Guia de M.A.

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO
FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL Y DE RECURSOS NATURALES

FACULTAD DE INGENIERÍA AMBIENTAL Y DE RECURSOS
NATURALES
GUÍA DE PRACTICAS DE LABORATORIO DE

MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL
CARLOS ODORICO TOME RAMOS

Biólogo con mención en Microbiología y parasitología
Callao-2018-Perú
2 Blgo. Carlos Tome Ramos

INTRODUCCIÓN
En el curso de Microbiología General el alumno aprende a realizar los trabajo básicos en un

laboratorio de Microbiología; para el curso de Microbiología Ambiental debe aprender
algunos análisis microbiológicos, sobre todo los análisis que le permita determinar
contaminación de una muestra determinada; para ello con la finalidad de facilitar éste
aprendizaje es que se presenta ésta guía de prácticas, donde se ha considerado la participación
de los microorganismos en el compostaje y los diferentes métodos de laboratorio para el
análisis microbiológicos tales como: el recuento de aerobios en placa (APC), método simplate
para dosis mùltiples de RPH y, el de coliformes sea con los métodos convencionales como los
métodos rápidos, ya que son los parámetros frecuentemente requeridos para determinar la
calidad y/o contaminación de una muestra.
Esperando cumplir con el objetivo trazado, dejamos a disposición de los interesados ésta obra.

PRACTICA Nº 1
COMPOSTAJE
1.- Introducción:
El compost, compostaje, compost o abono orgánico es el producto que se obtiene de

compuestos que forman o formaron parte de seres vivos en un conjunto de productos de origen
animal y vegetal; constituye un “grado medio” de descomposición de la materia orgánica que
ya es en sí un magnífico abono orgánico para la tierra, logrando reducir enormemente la
basura. Se denomina humus al “grado superior” de descomposición de la materia orgánica. El
humus supera al compost en cuanto abono, siendo ambos orgánicos.
El compostaje se forma de desechos orgánicos como: restos de comida, frutas y verduras,
aserrín, cáscaras de huevo, restos de café, trozos de madera, poda de jardín (ramas, césped,
hojas, raíces, pétalos, etc.). La materia orgánica se descompone por vía aeróbica o por
vía anaeróbica. Llamamos “compostaje” al ciclo aeróbico (con alta presencia de oxígeno) de
descomposición de la materia orgánica. Llamamos “metanización” al ciclo anaeróbico (con
nula o muy poca presencia de oxígeno) de descomposición de la materia orgánica.
El compost es obtenido de manera natural por descomposición aeróbica (con oxígeno) de
residuos orgánicos como restos vegetales, animales, excrementos y purines (parte líquida
altamente contaminante que rezuma de todo tipo de estiércoles animales), por medio de la
reproducción masiva de bacterias aeróbicas termófilas que están presentes en forma natural en
cualquier lugar (posteriormente, la fermentación la continúan otras especies de
bacterias, hongos y actinomicetos). Normalmente, se trata de evitar (en lo posible) la
putrefacción de los residuos orgánicos (por exceso de agua, que impide la aireación-
oxigenación y crea condiciones biológicas anaeróbicas malolientes), aunque ciertos procesos
industriales de compostaje usan la putrefacción por bacterias anaerobias.
Agentes de la descomposición: La construcción de pilas o silos para el compostaje tiene
como objetivo la generación de un entorno apropiado para el ecosistema de descomposición.
El entorno no solo mantiene a los agentes de la descomposición, sino también a otros que se
alimentan de ellos. Los residuos de todos ellos pasan a formar parte del compost.

Microscópicos: Los agentes más efectivos de la descomposición son las bacterias y
otros microorganismos. Los microorganismos eficientes son un conjunto de bacterias (caldo
microbiano) que unidas producen a temperaturas favorables un aprovechamiento de los
componentes de la materia a compostar para optimizar el proceso de compostaje. También
desempeñan un importante papel los hongos, protozoos y actinobacterias (o actinomicetos,
aquellas que se observan en forma de filamentos blancos en la materia en descomposición).
Macroscópicos: Ya a nivel macroscópico se encuentran las lombrices de
tierra, hormigas, caracoles, babosas, milpiés, cochinillas, etc., que consumen y degradan la
materia orgánica.
2.- Metodología:
Existen variadas técnicas de compostaje, las que se ajustan a diferentes necesidades; la

elección de una técnica u otra depende, entre otras cosas, de la cantidad y tipo de material a
procesar, inversión disponible y disponibilidad de terreno, complejidad operacional y del
producto final que se quiere obtener. Los distintos sistemas están determinados por los
mecanismos de aireación que se utilizan en el proceso, generalmente los podemos agrupar en:
aireación pasiva, aireación forzada, y aireación por volteos del material.
Compostaje en pilas estáticas: se forman pilas, en un bote o caja metálica grande (mínimo 1
m3, máximo 1.5 m3) con tapa, colocando una capa gruesa (aproximadamente 6 cm) de aserrín
o tierra y se deja sin movimiento, se vierte ahí todos los desechos orgánicos y se cubren con
otra capa de tierra, para que se mantenga la humedad se rocía con un poco de agua que resulta
indispensable y se espolvorea con cal para evitar malos olores. Termina ventilándose
naturalmente por un proceso de convección térmica natural. En este procedimiento no se tiene
temperatura, los procesos son los naturales a temperatura ambiente.
Compostaje en pilas estáticas aireadas: consiste en airear de manera forzada la materia que
se está compostando. La pila se construye sobre una red de tuberías, donde se suministra o
extrae aire frecuentemente para proporcionar un medio aeróbico. Esta técnica es conocida
también como técnica activa o caliente: se controla la temperatura para permitir el desarrollo
de las bacterias más activas, matar la mayoría de patógenos y gérmenes, y así producir
compost útil de forma rápida.

Compostaje en pilas de volteo: este sistema de compostaje es el más utilizado, y se realiza
mediante un volteo manual o mecánico. En este método se amontona el material, se mezcla y
voltea periódicamente, evitando así la compactación y entregando oxígeno al sistema.
La mayoría de plantas industriales y comerciales de compostaje utilizan procesos activos,
porque garantizan productos de mejor calidad en un plazo menor. El mayor grado de control y,
por tanto, la mayor calidad, suele conseguirse compostando en un recipiente cerrado con un
control y ajuste continuo de temperatura, flujo de aire y humedad, entre otros parámetros.
El compostaje casero es más variado, fluctuando entre técnicas extremadamente pasivas hasta
técnicas activas propias de una industria. Para ello se escoge un lugar al aire libre ya sea
patio o jardín de preferencia lejos de la casa o la cocina, le debe dar el sol y la sombra
durante el día. Cada vez que se integren nuevos desechos orgánicos a la composta o una vez a
la semana se revuelve todo con una varilla, este paso es muy importante para ventilar los
materiales. En tres o cuatro semanas se observará que es difícil distinguir lo que se fue
depositando a excepción de los desperdicios más recientes. Se pueden utilizar
productos desodorantes, aunque una pila bien mantenida raramente produce malos olores.
Después de cuatro meses se convertirá en humus (nombre vegetal de la Tierra que se forma
por la descomposición de la materia orgánica) y esto resulta en un abono estupendo con vida,
con una gran densidad y variedad de microorganismos que
sintetizan enzimas, vitaminas, hormonas, etc. y que repercuten favorablemente en el equilibrio
biótico del suelo.
3.- Etapas biológicas del compostaje
En una pila de compostaje hay 3 grupos principales de organismos:

Consumidores primarios
Consumidores secundarios
Consumidores terciarios
En un gramo de compost hay más de 10 millones de consumidores primarios o micro
organismos, la mayor parte son bacterias, que generan calor como producto de su trabajo y se
clasifican de acuerdo al rango de temperatura en el que operan:
Psicrofílicas: Entre -18ºC y 18º C. (0 y 64 ºF)
Mesofílicas: Entre 5º C y 43ºC (41 y 109º F)
Termofílicas: Entre 40 y 93º C (104 y 200 ºF)

Lo deseable es alcanzar en la pila condiciones Termofílicas (arriba de los 40º C), porque esas
bacterias son las que trabajan más rápido y hay otros microorganismos que solo trabajan a esas
temperaturas, además se destruyen microbios patógenos y malezas. Entre los consumidores
primarios también están los actinomicetos que son los que dan al compost un agradable olor a
tierra, los hongos y los gusanos que agregan material valioso al compost y la porosidad creada
contribuye a la aireación del mismo. Cuando hay poco aire y mucha humedad se genera otro
tipo de bacterias, las anaeróbicas, que son las causantes de los malos olores.
Los consumidores secundarios consumen a otros organismos, manteniendo bajo control a
dichas poblaciones, los nematodos por ejemplo se alimentan de bacterias, protozoarios,
esporas de hongos y entre sí.
Los consumidores terciarios se alimentan principalmente de consumidores secundarios, por
ejemplo unas arañas que solo se dedican a comer artrópodos sin tejer telarañas, los ciempiés
que comen invertebrados aún más grandes que ellos y escarabajos que se alimentan de
semillas y otro material vegetal.
4.- Parámetros del proceso de compostaje
Humedad. Una pila de compost efectiva debe tener una humedad entre el 40 y el 60%. Ese
grado de humedad es suficiente para que exista vida en la pila de compost y las bacterias
puedan realizar su función. Las bacterias y otros microorganismos se clasifican en grupos en
función de cuál es su temperatura ideal y cuánto calor generan en su metabolismo. Las
bacterias mesofílicas requieren temperaturas moderadas, entre 20 y 40 °C. Conforme
descomponen la materia orgánica generan calor. Lógicamente, es la zona interna de la pila la
que más se calienta. Las pilas de compost deben tener, al menos, 1 m de ancho por 1 m de alto
y la longitud que sea posible. Así se consigue que el propio material aísle el calor generado.
Hay sistemas que permiten pilas mucho más anchas y más altas. Así se puede hacer compost
de una tonelada de residuos en un metro cuadrado. La aireación pasiva se ejecuta por medio de
un piso falso. Tampoco necesita el revoloteo del material en degradación.
Temperatura. La temperatura ideal está alrededor de los 60 °C. Así la mayoría de patógenos
y semillas indeseadas mueren a la par que se genera un ambiente ideal para las bacterias
termofílicas, que son los agentes más rápidos de la descomposición. De hecho, el centro de la
pila debería estar caliente (tanto como para llegar a quemar al tocarlo con la mano). Si esto no
sucede, puede estar pasando alguna de las siguientes cosas:

Hay demasiada humedad en la pila por lo que se reduce la cantidad de oxígeno disponible para
las bacterias.
La pila está muy seca y las bacterias no disponen de la humedad necesaria para vivir y
reproducirse.
No hay suficientes proteínas (material rico en nitrógeno).
La solución suele pasar por la adición de material o el volteo de la pila para que se airee.
Dependiendo del ritmo de producción de compost deseado, la pila puede ser volteada más
veces para llevar a la zona interna el material de las capas externas y viceversa, a la vez que se
airea la mezcla. La adición de agua puede hacerse en ese mismo momento, contribuyendo a
mantener un nivel correcto de humedad. Un indicador de que ha llegado el momento del
volteo es el descenso de la temperatura debido a que las bacterias del centro de la pila (las más
activas) han consumido toda su fuente de alimentación. Llega un momento en que la
temperatura deja de subir incluso inmediatamente después de que la pila haya sido removida.
Eso indica que ya no es necesario voltearla más. Finalmente todo el material será homogéneo,
de un color oscuro y sin ningún parecido con el producto inicial. Entonces está listo para ser
usado. Hay quien prefiere alargar la maduración durante incluso un año más, ya que, aunque
no está demostrado, puede que los beneficios del compost así producido sean más duraderos.
Nutrientes: Para el crecimiento microbiano en la pila de compost, es necesario que haya un
balance entre carbono y nitrógeno que son los macronutrientes más importantes, los materiales
ricos en carbono son color café y seco y los ricos en nitrógeno son verdes y húmedos. Los
micronutrientes son el manganeso, cobre, magnesio y cobalto y hay una categoría intermedia
entre micro y macro nutrientes donde están el fósforo, potasio y calcio. Los microbios usan el
carbono para su oxidación metabólica, parte lo convierten en bióxido de carbono y parte lo
combinan con nitrógeno para sus células, cuando el carbono está en lignina o celulosa cuesta
biodegradarlo y hay que reciclarlo varias veces. Cuando el carbono se quema es cuando se
eleva la temperatura de la pila y a eso se debe que se reduzca el volumen de la pila durante el
compostaje. El nitrógeno es necesario para el crecimiento de las células, cuando hay exceso
del mismo se libera como amoniaco y cuando hay escasez se retarda el compostaje. La
relación óptima es de 19 a 30 partes de carbono por una de nitrógeno, cuando esta relación
es mayor se retarda el compostaje y se genera un olor desagradable, pero si la relación es
menor, los microorganismos se terminan el carbono y dejan ir el nitrógeno como amoniaco.

Garantizar esta relación puede ser difícil en la práctica. Las relaciones de carbono nitrógeno
para algunos desechos son las siguientes:
RESIDUO RELACIÓN C/N
Aserrín 200-500
Caballo (excremento) 25
Gallinaza 15
Grama 12-15
Orina 0.8
Paja 128-150
Papas (cáscaras) 25
Sangre 3
Vacas (excremento) 18
Vegetales (sin leguminosas) 11-12
El resto de nutrientes suele estar presente en las concentraciones adecuadas.
5.- Fórmula para calcular el balance de carbono de la Carga:
CQ=(A.XA.CA+B.XB.CB)/ 10000
CQ= Carbono en la carga total (Kg.)
A= Peso del estiércol o aserrín
XA= % en peso de sólidos totales del estiércol o aserrín
CA= % de carbono en peso seco del estiércol o aserrín
B= Peso del residuo de gras
XB= % en peso de sólidos totales del gras
CB= % de carbono en peso seco del gras
Fórmula para calcular el balance de nitrógeno de la carga:
NQ= (A.XA.NA+B.XB.NB)/10000
NQ= Nitrógeno de la carga total (Kg.)
NA= % de nitrógeno en peso seco del estiércol o aserrín
NB= % de nitrógeno del gras


PRACTICA Nº 2
TOMA Y HOMOGENEIZACIÓN DE LA MUESTRA PARA ANÁLISIS

MICROBIOLÓGICO
1.- Introducción:
La toma de muestra y su procesamiento adecuado, para realizar un análisis microbiológico

en el laboratorio, es de vital importancia para asegurar un resultado válido y confiable, de
tal manera que nos permita tomar decisiones. En esta primera práctica de laboratorio del
curso de microbiología ambiental, el alumno debe tener en cuenta las consideraciones
necesarias para asegurar una buena toma de muestra para su respectivo análisis
microbiológico.
2.- Metodología:
Para realizar una buena toma de muestra para análisis microbiológico se debe tener en cuenta
los siguientes lineamientos:
1.-La toma de muestra debe ser en forma aséptica.
2.- La muestra debe ser estadísticamente representativa.
3.- Los envases de muestreo deben presentar las siguientes características:
Limpios y secos
A prueba de fugas
Boca ancha
Tamaño adecuado para la muestra
Cierre hermético
Estériles
4.- Siempre que sea posible debe evitarse el uso de envases de vidrio
5.- Debe tenerse estricto cuidado de no sobresaturar las bolsas.
6.- Todos los instrumentos de muestreo deben estar estériles.
7.- Siempre que sea posible obtener por lo menos 100 gr. de cada unidad muestreada

8.- Identificar cada unidad de muestra con una tira de cinta adhesiva
9.- El transporte de la muestra, en lo posible, debe ser en sus envases originales.
10.- Las muestras deben ser entregadas al laboratorio inmediatamente, junto con las
condiciones de almacenamiento original.
3.- Recepción de la muestra:
Quien recepciona la muestra debe tener en cuenta lo siguiente:

Condiciones físicas generales del envase
Etiquetado y registro.
Almacenamiento: Muestras congeladas a –20 °C, muestras perecibles: entre 0 a 4°C , pero no
más de 36 horas.
4.- Procesamiento de la muestra:
Emplear la técnica aséptica para manipular el producto.

Mezcla: Usar 50gr. de muestra y después añadir 450 ml. de agua para dilución (1:10),
homogeneizar y preparar las diluciones siguientes (1:100, 1:1000, etc.) para los análisis
microbiológicos correspondientes.

P R A C T I C A Nº 3
RECUENTO EN PLACA DE AEROBIOS (APC)
1.- Introducción:
El recuento en placas de aerobios es uno de los métodos que nos permite determinar la calidad
higiénica de una muestra, ya que está destinado a indicar el nivel de microorganismos en un
producto. El rango óptimo para realizar el recuento de colonias es de 25 a 250.
2.- Materiales y Métodos:
 Agar para recuento en placa.

 Baño maría
 Botellas para dilución estériles.
 Contador de colonias en registrador de recuento.
 Diluyente
 Incubadora.
 Pipetas de 1,5 y 10 ml. estériles.
 Placas Estériles
 Refrigeradora
 Termómetro y Ph metro.
3.- Metodología:
– 1
Realizar la primera dilución 10 agregando 10 ml de muestra a 90 ml de diluyente. Las
diluciones siguientes (10 -2, 10 -5, etc.) se efectuará transfiriendo 1 ml. de la dilución anterior a
un tubo con 9 ml. de diluyente.
Sembrar 1 ml de cada dilución, por duplicado, por el método de difusión. (Incorporación de
medio)
Mezclar las diluciones de la muestra con el medio de agar en forma completa y uniforme,
mediante una rotación y moviendo las placas de atrás hacia delante de modo alternado, sobre
una superficie plana.
Dejar que el agar se solidifique e incubar a 35ºC x 48 horas. (Ver fig. 1)

Figura 1.- Un recuento en placa es una medida directa y proporciona un recuento de viables. En primer lugar, la
muestra se diluye seriadamente, transfiriendo 1 ml de la muestra a 9 ml de medio estéril y se mezclan
adecuadamente. Este proceso se repite basta obtener una dilución apropiada en este ejemplo, 1:100000 (10 -5).
Posteriormente se añade 0,1 ml a una placa de agar nutritivo, bien extendiéndolo en la superficie de la misma
(método de extensión en placa) o mezclándolo con el medio (método de vertido en placa). Las placas se incuban
y se recuentan las colonias que se desarrollan. Debido a razones estadísticas, las placas deben contener entre 30 y
300 colonias. En este ejemplo, la placa tiene 225 colonias.

3.- Lineamiento para el cálculo (según la FDA).
Placas Normales (25 – 250)

Calcular el APC de la siguiente manera: N = ΣC . .
[(1 x ni) + (0.1 x n2)] x (d)
Donde:
N = Número de colonia por ml o gramo del producto.
Σ C = Suma de todas las colonias en todas las placas contadas.
ni = Número de placas en la primera dilución contada.
n2 = Número de placas en la segunda dilución contada.
d = Dilución de la cual se obtuvo los primeros recuentos.
Ejemplo:
1: 100 1: 1000
232, 244 33, 28
N = (232 + 244 + 33 + 28) = 537 = 24,409  24,000

[(1 x 2) + (0.1 x 2)] x 10-2 0.022 Registrar en 2 dígitos
Todas las placas con menos de 25 u.f.c. (unidades formadoras de colonias)
Registrar como: < 25 x 1/d; Donde d es la primera dilución
Ejemplo: 1: 100 1: 1000

18 2
0 0

25 x 1/ 10-2  2500 u.f.c. / ml

< 2500 ufc- / ml (gr)
Todas las placas con mas de 250 u.f.c (peso < 100/ cm2)
Ejemplo: 1: 100 1: 1000

DNC 640 640.000 EAPC / ml (gr)
Todas las placas con un promedio mayor a 100 u.f.c. /cm2

Reportar: 100 x 1/d x área de la placa;
Donde: d es la disolución más alta
Ejemplos: Promedio de 110 colonias /cm2 Con área de la placa 65 cm2

Reportar: 100 x 1/ 10-3 x 65 > 65 x 105 EAPC
4.- Resultados:

5.- Discusiones y Conclusión:
6. - Recomendaciones:

P R A C T I C A Nº 4
MÈTODO SIMPLATE PARA DOSIS MÙLTIPLES DE RPH
1.- Introducción:
El método SimPlate para RPH se usa para la cuantificación de recuentos de plaquetas

heterotróficas (RPH) en agua. Se basa en la tecnología de enzimas múltiples de IDEXX
(Multiple Enzyme Technology®) patentado, que detecta bacterias viables en el agua
comprobando la presencia de enzimas clave que se sabe existen en esos organismos. Se vale
de sustratos de enzimas múltiples que producen una fluorescencia azul al ser metabolizados
por la bacteria que se encuentra en el agua. La muestra y el medio se añaden a una placa
SimPlate, se incuban y luego se examinan para determinar la presencia de pocillos
fluorescentes. El número de pocillos fluorescentes de la placa corresponde al Número Más
Probable (NMP) de bacteria total en la muestra original. Los valores NMP generados por el
método SimPlate para RPH se correlacionan con el método Pour Plate utilizando Agar de
recuento de plaquetas totales incubadas a 35°C durante 48 horas como se describe en Standard
Methods for the Examination of Water and Wastewater, 19th edition (Métodos Estándar para
el Análisis de Agua y Agua de Desecho).
2.- Material y método:
1. Hidrate el medio llenando el envase para medio hasta la marca de 100 mL con diluyente
esterilizado (p. ej. agua declorinada, agua desionizada, tampón de fosfato o 0,1% peptona),
coloque la tapa y agite para disolver. Vea la imagen Nº 1.
2. Pipetee 1 mL de muestra y luego 9 mL de medio re hidratado en el centro de la base de la
placa SimPlate. Vea la imagen N0 2.
3. Cubra la placa con la tapa y agite suavemente para distribuir la muestra en todos los
pocillos. Vea la imagen N0 3.
NOTA: las burbujas de aire en los pocillos no interfieren con la muestra

4. Coloque la placa en un ángulo de 90° a 120° para verter el exceso en el paño absorbente.
Vea la imagen N0 4.
5. Invierta la placa e incube durante 48 horas a 35 ± 0,5°C. Vea la imagen N0 5.
6. Cuente el número de pocillos que tienen fluorescencia: sujete una bombilla de 6 wats,
365nm, de luz UV a una distancia de 12.5 cm por encima de la placa. Apunte la bombilla hacia
la muestra. Alternativamente, usted puede leer los pozos fluorescentes a través de la parte
posterior de la base invertida del SimPlate.
7. Consulte la tabla de NMP (MPN) proporcionada para determinar el número más probable
de bacteria de recuento de plaqueta heterotrófica en la muestra original. La tabla tiene en
cuenta la muestra/medio eliminado en el paso 4.
2 3
4 5
Fig. Nº1 Procedimento de prueba

PROCEDIMIENTO DE CONTROL DE CALIDAD

El siguiente procedimiento se recomienda para cada lote de placas SimPlate para RPH o con
mayor frecuencia según lo establezcan los reglamentos:
1. Siga el “Procedimiento de prueba”, arriba citada, usando 10 mL de medio rehidratado y sin
muestra.
2. Ningún pozo debe mostrar fluorescencia después de la incubación.
RECOMENDACIONES
1. Proceda con técnica aséptica.
2. Las muestras clorinadas se deben tratar con tiosulfato de sodio antes de hacer la prueba.
3. Los resultados se pueden leer desde 45 hasta 72 horas después de iniciada la incubación.
4. Refrigere el medio no utilizado y descarte si no lo usa al cabo de 5 días.
5. Elimine la muestra y el medio siguiendo buenas prácticas de laboratorio.
6. Se pueden utilizar muestras más pequeñas siempre que el volumen final (muestra más
medio hidratado) sea 10 ± 0,2 mL. Ajuste el NMP para reflejar las diluciones. Por ejemplo, si
se ponen a prueba 1 mL de muestra y 9 mL de diluyente estéril (dilución de 1:10), multiplique
el número de la tabla de NMP por 10 para encontrar el NMP/mL correcto.
3.- Resultados:

4.- Discusiones y Conclusión
5.- Recomendaciones:

PRACTICA Nº 5
MÉTODO CONVENCIONAL PARA LA DETERMINACIÓN DE

COLIFORMES Y E. Coli I:
1.- Introducción
Determinar la calidad higiénica sanitaria, y/o el grado de contaminación microbiana de una

muestra en particular, es de suma importancia para la prevencion de enfermedades
transmisibles. Para ello, se utilizan organismos indicadores de la contaminación bacteriana y
de la calidad higiénica a través de dos grupos bacterianos:
Coliformes
Enterococos
Estos indicadores, según Buttiaux y Mossel, deben poseer las siguientes propiedades:
1.- Hábitat específico del medio intestinal.
2.- Presentes en gran cantidad en las heces, para ser detectados en altas concentraciones.
3.- Resistentes a las condiciones ambientales extra-intestinales.
4.- Detectables de forma fácil y completa.
E. coli y los coliformes son bacterias Gram negativas (coliformes), fermentadores de la lactosa
con producción de gas a 35ºC X 48 hrs y a 44.5ºC (coliformes fecales y E. coli).
2.- Materiales y Métodos:
Baño maría Frascos de muestreo Caldo Triptosa Lauril

Incubadora estéril (LST)
Balanza Frascos de diluciones Caldo de Bilis Lactosa
Pipetas estériles de 10 ml Verde Brillante (BGLB)

Caldo EC Caldo de Citrato Reactiv de Voges-Pros
Agar EMB Agar Peptanado al 0.1% Kouer
Caldo Triptano Reactivo de Kovac Reactivo para Tinción
Caldo MR. UP Gram
2.1.- Prueba Presuntiva para detección de bacterias coliformes totales

1.- Añadir 10 ml e muestra de agua a un frasco de dilución con 90 ml de agua peptona al
0.1%, homogeneizar.
2.- Preparar las siguientes diluciones añadiendo 1 ml de la dilución 1:10 a un tubo con 9
ml de agua peptonada (10-2) y así sucesivamente (10-3, 10-4, etc.).
3.- Transferir 1 ml de cada dilución a un juego de 5 tubos con 10 ml. del Caldo Triptosa
Lauril Sulfato (LST).
4.- Incubar a 35ºC por 24 a 48 hrs.
Reportar como resultados positivos la turbidez y presencia de gas en el vial de fermentación

(tubos Durham). En caso de agua potable, leer como positivo la presencia de turbidez.
2.2.- Prueba confirmativa para detección de coliformes totales
1.- De los tubos positivos del Caldo Triptosa Lauril Sulfato (LST), transferir un inóculo a
los tubos con 10 ml. de Caldo Bilis Lactosa Verde Brillante (BGLB).
2.- Incubar a 35ºC por 24 a 48 hrs y proceder a reportar sus resultados.
3.- Calcular el número más probable (NMP) con la tabla.

Figura 1.- El método del número más probable (NMP) proporciona un recuento de viables. Al aumentar el factor
de dilución, se alcanza un punto en el que algunos tubos contienen sólo un organismo y los otros, ninguno. A
partir del número, determinado por los tubos que presentan turbidez en tres diluciones sucesivas (en este caso 5,
3, 1), puede determinarse el número más probable de células estadísticamente (11,0) en la primera de las tres
diluciones, mediante una tabla de números más probables (Tabla 8.6). Este valor, multiplicado por el factor de
dilución nos proporciona el número de células viables de la muestra.
2.3.- Determinación de coliformes fecales y confirmación de e. coli
1.- Agitar suavemente cada tubo de LST que produce gas CO 2, puede usarse también tubos
de BGLB gas positivo) y transferir una asada al tubo de caldo EC e incubar a 44.5 o 45.5ºC
por 24 a 48 hrs. y proceder a realizar su lectura con la ayuda de la tabla del NMP.

2.- Sembrar por el método del estriado a partir de cada tubo que produce gas sobre el agar L-
EMB e incubar por 18 a 24 hrs a 35ºC.
3.- Transferir colonias sospechosas de cada placa EMB (ver fig.) a caldos de cultivos para
realizar los estudios morfológicos y bioquímicas. Incubar por 18 a 24 hrs a 35ºC.
4.- Realizar la tinción de Gram. Examinar todos los cultivos que aparezcan como bacilos
cortos o cocos Gram negativos para las siguientes pruebas bioquímicas.
Producción de Indol:
Inocular un tubo de Caldo Triptona e incubar por 24  2 hrs a 35ºC.
Detectar la presencia de Indol añadiendo 0.2 – 0.3 ml de Reactivo de Kovac.
La aparición de un color rojo en la capa superior, significa que el resultado de prueba es
positivo.
Voges Proskauer (VP):
Producción del ACETIL METIL CARBINOL.
Inocular un tubo de caldo MR – VP e incubar por 48  2 hrs a 35ºC.
Transferir 1 ml a un tubo de 13 x 100 mm.
Añadir 0.6 ml de solución alfa-naftal y 0.2 ml 40% de KOH y agitar.
Añadir unos cuantos cristales de creatina.

Agitar y dejar reposar por 2 hrs.
La prueba es positiva si se desarrolla un color rosado de eosina
Rojo de Metilo (RM):
Incubar el tubo de MR – VP por 48  2 hrs, adicionales a una temperatura de 35ºC después de
la prueba VP.
Añadir 5 gotas de la solución Rojo de Metilo a cada tubo.
El color rojo indica que la prueba es positiva; el amarillo que la reacción es negativa.
Citrato:
Inocular a un tubo de Caldo de Citrato.
Incubar a 96  6 hrs a 35ºC.
El desarrollo de una turbidez distinta significa que la reacción es positiva.
INTERPRETACIÓN
IMViC: ++-- ó -+--  E. Coli

(Biotipo 1) (Biotipo 2)
--++ Enterobacter aerógenes
3.- Resultados:
Microorganismo NMP/100ml NMP/ 100ml (según normatividad)

Coliformes Totales
Coliformes termo tolerantes

4.- Discusiones y Conclusión:
5.- Recomendaciones:

PRACTICA Nº 6
DETERMINACIÓN DE COLIFORMES POR MÉTODOS RÁPIDOS
1.- Introducción:
La utilización de métodos rápidos de análisis para Coliformes y E.coli, que nos permitan
cuantificar sin necesidad de confirmaciones bioquímicas, resulta sumamente ventajosa para la
industria de los alimentos especialmente los alimentos frescos, así como también para
muestras de agua y suelos, ya que nos permite liberar rápidamente los productos para el
consumo sabiendo que se cumple con la legislación vigente, a la vez se disminuyen los costos
de almacenamiento y se ganan días del producto en la góndola. Los métodos tradicionales para
el análisis de Coliformes totales y E. coli comprenden tres pasos sucesivos de complejidad
creciente y el tiempo del análisis es de 4 a 6 días, dependiendo de los resultados. Existen
diferentes propuestas de métodos rápidos en el mercado para el recuento de E. coli y
Coliformes totales, que nos permiten obtener resultados en 24 hs.; tales como el caldo m-
ColiBlue 24, Colilert, COMPACT DRY EC etc.
2.- Materiales y Métodos
2.1 Coliformes en el medio solido agar bilis rojo violeta (VRBA)

 Realizar las diluciones seriados de la muestra en agua peptonada (0.1%)
 Transferir 2 alícuotas de 1 ml de cada dilución a placas de petri.
 Sembrar en placas de la siguiente manera:
a) Para el método convencional, vaciar 10 ml de VRBA temperado a 48ºC en las
placas y homogeneizar. Para predecir el crecimiento de la superficie y la
propagación de las colonias, cubrir con 5 ml VRBA y dejar solidificar.
b) Si se necesita la resucitación, verter una capa basal de 8 – 10 ml de Agar de Soya
Triptica temperada a 48ºC - homogeneizar e incubar a temperatura ambiente por 2
 0.5 hrs. Luego cubrir con 8 – 10 ml de VRBA temperada y dejar que solidifique.
 Incuba por 18 – 24 hrs. a 35ºC. Para productos lácteos a 32ºC.

 Contar colonias rojo púrpura de 0.5 mm de diámetro y rodeados por zonas de ácidos
biliares precipitados.
 Para confirmación transferir cada colonia a un tubo con caldo Lactosado Verde
Brillante Bilis. Incubar a 35ºC x 24 – 48 hrs.
 Reportar como u.f.c. / ml (gr.) de coliformes.
2.2.- Coliformes totales y e. coli por el método de filtración por membrana.

 Filtrar un volumen de 20 – 100 ml muestra de agua en asepsia (ver fig.).
 Enjuagar por 2 ó 3 veces con volúmenes de 20 ml de agua de dilución.
 Transferir la membrana a la superficie de una placa con el medio: Agar Endo les,
Agar m-Fc o Agar m – Fc – 7h o almohadillas con el caldo m – coli blue 24, evitando
que se formen burbujas entre el medio y la membrana.
 Incubar: 35ºC x 24 hrs. las placas con:
- Agar Endo les CT ufc / ml
- m - coli Blue 24 CT ufc/ml. (colonias rojas y azules) o E. coli ufc / ml (solo las
colonias azules)
- 44.5ºC x 24 hrs las placas con: Agar m Fc
 Verificar 5 colonias del medio Endo les, transfiriendo con la ayuda del asa de siembra
a un tubo con caldo lactosado Verde Brillante Bilis e incubar a 35ºC x 24 a 48 hrs.
 Para la lectura puede utilizar el microscopio e identificar mejor las colonias. Reportar
sus resultados como u.f.c. / 100 ml
.

3.- Resultados:
MUESTRA Ufc/100l Cloro (mg/l)

MUESTRA 1
MUESTRA 2
MUESTRA 3
4.- Discusiones y Conclusión
5.- Recomendaciones

ANEXOS
DETERMINACIÓN DEL NÚMERO MÁS PROBABLE
1.- Introducción
Existen tres métodos que se usan con mayor frecuencia para calcular el número de bacterias en
una muestra determinada:
1.- Recuento Directo al Microscopio
2.- Recuento en Placa
3.- Número más Probable
El número más probable es una estimación de la densidad de los microorganismos viables en
una muestra, que se obtiene, aplicando a los resultados obtenidos, la teoría de la probabilidad.
Los resultados más fidedignos se obtienen cuando todos los tubos de la dilución más baja son
positivos (es decir presentan multiplicación microbiana) y todo los tubos de la dilución más
alta son negativos (o sea no presentan multiplicación microbiana). Las diluciones de diez
veces son los más sencillos de efectuar, y el inóculo frecuentemente de uso en series de NMP
de 3, 5, ó 10 tubos. Los límites de confianza del NMP se estrechan a medida que aumenta el
número de tubos inoculados para cada dilución.
2.- Tablas de NMP y límites de confianza del 95% (tabla 1, 2, de Man)
Las combinaciones que no figuran en las tablas tienen muy pocas probabilidades de
presentarse. Si los resultados no corresponden con los de la tabla hay que repetir la prueba con
la muestra original, y si esto no es posible, el NMP puede obtenerse con la tabla 2. También
puede utilizarse una ecuación matemática para obtener una aproximación de combinaciones
del NMP.
 Cuando se preparan más de tres diluciones de una muestra, el NMP debe determinarse
a partir únicamente de tres diluciones consecutivos.

 Seleccionar la dilución más alta (que tiene el menor volumen de la muestra) con tubos
positivos y luego utilice las dos diluciones más altas que le siguen.
 Cuando ninguna de las diluciones sometidas a prueba da todos los tubos positivos,
seleccionar (si es posible) las tres primeras diluciones consecutivas cuya dilución de un
medio haya dado positivo.
 Cuando todos los tubos sean positivos, expresar el NMP como mayor del resultado de
la combinación 3 – 3 – 2 ó 5 – 5 – 4.
 Para obtener una aproximación de combinación del NMP, puede aplicarse la fórmula
de Thomas:
P
P = Es el número de tubos positivos
NMP / g (ml) =
N = Cantidad total de la muestra a todos
los
NT
tubos negativos
T = Cantidad total de la muestra en
todos los tubos.
 A menudo es necesario calcular el NMP a partir de volúmenes de la muestra inicial

distintos de los enumerados en los cuadros 1 y 2. Si el mayor volumen de muestra
usado para la referencia de la tabla es 0.01 gr. Multiplique por 10 el NMP que aparece
en la tabla. De modo análogo, si la porción mayor usada para la referencia de la tabla
es 1 gr. En vez de 0.1 gr. Divídase por 10 el NMP obtenido de la tabla.

TABLA Nº 1 5 1 0 33
5 1 1 46
Selección del NMP y estimaciones de 5 1 2 63
los límites de confianza del 95% para 5 2 0 49
5 2 1 70
pruebas de tubos de fermentación con 5 2 2 90
5 tubos de proporciones de 0,1; 0,01 y 5 3 0 79
5 3 1 110
0,001 g. (ml.) 5 3 2 140
5 4 0 130
5 4 1 170
Número de tubos positivos NMP/g. 5 4 2 220
5 4 3 280
0,1 0,01 0,001 (ml)
5 4 4 350
0 0 0 2
5 5 0 240
0 0 1 2
5 5 1 350
0 1 0 2
5 5 2 540
1 0 0 2
5 5 3 920
1 0 1 4
5 5 4 1600
1 1 0 4
1 2 0 6
2 0 0 4
2 0 1 7
2 1 0 7
2 1 1 9
2 2 0 9
2 2 0 9
3 0 0 8
3 0 1 11
3 1 0 11
3 1 1 14
3 2 0 14
3 2 1 17
3 3 0 17
4 0 0 13
4 0 1 17
4 1 0 17
4 1 1 21
4 2 0 22
4 2 1 26
4 3 0 27
4 3 1 33
4 4 0 34
5 0 0 23
5 0 1 31

TABLA Nº 2 0 4 5 17 1 5 1 15
0 5 0 9,4 1 5 2 17
Número más 0 5 1 11 1 5 3 19
probable por 100 ml. 0 5 2 13 1 5 4 22
0 5 3 15 1 5 5 24
de muestra, 0 5 4 17
planteando 5 0 5 5 19
1 0 0 2
porciones en tres 1 0 1 4 Número de NMP
diluciones en serie 1 0 2 6 tubos positivos
1 0 3 8
geométrica 1 0 4 10 10 1 0,1
1 0 5 12 2 0 0 4,5
Número de NMP 2 0 1 6,8
1 1 0 4
tubos positivos 1 1 1 6,1 2 0 2 9,1
1 1 2 8,1 2 0 3 12
10 1 0,1 2 0 4 14
1 1 3 10
0 0 0 - 2 0 5 16
1 1 4 12
0 0 1 1,8 2 1 0 6,8
0 0 2 3,6 2 1 1 9,2
0 0 3 5,4 2 1 2 12
0 0 4 7,2 2 1 3 14
Número de NMP
0 0 5 9 2 1 4 17
0 1 0 1,8 tubos positivos
2 1 5 19
0 1 1 3,6 10 1 0,1 2 2 0 9,3
0 1 2 5,5 1 1 5 14 2 2 1 12
0 1 3 7,3 1 2 0 6,1 2 2 2 14
0 1 4 9,1 1 2 1 8,2 2 2 3 17
0 1 5 11 1 2 2 10 2 2 4 19
0 2 0 3,7 1 2 3 12 2 2 5 22
0 2 1 5,5 1 2 4 15 2 3 0 12
0 2 2 7,4 1 2 5 17 2 3 1 14
0 3 3 9,2 1 3 0 8,3 2 3 2 17
0 2 4 11 1 3 1 10 2 3 3 19
0 2 5 13 1 3 2 13 2 3 4 22
0 3 0 5,6 1 3 3 15 2 3 5 25
0 3 1 7,4 1 3 4 17 2 4 0 15
0 3 2 9,3 1 3 5 19 2 4 1 17
0 3 3 11 1 4 0 11 2 4 2 20
0 3 4 13 1 4 1 13 Número de
0 3 5 15 1 4 2 15
0 4 0 7,5 tubos positivos
1 4 3 17
0 4 1 9,4 1 4 4 19 10 1 0,1 NMP
0 4 2 11 1 4 5 22 2 4 3 23
0 4 3 13 1 5 0 13 2 4 4 25
0 4 4 15

2 4 5 28 3 5 4 41 10 1 0,1
2 5 0 17 3 5 5 45 4 5 0 41
2 5 1 20 4 0 0 13 4 5 1 48
2 5 2 23 4 0 1 17 4 5 2 56
2 5 3 26 4 0 2 21 4 5 3 64
2 5 4 29 4 0 3 25 4 5 4 72
2 5 5 32 4 0 4 30 4 5 5 81
3 0 0 7,8 4 0 5 36 5 0 0 23
3 0 1 11 4 1 0 17 5 0 1 31
3 0 2 13 4 1 1 21 5 0 2 43
3 0 3 16 4 1 2 26 5 0 3 58
3 0 4 20 Número de 5 0 4 76
3 0 5 23 5 0 5 95
tubos positivos
3 1 0 11 5 1 0 33
3 1 1 14 10 1 0,1 NMP 5 1 1 46
3 1 2 17 4 1 3 31 5 1 2 64
3 1 3 20 4 1 4 36 5 1 3 84
3 1 4 23 4 1 5 42 5 1 4 110
3 1 5 27 4 2 0 22 5 1 5 130
3 2 0 14 4 2 1 26 5 2 0 49
3 2 1 17 4 2 2 31 5 2 1 70
3 2 2 20 4 2 3 38
3 2 3 24 4 2 4 44
3 2 4 27 4 2 5 50
3 2 5 31 4 3 0 27
Número de 4 3 1 33
4 3 2 39
tubos positivos Número de NMP
4 3 3 45
10 1 0,1 NMP 4 3 4 52 tubos positivos
3 3 0 17 4 3 5 59
3 3 1 21 4 4 0 34 10 1 0,1
3 3 2 24 4 4 1 40 5 2 2 95
3 3 3 28 4 4 2 47 5 2 3 120
3 3 4 31 4 4 3 54 5 2 4 150
3 3 5 35 4 4 4 62 5 2 5 180
3 4 0 21 4 4 5 69 5 3 0 79
3 4 1 24 5 3 1 110
3 4 2 28 5 3 2 140
3 4 3 32 5 3 3 180
3 4 4 36 5 3 4 210
3 4 5 40 5 3 5 250
3 5 0 25 5 4 0 130
3 5 1 29 Número de NMP 5 4 1 170
3 5 2 32 5 4 2 220
tubos positivos
3 5 3 37 5 4 3 280

5 4 4 350
5 4 5 430
5 5 0 240
5 5 1 350
5 5 2 540
5 5 3 920
5 5 4 1600
5 5 5 -


TABLA Nº3
NMP para Dosis múltiple por HPC

BIBLIOGRAFIA
1. ENERGÍA, DESARROLLO Y VIDA; UNI; BIOAGRICULTURA CASA BLANCA.

Resumen del Curso taller. Biodigestores y su aplicación al desarrollo. Lima-Perú.
Auspiciado por CONCYTEC, Abril del 2 002.
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usg=__g8NyMpCnxJgDBZv87201re-
kSa8=&h=209&w=412&sz=15&hl=es&start=2&tbnid=FcpcYBYptcnrSM:&tbnh=63
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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO

FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL Y DE RECURSOS NATURALES

GUÍA DE PRACTICAS DE LABORATORIO DE

CARLOS ODORICO TOME RAMOS

2 Blgo. Carlos Tome Ramos

En el curso de Microbiología General el alumno aprende a realizar los trabajo básicos en un

3 Blgo. Carlos Tome Ramos

El compost, compostaje, compost o abono orgánico es el producto que se obtiene de

4 Blgo. Carlos Tome Ramos

Existen variadas técnicas de compostaje, las que se ajustan a diferentes necesidades; la

5 Blgo. Carlos Tome Ramos

3.- Etapas biológicas del compostaje

En una pila de compostaje hay 3 grupos principales de organismos:

6 Blgo. Carlos Tome Ramos

4.- Parámetros del proceso de compostaje

7 Blgo. Carlos Tome Ramos

8 Blgo. Carlos Tome Ramos

Vegetales (sin leguminosas) 11-12

El resto de nutrientes suele estar presente en las concentraciones adecuadas.

5.- Fórmula para calcular el balance de carbono de la Carga:

9 Blgo. Carlos Tome Ramos

10 Blgo. Carlos Tome Ramos

TOMA Y HOMOGENEIZACIÓN DE LA MUESTRA PARA ANÁLISIS

La toma de muestra y su procesamiento adecuado, para realizar un análisis microbiológico

11 Blgo. Carlos Tome Ramos

3.- Recepción de la muestra:

Quien recepciona la muestra debe tener en cuenta lo siguiente:

4.- Procesamiento de la muestra:

Emplear la técnica aséptica para manipular el producto.

12 Blgo. Carlos Tome Ramos

RECUENTO EN PLACA DE AEROBIOS (APC)

2.- Materiales y Métodos:

 Agar para recuento en placa.

13 Blgo. Carlos Tome Ramos

300 colonias. En este ejemplo, la placa tiene 225 colonias.

14 Blgo. Carlos Tome Ramos

Placas Normales (25 – 250)

N = (232 + 244 + 33 + 28) = 537 = 24,409  24,000

Todas las placas con menos de 25 u.f.c. (unidades formadoras de colonias)

Registrar como: < 25 x 1/d; Donde d es la primera dilución

Ejemplo: 1: 100 1: 1000

15 Blgo. Carlos Tome Ramos

25 x 1/ 10-2  2500 u.f.c. / ml

Ejemplo: 1: 100 1: 1000

Todas las placas con un promedio mayor a 100 u.f.c. /cm2

Ejemplos: Promedio de 110 colonias /cm2 Con área de la placa 65 cm2

16 Blgo. Carlos Tome Ramos

17 Blgo. Carlos Tome Ramos

MÈTODO SIMPLATE PARA DOSIS MÙLTIPLES DE RPH

El método SimPlate para RPH se usa para la cuantificación de recuentos de plaquetas

2.- Material y método:

18 Blgo. Carlos Tome Ramos

19 Blgo. Carlos Tome Ramos

PROCEDIMIENTO DE CONTROL DE CALIDAD

20 Blgo. Carlos Tome Ramos

21 Blgo. Carlos Tome Ramos

MÉTODO CONVENCIONAL PARA LA DETERMINACIÓN DE

Determinar la calidad higiénica sanitaria, y/o el grado de contaminación microbiana de una

2.- Materiales y Métodos:

Baño maría Frascos de muestreo Caldo Triptosa Lauril

22 Blgo. Carlos Tome Ramos

2.1.- Prueba Presuntiva para detección de bacterias coliformes totales

Reportar como resultados positivos la turbidez y presencia de gas en el vial de fermentación