potable el frasco deberá contener 1 mL de tiosulfato de sodio por cada
litro de agua muestreada (inactivando el cloro presente en el agua potable).
o La muestra debe tomarse con sumo cuidado evitando rozaduras y lo mas estéril como
sea posible, en el caso de agua potable o de cisterna.
o Procesar la muestra dentro de las dos primeras horas después de haber sido
recolectada y si no fuera posible se deberá mantener la muestra en refrigeración (2ºC
a 8ºC durante máximo 12 horas).
o Cerrar herméticamente el frasco y etiquetar.
- Recuento
o Rotular el material a utilizar.
o Volumen de muestra:
ƒ Vertido en Placa: 1,0 mL
Este método se aplica para agua potable.
ƒ Filtración por Membrana: 100 mL y 10 mL
Este método se aplica para agua destilada y agua potable; en el caso de agua
destilada se filtran volúmenes de 100 mL para cada medio a emplear (APC, MC, AC)
y en el caso de agua potable se filtran 10 mL también para cada medio (APC, MC,
AC).
o Medio de cultivo: Agar Recuento de Placa de Método Estándar o TGYA o Agar Plate
Count
o Condiciones de Incubación: 30ºC a 35ºC.
o Tiempo de incubación: 48 a 72 horas.
Método de Filtración por Membrana
à Método de Vertido en Placa
Fig. 3.1. Sistema de filtración:

Filtración por Membrana
Fig. 3.2. Siembra por
vertido en placa
3.5 Resultados
Registrar e interpretar los
resultados obtenidos.
3.6 Cuestionario
- Defina:
o Niveles de alerta
o Niveles de acción.
- Sustente el seguimiento microbiológico que aplica a los diferentes tipos de agua.
3.7 Fuentes de información

- Farmacopea de los Estados Unidos de América 32º Rev.–Formulario Nacional 27º Ed. (USP
32- NF 27).
- World Health Organization. WHO Technical Report Series, No. 929, Thirty-ninth report.
2005. Annex 3. WHO Good Manufacturing Practices: water for pharmaceutical use.

VIII. PRÁCTICA Nº 8.- TOMA DE MUESTRA Y ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE
AMBIENTES Y SUPERFICIES CRITERIOS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS EN
LA INDUSTRIA FARMACÉUTICA. USP 38; CAP 1116.
4.1 Marco teórico
Dado que los microorganismos se desarrollan en una amplia variedad de ambientes naturales,
es importante controlar su presencia, más aún cuando en la industria farmacéutica se llevan a
cabo procesamientos asépticos de fármacos a granel, formas farmacéuticas y en ciertos casos,
dispositivos médicos, además de la necesidad de la necesidad del establecimiento y control de
la calidad microbiológica de ambientes controlados (USP 38; CAP 1116).
4.2 Competencias
- Reconoce la importancia y adquiere destreza en la realización de controles
microbiológicos de los ambientes en la industria farmacéutica.
- Aplica y experimenta la metodología para la toma de muestra de ambientes y
superficies.
- Observa las especificaciones y requerimientos de los cuartos limpios y ambientes
controlados en la industria farmacéutica.
4.3 Materiales y Equipos
- Materiales:
o 4 Láminas de papel manteca estériles de dimensión A4, que en la parte central
presenten un recuadro recortado de 10 x 10 cm
o 4 Tubos de 30 x 20 mm conteniendo 10 hisopos estériles cada uno
o 12 Tubos estériles de 18 x 150 mm
o 20 Pipetas estériles x 1 ó 2 mL
o 1 Vortex
o 40 Placas Petri estériles descartables
o 4 Probetas estériles x 100 mL
o 4 Frascos de 100 mL de Agar Digerido de Caseína y Soja.
o 4 Frascos de 100 mL Agar Sabouraud Glucosado.
o 4 Tubos con 5 mL de Cloruro de Sodio al 0,9 %.
o 12 Placas Rodac con Agar Digerido de Caseína y Soja*.
o 16 Placas Petri con Agar Digerido de Caseína y Soja*.
- Medios de Cultivo y Reactivos:
o Agar Digerido de Caseína y Soja: 4 g por cada 100 mL de medio.
o Agar Sabouraud Glucosado: 6,5 g por cada 100 mL de medio.
o Cloruro de Sodio: 0,45 g de Cloruro de Sodio en 50 mL de agua destilada
4.4 Procedimiento
- Microorganismos Viables Transportados por el Aire:
o Placas de Sedimentación.
- Microorganismos Viables en Superficies:
o Placas de contacto Rodac (Replicate Organism Direct Agar Contact).
o Hisopado.
Fig. 4.1. Hisopos Fig. 4.2. Solución de enjuague

Fig. 4.3. Placas Rodac
- Control de ambientes
o Seleccionar el área del laboratorio para realizar el control ambiental.
o Colocar placas petri con Agar Digerido de Caseína de Soya (por duplicado cada
punto a monitorear) por espacio de 20 minutos como mínimo.
o Realizar el mismo procedimiento pero esta vez exponiendo placas petri con agar
Sabouraud Glucosado.
o Luego de la exposición, proceder a incubar:
o Las placas de Agar Digerido de Caseína de Soya a 30ºC a 35 oC, por dos días
o Las placas de Agar Sabouraud Glucosado a 20 ºC a 25 oC, por cinco días.
o Realizar las observaciones diarias de las placas para evidenciar el crecimiento
microbiano y reportar los resultados obtenidos.
o Realizar las observaciones al microscopio y reportar los resultados obtenidos:
o Para las bacterias realizar primero la coloración Gram.
o Para los hongos preparar láminas con hidróxido de potasio (KOH).
- Control de superficies
Seleccionar el método adecuado para los objetos asignados.
o Placas RODAC:
Aplicar la placa sobre la superficie a evaluar.
o Hisopado:
a. Embeber el hisopo en solución salina e hisopar según el tipo de superficie a
evaluar.
- Usando la plantilla con la superficie delimitada haciendo uso de las láminas
con el área de 10 x 10 cm. , haciéndolo primero en forma horizontal, luego
vertical, en diagonal de derecha a izquierda y después de izquierda a derecha.
- Hisopado directo.
b. Terminada la operación introducir el hisopo en un tubo que contiene 5 mL de
solución salina, rotular y agitar en un vortex por 1 minuto.
c. Tomar 1 mL y trasladarlo a una placa estéril para adicionarle 15 mL de agar
digerido de caseína y soja.
d. Incubar de 30º a 35ºC por 48 a 72 horas.
e. Reportar las observaciones y anotar los resultados obtenidos.
f. Realizar las observaciones al microscopio y reportar los resultados obtenidos:
i. Para las bacterias realizar primero la coloración Gram.
ii. Para los hongos preparar láminas con hidróxido de potasio (KOH).
4.5 Resultados
Registrar e interpretar los resultados obtenidos
4.6 Cuestionario
- ¿ En qué se basan las diferentes normativas que clasifican los ambientes controlados?
- ¿ Qué clase de ambientes requieren un constante monitoreo ambiental ?
Bibliografia
1.Farmacopea de los Estados Unidos de América USP Edición 38º –Formulario Nacional 33º Ed.
2.Farmacopea Británica 2016 (British Pharmacopoeia, 2016), 2016.
3.Farmacopea Europea Edición (European Pharmacopoeia, 8º Ed.), 2016.
Páginas Web
1.- http://www.usp.org/es/usp-nf
2.- https://www.edqm.eu/en/european-pharmacopoeia-8th-edition-1563.html
3.- https://www.pharmacopoeia.com/what-is-the-bp
4.- http://www.who.int/es/
6.- http://www.fip.org/

IX.- PRÁCTICA Nº 9.- PRUEBAS DE PROMOCIÓN DE CRECIMIENTO Y APTITUD DEL
MÉTODO PREVIO AL ANÁLISIS DE UN PRODUCTO FARMACÉUTICO NO ESTÉRIL:
LISTA DE CHEQUEO Y EJECUCIÓN. USP 38; CAP 61; 62.
5.1 Marco teórico

El examen microbiológico de productos farmacéuticos no estériles incluye en primera instancia
las pruebas de recuento cuantitativo de bacterias mesófilas y hongos que pueden desarrollarse
en condiciones aeróbicas.
Si los productos a examinar poseen actividad antimicrobiana, ésta deberá eliminarse o
neutralizarse para lo cual los inactivadores deberán ser de probada eficacia además de ser
inocuos para los probables microorganismos contaminantes.
Previo al análisis deberán realizarse la prueba de promoción de crecimiento y la prueba de
aptitud del método de recuento, ésta última será definida según la naturaleza del producto y
el límite de microorganismos requerido (USP 38: <61>, <62>).
5.2 Competencias
- Reconoce la necesidad de ejecutar procedimientos previos a las pruebas
microbiológicas de recuento en productos no estériles.
- Aplica y experimenta la metodología para las pruebas de promoción de crecimiento y
de aptitud de los métodos de recuento microbiano.
5.3 Material y Equipos
- Materiales
o 35 Tubos con 10 mL de Buffer pH 7,2 (volumen total 350 mL).
o 15 Tubos con 10 mL de Buffer pH 7,2 (volumen total 350 mL) más Polisorbato al
0,05%
o 88 Placas Petri estériles
o 5 Pipetas de 0,1 ó 1,0 mL
o Gradillas
o 15 Espátulas de Drigalsky estériles
o 24 Pipetas de 2,0 mL
o 12 Placas con Agar Manitol Salado
o 12 Placas con Agar Cetrimide
o 12 Placas con Agar Sabouraud
o 4 Frascos con 100 mL de Agar Digerido de Caseína y Soja
o 4 Frascos con 100 mL de Agar Manitol Salado
o 4 Frascos con 100 mL de Agar Cetrimide
o 4 Frascos con 100 mL de Agar Sabouraud
o 8 Tubos com 9 mL de Caldo Agar Digerido de Caseína y Soja
o 4 Tubos com 9 mL de Caldo Sabouraud
- Medios de Cultivo y Reactivos:
o Fosfato monobásico de potasio
o Agar Manitol Salado
o Agar Cetrimide
o Agar Sabouraud
o Agar Digerido de Caseína y Soja
o Agar Cetrimide
o Agar Sabouraud Glucosado
o Caldo Digerido de Caseína y Soja
o Caldo Sabouraud
- Cepas de estudio:

o 4 Cultivos puros de Aspergillus niger en Agar Sabouraud (agar inclinado), de por lo
menos 5 a 7 días.
o 4 Cultivos puros de Staphylococcus aureus en Agar Casoy (agar inclinado), de por lo
menos 24 horas antes de la práctica.
o 4 Cultivos puros de Pseudomonas aeruginosa en Agar Casoy (agar inclinado), de por
lo menos 24 horas antes de la práctica.
5.4 Procedimiento
Para la prueba de promoción del crecimiento de los medios se emplearán los métodos de:
Vertido en placa, Extensión en superficie e Inoculación Directa utilizando:
a. Agar Digerido de Caseína y Soja.
b. Agar Saboureaud Dextrosa.
c. Agar Cetrimide.
d. Agar manitol salado.
e. Caldo Digerido de Caseína y Soja.
- Promoción del Crecimiento de los Medios (Medio más inóculo)
o Inocular los medios con no más de 100 ufc de los siguientes microorganismos.
- Staphylococcus aureus (ATCC 6538) o ambiental, Pseudomonas aeruginosa (ATCC
9027) o ambiental, para los medios medios (a) y (b).
o Inocular los medios con no más de 100 ufc de los siguientes microorganismos.
- Aspergillus niger (ATCC 16404) o ambiental, para el medio (d).
o Incubar de 30ºC a 35ºC por tres días para el caso de las bacterias y de 20ºC a 25ºC
por 5 días para el caso de hongos.
o Reportar los resultados obtenidos teniendo en consideración que el resultado no
debe diferir en un factor mayor que 2 a partir del valor calculado en medios sólidos.
- Método de Vertido en Placa (véase figura 3.2.):
o Agregar 1 mL de la suspensión (inóculo de 100 ufc) y 15 a 20 mL de los medios
sólidos adecuado según sea el caso, manteniendo la temperatura de a no más de
45ºC.
o Incubar según se indicó anteriormente.
o Realizar el recuento y reportar la media aritmética del número de ufc obtenido en
cada medio.
o Contrastarlo con el número de ufc del inóculo original.
- - Método de Extensión en Superficie:
o Esparcir un volumen de 0,1 mL de suspensión (inóculo de 100 ufc) en las placas que
contienen los medios según sea el caso.
o Incubar según se indicó anteriormente.
o Realizar el recuento y reportar la media aritmética del número de ufc obtenido en
cada medio
o Contrastarlo con el número de ufc del inóculo original.
Fig. 5.1. Siembra en Superficie

- Inoculación Directa:
o Agregar un inóculo de suspensión bacteriana correspondiente equivalente a 100 ufc,
al caldo específico.
Tabla 5.2. Preparación de las Cepas para las Pruebas de de Promoción de Crecimiento y
Aptitud del Método de Recuento e Presencia del Producto
Aptitud del Método de Recuento en
Promoción de Crecimiento
Microorganismos Preparación de Presencia del Producto
Cepas
RTMA RTCHL RTMA RTCHL
ADCS o CDCS
ADCS o CDCS
ADCS o CDCS (NMP)
≤ 100 ufc
S. aureus 30 – 35ºC ≤ 100 ufc
30 – 35ºC 30 – 25ºC
18 – 24 h
≤ 3d ≤ 3d
ADCS o CDCS
ADCS o CDCS
ADCS o CDCS (NMP)
30 – 35ºC ≤ 100 ufc
P. aeruginosa 30 – 35ºC
≤ 100 ufc
18 – 24 h 30 – 25ºC
≤ 3d
≤ 3d
ADCS o CDCS
ADCS o CDCS
ADCS o CDCS (NMP)
≤ 100 ufc
B. subtilis 30 – 35ºC
30 – 35ºC
≤ 100 ufc
18 – 24 h 30 – 25ºC
≤ 3d
≤ 3d
ADCS A. SAB ADCS SAB
A. SAB o C.SAB
≤ 100 ufc ≤ 100 ufc ≤ 100 ufc ≤ 100 ufc
C. albicans 20 – 25ºC
30 – 35ºC 20 – 25ºC 20 – 25ºC 20 – 25ºC
2–3d
≤ 5d ≤ 5d ≤ 5d ≤ 5d
ADCS A. SAB ADCS SAB
A. SAB o PDA
≤ 100 ufc ≤ 100 ufc ≤ 100 ufc ≤ 100 ufc
A. niger 20 – 25ºC
30 – 35ºC 20 – 25ºC 20 – 25ºC 20 – 25ºC
5–7d
≤ 5d ≤ 5d ≤ 5d ≤ 5d
5.5
Resultados
Emisión de reporte final.
5.6 Cuestionario
- ¿ Cuál es la finalidad para la aplicación de los diferentes métodos de recuperación de
microorganismos ?
- De no contar con suficiente material de vidrio para la ejecución de las pruebas de
promoción de crecimiento ¿a qué microorganismos se restringiría esta prueba
preliminar?
Bibliografia
Páginas Web

X. PRÁCTICA Nº 10.- ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE FORMAS FARMACEUTICAS
NO ESTERILES: SÓLIDAS Y LIQUIDAS. VALIDACIÓN DEL MÉTODO. USP 38 CAP
61; CAP 62.
Marco teórico
El análisis microbiológico de estas formas farmacéuticas incluye pruebas que permiten calcular el
número de microorganismos aeróbicos viables y el número de hongos filamentosos y levaduras
presentes, así como determinar la ausencia de especies microbianas patógenas consideradas
como indicadores de contaminación (USP 38: CAP 61; CAP 62).
6.2 Competencias
- Reconoce la importancia de comprobar la aptitud de los métodos de análisis: recuento y

pruebas de microorganismos específicos.
- Aplica y experimenta la metodología para las pruebas de microorganismos específicos de
una forma farmacéutica sólida oral y liquida.

- Materiales
o 24 Tubos x 9 mL de Buffer pH 7,2
o 12 Tubos con 9 mL de Caldo Mossel
o 12 Frascos de 250 mL, con 90 mL de Buffer pH 7,2
o 8 Frascos de 250 mL, con 100 mL de Buffer pH 7,2
o 4 Frascos con 200 mL de Agar Digerido de Caseína y Soja
o 4 Frascos con 200 mL de Agar Sabouraud Dextrosa.
o 4 Frascos con 90 mL de Caldo Mossel.
o 16 Frascos con 90 mL de Caldo Digerido de Caseína y Soja
o 4 Frascos con 100 mL de Caldo Mac Conckey
o 4 Frascos con 100 mL de Caldo Rappaport Vassiliadis.
o 12 Placas con Agar Manitol Salado
o 4 Placas con Agar Cetrimide
o 16 Placas con Agar Violeta Rojo Bilis.
o 32 Pipetas de 1 mL, ó 2mL
o 12 Pipetas de 10 mL.
o 1 Baño María a 22,5 ºC
o 20 Pipetas de 5 mL.
o 4 Asas de siembra
- Medios de Cultivo y Reactivos
o Buffer pH 7,2
o Caldo Mossel
o Agar Sabouraud Glucosado
o Caldo Mossel
o Caldo Mac Conckey
o Caldo Rappaport Vassiliadis.
o Agar Cetrimide
o Agar Violeta Rojo Bilis
- Cepas de estudio:

o Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa, cultivo de 24 horas en Agar Digerido
de Caseína y Soja en solución amortiguada de fosfato monobásico de potasio de pH 7,2
que permitan obtener inóculos de 100 ufc.
o Aspergillus niger, cultivo en solución amortiguada de fosfato monobásico de potasio más
0,05 % de polisorbato 80, de pH 7,2 de 5 días que permita obtener inóculos de 100 ufc.
6.4. Procedimiento
6.4.1.Criterios a aplicar según la solubilidad de las muestras:
Proceder a preparar las muestras a analizar para cada una de las siguientes pruebas según los
criterios que se describen:
a. Productos solubles en agua: Dilución 1 en 10 (o adicionales de ser necesario) del producto a
examinar (ajustando el pH de 6 a 8, de ser necesario), en:
- Solución Amortiguada de Cloruro de Sodio-Peptona de pH 7,0
- Solución Amortiguada de Fosfato de pH 7,2
- Caldo Digerido de Caseína y Soja
b. Productos no grasos insolubles en agua: Ídem al anterior; puede añadirse un tensoactivo (1
g por L de polisorbato 80).
Fig. 6.1. Dilución de

la muestra a evaluar
6.4.2. Pruebas de Verificación de Propiedades de Promoción de Crecimiento e Inhibitorias de

los Medios
Analizar cada preparación de medio verificando las propiedades promoción de crecimiento de
los medios en general, así como las propiedades inhibitorias específicas y las propiedades
indicadoras de los medios selectivos y diferenciales, según sea el caso (véase tabla 6.1.a. y b.).
Tabla 6.1.a. Propiedades de Promoción de Crecimiento, Inhibitorias e Indicadoras de los Medios
Prueba Medio Propiedad Cepa
Prom. de crecimiento E. Coli / P. aeruginosa
Bacterias Gram- Negativas C. Moss
Inhibitoria S. aureus
tolerantes a la Bilis
VRB Prom. Crecim + Indic. E. Coli / P. aeruginosa
Prom. De crecimiento E. coli
C.Mc
Escherichi coli Inhibitoria S. aureus
MC Prom. Crecim + Indic. E. coli
Tabla 6.1.b. Propiedades de Promoción de Crecimiento, Inhibitorias e Indicadoras de los Medios

Prueba Medio Propiedad Cepa
Prom. de crecimiento S. typhimurium
CRV
Inhibitoria S. aureus
Salmonella
Prom. Crecim + Indic. S. typhimurium
XLD
Indicadora E. coli
Prom. de crecimiento P. aeruginosa
Pseudomona aeruginosa CT
Inhibitoria E. coli
Prom. Crecim + Indic. S. aureus
Staphylococcus aureus Mn
Inhibitoria E. coli
C.Ref Prom. de crecimiento Cl. sporogenes
Clostridios
A.Col Prom. de crecimiento Cl. sporogenes
C.Sab Prom. de crecimiento C. albicans
Candida albicans
SAB Prom. Crecim + Indic. C. albicans

6.5. Pruebas de Aptitud de los Métodos de Recuento y de Microorganismos Específicos:
Para cada producto nuevo a analizar, realizar una preparación de la muestra de 1 en 10, al
momento de la mezcla, agregar cada cepa de prueba en el medio indicado en una cantidad de
no más de 100 ufc (medio más producto a analizar y más inóculo).
Realizar la prueba según se indica en el período más corto de incubación; cualquier actividad
antimicrobiana, requiere de la neutralización correspondiente.
A. Aptitud del Método de Recuento
a. Inoculación y dilución: Agregar a las muestras de productos preparadas y a un control (sin
producto), un volumen de suspensión microbiana para obtener un inóculo de 100 ufc.
b. Recuperación de microorganismos en presencia de producto:
Filtración por Membrana (véase figura 3.1.):
- Transferir una cantidad que represente 1 g del producto al filtro de membrana con un
volumen adecuado de diluyente.
- Transferir el filtro de membrana a la superficie del Agar Digerido de Caseína y Soja
para determinar el recuento total de microorganismos aerobios (RTMA).
- Transferir el filtro de membrana a la superficie del Agar Saboureaud Dextrosa para
determinar el recuento total combinado de hongos filamentosos y levaduras (RTCHL).
- Incubar.
- Realizar el recuento y reportar.
Recuento en Placa:
Trabajar por duplicado cada medio y usar el recuento medio del resultado.
- Método de Vertido en Placa (véase figura 3.2.):
ƒ Agregar 1 mL de la muestra preparada y 15 a 20 mL de los medios sólidos, Agar
Digerido de Caseína y Soja, y,
ƒ Agar Saboureaud Dextrosa según sea el caso, manteniendo la temperatura de
ambos medios a no más de 45ºC.
ƒ Incubar según se indica en 5.1.c.
ƒ Realizar el recuento y reportar la media aritmética del número de ufc obtenido
en cada medio
ƒ Contrastarlo con el número de ufc del inóculo original.
Método de Extensión en Superficie:
- Agregar de 15 a 20 mL de los medios sólidos, Agar Digerido de Caseína y Soja, y,
Agar Sabouraud Dextrosa según sea el caso, mantenidos a la temperatura de no más
de 45ºC, a cada placa.
ƒ Dejar solidificar.
ƒ Esparcir un volumen de 0,1 mL de la muestra preparada.
ƒ Incubar.
ƒ Realizar el recuento y reportar la media aritmética del número de ufc obtenido
en cada medio
ƒ Contrastarlo con el número de ufc del inóculo original.
c. Neutralización/Eliminación de la actividad Antimicrobiana:
- Comparar el número de microorganismos recuperados a partir de la muestra
preparada y diluida versus el número de microorganismos recuperados a partir de la
muestra control.
- Si se inhibe el crecimiento en un factor mayor a 2 modificar el procedimiento según
se indica a continuación:
i. Aumentando el volumen del diluyente o medio de cultivo.
ii. Incorporando agentes neutralizantes generales o específicos en el diluyente.
iii. Filtración por membrana.
iv. Una combinación de todos los anteriores.
B. Aptitud de los métodos para las pruebas de microorganismos específicos.
a. Bacterias Gram –Negativas Tolerantes a la bilis (véase Fig. 6.2.a).
Preparar las muestras e inocularlas, usando como diluyente Caldo Digerido de Caseína y
Soja. Mezclar e incubar a 20º - 25ºC por 2 horas (suficiente para resucitar bacterias),
pero no más de 5 horas.
- Prueba de Ausencia: usar un volumen correspondiente a 1 g del producto e inocular
Caldo Mossel para enriquecimiento de Enterobacterias: incubar de 30º a 35ºC, durante

24-48 horas. Subcultivar en Agar Violeta Rojo Bilis Glucosa; incubar de 30º a 35ºC
durante 18-24 horas. El producto cumple con la prueba si no se desarrollan colonias.
- Prueba Cuantitativa: inocular Caldo Mossel para enriquecimiento de Enterobacterias
con preparaciones que contengan 0,1 0,01 g y 0,001 g ó mL de la muestra a evaluar;
incubar a 30º - 35ºC durante 18-24 horas. El producto cumple con la prueba si no se
desarrollan colonias; indicar la menor cantidad de producto que produce resultado
positivo y la mayor cantidad de producto que produce resultado negativo(véase Tabla
6.2.a.).
Tabla 6.2. Interpretación de Resultados en la Prueba Cuantitativa de
Bacterias Gram Negativas Tolerantes a la Bilis
Cantidad probable de
Resultados para cada cantidad del producto bacterias
0,1 g ó mL 0,01 g ó mL 0,001 g ó mL (por g o mL del producto)
+ + + Más de 103
+ + - Menos de 103 y más de 102
+ - - Menos de 102 y más de 10
- - - Menos de 10
CDCS (90mL)
10 g ó 10mL
20 – 25ºC
2–5h
10mL 0,1 g. o mL 0,1 g. o mL 0,1 g. o mL.
Caldo Mossel
(100mL)
Caldo Mossel (10mL)

30 – 35ºC
24 – 48 h
VRB VRB
30 – 35ºC 30 – 35ºC
24 – 48 h 24 – 48 h
Fig. 6.2.a. Bacterias Gram
Prueba de Ausencia Negativas Tolerantes a a la Prueba Cuantitativa
Bilis

b. Salmonella: Preparar las muestras e inocularlas, usando como diluyente Caldo Digerido de
Caseína y Soja; usar no menos de 10 g ó 10 mL para inocular Caldo Digerido de Caseína y
Soja, mezclar e incubar de 30º a 35ºC durante 18-24 horas. Agitar y transferir 1 mL a 100 mL
de Caldo Digerido de Caseína y Soja e incubar a de 30º a 35ºC durante 18-24 horas. Transferir
0,1 mL a 10 mL de Caldo Rappaport Vassiliadis para Enriquecimiento de Salmonella, e incubar
a 30º - 35º C, durante 18-24 horas. Subcultivar en una placa de Agar Xilosa Lisina
Desoxicolato. Incubar a una temperatura de 30º-35ºC por 18-48 horas (véase Fig. 6.2.b.).
El crecimiento de colonias color rojo (con o sin centro negro) indica posible presencia de
Salmonella, lo cual debe confirmarse con pruebas de identificación.
CDCS (90mL)
10g o 10mL
30 – 35ºC
18 – 24 h
0,1mL
Caldo Rappaport –
Vassiliadis (10mL)
30 – 35ºC
18 – 24 h
XLD
30 – 35ºC
18 – 48 h
Fig. 6.2.b. Samonella sp.
c. Escherichia coli: Preparar las muestras e inocularlas, usando como diluyente Caldo Digerido de
Caseína y Soja; usar 1 g ó 1 mL para inocular Caldo Digerido de Caseína y Soja, mezclar e
incubar de 30º a 35ºC durante 18-24 horas. Agitar y transferir 1 mL a 100 mL de Caldo Mac
Conckey e incubar a 42º - 44º C, durante 24-48 horas. Subcultivar en una placa de Agar Mac
conckey a 30º-35ºC por 18-72 horas.
El crecimiento de colonias indica posible presencia de E. coli, lo cual debe confirmarse con
pruebas de identificación (véase Fig. 6.2.c-e.).
d. Pseudomonas aeruginosa: Preparar las muestras e inocularlas, usando como diluyente Caldo
Digerido de Caseína y Soja; usar 1 g ó 1 mL para inocular Caldo Digerido de Caseína y Soja,
mezclar e incubar de 30º a 35ºC durante 18-24 horas. Agitar y transferir 1 mL a 100 mL de
Caldo Digerido de Caseína y Soja e incubar a de 30º a 35ºC durante 18-24 horas. Subcultivar
en una placa de Agar Cetrimide. Incubar a una temperatura de 30º-35ºC por 18-72 horas.

El crecimiento de colonias indica posible presencia de Ps. aeruginosa, lo cual debe
confirmarse con pruebas de identificación (véase Fig. 6.2.c-e.).
Fig. 6.2.c-e. Escherichia coli; Pseudomonas aeruginosa; Staphylococcus; Clostridium sp.y Candida albicans
Dilución 1/10
Diluyente (90mL)
10mL 10mL
10mL
CDCS 80ºC
(100mL) 10 min Caldo SAB
(100mL)
30 – 35ºC
18 - 24 h 30 – 35ºC
3-5d
C.T. Mn. Caldo Ref. Caldo Ref. SAB.

Caldo MC (100mL) (100mL)
(100mL)
30 – 35ºC 30 – 35ºC Anaerobiosis

18 - 72 h 18 - 72 h 30 – 35ºC
42 – 44ºC 48 h 30 – 35ºC
24 - 48 h 24 – 48 h
Pseudomonas Staphylococcus
aeruginosa aureus A.Col. A.Col. Candida albicans
30 – 35ºC
18 - 72 h
Anaerobiosis
M.C. 30 – 35ºC
Escherichia coli 48 h
Clostridium sp.
e. Staphylococcus aureus: Preparar las muestras e inocularlas, usando como diluyente Caldo
Digerido de Caseína y Soja; usar 1 g ó 1 mL para inocular Caldo Digerido de Caseína y Soja,
mezclar e incubar de 30º a 35ºC durante 18-24 horas. Agitar y transferir 1 mL a 100 mL de
Caldo Digerido de Caseína y Soja e incubar a de 30º a 35ºC durante 18-24 horas. Subcultivar
en una placa de Agar Cetrimide. Incubar a una temperatura de 30º-35ºC por 18-72 horas.
El crecimiento de colonias color amarillo, o blanco rodeado de amarillo indica posible
presencia de Staphylococcus aureus, lo cual debe confirmarse con pruebas de identificación
(véase Fig. 6.2.c-e.).
6.4.4. Prueba de Producto:
Proceder de la misma forma que en A. y B. pero sin inóculo.
6.5 Resultados
6.6 Cuestionario
- Si se trata de realizar el examen microbiológico de un antibiótico, explique las operaciones
preliminares y fundamente su respuesta.
- De no contar con suficiente material de vidrio para la ejecución de todos las pruebas
preliminares ¿Qué haría? ¿Obviaría alguna de ellas? ¿Procedería a la ejecución de todas
consecutivamente? Si es así ¿En qué orden procedería ? Fundamente su respuesta.
Bibliografia
XI. PRÁCTICA Nº 11.- PRUEBAS DE APTITUD DEL MEDIO PREVIO AL ANÁLISIS DE

UN PRODUCTO FARMACÉUTICO ESTÉRIL. VALIDACION DEL METODO.
USP 38 CAP 71.

8.1 Marco teórico
Estos procedimientos farmacopeicos no se han diseñado para garantizar que una partida de un
producto es estéril o ha sido esterilizada. Esta garantía se consigue principalmente mediante la
validación del proceso de esterilización o de los procedimientos del procesamiento aséptico.
La prueba se aplica a sustancias, preparaciones o artículos cuya esterilidad es requerida por la
Farmacopea. Sin embargo, un resultado satisfactorio únicamente indica que no se han encontrado
microorganismos contaminantes en la muestra examinada bajo las condiciones de la prueba.
La prueba de esterilidad se lleva a cabo bajo condiciones asépticas, por lo que, para lograr tales
condiciones, el entorno de la prueba debe adaptarse a la manera en que ésta se realice. Las
precauciones para evitar la contaminación se deben tomar de modo tal que no se afecte a ningún
microorganismo que deba detectarse en esta prueba. Las condiciones de trabajo en la que se
efectúan las pruebas se monitorean regularmente mediante el muestreo adecuado del área de
trabajo y la realización de controles apropiados. (véase USP 38: <71> Pruebas de Esterilidad).
8.2 Competencias
- Aplica y experimenta la metodología de l c o n t r o l d e e s t e r i l i d a d de una forma

farmacéutica esteril.
- Reconoce las diferencias en la metodología para el análisis microbiológico de formas
farmacéuticas esteriles.
o 12 Tubos con 10 mL de Buffer, pH 7,2
o Tubos con 10 mL de Buffer, pH 7,2, más Polisorbato
o Frascos con 150 mL de Agar Digerido de Caseína y Soja
o Frascos con 100 mL de Agar Sabouraud Dextrosa
o 21 Pipetas de 0,1 y 1 ,0 mL estériles
o Kitasatos estériles de 1 L
o Equipos de filtración estériles
o Pinzas estériles
o Membranas filtrantes estériles
o Balanzas
o Jeringas de 20 mL descartables estériles
o 18 Frascos con 100 mL de peptona pH 7,1
o Frascos con 100 mL de Medio Tioglicolato Líquido
o Frascos con 100 mL de Caldo Digerido de Caseína y Soja
o Cultivos puros de Aspergillus niger en Agar Sabouraud (agar inclinado), de por lo menos 5
a 7 días.
o Cultivos puros de Staphylococcus aureus en Agar Casoy (agar inclinado), de por lo menos
24 horas antes de la práctica.
Microorganismo Incubación
Medio de Cultivo
Especie Cepa ATCC T° Tiempo
S. aureus
Caldo Tioglicolato C. sporogenes 19404 30–35°C 3 días
P. aeruginosa
6538
Caldo Casoy B. subtillis 6633 30–35°C 3 días
9027
B. subtillis
10231
Caldo Casoy C. albicans 20–25 °C 5 días
16404
A. niger

7.4 Procedimiento
7.4.1. Pruebas de Verificación de las Propiedades de Promoción de Crecimiento e Inhibitorias de
los Medios y Aptitud de las Pruebas de Recuento y de Microorganismos Específicos
Proceder para las siguientes pruebas según se muestra en el texto correspondiente de la
practica Nº 6.
Proceder de la misma forma que en 1.4.1. pero sin inóculo.
practica Nº 6.
7.5 Resultados
Emisión de reporte final e interpretacion de los resultados.

7.6 Cuestionario
- Describa los criterios a tener en cuenta en la prueba de promoción de crecimiento de
microorganismos aerobios, anaerobios y hongos.
Bibliografia
Páginas Web

XII.-PRÁCTICA Nº 12.- ANÁLISIS DE UN PRODUCTO FARMACÉUTICO ESTÉRIL
VALIDACIÓN DEL MÉTODO POR TRANSFERENCIA DIRECTA Y FILTRACION POR
MEMBRANA. USP 38 CAP 71.
Marco teórico
Estos procedimientos farmacopeicos no se han diseñado para garantizar que una partida de un
producto es estéril o ha sido esterilizada. Esta garantía se consigue principalmente mediante la
validación del proceso de esterilización o de los procedimientos del procesamiento aséptico.
La prueba se aplica a sustancias, preparaciones o artículos cuya esterilidad es requerida por la
Farmacopea. Sin embargo, un resultado satisfactorio únicamente indica que no se han encontrado
microorganismos contaminantes en la muestra examinada bajo las condiciones de la prueba.
La prueba de esterilidad se lleva a cabo bajo condiciones asépticas, por lo que, para lograr tales
condiciones, el entorno de la prueba debe adaptarse a la manera en que ésta se realice. Las
precauciones para evitar la contaminación se deben tomar de modo tal que no se afecte a ningún
microorganismo que deba detectarse en esta prueba. Las condiciones de trabajo en la que se
efectúan las pruebas se monitorean regularmente mediante el muestreo adecuado del área de
trabajo y la realización de controles apropiados. (USP 38; CAP 71. Pruebas de Esterilidad).
Competencias
- Aplica y experimenta la metodología del control de esterilidad de una forma farmacéutica esteril.
-Reconoce las diferencias en la metodología para el análisis microbiológico de formas farmacéuticas
esteriles.

o 4 Kitasatos estériles de 1 L
o 4 Equipos de filtración estériles
o 8 Pinzas estériles
o 6 Membranas filtrantes estériles
o 1 Bomba de vacío
o 8 Jeringas de 20 mL descartables estériles
o 12 Frascos con 100 mL de peptona pH 7,1
o 8 Frascos con 100 mL de Medio Tioglicolato Líquido
Resultados
Emisión de reporte final e interpretación de los resultados.
Cuestionario
- Describa la composición de los medios de cultivo empleados en la prueba de esterilidad e

indique la función de cada ingrediente.

PROCEDIMIENTO
PRUEBA DE ESTERILIDAD:
Método de Transferencia Directa
Limpiar la superficie de
las envolturas que
contienen las muestras
con alcohol al 70% y
abrirlas cuidadosamente
con tijeras estériles
Transferir las muestras a un
frasco que contenga
Con ayuda de 1000 mL de caldo thioglicolato y
pinzas estériles a otro frasco que contenga 1000
mL de caldo tripticase soya
Caldo tioglicolato,
Llevar a a 20 a 25ºC
incubar por 14
dí as: Caldo tripticase
soya a 30 a 35ºC
Presencia de Ausencia de
crecimiento: el crecimiento: el
producto no cumple producto cumple
con los con los
requerimientos de la requerimientos de
pr ueba la prueba

ANÁLISIS DE UN PRODUCTOS FARMACÉUTICO ESTÉRIL Y VALIDACIÓN DEL MÉTODO
FILTRACIÓN POR MEMBRANA: SOLUCIÓN INYECTABLE
Material y Equipos
o 3 Balanzas
o 4 Cultivos puros de Aspergillus niger en Agar Sabouraud (agar inclinado), de por lo menos
5 a 7 días.
o 4 Cultivos puros de Staphylococcus aureus en Agar Casoy (agar inclinado), de por lo menos
24 horas antes de la práctica.
PROCEDIMIENTO
PRUEBA DE ESTERILIDAD:
Método de Filtración por Membrana
Limpiar la Transferir el contenido de las muestras a

superficie de las través la unidad de filtración estéril (con
ampollas con la membrana filtrante de δ:47 mm y
alcohol al 70% poro: 0,45 μ.
Tomar el
contenido de las Enjuagar la membrana con
ampollas con una agua peptonada
jeringa estéril
Una mitad a 100

mL de caldo
tripticase soya,
Desmontar el equipo incubar a 20 a 25ºC
asépticamente y con pinzas
estériles tomar la membrana Incubar por 14
cortarla y transferir: días a...
30 a 35ºC
La otra mitad a
100 mL de caldo
thioglicolato
Resultados.- Reporte e interpretacion de resultados

Cuestionario
- Que criterios y características deben tener los medios de cultivo para el control de
esterilidad de suspensiones acuosas de antibióticos.
Bibliografia

XIII.-PRÁCTICA Nº 13.- SEMINARIO DE INVESTIGACION: PRUEBA DE ENDOTOXINAS
BACTERIANAS
OPERACIONES PREPARATORIAS, CÁLCULOS PARA HALLAR EL MVD: LISTA DE
CHEQUEO DETERMINACIÓN DE LOS LÍMITES DE ENDOTOXINAS PARA ARTÍCULOS
NO FARMACOPEICOS
Marco teórico
La Prueba de Endotoxinas Bacterianas {PEB) es una prueba para detectar o cuantificar endotoxinas de
bacterias gramnegativas usando un lisado de amebocitos del cangrejo herradura (Umulus polyphemus
o Tachypleus tridentatus).
Hay tres técnicas para esta prueba: la técnica de coagulación (gel-clot), la cual está basada en la
formación de gel; la técnica turbidimétrica, basada en la producción de turbidez después de la
ruptura de uniones de un sustrato endógeno; y la técnica cromogénica que se basa en el desarrollo de
color después de la ruptura de un complejo sintético péptido-cromógeno. Efec• tuar la prueba con
cualquiera de las tres técnicas. En caso de duda o controversia, la decisión final se toma basándose
en la prueba de límite de coagulación, a menos que se indique algo diferente en la monografía del
producto en análisis. La prueba se efectúa de forma tal que se evite la contaminación por
endotoxinas.
Consiste en verificar si el Reactivo de Lisado de Amebocitos (LAL) tiene la sensibilidad
etiquetada y/o se encuentra dentro de los rangos aceptables (0,5 lambda a 2 lambda).
Para esto, se enfrentan diferentes concentraciones de un Control Estándar de Endotoxinas con el
reactivo de LAL. Se reconstituye el Control de Endotoxinas (5 000 EU/vial) con 5 mL de agua
apirógena certificada, homogenizándola en un vortex por 30 minutos.
Usando micropipetas calibradas y tubos despirogenados, se hacen diluciones en forma aséptica hasta
obtener concentraciones de endotoxina de: 2 λ, λ, 0,5 λ, 0,25 λ, las cuales son
equivalentes a:
Spike*: 0,6 UE/ mL
2 λ: 0,06 UE/ mL
λ: 0,03 UE/ mL
0,5 λ: 0,015 UE/ mL
0,25 λ: 0,0075 UE/ mL
Competencias
- Aplica y experimenta la metodología para las pruebas de Endotoxinas bacterianas

- Reconoce las diferencias en la metodología para el análisis microbiológico d e
endotoxinas bacterianas.
Material y Equipos
o 2 Baño María a 37ºC
o 4 Gradillas para 40 tubos de 10 mm x 100 mm
o 4 Gradillas para tubos de 18 x 150 mm
o 4 Cronómetros
o 4 Termómetros
o 4 Micropipetas de 100 uL (Eppendorf)
o 4 Agitadores Vortex
o 8 Paquetes de 50 tubos cada uno apirógenos de 10 x 75 mm
o 4 Cajas de tips apirógenos de 5 a 100 uL
o 1 Caja de tiras indicadoras de pH
o 50 Tubos de 18 x 150 mm despirogenizados con tapas de acero (180ºC x 3 horas) envueltas
en paquetes de 8 tubos con papel aluminio.
o 10 Pipetas de 10 mL despirogenizadas a 180ºC x 3 horas con papel aluminio.
o 20 Pipetas de 1 a 2 mL despirogenizadas a 180ºC x 3 horas con papel aluminio.

o 1 Frasco de control estándar de endotoxina
o 8 Frascos del reactivo Lisado de Amebocitos de Limulus
o 8 Frascos de agua LAL
11.4 Procedimiento
11.4.1. Pruebas de Verificación de las Propiedades de Promoción de Crecimiento e Inhibitorias de
los Medios y Aptitud de las Pruebas de Recuento y de Microorganismos Específicos
practica Nº 6.
Proceder de la misma forma que en 1.4.1. pero sin inóculo.
practica Nº 6.
11.5 Resultados

11.6 Cuestionario
- Describir el fundamento de cada una de las técnicas de la Prueba de Endotoxinas
Bacterianas
Bibliografia
Páginas Web

PRUEBA DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS Y PRESENTACIÓN DE UNA MATRIZ QUE
INCLUYE TODAS LAS ACTIVIDADES INVOLUCRADAS. USP 39 CAP 85.
Marco teórico
La Prueba de Endotoxinas Bacterianas (PEB) es una prueba para detectar o cuantificar endotoxinas de
bacterias gramnegativas usando un lisado de amebocitos del cangrejo herradura (Umulus polyphemus
o Tachypleus tridentatus). (USP 38 CAP 85).
Hay tres técnicas para esta prueba: la técnica de coagulación (gel-clot), la cual está basada en la
formación de gel; la técnica turbidimétrica, basada en la producción de turbidez después de la
ruptura de uniones de un sustrato endógeno; y la técnica cromogénica que se basa en el desarrollo de
color después de la ruptura de un complejo sintético péptido-cromógeno. Efec• tuar la prueba con
cualquiera de las tres técnicas. En caso de duda o controversia, la decisión final se toma basándose
en la prueba de límite de coagulación, a menos que se indique algo diferente en la monografía del
producto en análisis. La prueba se efectúa de forma tal que se evite la contaminación por
endotoxinas.
DETERMINACIÓN DE LA MÁXIMA DILUCIÓN VÁLIDA (MDV)
Consiste en verificar si el Reactivo de Lisado de Amebocitos (LAL) tiene la sensibilidad

etiquetada y/o se encuentra dentro de los rangos aceptables (0,5 lambda a 2 lambda).
Para esto, se enfrentan diferentes concentraciones de un Control Estándar de Endotoxinas con
el reactivo de LAL.
Se reconstituye el Control de Endotoxinas (5 000 EU/vial) con 5 mL de agua apirógena certificada,
homogenizándola en un vortex por 30 minutos.
Usando micropipetas calibradas y tubos despirogenados, se hacen diluciones en forma aséptica hasta
obtener concentraciones de endotoxina de: 2 λ, λ, 0,5 λ, 0,25 λ, las cuales son
equivalentes a:
Spike*: 0,6 UE/ mL

2 λ: 0,06 UE/ mL
λ: 0,03 UE/ mL
0,5 λ: 0,015 UE/ mL
0,25 λ: 0,0075 UE/ mL
Competencias
- Aplica y experimenta la metodología para las pruebas de Endotoxinas bacterianas

- Reconoce las diferencias en la metodología para el análisis microbiológico de endotoxinas
bacterianas.
Material y Equipos
o 2 Baño María a 37ºC

o 4 Gradillas para 40 tubos de 10 mm x 100 mm
o 4 Gradillas para tubos de 18 x 150 mm
o 4 Cronómetros
o 4 Termómetros
o 4 Agitadores Vortex
o 8 Paquetes de 50 tubos cada uno apirógenos de 10 x 75 mm
o 4 Cajas de tips apirógenos de 5 a 100 uL
o 1 Caja de tiras indicadoras de pH
o 50 Tubos de 18 x 150 mm despirogenizados con tapas de acero (180ºC x 3 horas) envueltas
en paquetes de 8 tubos con papel aluminio.

o 20 Pipetas de 1 a 2 mL despirogenizadas a 180ºC x 3 horas con papel aluminio.
o 1 Frasco de control estándar de endotoxina
o 8 Frascos del reactivo Lisado de Amebocitos de Limulus
o 8 Frascos de agua LAL.
Procedimiento

Resultados
Emisión de reporte final e interpretación.

Cuestionario
- Describa los criterios y características que se deben tener en cuenta para la preparación de
las soluciones y la determinación de máxima dilución valida (MDV)
Bibliografia
Páginas Web

XV. PRÁCTICA Nº 15.- SEMINARIO DE INVESTIGACION:
PRUEBA DE POTENCIA ANTIBIÓTICA PARA UN ANTIMICROBIANO: OPERACIONES
PRELIMINARES, PREPARACIÓN DE MATERIALES, ESTÁNDAR, INÓCULOS Y
EJECUCIÓN DEL ANÁLISIS. USP 38 CAP 81.
Marco teórico
En las condiciones adecuadas, la actividad (potencia) de los antibióticos puede demostrarse por su
efecto inhibidor sobre los microorganismos. La reducción en la actividad microbiana puede ser difícil
de demostrar por métodos químicos. Este capítulo resume los procedimientos para antibióticos
reconocidos en la Farmacopea de los Estados Unidos (USP) para los que la valoración microbiológica es
el método analítico estándar: USP 38 CAP 81.
Se utilizan dos técnicas generales: la valoración en cilindro-placa (o en placa) y la valoración
turbidimétrica (o en tubo).
Valoración en cilindro-placa: La valoración en cilindro-placa se basa en la difusión del antibiótico
desde un cilindro vertical a través de una capa de agar solidificado en un plato o placa de Petri. El
crecimiento del microorganismo específico inoculado en el agar resulta inhibido en un área circular o
zona en torno al cilindro que contiene la solución del antibiótico.
Valoración turbidimétrica: La valoración turbidimétrica se basa en la inhibición del crecimiento de
un microorganismo en una solución uniforme del antibiótico en un medio fluido que favorezca el
crecimiento del microorganismo en ausencia del antibiótico.

o 3 Frascos x 50 mL
o 3 Frascos x 100 mL
o 3 Frascos x 400 mL
o 3 Frascos x 1 L
o 2 Frasco Roux
o 30 Perlas de vidrio
o 60 Placas Petri
o 10 Pipetas x 1 mL
o 10 Pipetas x 2 mL
o 10 Pipetas x 5 mL
o 10 Pipetas x 10 mL
o 4 Sacabocado
o 4 Beaker x 10 mL
o 3 Alcohol al 70% x 200 mL
o 3 Gasa
Composición
Condiciones de Incubación
Sugerida del lnóculo
Temperatu-
Número• ra Tiem-
Cantidad
Antibiótico Organismo de Prueba ATCC Mediob (º) po
Medio" (ml/100 ml) Amfotericina B Socchoromyces cerevisioe 9763 19
29-31 48 h 19 1,0
Bacitracina Micrococcus tuteus 10240 1 32-35 24 h
1 0,3

Bleomicina Mycobacterium smeqmatis 607 36 36-37,5 48 h
35 1,0
Carbenicilina< Pseudomonas oeruainoso 25619 1 36-37,5 24 h
10 0,5
Cloxacilina sioonvtococcus oureus 29737 1 32 35 24 h
1 0,1
Colistimetato 8ordetella broocniseoüca 4617 1 32-35 24 h
10 0,1
Colistina 8ordetella broncniseouco 4617 1 32-35 24 h
10 0,1
Dihidroestreptomi-
Según se re- cina Boc,llus subtil,s 6633 32 32 35
5 días 5 Quiera
Eritromicina Micrococcus luteus 9341 1 32-35 24 h
11 1,5
Gentamicina Stophylococcus epidermidis 12228 1 32-35 24 h
11 0,03
Nafcilina Staphylococcus oureus 29737 1 32-35 24 h
1 0,3
Neomicina Stophylococcus eoidermidis 12228 1 32-35 24 h
11 0,4
Novobiocina Staphylococcus eoidermidis 12228 1 32-35 24 h
1 4,0
Nistatina soccnoromvce: cerevistoe 2601 19 29-31 48 h
19 1,0
Perornorrucina Staohvlococcus eoidermid,s 12228 1 32-35 24 h
11 2,0
Penicilina G Staohvlococcus oureus 29737 1 32-35 24 h
1 1,0
Polimixina B 8ordetella bronchlsepuca 4617 1 32-35 24 h
10 0,1
Sisomicina Staphylococcus epidermidis 12228 1 32-35 24 h
11 0,03
S
egún se re- Vancomicina Bocillus subtilis 6633 32 32-35
5 días 8 quiera
• American Type Culture Collection, 10801 University Soulevard, Manassas VA 20110-2209 (http://www.atcc.org)
b Ver Medios y Soluciones, Medios.
e Usar 0,5 ml de una dilución 1 :25 de la suspensión madre/100 ml de Medio I O.
Procedimiento
POTENCIA ANTIBIÓTICA: Método
Cilindro-Placa de Cultivo

13.5 Resultados
Emisión de reporte final e interpretación.
13.6 Cuestionario
- Describa los criterios a tener en cuenta para la Validacion del Metodo de Valoracion de
Antobioticos.
Bibliografia
Páginas Web

Guia de Practicas Control Microbioogico de Medicamentos Farmac 2016 I 33 0

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2. Bacilos Gram negativos no Fermentadores. Grupo Pseudomonas

3. Oxidasa Positivo Grupo Vibrio

Inoculación en agar TSI

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PRACTICA 6.- Lectura, interpretacion y discusión de los

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Método de Filtración por Membrana

à Método de Vertido en Placa

Fig. 3.1. Sistema de filtración:

3.7 Fuentes de información

F-CV3-3B-1 21 REV. ABRIL 2016

Fig. 4.1. Hisopos Fig. 4.2. Solución de enjuague

F-CV3-3B-1 22 REV. ABRIL 2016

Registrar e interpretar los resultados obtenidos

F-CV3-3B-1 23 REV. ABRIL 2016

5.1 Marco teórico

F-CV3-3B-1 24 REV. ABRIL 2016

Fig. 5.1. Siembra en Superficie

F-CV3-3B-1 25 REV. ABRIL 2016

F-CV3-3B-1 26 REV. ABRIL 2016

- Reconoce la importancia de comprobar la aptitud de los métodos de análisis: recuento y