Breast Cancer Research, 2006; 8(5): R59-R59 (más artículos en esta revista)

CD44 + / CD24 - células del cáncer de

mama presentan mayor invasoras
propiedades: un primer paso
necesario para metástasis
BioMed Central
Carol Sheridan (casherid@iupui.edu) [1], Hiromitsu Kishimoto (kisihiro@hyo-med.ac.jp)
[1], Robyn K Fuchs (rfuchs@iupui.edu) [2], Sanjana Mehrotra (mehrotrasanjana @ yahoo .
com) [3], Poornima Bhat-Nakshatri (pnakshat@iupui.edu) [4], Charles H Turner
(turnerch@iupui.edu) [6], Robert Goulet (rgoulet@iupui.edu) [1], Sunil Badve
(sbadve@iupui.edu) [3], Harikrishna Nakshatri (hnakshat@iupui.edu) [1]
[1] Departamento de Cirugía, Indiana University School of Medicine, Indianapolis, IN
46202, EE.UU.
[2] Departamento de Anatomía y Biología Celular, Indiana University School of Medicine,
Indianapolis, IN 46202, EE.UU.
[3] Departamento de Patología, Indiana University School of Medicine, Indianapolis, IN
46202, EE.UU.
[4] Walther Centro de Oncología, Indiana University School of Medicine, Indianapolis, IN
46202, EE.UU.
[5] Walther Cancer Institute, Indianapolis, IN 46208, EE.UU.
[6] Ortopedia laboratorios de investigación, Indiana University School of Medicine,
Indianapolis, IN 46202, EE.UU.
[7] Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Indiana University School of
Medicine, Indianapolis, IN 46202, EE.UU.
Copyright © 2006 Sheridan et al.; Licenciatario BioMed Central Ltd

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es debidamente citados.

Resumen
Introducción

Una subpoblación (CD44 + / CD24 -) de células del cáncer de mama se ha informado de

que el eje / propiedades de células progenitoras. El objetivo de este estudio fue investigar
si esta subpoblación de las células del cáncer tiene la capacidad única para invadir, casa,
y proliferan en los sitios de metástasis.

Métodos
CD44 y CD24 expresión fue determinada por citometría de flujo. Secante del Norte se
utilizó para determinar la expresión de proinvasive y «hueso y pulmón metástasis firma de
los genes. Un ensayo Matrigel invasión y intracardiaco inoculación en ratones desnudos
fueron utilizados para evaluar la invasión, y la vivienda y la proliferación en los sitios de
metástasis, respectivamente.

Resultados

Cinco de los 13 el cáncer de mama líneas celulares examinados (MDA-MB-231, MDA-

MB-436, Hs578T, SUM1315, y HBL-100) contiene un porcentaje más alto (> 30%) de
CD44 + / CD24 - células. Con líneas de células CD44 + alto / CD24 - expresa el número de
células basales / mesenquimales o mioepiteliales, pero no luminal marcadores. Los
niveles de expresión de genes proinvasive (IL-1 α, IL-6, IL-8, uroquinasa y activador del
plasminógeno [UPA]) fueron mayores en las líneas celulares con un importante CD44 + /
CD24 - población que en otras líneas celulares. Entre las CD44 + / CD24 --positivas las líneas
celulares, MDA-MB-231 tiene la propiedad única de expresar una amplia gama de genes
que favorecen el hueso y las metástasis de pulmón. De acuerdo con estudios previos en
ratones desnudos, con líneas de células CD44 + / CD24 - subpoblación son más invasivas
que otras líneas celulares. Sin embargo, sólo un subconjunto de CD44 + / CD24 --positivas las
líneas celulares fue capaz de casa y proliferan en los pulmones.

Conclusión

El cáncer de mama con células CD44 + / CD24 - subpoblación expresar mayores niveles
de proinvasive genes y tienen propiedades altamente invasivos. Sin embargo, este
fenotipo no es suficiente para predecir la capacidad de metástasis pulmonar.

Introducción
Células madre teoría propone que los cánceres surgen de la transformación maligna de la
normalidad tallo / células progenitoras [1 - 4]. Las propiedades inherentes de tallo /
progenitoras células pueden transformarse difundir sus homólogos con la capacidad de
eludir las terapias antitumorales tradicionales y establecer metástasis [3 - 5].
Tumorigénicos tallo / células progenitoras se han documentado en neoplasias malignas
hematológicas, así como en tumores sólidos [6 - 8]. Varios estudios implicados un
subconjunto de la células del cáncer de mama tienen mayor capacidad para formar
tumores en ratones inmunodeficientes [9, 10]. Esta subpoblación de células también
demostró una capacidad de auto-renovación y heterogénea generación de progenie.
Estas células se distinguen de sus homólogos de nontumorigenic un marcador de
superficie celular perfil: el CD44 + / CD24 - / Lineage -. Sin embargo, el potencial de estas
tumorigénicos tallo / células progenitoras para establecer metástasis no se conoce.

La metástasis es un proceso complejo que involucra no sólo la invasión, sino también la

vivienda y la proliferación en los sitios de metástasis [11]. Este proceso requiere la
actividad de varios genes, incluida la uroquinasa activador del plasminógeno (UPA) / UPA
sistema receptor, citocinas (IL-1, IL-6, IL-8, IL-11, factor de necrosis tumoral, y la
transformación del factor de crecimiento-β 1),quimiocinas y sus receptores (células
estromales derivadas de factor-1 α y los receptores de quimioquinas CXC [CXCR] 4), y
metaloproteinasas de la matriz (MMPs) [12 - 14]. Recientes análisis de microarrays de
clonal variantes de MDA-MB-231 que las células de origen y crecer en los sitios
metastásicos, como hueso y pulmón han puesto de manifiesto un patrón de expresión
génica asociados con la metástasis a estos sitios [14, 15]. Metástasis óseas incluyen
genes firma CXCR4, del tejido conectivo derivado del factor (CTGF), IL-11, el
metalloproteinase-disintegrin miembro de la familia ADAMTS1 (a disintegrin y
metalloproteinase con thrombospondin-1) y MMP1, mientras que los genes de la
metástasis del pulmón incluyen la firma CXCR4, MMP1 y ciclo-oxigenasa-2. Un estudio
reciente describe la función del receptor activador del factor nuclear κ-B (RANK) / RANK
ligando en la metástasis de células del cáncer de mama al hueso [16].

Los últimos perfiles de expresión génica ha desafiado a la larga la opinión de que las
células metastásicas son raros y surgir más tarde durante las fases de progresión tumoral,
como consecuencia de la progresiva acumulación de mutaciones. Una posibilidad
alternativa es que la mayoría de tumores primarios contienen un subconjunto de las
células del cáncer que tiene un 'fenotipo metastásico' [17 - 19]. Hemos investigado si las
células del cáncer de mama con el CD44 + / CD24 - fenotipo poseen tres características
esenciales de las células metastásicas con fenotipo: manifestación de invasión y
metástasis de genes asociados; invasión, y la vivienda y la proliferación en los sitios de
metástasis. Se demuestra que un subgrupo de cáncer de mama líneas celulares con un
mayor porcentaje de CD44 + / CD24 - células expresan niveles más elevados de los genes
y proinvasive invadir Matrigel in vitro. Sin embargo, el CD44 + / CD24 - fenotipo no es
suficiente para la vivienda y la proliferación en los sitios de metástasis.

Materiales y métodos
El cáncer de mama líneas celulares

Salvo que se indique lo contrario, el cáncer de mama líneas celulares se obtuvieron a

partir de tejidos American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.). SUM1315
células se obtuvieron a partir de Asterand (Detroit, MI, EE.UU.) y se mantendrá en
Dulbecco modificado del águila medio (DMEM) / F12 (CellGro, Herndon, VA, EE.UU.), que
contiene 5% de suero de ternera fetal (FCS), y se completará con 10 μ g / ml de insulina y
20 ng / ml de factor de crecimiento epidérmico. MCF-7, T47-D, MDA-MB-231, MDA-MB-
436, MDA-MB-468, SK-BR-3, Hs578T y HBL-100 células fueron cultivadas en medio
mínimo esencial que contiene el 10% FCS. ZR-75-1 y DU4475 células fueron cultivadas
en RPMI que contiene 10% FCS. MCF-10A células fueron cultivadas en medios de
comunicación DMEM/F12 que contengan 5% suero de caballo y los siguientes
complementos: 10 μ g / ml de insulina, 20 ng / ml de factor de crecimiento epidérmico, 100
ng / ml euterotoxin cólera, 0,5 μ g / ml de hidrocortisona y 2 mmol / l de L-glutamina.
BT474 células fueron cultivadas en RPMI que contiene 10% FCS, 2 mmol / l de L-
glutamina, 10 mmol / l HEPES, 1 mmol / l pirofosfato de sodio, 4,5 g / ml de glucosa, 1,5 g
/ ml de carbonato de sodio, y 10 μ g / ml insulina.

Citometría de flujo

Las células se lavaron una vez con buffer fosfato-salino (PBS) y, a continuación,
cosechadas con 0,05% trypsin/0.025% EDTA. Independiente células fueron lavadas con
PBS que contengan 1% FCS y el 1% penicilina / estreptomicina (tampón de lavado), y el
resuspendido en buffer de lavado (10 6 cells/100 μ l). Las combinaciones de fluorocromo y
conjugado con anticuerpos monoclonales obtenidos a partir de BD Biosciences (San
Diego, CA, EE.UU.) contra la CD44 (FITC; cat. # 555478) y CD24 (PE; cat. # 555428) o
sus respectivos controles de isotipo se han añadido a la celda suspensión a las
concentraciones recomendadas por el fabricante y se incubaron a 4 ° C en la oscuridad
durante 30 a 40 min. La etiqueta se lavaron las células en el tampón de lavado, entonces
fijo en PBS que contenía 1% de paraformaldehído y, a continuación, analizar en un
FACSVantage (BD Biosciences).

Del Norte y el análisis de la transcriptasa inversa reacción de

polimerasa en cadena

Se aisló ARN usando RNAeasy Kit (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.) y 5 μ g RNA fue
sometido a análisis del Norte, tal como se describe anteriormente [20]. RT-PCR para IL-8
se realizó utilizando solo paso RT-PCR kit de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.) y los
siguientes primers: 5'-GTA AAC ACT TCC ATG CTG AAG-3 'y TTT TAT GAA TTC TCA
GCC CTC-3 '.

Los estudios en animales

El Animal Care institucional y el empleo Comité aprobó todos los estudios con animales.
Por intracardiaco estudios de inyección, 10 5 células se suspendieron en 100 μ l-HEPES
solución salina amortiguadora y lentamente se inyecta en el ventrículo izquierdo cardíaco,
de 7 semanas de edad las mujeres nu / nu ratones utilizando un calibre de 27 agujas (7 a
12 animales por cada tipo de células ), Tal como se describe anteriormente [21]. Los
animales inyectados con TTM-231, LMD-231, o MDA-MB-468 células fueron asesinados
cuando se desarrolló una o más de los siguientes signos: la extremidad posterior parálisis
de la espina sospecha de metástasis, la excesiva pérdida de peso, tumores visibles, o
trabajado de respiración metástasis pulmonar. Pulmones y axilares bilaterales contenidos
fueron recogidos en formalina para hematoxilina y eosina preparación. Los animales
inyectados con TTM-436 células o células DU4475 fueron asesinados 10 semanas
después de la inyección intracardiaco. Pulmones de los animales inyectados con MDA-
MB-468 células (dos animales) fueron digeridos con colagenasa y hialuronidasa, y las
células cancerosas fueron ordenados por citometría de flujo utilizando conjugado con PE-
CD326 (EpCAM, # 130-091-253; Miltenyi Biotech, Auburn, CA, EE.UU.) para enriquecer
las células cancerosas. CD326-células positivas fueron evaluados para CD44 y CD24
estado inmediatamente después de su clasificación o 1 semana después de la
clasificación.

Matrigel invasión de ensayo

La invasión de ensayo se realizó según lo recomendado por el fabricante de la invasión kit

de ensayo (# ECM554; Chemicon Internacional, Temecula, CA, EE.UU.). En resumen, las
células se mueren de inanición o suero durante 24 horas y 50000 células fueron
colocadas en la parte superior insertar con Matrigel. Suero libre de los medios de
comunicación o los medios de comunicación con un 10% de suero fueron colocados en la
parte inferior. El número de células que invadió a través de la Matrigel se calculó
utilizando fluorométricos ensayo. Por cada línea celular, fluorométricos la lectura desde la
parte inferior de pozos con el suero libre de los medios de comunicación se define como
una unidad para determinar el cambio relativo en la invasión a la presencia de un 10% de
suero. Cada experimento que figuran uno o dos pozos sin suero y dos pozos con suero
para cada línea celular. El experimento se repitió dos veces para la mayoría de las líneas
celulares MCF salvo-7, que se hizo tres veces.

El análisis estadístico

Los datos fueron analizados con el software GraphPad [22] para determinar los valores de
P utilizando la prueba exacta de Fisher.

Resultados
Humanos, el cáncer de mama líneas celulares difieren
cuantitativamente en la proporción de CD44 + / CD24 - células

Para probar la hipótesis de que el cáncer de mama humano líneas celulares difieren en la
proporción de CD44 + / CD24 - células, que caracteriza el cáncer de mama 13 líneas
celulares por citometría de flujo para la superficie expresión de CD44 y CD24. Además de
las líneas celulares de sus padres, los derivados de MDA-MB-231 y MDA-MB-436 células
fueron analizados. TTM-231 células se obtuvieron a partir de MDA-MB-231 células
cultivadas en la almohadilla de grasa mamaria de ratones desnudos. LMD-231 células se
obtuvieron a partir de MDA-MB-231 células que había metástasis a pulmón de la
almohadilla de grasa mamaria de ratones nude [23]. TTM-436 células se obtuvieron a
partir de MDA-MB-436 células cultivadas en la almohadilla de grasa mamaria de ratones
desnudos. Un representante análisis de citometría de flujo de TTM-231, DTM-436, MCF-7,
Hs578t, BT474 y líneas de células que muestran los patrones de expresión de CD44 y
CD24 se muestra en la Figura 1. Isotipo control de TTM-436 se muestra, a pesar de
isotipo de los controles se llevaron a cabo para todas las líneas celulares de investigación.
En el Cuadro 1 los resultados de este análisis se resumen en lo que respecta a cuatro
fracciones definidas por estos dos marcadores: CD44 + / CD24 -, CD44 - / CD24 +, CD44 + /
CD24 +, CD44 y - / CD24 -. Esta tabla también muestra el tipo de tumor y el tejido fuente,
de origen celular, molecular y clasificación basada en la expresión génica o de perfiles de
expresión de marcadores [24 - 27]. De acuerdo a esta clasificación, CK19 se expresa
predominantemente en las líneas celulares de tipo luminal que CK5, CD10, y ETS1 se
expresan en líneas de células basales de origen. Vimentina se expresa en líneas de
células mesenquimales de tipo. MDA-MB-231 y su derivado líneas celulares DTM-436,
Hs578T, SUM1315, y HBL-100 posee todos un aumento de CD44 + / CD24 - subpoblación
(> 30%). El inmortalizado humanos de células epiteliales de mama línea MCF10A también
contenía una CD44 + / CD24 - subpoblación. Sin embargo, el porcentaje de CD44 + /
CD24 - subpoblación en esta línea celular variado notablemente de un experimento a
experimento, y parece ser dependiente en el suero utilizado para el cultivo de células.
Este no es el caso de líneas de células transformadas. Además, tenga en cuenta que los
padres y el tumor derivado de las variantes de MDA-MB-231 y MDA-MB-436 similares
CD44 + / CD24 - subpoblaciones.

El cáncer de mama líneas de células CD44 con un peso significativo

en + / CD24 - subpoblación expresar mayores niveles de genes
asociados con la invasión

Para investigar la relación entre el CD44 + / CD24 - fenotipo y proinvasive la expresión

génica, Northern blot y / o RT-PCR se realizaron análisis. Los genes en una descrito
recientemente 'metástasis óseas firma "(CXCR4, IL-11, CTGF, osteopontin, MMP-1, y
ADAMTS1) y otros genes implicados en la invasión / metástasis (IL-1 α, IL-6, IL-8, y UPA)
se incluyeron en este análisis [12,14, 15, 21]. La relación entre el tamaño de las CD44 + /
CD24 - población y de expresión de estos genes se resume en la figura 2a. Cabe destacar
que sólo el MDA-MB-231 expresado todos los derivados de los genes en las metástasis
óseas la firma, aunque la expresión de IL-11 y CTGF es baja o indetectable en la línea
celular de sus padres en comparación con TTM-231 o LMD-231 células. Aunque varias
líneas celulares expresaron bajos niveles de CXCR4, MDA-MB-231 y sus derivados
exhibió la más alta expresión. Este resultado fue confirmado independientemente por
citometría de flujo. TTM-231 y LMD-231 células expresaron mayores niveles de CXCR4
(50% a 70%) que hizo ningún otro línea celular (datos no presentados). Veinte y cinco por
ciento de las células DU4475 expresó CXCR4. De MCF-7 células del 5% al 8%,
expresado CXCR4 sólo cuando se llevan en rojo fenol-gratis-carbón dextrano tratados
medios de comunicación, mientras que el resto de las líneas celulares no presentan
superficie celular CXCR4. MMP-1 fue más alta expresión en las células Hs578T y el MDA-
MB-231 línea y sus derivados. Todos los demás receptores de estrógenos (ER) - α-
negativo, pero no ER-α-el cáncer de mama positivo líneas celulares expresaron su más
bajo, pero niveles detectables de MMP-1. Todas las líneas celulares expresaron niveles
similares de osteopontin, lo que sugiere que su expresión no está vinculado a la CD44 + /
CD24 - fenotipo.

Expresión de genes adicionales proinvasive prueba se observó principalmente en las

líneas celulares con un aumento de CD44 + / CD24 - subpoblación. Por ejemplo, la
expresión de la IL-1 α, IL-6 y IL-8 se limitó a las líneas de células MDA-MB-231, DTM-231,
LMD-231, MDA-MB-436, DTM-436, Hs578T, y HBL-100, sin embargo, sensibles RT-PCR
ensayo reveló IL-8 expresión en varias líneas celulares a niveles variables (figura 2a].
Curiosamente, derivado del tumor o metástasis derivados de las variantes de MDA-MB-
231 células demostrado una mayor expresión de estos genes en comparación con las
células de sus padres; este hallazgo sugiere que las células que expresan estos genes en
los niveles superiores han mejorado tumorigénicos potencial. Aunque en la actualidad
carecen de líneas de células CD44 + / CD24 - subpoblación, UPA expresión más altos se
registraron en las líneas celulares con un mayor fracción del CD44 + / CD24 -
subpoblación. De acuerdo con el análisis de microarrays de los cánceres de mama
primarios, en general expresión de genes proinvasive fue mayor en ER-α-negativos líneas
celulares que en ER-α-positivas las líneas celulares [28, 29].

A continuación, examinó si CD44 + / CD24 - y no-CD44 + / CD24 - subpoblaciones de

células de una sola línea celular exposición expresión diferencial de genes proinvasive.
Los reiterados intentos de cultura CD44 - / CD24 - subpoblación de TTM-231, lo que
representa menos de 15% de las células, no tuvieron éxito debido a las malas placas
eficiencia. Por lo tanto, estamos aislados CD44 + / CD24 - y CD44 + / CD24 + células de
TTM-436 células por citometría de flujo (figura 2b] y proinvasive analizado la expresión
génica de inmediato, ya sea mediante RT-PCR (datos no presentados) o para el cultivo
después de una semana del Norte de análisis (figura 2c]. CD44 + / CD24 - y CD44 + /
CD24 + células mostraron una modesta diferencia en IL-8, pero no MMP-1, IL-6, UPA y
expresión (figura 2c]. Estos resultados sugieren que CD44 + / CD24 + células conservan la
expresión de los genes proinvasive que hemos probado.

Invasoras de propiedad se limita a cáncer de mama con líneas de

células CD44 + / CD24 - subpoblación
Debido a que sólo las líneas celulares con una fracción importante de CD44 + / CD24 -
células manifestado proinvasive genes, se comparó la capacidad invasiva de las líneas
celulares con o sin CD44 + / CD24 - células. Se excluyeron los SUM1315 línea de este
ensayo debido a que estas células requieren suero y del factor de crecimiento epidérmico
para la supervivencia, y no se puede mantener en el suero libre de los medios de
comunicación durante 24 horas. Considerando que el cáncer de mama sin líneas de
células CD44 + / CD24 - las células invasoras carecían de capacidad, las personas con
CD44 + / CD24 - subpoblación (MDA-MB-231, MDA-MB-436, y Hs578T) exhibieron
invasión (Figura 3a]. Hubo tendencia hacia un mayor invasión de TTM-231 y TTM-436 en
comparación con las respectivas células de los padres (MDA-MB-231 y MDA-MB-436),
aunque las diferencias no fueron estadísticamente significativos. Estos resultados
muestran que el CD44 + / CD24 - fenotipo de células del cáncer de mama se asocia con la
capacidad invasiva.

También se examinaron la capacidad invasiva de la CD44 + / CD24 - y CD44 + /

CD24 + subpoblaciones de TTM-436 células. Curiosamente, CD44 + / CD24 - las células
son más invasivas que se CD44 + / CD24 + células (Figura 3b]. Estos resultados un mayor
apoyo a la asociación entre CD44 + / CD24 - fenotipo y la invasión.

El CD44 + / CD24 - fenotipo no es suficiente para establecer

metástasis pulmonar

Para probar la hipótesis de que CD44 + / CD24 - fenotipo es suficiente para el

establecimiento de metástasis in vivo, hemos probado la capacidad de estas líneas
celulares para establecer metástasis pulmonar intracardiaco después de la inyección.
Además del requisito de propiedad invasoras, células metastásicas deben tener las
siguientes propiedades: la supervivencia en la circulación, la adhesión al órgano diana, la
extravasación y la puesta en marcha de crecimiento metastático en el sitio. Intracardiaco
inyección de las células del cáncer en ratones nude permite la evaluación de la capacidad
metastásica de las células del cáncer posteriores a la entrada en circulación
[14, 15, 21, 30 - 33]. Desnudo ratones inyectados con células fueron controlados por
síntomas visibles de metástasis para un máximo de 10 semanas. El patrón de metástasis
de cada una de las líneas celulares de la prueba se resume en el cuadro 2. TTM-231
animales inyectados expuesto signos de metástasis tan pronto como 6 semanas, con la
mayoría de los animales afectados por 10 semanas. Metástasis crecimiento se detectó en
las vértebras, extremidades, pared torácica, esternón, mandíbula, y escápula. Histológico
reveló manchas más crecimientos metastásico en los pulmones (Figura 4a]. Ósea y de
órganos metástasis viscerales se confirmó por energía dual de rayos X absorciometría
exploraciones y de alta resolución Faxitron imágenes (Figura 4b] y la necropsia. Tenga en
cuenta que los animales inyectados con cualquiera de los padres MDA-MB-231 o LMD-
231 células exhiben un patrón similar de metástasis (datos no presentados). Aunque sin
metástasis óseas, los animales inyectados con MDA-MB-468 células tenido graves
morbilidad y mortalidad. En contraste, los animales inyectados con los padres MDA-MB-
436, DTM-436, Hs578T, SUM1315, o DU4475 células no mostraron ningún síntoma de
metástasis incluso 10 semanas después de la inyección intracardiaco. Un representante
Faxitron imagen de un animal inyectado con TTM-436 células se muestra en la Figura 4b.
Pulmones de los animales inyectados con MDA-MB-468 o TTM-436 (6 / 8), pero no
Hs578T, SUM1315, o DU4475 células, mostró un amplio crecimiento de las células
cancerosas (Cuadro 2 y Gráfico 4a]. De este modo, el CD44 + / CD24 -fenotipo, mientras
que asociado con la invasión, no es suficiente para el establecimiento de metástasis.
Metástasis pulmonar de MDA-MB-468 células es independiente de la
expresión de «metástasis pulmonar firma de los genes

CD44 + / CD24 - / Lin - células de cáncer de mama primario para el progreso CD44 + /
CD24 +, CD44 - / CD24 +, CD44 y - / CD24 - fenotipos cuando se implanten en la
almohadilla de grasa mamaria de nonobese diabéticos / inmunodeficiencia combinada
severa ratones [9 ]. Sin embargo, si CD44 + / CD24 - células de manera similar a un
progreso heterogéneo de población en los sitios de metástasis no se conoce. Esta
posibilidad fue explorada mediante MDA-MB-231 (con un 85% CD44 + / CD24 -
subpoblación) y MDA-MB-468 células (con <3% CD44 + / CD24 - subpoblación). Las
células cancerosas que metástasis a pulmones fueron clasificados e identificados
utilizando anticuerpos CD326, que sólo reconoce las células epiteliales humanas. CD44 y
CD24 expresión en los padres y la metástasis de pulmón de células (LMD-231 y LMD-
468) fueron analizadas por citometría de flujo. El CD44 y CD24 perfiles de expresión
LMD-468 y LMD-231 células fueron similares a las de los padres células (Figura 5 bis y
datos no presentados). Así, en los sitios de metástasis, el cáncer de células fenotipo
sobre la base de CD44 y CD24 expresión no cambia significativamente en comparación
con la de los padres las células cancerosas. Además, es poco probable que pocos
CD44 + / CD24 - de las células MDA-MB-468 células contribuido a la metástasis del
pulmón y luego avanzó a convertirse en CD44 + / CD24 +.

A continuación, examinó si LMD-468 células expresan niveles más altos de metástasis

pulmonares firma genes que los padres las células. Metástasis de pulmón firma de genes
se definieron a partir de clonal variantes de MDA-MB-231 células que crecieron en los
pulmones después de la inyección intracardiaco [30]. Todos los anteriormente descritos
metástasis pulmonar firma genes que hemos probado se expresaron en LMD-231 células.
En contraste, la mayoría de estos genes no se expresan en ambos MDA-MB-468 y LMD-
468 células (Figura 5b]. Por otra parte, TTM-436 células, que crecen en los pulmones, no
expresan la mayoría de las metástasis pulmonares firma genes. Estos resultados sugieren
que las metástasis pulmonares firma la expresión génica no es absolutamente necesario
para la metástasis de pulmón de células del cáncer de mama.

Discusión
CD44 + / CD24 - fenotipo de células del cáncer de mama se asocia con
propiedades invasivas

Hemos investigado la importancia del tallo / progenitoras fenotipo definido por la

positividad de CD44 y CD24 negatividad para células del cáncer de mama a invadir y
metastizar. La metástasis es un proceso complejo que involucra la actividad integrada de
los genes, que funcionan en pasos discretos que son los siguientes: la angiogénesis,
invasión, intravasation, la supervivencia en circulación, la extravasación y la vivienda y la
proliferación en los sitios de metástasis [19, 34]. Estos genes incluyen UPA / UPA
receptor, MMPs, citocinas como la IL-1, IL-6, IL-8 e IL-11, la hormona paratiroidea
relacionadas con el péptido y el receptor de quimiocinas CXCR4 [12, 14, 21, 31]. En este
sentido, ponen de manifiesto que varios de estos genes se expresan en las líneas
celulares que contienen un gran número de CD44 + / CD24 - las células y que el patrón de
expresión de estos genes y el CD44 + / CD24 - se correlaciona con el fenotipo invasivo
comportamiento de líneas celulares. Sin embargo, el CD44 + / CD24 - fenotipo no es
suficiente para la vivienda y el crecimiento en los sitios de metástasis. De este modo, los
pasos en la cascada de eventos necesarios para la propagación del cáncer dependen de
los distintos grupos de genes, y el CD44 + / CD24 - fenotipo puede definir la expresión del
grupo de genes implicados en la invasión.

CD44 y CD24 se ha demostrado que regular invasión y metástasis de células del cáncer
de mama, ya sea positiva o negativamente. Aunque la mayoría de los estudios han
demostrado CD44 mediado por invasión de células del cáncer de mama [35, 36], López y
compañeros de trabajo [37] mostró inhibición de la metástasis del cáncer de mama de
esta molécula. Del mismo modo, CD24 ha demostrado para promover [38] o inhibir [39],
invasión y metástasis de células del cáncer de mama. Sin embargo, la asociación de
CD44 + / CD24 - con la invasión fenotipo observado en este estudio no está vinculado a la
función de estos genes porque MDA-MB-468 células que expresan tanto CD24 y CD44 no
invadir. Además, la CD44 + / CD24 - subpoblación de TTM-436 es más invasivo que el
CD44 + / CD24 + subpoblación de la misma línea celular (Figura 3b]. De este modo, los
invasores de propiedad es intrínseca a las células de CD44 + / CD24 - fenotipo. Que entre
los genes expresados en CD44 + / CD24 - las células invasoras confiere el fenotipo aún no
se ha determinado porque CD44 + / CD24 - y CD44 + / CD24 + subpoblaciones de TTM-
436 células expuestas modestas diferencias en los niveles de expresión de los genes
probados proinvasive pero exhiben diferencias en la invasión. En el original estudio sobre
el cáncer de mama tumorigénicos células progenitoras [9] CD10 y CD140b fueron
utilizados como marcadores de linaje, por lo que el cáncer de células que expresan CD10
o CD140b fueron excluidos de células progenitoras. Sin embargo, el cáncer de mama
varias líneas celulares que hemos examinado y expresar CD10 se considera un marcador
de células basales [25]. Estudios están en curso para determinar si los CD44+ / CD24 -
subpoblación pueden subdividirse a su vez basado en la expresión de marcadores como
el CD10 y si esos subconjuntos han única invasión / metástasis propiedades.

La metástasis invasoras propiedades de varias de las líneas celulares que hemos

utilizado en este estudio fueron examinados por otros antes de la determinación de
CD44 + / CD24 - células, y la mayoría de estos estudios de correlación con las
propiedades invasivas ER-α y / o expresión de la condición de marcadores
mesenquimales como la vimentina o MMPs [24, 40, 41]. Estos estudios establecieron una
tendencia general hacia una mayor agresividad de ER-α-negativos células del cáncer de
mama. Sin embargo, no todos ER-α-fueron negativos células invasoras (MDA-MB-468 y
SK-BR-3 células, por ejemplo) [24, 42]. Nuestro estudio muestra claramente una
asociación directa entre el CD44 + / CD24 - fenotipo y la invasión. Sin embargo, ni nuestro
estudio ni estudios previos revelaron una asociación entre la vivienda y la proliferación en
los sitios de metástasis y ER-α, mesenquimales marcador de expresión, o CD44 + /
CD24 - fenotipo. Por ejemplo, el ER-α-positivas y negativas-vimentina línea de células
MCF-7 que carecen de CD44 + / CD24 - subpoblación formas osteosclerotic lesiones
óseas en intracardiaco inyección en ratones nude [32]. Del mismo modo, se observó
metástasis de pulmón MDA-MB-468 células, que son ER-α negativo y vimentina negativo,
y carecen de una CD44 + / CD24 - subpoblación. En contraste, la vimentina-positivas y
ER-α-negativos Hs578T línea celular, que tiene un 86% CD44 + / CD24 - subpoblación, no
para formar metástasis de pulmón. La menor diferencia en nuestros resultados y datos
publicados anteriormente en relación con metástasis hematógena de Hs578T en la
almohadilla de grasa mamaria inyección [24] es probablemente debido a la baja
frecuencia de metástasis (10%). Además, no observar SUM1315 metástasis de las
células, con un 97% CD44 + / CD24 - subpoblación, en ratones desnudos, aunque
estudios previos han demostrado metástasis óseas de estas células en nonobese
diabéticos / inmunodeficiencia combinada severa con ratones humanizados, pero no
huesos del ratón [43].

En un estudio complementario, Abraham y compañeros de trabajo [44] informó de que la

prevalencia de CD44 + / CD24 - las células (con tumores> 10% de CD44 + / CD24 - las
células cancerosas) en el 22% de las muestras tumorales. La prevalencia de estas células
en correlación con metástasis a distancia, pero no otros parámetros clínicos. Nuestros
datos sugieren que el CD44 + / CD24 -población desempeña un papel fundamental en el
paso invasoras de metástasis. Por lo tanto, metástasis a distancia en pacientes con
niveles elevados de CD44 + / CD24 - las células pueden estar relacionados con una mayor
invasividad de las células cancerosas. Es posible que el establecimiento de crecimiento
en los sitios de metástasis está controlada por un conjunto de genes cuya expresión no
guarda relación con el CD44 + / CD24 - fenotipo. Una opinión es que la reducción de
expresión de genes implicados en la celda de la comunicación celular inicia la invasión,
mientras que la re-expresión de genes implicados en la celda de la comunicación celular
es esencial para la supervivencia y el reattachment de metástasis [45]. Por lo tanto, el
crecimiento metastásico puede ser determinada principalmente por vías de señalización
que controlan la re-expresión de células de genes de comunicación celular, que puede ser
más influidos por el órgano-específicas microambiente. En este sentido, la transformación
del factor de crecimiento-β-activado vía de señalización se propone desempeñar un papel
importante en el crecimiento de células cancerosas en los sitios de metástasis [13, 14].
Aunque estudios previos han identificado metástasis pulmonar firma genes utilizando
MDA-MB-231 células como un modelo del sistema [30], nuestros estudios revelan que el
mismo conjunto de metástasis pulmonares firma genes no esté implicado en la metástasis
de MDA-MB-468 células. Por lo tanto, estudios adicionales se requieren para dilucidar los
mecanismos de crecimiento celular del tumor en los sitios de metástasis.

CD44 + / CD24 - fenotipo puede definir los cánceres de mama de basal /

mioepiteliales origen

Estudios de perfiles moleculares han clasificado para los cánceres de mama con cinco
tipos distintos importancia pronóstica: luminal de tipo A, tipo B luminal, ErbB2 positivos,
como normal-, y de tipo basal [28, 29]. Luminal pacientes con tumores de tipo A tienen el
pronóstico más favorable, mientras que los pacientes con las concentraciones basales de
los tumores de tipo tienen peor pronóstico. El cáncer de mama líneas celulares también
han sido clasificados en cinco grupos - luminal, basal, mesenquimales, ErbB2 positivos, y
mioepiteliales - sobre la base de perfiles de expresión génica [25, 27]. Como por perfiles
de expresión génica, basales y células mesenquimales son similares a excepción de la
expresión diferencial de genes 227. Curiosamente, todas las líneas celulares que figuran
CD44 + / CD24 - la población se encuentran en la basal / mesenquimales o el grupo
mioepiteliales (Tabla 1]. Así, el eje / células progenitoras para luminal y ErbB2 positivos
cánceres de mama, que representan la mayoría de los cánceres de mama, aún no se han
identificado. En este sentido, un «lado la población" de las células con alta capacidad de
flujo de salida de drogas ha sido descrito como el cáncer de células madre para el cáncer
de mama, cáncer de pulmón, glioblastoma y [46, 47]. Estas células lado la población se
han identificado en el cáncer de mama líneas celulares de tipo luminal, y estas células
sobreexpresan genes transportador ABCG2 (ATP vinculante cassette, subfamilia G,
miembro 2) y ABCA3 (ATP vinculante cassette, subfamilia A, miembro 3) [ 46]. Las células
que expresan altos niveles de CD24 en ratón se definen como células epiteliales
luminales, y Lin - CD29 hi células CD24 + se han definido como las células madre
mamarias en ratones [48, 49]. Tenga en cuenta que todos los luminal tipos de células
contienen desproporcionadamente más altos niveles de CD44 - / células CD24 + (Tabla 1],
y esta población puede contener el cáncer de células progenitoras correspondiente a
luminal tipo de tumores. Identificación de cáncer de las células madre específicas para
luminal las células, que representan alrededor del 70% de los cánceres de mama, puede
permitir una mejor comprensión de los eventos de señalización que participan en
discretos pasos de progresión del cáncer de mama, incluida la metástasis.

Conclusión
En este informe se presenta la relación entre CD44 + / CD24 - fenotipo de células del
cáncer de mama y discretos pasos de la cascada metastásica. CD44 + / CD24 - fenotipo
se asocia con una mejora de las propiedades invasivas y elevada expresión de genes
implicados en la invasión. Un hallazgo sorprendente es la falta de correlación entre
CD44 + / CD24 - fenotipo y la capacidad para el hogar y proliferan en los sitios de
metástasis. Por otra parte, nuestros estudios sugieren que se derivan / células
progenitoras definido por CD24 y CD44 tumorigénicos identificar células progenitoras
correspondiente al tipo basal.

Abreviaturas
ADAMTS = a disintegrin y metalloproteinase con thrombospondin; CTGF = tejido
conectivo del factor de crecimiento; CXCR = CXC receptor de quimioquinas; DMEM =
Dulbecco modificado del águila de mediano; ER = receptores de estrógenos; FCS = suero
de ternera fetal; interleucina IL =; MMP = metaloproteinasas de la matriz; PBS =-Buffer
fosfato salino; LUGAR = receptor activador del factor nuclear κ-B; RT-PCR = transcriptasa
inversa reacción de polimerasa en cadena; UPA = activador del plasminógeno
uroquinasa.

Conflicto de intereses
Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.

Autores de las contribuciones

CS realizó el análisis de las líneas celulares de células madre fenotipo, en el norte de
análisis, intracardiaco inyección, y necropsia de los animales. HK realizado intracardiaco
de inyección y otros formados en esta técnica. RF y CHT llevó a cabo los estudios de
imagen. SM y SB fueron los responsables de la histología. PBN del Norte llevó a cabo
análisis y ensayos de invasión. RG participó en la adquisición de muestras de tumor
primario que se analizaron en paralelo con las líneas celulares. HN ha participado en el
diseño de todos los experimentos, la realización de citometría de flujo, y escribir el
manuscrito.

Agradecimientos
Damos las gracias al Dr YC Yang para IL-11 cDNA, SE Rice y de asistencia en citometría
de flujo. Agradecemos a los Dres Edward Chen, Daniela Matei, y David Donner para
lectura crítica de este manuscrito. Esta labor fue apoyada por las subvenciones de la
American Institute for Cancer Research (03A069-REN), el Instituto Nacional del Cáncer
(R01-CA89153) y la Universidad de Indiana piloto del Centro del Cáncer de Grant (a HN).
HN es Marian J Morrison investigador en la investigación sobre el cáncer de mama.

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