UNIVERSIDAD DE CHILE

FACULTAD DE MEDICINA
ESCUELA DE POSTGRADO

LA HIPOTIROXINEMIA GESTACIONAL AUMENTA LA

PERMEABILIDAD DE LA BARRERA
HEMATOENCEFÁLICA FACILITANDO EL DESARROLLO
DE ENFERMEDADES AUTOINMUNES DEL SISTEMA
NERVIOSO CENTRAL EN LA PROGENIE

PAOLA ANDREA TOLEDO LEIVA

TESIS PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS BIOMEDICAS

Directores de Tesis: Dra. Claudia Riedel Soria

Dra. Mª Cecilia Hidalgo Tapia

2019
2018
2
DEDICATORIA

3
AGRADECIMIENTOS

4
 ÍNDICE GENERAL

ÍNDICE GENERAL……………………………………………………….……………….5

ÍNDICE DE FIGURAS…………………………………………………………….………9

ÍNDICE DE TABLAS……………………………………………………………...……..11

ABREVIATURAS………………………………………………………………….….….12

RESUMEN……………………………………………………………………………..….16

ABSTRACT…………………………………………………………………………...…..18

INTRODUCCIÓN………………………………………………………….………..……20

1. Programación fetal…………………………………………………….………….……20

2. Mecanismos de la programación fetal…………………………………………...……21

2.1. Mecanismos epigenéticos……………………………………………………..….……22

2.2. Función mitocondrial y especies reactivas del oxígeno……………………...………..23

2.3. Estrés del retículo endoplásmico…………………………………………………....…23

3. Hormonas y programación fetal………………………………………….……..…….23

4. Hormonas tiroideas…………………………………………………………………….26

5. Hormonas tiroideas durante la gestación………………………………………….…31

6. Hipotiroxinemia y programación fetal……………………………………….………34

7. Encefalomielitis autoinmune experimental y esclerosis múltiple………………...…38

8. Etiopatogenia de la esclerosis múltiple / encefalomielitis autoinmune

experimental………………………………………………………………………………39

9. La barrera hematoencefálica en la esclerosis múltiple / encefalomielitis autoinmune

experimental………………………………………………………………………………42

10. Posibles mecanismos de la hipotiroxinemia gestacional en el desarrollo de la

neuroinflamación…………………………………………………………………………48

5
11. Alcances del proyecto………………………………………………………..……..…49

HIPÓTESIS……………………………………………………………………….………50

OBJETIVOS…………………………………………………………………….….…..…51

Objetivo general…………………………………………………………….………….…51

Objetivos específicos…………………………………………………………………...…51

1. Análisis de la permeabilidad basal de la barrera hematoencefálica al colorante Evans blue

en ratones gestados en hipotiroxinemia………………...………………………………….51

2. Probar la permeabilidad basal de la barrera hematoencefálica a células inmunes en ratones

gestados en hipotiroxinemia…………………………………………………………….….51

3. Evaluar la infiltración de células inmunes al sistema nervioso central de ratones gestados

en hipotiroxinemia durante la fase inductiva y aguda de la encefalomielitis autoinmune
experimental. ………………………………………………………………………………51

METODOLOGÍA

1. Animales……………………………………………………………………………...…52

2. Inducción de hipotiroxinemia gestacional………………………………………………52

3. Medición de hormonas tiroideas…………………………………………...……………54

4. Metodología específica para el desarrollo del objetivo 1: Análisis de la permeabilidad

basal de la barrera hematoencefálica al colorante Evans blue en ratones gestados en
hipotiroxinemia……………………………………………………………………...……54

4.1. Ensayo de permeabilidad al Evans blue……………………………………….………54

4.2. Espectrofotometría………………………………………………………………….…57

4.3. Procesamiento de las muestras histológicas…………………….…………………..…57

4.4. Inmunohistoquímica……………………………………………….…………………..58

4.5. Microscopía confocal…………………………………………………………….……58

6
5. Metodología específica para el desarrollo del objetivo 2: Probar la permeabilidad
basal de la barrera hematoencefálica a células inmunes en ratones gestados en
hipotiroxinemia……………………………………………………………………...……59

5.1. Transferencia adoptiva de esplenocitos totales………………………….…….……59

5.2. Obtención de células inmunes…………………………………………………….…62

5.2.1. Obtención de células inmunes de la sangre………………………………………… 62

5.2.2. Obtención de células inmunes del bazo…..………………………………………… 63

5.2.3. Obtención de células inmunes del sistema nervioso central…………………………63

5.3. Citometría de flujo……………………………………………………………………64

6. Metodología específica para el desarrollo del objetivo 3. Evaluar la infiltración de

células inmunes al sistema nervioso central de ratones gestados en hipotiroxinemia
durante la fase inductiva y aguda de la encefalomielitis autoinmune
experimental………………………………………………………………………………69

6.1. Inducción de la encefalomielitis autoinmune experimental activa crónica

monofásica………………………………………………………………………………...72

6.2. Inducción de la encefalomielitis autoinmune experimental

pasiva…………………………………………………………………………...………….72

7. Metodología para el cálculo de n muestral…………………………………………… 73

8. Análisis estadístico…………………………………………………………………...…76

RESULTADOS

1. El tratamiento con metimazol durante la preñez induce hipotiroxinemia en los

ratones gestantes…………………………………………………………….………….…77

2. Objetivo 1: Análisis de la permeabilidad basal de la barrera hematoencefálica al

colorante Evans blue en ratones gestados en hipotiroxinemia…………………………80

3. Objetivo 2: Probar la permeabilidad basal de la barrera hematoencefálica a células

inmunes en ratones gestados en hipotiroxinemia………………………………………94

7
4. Objetivo 3: Evaluar la infiltración de células inmunes al sistema nervioso central de
ratones gestados en hipotiroxinemia durante la fase inductiva y aguda de la
encefalomielitis autoinmune experimental……………………………………………123

DISCUSIÓN……………………………………………….……………………….……158

CONCLUSIÓN………………………………….…………………………………….....172

BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………………...……173

ANEXO 1…………………………………………………………………………………199

ANEXO 2…………………………………………………………………………………217

8
 ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Causas y consecuencias de la programación fetal…………………………...25

Figura 2. La glándula tiroides y la síntesis de hormonas tiroideas……………………28

Figura 3. Mecanismo genómico de acción de las hormonas tiroideas en la célula

blanco……………………………………………………………………………………...30

Figura 4. Cambios en las concentraciones séricas de hormonas tiroideas maternas y

fetales durante la gestación………………………………..……………………………..33

Figura 5. La gestación en HTX adelanta el inicio y aumenta la severidad de la EAE en

la progenie………………………………..………………………………………………..37

Figura 6. Activación de los linfocitos T CD4+ autorreactivos y daño del SNC en la

EAE………………………………..…………………………………………………….....41

Figura 7. Estructura de la barrera hematoencefálica………………………………..…43

Figura 8. Migración de las célula inmunes a través del endotelio de la BHE………....47

Figura 9. Inducción de HTX en ratones gestantes de la cepa C57BL/6 CD45.2……...53

Figura 10. Evaluación de la permeabilidad al EBD de la BHE de ratones gestados en

HTX………………………………..……………………………………………………....56

Figura 11. Evaluación de la permeabilidad basal a células inmunes de la BHE en

ratones gestados en HTX………………………………………………………………....61

Figura 12. Estrategia de selección para la identificación de las poblaciones de células

inmunes por citometría de flujo……………………………………………………….....67

Figura 13. Inducción de la EAE pasiva a ratones CD45.2 gestados en HTX………...70

Figura 14. Inducción de la EAE crónica monofásica a ratones CD45.2 gestados en

HTX posterior a la transferencia adoptiva de esplenocitos de ratón CD45.1 sano…...71

Figura 15. Inducción de HTX gestacional………………………………………………79

Figura 16. La HTX gestacional produce un aumento de la permeabilidad de la BHE al

EBD en la progenie………………………………………………………………………..84

Figura 17. La HTX gestacional produce un aumento de la permeabilidad de la BHE al

EBD en la progenie………………………………………………………………………..90

9
Figura 18. La HTX gestacional no produce diferencias en la captación del EBD en el
plexo coroideo de la progenie…………………………………..………………………...93

Figura 19. : La migración de esplenocitos CD45.1+ al SNC es similar en la progenie

gestada en HTX con respecto al control en condiciones basales…………………….…97

Figura 20. La migración de neutrófilos al SNC es similar en la progenie gestada en

HTX con respecto al control en condiciones basales…………………………………..101

Figura 21. La migración de células CD11c+ al SNC es similar en la progenie gestada en

HTX con respecto al control en condiciones basales………………………………….105

Figura 22. La HTX gestacional aumenta el ingreso de monocitos inflamatorios, pero

no de los macrófagos al SNC en condiciones no inflamatorias……………………….111

Figura 23. La migración de linfocitos B al SNC es similar en la progenie gestada en

HTX con respecto al control en condiciones basales………………………………….115

Figura 24. La migración de linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+ al SNC es similar en

la progenie gestada en HTX con respecto al control en condiciones basales………..120

Figura 25. La transferencia adoptiva de linfocitos CD45.1+ encefalitogénicos no induce

la EAE a los animales receptores……………………………………………………….126

Figura 26. Los animales gestados en hipotiroxinemia desarrollan la EAE de manera

más precoz……………………………………………………………………………….130

Figura 27. La migración de los esplenocitos CD45.1+ al SNC es similar en la progenie

gestada en HTX en relación al control durante la EAE………………………………134

Figura 28. El ingreso de neutrófilos al SNC es similar en la progenie gestada en HTX

en relación al control durante la EAE…………………………………………...…….138

Figura 29. El ingreso de de las células CD11c+ al SNC es similar en la progenie

gestada en HTX en relación al control durante la EAE………………………………142

Figura 30. La HTX gestacional disminuye el ingreso de macrófagos transferidos al

SNC durante la EAE…………………………………………………………………….147

Figura 31. El ingreso de de las linfocitos B al SNC es similar en la progenie gestada en

HTX en relación al control durante la EAE……………………………………….…..151

Figura 32. La HTX gestacional disminuye el ingreso linfocitos T CD8+ transferidos al

SNC en relación al control durante la EAE……………………………………………155

10
 ÍNDCE DE TABLAS

Tabla 1. Anticuerpos y diluciones utilizados para análisis de citometría de flujo de las

células inmunes del sistema nervioso central, sangre y bazo……………………………68

Tabla 2. N muestral estimado para los experimentos según objetivo……….…………75

Tabla 3. Resumen de resultados obtenidos en el objetivo 1….………..………………159

Tabla 4. Resumen de los resultados obtenidos en el SNC y bazo del grupo HTX en el
objetivo 2 ………………………………………………………………………………...165

Tabla 5. Resumen de los resultados obtenidos en el SNC del grupo HTX durante la fase
inductiva de la EAE en el objetivo 3 .……………………………………………………170

11
 ABREVIATURAS

ACK: tampón de lisis amonio-cloruro-potasio

AJ: uniones adherentes (del inglés “adherent junctions”)
ANOVA: análisis de varianza
APC-CY7: Aloficocianina cyan 7
APC: Aloficocianina
ATA: American Thyroid Association
B220: marcador para linfocitos B
BBB: “blood brain barrier”
BHE: barrera hematoencefálica
BSA: albúmina sérica bovina
CCL2: proteína quimiotáctica de monocitos
CNS: central nervous system
CPA: célula presentadora de antígenos
CpG: regiones del ADN con alta concentración de citosina y guanina
CTRL: control
CXCL12: factor derivado de células del estroma 1
D1: deiodinasa 1
D2: deiodinasa 2
D3: deiodinasa 3
DAPI: 4 ',6-diamino-2-fenilindol
DIT: diyodotirosina
DUOX: duoxidasa
EAE: encefalomielitis autoinmune experimental
EBD: Evans blue dye
EDTA: ácido etilendiaminotetraacético
ELISA: Ensayo inmunoabsorbente acoplado a enzima
FITC: Isotiocianato de fluoresceína
FSC-A: dispersión frontal (del inglés “foward scatter” )

12
hAIT: transportador apical de I- humano
HT: hormonas tiroideas
HTR: Receptor de hormonas tiroideas
HTX + T4: hipotiroxinémico con aporte de T4
HTX: hipotiroxinemia
I- : yoduro
i.p.: intraperitoneal
ICAM-1: Molécula de adhesión intercelular 1
IFN: Interferón
JAMs: Moléculas de adhesión de unión (del inglés “Junctional adhesion molecules” )
IGF: factores de crecimiento insulínicos
IL: Interleuquina
LAT: transportadores de aminoácidos tipo-L
LPS: lipopolisacárido
LT3: T3 libre
LT4: T4 libre
MAPK: Proteína quinasa activada por mitógeno
MBP: Proteína básica de la mielina
MCT: transportadores de monocarboxilato
miRNA: micro-RNA
MIT: monoyodotirosina
MMI: metimazol
NIS: simporter Na+/I-
NRE: elementos de respuesta negativa a hormonas tiroideas
OATP: transportadores de aniones orgánicos
p.i: post inmunización
PAF: paraformaldehído
PBS: solución tampón fosfato
PE: R-ficoeritrina
Pe-Cy7: Ficoeritrina Cyan 7
PE: Ficoeritrina

13
PerCP-Cy5.5: Clorofila peridinina Cyan 5.5
PKC: proteína quinasa C
MOG: glicoproteína de la mielina del oligodendrocito
pMOG: péptido de la glicoproteína de la mielina del oligodendrocito
PPAR: receptor activado por proliferadores lisosomales
MBP: proteína básica de la mielina
PLP: proteína proteolipídica
RIA: radio inmunoensayo
ROS: especies reactivas de oxígeno
RT: room temperatura (temperatura ambiente)
RXR : receptor de ácido retinoico
SEM: error medio estándar
SNC: sistema nervioso central
SSC: Dispersión lateral (del inglés “side scatter”)
T3: 3,5,3’-triyodotironina
T3r: T3 reversa
T4 : 3,5,3’,5’-tetrayodotironina
TBG: globulina de unión a tiroxina
TCA: ácido tricloro acético TG: tiroglobulina
TGF-β: factor de crecimiento transformante- beta
TH: thyroid hormones
THR: receptor de hormonas tiroideas
TJ: uniones estrechas (del ingés “tight junctions”)
TNF-α: factor de necrosis tumoral-alfa
TOX: control positivo inyectado con toxina pertussis i.p.
TP: toxina pertussis
TPO: tiroperoxidasa
TRE: elemento de respuesta a hormonas tiroideas
TRH: hormona liberadora de tirotropina
TSH: hormona estimulante d ela tiroides

14
tT3: T3 total
tT4: T4 total
VCAM-1: Molécula de adhesión vascular celular 1

15
 RESUMEN

La hipotiroxinemia (HTX) es una condición asintomática muy frecuente durante el

embarazo, la que puede causar alteraciones cognitivas en la progenie. Estudios previos han
mostrado que la HTX gestacional acelera el desarrollo de la encefalomielitis autoinmune
experimental (EAE) en la progenie, un modelo de estudio para la esclerosis múltiple. Los
ratones gestados en HTX tienen niveles séricos elevados de IL-17, una citoquina
proinflamatoria muy importante para el desarrollo de la EAE. IL-17 aumenta la
permeabilidad de la barrera hematoencefálica (BHE), lo que permite la infiltración de células
inmunes al sistema nervioso central (SNC) provocando el daño tisular.

En base a esta evidencia, proponemos la siguiente hipótesis de trabajo: “Ratones

gestados en HTX tienen alterada la BHE, lo que permite un aumento de la migración de
células inmunes al SNC durante la EAE”. Para evaluar esta hipótesis, propusimos los
siguientes objetivos específicos: 1. Analizar la permeabilidad basal de la BHE al colorante
Evans blue (EBD) en ratones gestados en HTX. 2. Poner a prueba la permeabilidad basal de
la BHE a células inmunes en ratones gestados en HTX. 3. Evaluar la infiltración de células
inmunes al SNC de ratones gestados en HTX durante la fase inductiva y aguda de la EAE.

Los animales gestados en HTX mostraron un aumento de la permeabilidad al EBD

en el cerebro y en la médula espinal. Además, un ensayo de transferencia adoptiva de
esplenocitos totales de una cepa congénica mostró que los animales gestados en HTX tenían
un aumento de la migración de monocitos inflamatorios al SNC en condiciones basales.
Finalmente, un ensayo combinado de transferencia adoptiva de esplenocitos totales e
inducción de EAE mostró que los animales gestados en HTX tenían una disminución de la
población de linfocitos T CD8+, linfocitos B y células CD11c+ al día 5 post inducción (p.i.)
asociado a un aumento de los neutrófilos y macrófagos al día 7 p.i. en el SNC.

Los resultados de esta tesis muestran por primera vez que la BHE de la progenie
gestada en HTX tiene un aumento de la permeabilidad en condiciones basales. Además,
sugieren que los animales gestados en HTX tienen una respuesta inmune a la EAE que
favorece la respuesta efectora sobre la actividad regulatoria en las etapas tempranas de la

16
enfermedad. Estos datos apoyan la idea de que la HTX gestacional produce una impronta en
la BHE y en la respuesta inflamatoria de la progenie. Esta impronta ayuda a explicar en parte
por qué la progenie gestada en HTX desarrolla una enfermedad más precoz que los controles.

17
 ABSTRACT

Hypothyroxinemia (HTX) is a very frequent asymptomatic condition during

pregnancy, which can cause cognitive disorders in the offspring. Previous studies have shown
that gestational HTX accelerates the development of experimental autoimmune
encephalomyelitis (EAE) in the offspring, a study model for multiple sclerosis. Mice gestated
in HTX have high serum levels of IL-17, a proinflammatory cytokine that is very important
for the development of EAE. IL-17 increases the permeability of the blood-brain barrier
(BBB), which allows the infiltration of immune cells to the central nervous system (CNS)
causing tissue damage.

Based on this evidence, we propose the following working hypothesis: "Mice

gestated in HTX have altered BBB, which allows an increase in migration of cells of the
immune system to the CNS during EAE". In order to evaluate this hypothesis, we proposed
the following specific objectives: 1. To analize baseline permeability of BBB to Evans blue
dye (EBD) in mice gestated in HTX. 2. To test basal permeability of BBB to immune cells
in mice gestated in HTX. 3. To evaluate the infiltration of immune cells to the CNS of mice
gestated in HTX during the inductive and acute phase of EAE.

Animals gestated in HTX showed an increase permeability to EBD in the brain and
spinal cord. In addition, an adoptive transfer assay of total splenocytes from a congenic strain
showed that the animals HTX offspring had an increased migration of inflammatory
monocytes to the CNS under basal conditions. Finally, a combined assay of adoptive transfer
of total splenocytes and induction of EAE showed that the HTX offspring had a decrease in
the population of CD8+ T lymphocytes, B lymphocytes and CD11c+ cells at day 5 post
induction (p.i.) associated to an increase in neutrophils and macrophages at day 7 p.i. In the
CNS.

The results of this thesis show for the first time that BBB of HTX offsprings has an increase
in permeability under basal conditions. In addition, it suggests that animals gestated under
HTX have a distict immune response to EAE that favours the effector response over
regulatory activity at early stages of the disease. These results are a direct evidence that

18
gestational HTX produces an imprinting in BBB and in the progeny inflammatory response.
This imprinting helps to explain partly why HTX offspring develops an earlier EAE than
controls.

19
 INTRODUCCIÓN

1. Programación fetal

El término “programación”, acuñado por Lucas en 1991, se refiere al proceso mediante

el cual cambios específicos en el ambiente intrauterino, durante períodos críticos del
desarrollo embrionario y fetal, pueden gatillar adaptaciones que resultan en cambios
permanentes de la fisiología del conceptus (1).

En 2004, Bateson y cols., publicaron la hipótesis del “origen temprano de las

enfermedades” o “programación fetal”, basados en evidencias epidemiológicas y
experimentales que mostraban que el estado nutricional de la madre durante la gestación
inducía patrones de desarrollo en el feto que lo “prepararían” para el ambiente extrauterino
en el que viviría (2). Sin embargo, si la progenie se encontraba con un ambiente extrauterino
distinto a la “predicción” hecha durante el desarrollo intrauterino, la progenie sería más
susceptible de desarrollar enfermedades crónicas no transmisibles durante la vida adulta (3),
tales como hipertensión arterial, cardiopatía coronaria, resistencia a la insulina y diabetes tipo
2 (4-6).

Desde entonces, los estudios epidemiológicos en humanos han mostrado que las
alteraciones del crecimiento intrauterino, en especial el peso bajo al nacer, se asocian a
múltiples enfermedades del adulto del sistema cardiovascular (7), respiratorio (8), endocrino
(9), inmunológico (10) , nervioso (11), musculoesquelético (12) y metabólico (13). Junto a
esto, estudios experimentales en modelos animales han mostrado que la inducción de
modificaciones en el ambiente intrauterino pueden alterar el desarrollo fetal. La inducción de
estrés materno, hipoxia, insuficiencia placentaria, el déficit de hormonas tiroideas maternas,
la administración de glucocorticoides a la madre y la manipulación de la dieta llevan a
alteraciones post natales de la progenie en la función cardiovascular (14), metabólica (14),
endocrina (14), nerviosa (11, 15) e inmunológica (16).

Es interesante destacar que las diferentes etapas del desarrollo del conceptus son

20
susceptibles a sufrir alteraciones del ambiente intrauterino capaces de causar programación
fetal. Por ejemplo, en un modelo de rata, la alimentación de los animales gestantes con una
dieta baja en proteínas sólo durante el período preimplantacional indujo una disminución del
peso de nacimiento, un aumento de la presión arterial sistólica y una disminución del tamaño
del bazo e hígado en las crías (17); mientras que la inducción de insuficiencia placentaria en
ratas en etapas tardías de la gestación produce una disminución significativa del número de
glomérulos renales en las crías en comparación al control (18). Junto a esto, una misma noxa
puede producir efectos diferentes dependiendo del momento de la gestación en que actúe.
Por ejemplo, la administración de glucocorticoides durante la gestación temprana en un
modelo de rata induce alteraciones sicomotoras y en el comportamiento social de la crías
(19), mientras que la administración de glucocorticoides durante la gestación tardía acelera
la maduración del pulmón, hígado, riñón, intestino y glándulas adrenales en preparación para
la vida extrauterina (20).
Otra característica importante de la programación fetal, son los efectos sobre el
dimorfismo sexual. Por ejemplo, sólo las crías hembras de ratas alimentadas con una dieta
rica en grasas presentan hipertensión arterial en la vida adulta (21). Por el contrario, en un
modelo de insuficiencia placentaria, sólo las crías machos tuvieron aumento de los
triglicéridos plasmáticos y alteraciones en la expresión de enzimas hepáticas en la vida adulta
(22).
En suma, la programación fetal es un proceso complejo, cuyos efectos en la progenie
dependerán del momento, duración, severidad, y tipo de alteración que afecte el desarrollo
del conceptus (23).

2. Mecanismos de la programación fetal

Aunque la correlación entre las alteraciones del crecimiento intrauterino y el riesgo

de desarrollar enfermedades crónicas durante la vida extrauterina es fuerte, los mecanismos
moleculares responsables de los efectos de la programación fetal aún no están del todo
dilucidados. La literatura disponible incluye mecanismos epigenéticos, las especies reactivas
del oxígeno (ROS) y estrés del retículo endoplásmico (24).

21
2.1. Mecanismos epigenéticos

Aunque los estudios de asociación génica han identificados cientos de variantes

asociadas al origen de las enfermedades crónicas, el desarrollo de muchas de estas dolencias
no logra ser justificada por el traspaso de genes solamente (25). Es aquí donde los
mecanismos de control epigenéticos surgen como una explicación detrás de fenómenos
complejos como la programación fetal y el desarrollo de enfermedades crónicas (26).

Se ha reportado que los mecanismos epigenéticos podrían tener un rol en la

programación fetal de la progenie, tanto en humanos como en modelos animales (24). El
mecanismo más estudiado es la metilación del ADN, el que consiste en la adición de un grupo
metilo en el carbono 5 de la citosina mediante una ADN-metiltransferasa, produciendo 5-
metilcitosina. En mamíferos, la metilación del ADN ocurre en residuos de citosina que
preceden a un residuo de guanina (CpG) en regiones del ADN ricas en estas secuencias (“islas
CpG”). Típicamente, cuando la metilación de las islas CpG ocurre en zonas reguladoras del
promotor, ocurre un silenciamiento transcripcional del gen afectado (27). Un segundo
mecanismo epigenético que contribuye a la regulación de la expresión génica es la
modificación post-traduccional de las histonas mediante metilación, fosforilación,
acetilación y ubiquitinización (27). En la programación fetal estos mecanismos están
involucrados en la regulación de la expresión de múltiples genes, entre los que destacan
receptores nucleares relevantes en el metabolismo y función vascular, como el receptor X
hepático (28, 29), el receptor de glucocorticoides (30, 31), el receptor activado por
proliferadores lisosomales (PPAR) (32); y proteínas responsables del desarrollo neuronal
como la reelina y el factor neurotrófico derivado del cerebro (33).

Un tercer mecanismo de regulación epigenética son los micro-RNA (miRNA), los

que son oligonucleótidos no codificantes capaces de bloquear la traducción o mediar la
degradación de los mRNA (24). Los miRNA participan activamente en los procesos
fisiológicos y del desarrollo, desde la implantación del conceptus hasta el periodo postnatal
(34). Sin embargo, los miRNA también participan en la génesis de patologías del embarazo
y en los efectos de éstas sobre la programación fetal (34), como por ejemplo en la privación
nutricional materna (35), diabetes gestacional (36), preeclampsia (37) y el hipotiroidismo
(38-40).

22
2.2. Función mitocondrial y especies reactivas del oxígeno

Las ROS son productos de las reacciones fisiológicas de óxido-reducción de las

células y participan en la proliferación, diferenciación, apoptosis y morfogénesis. Modelos
animales han mostrado que el retardo del crecimiento intrauterino se asocia a un aumento del
estrés oxidativo mitocondrial en el hígado, páncreas y sistema cardiovascular en la progenie,
provocando daño en la programación de las vías metabólicas y de la función vascular,
respectivamente (24).

2.3. Estrés del retículo endoplásmico

Situaciones como la hipoxia y el déficit nutricional materno aumentan la producción

de ROS y la acumulación de proteínas mal plegadas en la placenta y el feto, lo que a su vez
activa las vías de estrés del retículo endoplásmico o la respuesta a proteínas desplegadas.
Aunque el estrés del retículo endoplásmico se asocia a respuestas fetales a corto plazo ante
noxas maternas, los efectos a largo plazo de este mecanismo de adaptación fetal no están
claros (24).

3. Hormonas y programación fetal

Dado que el desarrollo fetal depende primordialmente del aporte de oxígeno y

nutrientes desde la madre (41), la fisiopatología detrás de la asociación entre el bajo peso al
nacer y las alteraciones en el adulto se ha relacionado principalmente con el déficit
nutricional e hipoxia durante las etapas tempranas de la vida (23). Sin embargo, la
disponibilidad de nutrientes y el aporte de oxígeno afectan también el ambiente hormonal, lo
que convierte a las hormonas en un elemento importante en la patogénesis de las
enfermedades durante la vida extrauterina (Figura 1) (42).

23
 C
A
U Ambiente Enfermedades Hormonas Dieta
S glucocorticoides, Madre
Altitud, tóxicos Pre-eclampsia, diabetes Micro y macro
A hormonas tiroideas nutrientes
S

Leyenda en la página siguiente

Tamaño y función placentaria Placenta
P
R
O
G
R Aporte de oxígeno y nutrientes al feto
A Feto
M
A
C
I
Ó Hormonas fetales
N

Programación fetal

E
F
E
C Enfermedades del adulto Adulto
T
O
S

24
Figura 1. Causas y consecuencias de la programación fetal. Factores ambientales y
maternos, tales como enfermedades del embarazo, hormonas y alteraciones en la dieta,
producen cambios en el ambiente intrauterino. Estas modificaciones se traducen en
alteraciones en el aporte de oxígeno y nutrientes al conceptus, las que finalmente producirán
alteraciones en el ambiente hormonal del feto. La interacción de estos elementos activará
mecanismos de programación fetal, los que aumentarán el riesgo de la progenie a desarrollar
enfermedades crónicas durante la vida adulta (Modificado de (23)).

25
 Durante el desarrollo intrauterino, las hormonas ejercen sus efectos fisiológicos
directamente sobre el crecimiento a través de la modulación génica, e indirectamente
mediante cambios en el crecimiento placentario, metabolismo fetal, y en la producción de
factores de crecimiento y otras hormonas por los tejidos feto-placentarios (42).

Por otra parte, los cambios en el medio intrauterino pueden inducir cambios
endocrinos específicos que, dependiendo de la naturaleza, intensidad y duración del estímulo,
podrían alterar los patrones del desarrollo del conceptus, produciendo efectos permanentes
en la vida adulta (42). A modo de ejemplo, un aumento en los niveles de glucocorticoides
durante el embarazo puede producir alteraciones en el eje hipotálamo-hipófisis-adrenal fetal,
las que a su vez se asocian al desarrollo de diabetes mellitus, obesidad, hipertensión arterial
y alteraciones neurosiquiátricas en la etapa adulta (43, 44). De manera similar, la restricción
calórica en la dieta durante el embarazo se asocia a una disminución en la masa de células β-
pancreáticas, de la secreción de insulina y de la tolerancia a la glucosa en la progenie (45).

Las hormonas claves involucradas en estos procesos regulatorios son los

glucocorticoides, la insulina, los factores de crecimiento insulínicos (IGFs) y las HT (42).

4. Hormonas tiroideas

Las HT 3,5,3’,5’-tetrayodotironina (T4) y 3,5,3’-triyodotironina (T3) son las

principales hormonas sintetizadas por la glándula tiroides (46). Las HT son esenciales para
el crecimiento, desarrollo, metabolismo y normal funcionamiento del organismo desde la
etapa embrionaria (46-48).

La síntesis y secreción de las HT ocurre en los tirocitos bajo el estímulo de la hormona

estimulante de la tiroides o tirotropina (TSH), la que es producida y liberada por la
adenohipófisis . Por su parte, la producción de TSH es estimulada por la hormona liberadora
de tirotropina (TRH) producida en el hipotálamo, e inhibida por las HT (47). La TSH se une
a su receptor en la membrana del tirocito, lo que activa una serie de cascadas de señalización
intracelular que activan la expresión de genes que regulan el aumento de la captación de

26
yoduro (I-), la síntesis de tiroglobulina (TG), la transcripción de genes que codifican diversas
proteínas de la maquinaría biosintética de las HT como la duo oxidasa-2 (DUOX) y la
tiroperoxidasa (TPO), la endocitosis de la TG yodada y la secreción de HT al torrente
sanguíneo (46, 49). El I- proveniente de la dieta ingresa al tirocito mediante transporte activo
a través un transportador específico llamado simporter Na+/I- (NIS) que está ubicado en la
membrana basolateral del tirocito. Este sistema utiliza el transporte de Na+ a favor de su
gradiente electroquímico para ingresar el I- a la célula en contra de su gradiente
electroquímico (50). Una vez en el citoplasma, el I- ingresa al coloide mediante mecanismos
de transporte pasivo tales como el transportador pendrina, transportador apical de I- humano
(hAIT) y anoctamina-1, que se ubican en la membrana apical del tirocito (49, 51, 52). El I-
es oxidado por las enzimas DUOX y TPO y luego organificado, es decir, incorporado a
residuos de tirosina de la TG formando mono y di-yodo tirosina (MIT y DIT,
respectivamente) (49). Luego MIT y DIT se unen por enlaces ésteres para formar
yodotironina: dos DIT forman T4 y una MIT con una DIT forman T3 (53) (Figura 2).

27
Figura 2. La glándula tiroides y la síntesis de hormonas tiroideas. La TSH se une a su
receptor en la membrana basolateral del tirocito, lo que lleva a la expresión de genes que
regulan la producción de HT (flechas entrecortadas café marrón). El I- es capturado desde el
torrente sanguíneo por el transportador NIS. Una vez dentro del tirocito, el I- difunde y es
transportado al coloide por la acción de los transportadores pendrina, hAIT y anoctamina-1,
que se ubican en la membrana apical del tirocito. Una vez en el coloide, el I- es oxidado por
la TPO y DUOX, en presencia de H2O2. Luego la TPO cataliza la organificación del I- en la
TG en sus residuos de tirosina. La TG yodada es endocitada, el endosoma se fusiona con los
lisosomas y la TG es hidrolizada por las enzimas lisosomales. Finalmente, se produce la
exocitosis de las hormonas T4 y T3, liberándolas al torrente sanguíneo para ser distribuidas a
todo el organismo (modificado de (54)).

28
 La principal hormona secretada por la tiroides es la T4, que en el torrente sanguíneo
circula unida en un 90% a proteínas como la globulina de unión a tiroxina (TBG) (53). T4
ingresa al interior de las células mediante los transportadores de monocarboxilato (MCT),
transportadores de aniones orgánicos (OATP) y transportadores de aminoácidos tipo-L
(LAT) (55) donde se transforma en T3, la forma biológicamente más activa de las HT, por
acción de las enzimas deiodinasas 1 y 2 (D1 y D2), o es inactivada a T3 reversa (T3r) por la
deiodinasa 3 (D3) (56). El efecto biológico de T3 es principalmente genómico y está mediado
por la unión al receptor de HT (THR) que actúa como factor de transcripción (57). El THR
forma homodímeros y heterodímeros con receptores de ácido retinoico (RXR), y se une a
secuencias específicas del ADN dentro de las zonas regulatorias de una gran variedad de
genes (57). Estas secuencias se denominan “elementos de repuesta a HT” (TRE) y
“elementos de respuesta negativa a HT” (NRE), los que actúan como activadores o
inhibidores de la transcripción génica, respectivamente (58, 59) . Para los TRE, la unión de
T3 a su sitio de reconocimiento induce la disociación de un co-represor y promueve la unión
de un co-activador al complejo RHT-RXR, activando la transcripción génica. Por el
contrario, para los NRE, la acción de T3 induce la disociación de un co- activador y promueve
la unión de un co-represor al complejo RHT-RXR, inhibiendo la transcripción génica (58,
59) (Figura 3).

29
Figura 3. Mecanismo genómico de acción de las hormonas tiroideas en la célula blanco.
Las HT ingresan a la célula a través de transportadores MCT. T4 es convertida a T3 en la
célula por acción de las D1 y D2, o inactivada a T3r. En el núcleo, T3 ejerce su acción
uniéndose a su receptor (THR) que forma homodímeros o heterodímeros con RXR
(esquematizado en la figura). En condiciones basales, el dímero HRT-RXR se encuentra
unido a secuencias específicas en las zonas regulatorias de los genes blancos. Estas
secuencias TRE y NRE actúan como activadores o inhibidores de la transcripción génica,
respectivamente. Para TRE, T3 se une al THR, se disocia un co-represor y se une un co-
activador al complejo, reclutando así la maquinaria transcripcional. Para NRE, se disocia un
co-activador y se une un co-represor, inhibiendo la transcripción génica (Modificado de
(58)).

30
 Además de los efectos sobre la regulación génica, las HT tienen mecanismos de
acción no genómicos, tales como el control de la entrada de calcio al medio intracelular, el
tráfico de proteínas intracelulares, la regulación de la PKC y la activación de la vía de las
MAPK a través de la unión a la integrina αVβ3 en la membrana celular (59).

A pesar de que T4 ha sido considerada como una hormona de reserva, precursora de

la forma biológicamente activa T3, existe evidencia de que T4 también ejerce importantes
efectos biológicos como regular la proliferación celular (60, 61), angiogénesis (62) y
organización del citoesqueleto en astrocitos (63). Aunque el mecanismo de acción de T4 no
está claro, se ha propuesto que esta hormona activaría diferentes cascadas de señalización
intracelular a través del receptor αVβ3 para integrina (61, 62).

5. Hormonas tiroideas durante la gestación

En especies como los humanos y los roedores, el papel de las HT maternas es

fundamental durante todo el desarrollo intrauterino (64), en especial hasta la 12ª semana de
gestación cuando el eje hipotálamo-hipófisis-tiroides fetal comienza a sintetizar HT (65).
Estudios realizados en fetos humanos durante el primer trimestre de la gestación mostraron
que las concentraciones celómicas de T4 se correlacionaban positivamente con los niveles
séricos maternos de T4, pero eran 100 veces menores a los valores de la madre (66). Además,
las concentraciones celómicas de T3 eran casi 10 veces menores que las de T4 (66). Por el
contrario, las concentraciones celómicas de T3 reversa (rT3 , forma inactiva de T3) eran casi
4 veces mayores que los niveles de T4 (66), lo que sugiere que la T4 materna es la principal
HT que cruza la barrera placentaria y, una vez en el feto, es convertida a T3 por la D3 en el
tejido placentario (67, 68). Esto se explica ya que la placenta expresa diferentes
transportadores de HT de manera estratégica en el sinciciotrofoblasto y en el citotrofoblasto,
la mayoría con una mayor afinidad por T4 (55).

Sin embargo, la proporción de T4 no unida a proteínas o T4 libre (LT4) en el embrión

es mucho mayor que en el suero materno, por lo que la concentración de LT4 realmente
disponible para los tejidos alcanza valores comparables a los de la madre (69). Dado que la

31
capacidad de unión de las proteínas fetales a T4 está determinada ontogénicamente, la
disponibilidad de LT4 para los tejidos fetales durante las etapas tempranas del embarazo
depende exclusivamente de la T4 materna (70). Sin embargo, después de iniciada la
producción de HT fetales, la tiroides fetal no es capaz por sí sola de sostener el alza en los
niveles de T4 y LT4 observadas hacia el término del embarazo, tanto por la inmadurez del eje
hipotálamo-hipófisis-tiroides como por la pobre iodinación de la TG en la tiroides del feto
(71). Esto implica que la madre continúa aportando T4 al feto hasta el nacimiento (71). Por
esta razón, el déficit materno de HT, en particular de T4, causa daño irreversible a la progenie
(72-74) (Figura 4).

32
 HT maternas HT fetales + maternas

Producción de HT fetales

T4 materna
Concentración sérica (unidades arbitrarias)

rT3 en feto

T4 en feto
T3 en feto

LT4 en feto
LT4 materna

10 20 30 40
Semanas de gestación

Figura 4. Cambios en las concentraciones séricas de hormonas tiroideas maternas y

fetales durante la gestación. La secreción de HT fetales se inicia aproximadamente a la 12ª
semana de gestación (flecha roja). Antes de ese punto, las HT presentes en el feto son de
origen materno. Luego del inicio de la producción fetal de HT, las HT presentes en el feto
son de origen tanto materno como fetal. Antes de la 12ª semana, las concentraciones de T4
en el feto se correlacionan positivamente con las de la madre en las primeras etapas de la
gestación. Sin embargo, las concentraciones de T3 fetal son bajos, mientras que los niveles
de rT3 fetal son mayores que los niveles de T4 fetal. Esto que sugiere que la principal fuente
de HT para el feto es la T4 materna. Después del inicio de la producción de HT por la tiroides
fetal, las concentraciones de T4 y T3 se acercan a los niveles séricos de la madre. Sin embargo,
la iodinación de la TG en la tiroides del feto es muy pobre. Esto implica que la madre continúa
aportando T4 al feto hasta el nacimiento. (Modificado de (64, 75)).

33
 Las HT son cruciales durante el desarrollo intrauterino ya que participan en el
crecimiento, desarrollo, maduración y adecuado funcionamiento de todo el organismo (76).
En etapas tempranas de la gestación, las HT promueven el desarrollo placentario a través de
la estimulación de la secreción de progesterona, 17β-estradiol, gonadotrofina coriónica
humana, lactógeno placentario y factor de crecimiento epidermal en el trofoblasto (77, 78).
A su vez, el factor de crecimiento epidermal estimula la secreción de gonadotrofina coriónica
humana y lactógeno placentario en el trofoblasto, lo que sugiere la existencia de un sistema
de control paracrino y sinérgico con las HT (79). Por otra parte, durante la gestación
avanzada, la HT son mediadores importantes de los efectos de los glucocorticoides en la
maduración del feto en el preparto (76). Hacia el término del embarazo, el cortisol induce
cambios en la actividad de las enzimas deiodinasas, que culminan en un aumento de los
niveles plasmáticos de la T3 antes del parto (80, 81). Modelos experimentales de
tiroidectomía fetal muestran que la ausencia de este aumento fisiológico de T3 modifica la
expresión del receptor de la hormona de crecimiento e IGF (76). Esto sugiere que las HT
actuarían de manera directa y también como intermediarios en la función de otras hormonas
en el desarrollo placentario, en la regulación del eje somatotópico y en la diferenciación
tisular en preparación para la vida extrauterina (76).

Existe evidencia basada en estudios epidemiológicos en humanos y datos

experimentales que muestran que el déficit de HT puede causar un amplio espectro de
alteraciones en la progenie, con importantes repercusiones durante la vida adulta (82). La
mayor parte de estos reportes muestran asociaciones con alteraciones neuropsiquiátricas (83-
88), posiblemente causadas por defectos en la neurogénesis, migración neuronal y
mielinización en el SNC (89).

6. Hipotiroxinemia y programación fetal

La HTX se caracteriza por una disminución de los niveles de T4 plasmáticos asociado

a niveles de T3 y TSH normales (90). Es una condición frecuente a nivel mundial con
prevalencias en embarazadas que oscilan entre 1,6% y 26,5%, dependiendo del área

34
geográfica (91). En Chile, Castillo y cols. reportaron una prevalencia del 3% en mujeres
cursando embarazos normales (92) .

La principal causa de la HTX materna es el déficit de I- en la dieta (91). Se estima que

el requerimiento de I- de una mujer embarazada es de 250 µg/día, lo que se traduce en una
excreción urinaria entre 150 y 250 µg/L (93). Es condiciones de déficit de I-, la tiroides
favorece la secreción de T3 sobre T4. Esto causa una desaturación progresiva de la TBG,
llevando a una disminución de la LT4. Por el contrario, la T3 circulante se mantiene dentro
de límites normales y sostiene el feedback negativo sobre la adenohipófisis frenando la
secreción de TSH. Esto explica por qué la embarazada hipotiroxinémica es clínicamente
eutiroidea (70).

A pesar de ser una condición asintomática, existen reportes epidemiológicos que

indican que la HTX gestacional se asocia a alteraciones cognitivas en la progenie, tales como
alteraciones del desarrollo sicomotor (94), déficit atencional (95), esquizofrenia (96) y
autismo (74), disminución del coeficiente intelectual (72) y retardo mental (73). Además,
estudios en modelos animales muestran que la HTX materna produce alteraciones de las
sinapsis y el aprendizaje espacial (97); defectos en la citoarquitectura de la corteza
somatosensorial e hipocampo (98, 99); alteraciones en la migración neuronal (100); y
alteraciones en la función motora y auditiva (101). Estas observaciones sugieren que la HTX
es un factor capaz de afectar la programación fetal y producir efectos dañinos en la progenie.

La Asociación Americana de la Tiroides (American Thyroid Association – ATA) en su

guía del 2017, reconoce que la HTX gestacional tiene efectos dañinos en el desarrollo
cognitivo de la progenie, pero no recomienda el tratamiento de rutina con levotiroxina en las
embarazadas con HTX (102). Esto se debe a que los estudios clínicos disponibles no
demuestran un beneficio de la suplementación de T4 en estas mujeres (103, 104). Sin
embargo, la ATA también considera esta recomendación como débil ya que estos estudios
tuvieron fallas en las dosis y el momento de administración del tratamiento fue posterior a
las 12 semanas de gestación (90).

Estudios realizados en nuestro laboratorio muestran que la HTX gestacional podría

35
además ser un factor de riesgo en el desarrollo de enfermedades neuroinflamatorias (105).
Nuestros datos muestran que la progenie gestada en HTX desarrolla una EAE más precoz y
severa que los controles gestados en condiciones eutiroideas, asociado a un mayor número
de linfocitos T CD4+ y CD8+ infiltrantes en la médula espinal (Figura 5).

36
Figura 5. La gestación en HTX adelanta el inicio y aumenta la severidad de la EAE en
la progenie. A) La EAE es más precoz y alcanza puntajes clínicos más elevados en los
ratones gestados en HTX que en condiciones de eutiroidismo. B) Los ratones gestados en
HTX tienen niveles séricos de IL-17 más altos que los controles. C) y D) El análisis
cuantitativo de células T CD4+ y CD8+ por inmunofluorescencia en la médula espinal
muestra un aumento de estas células en los ratones con EAE gestados en HTX. Offspring =
progenie; ET = eutiroidismo (Modificado de (105)).

37
7. Encefalomielitis autoinmune experimental y esclerosis múltiple

La esclerosis múltiple es una enfermedad autoinmune, inflamatoria, desmielinizante,

degenerativa e irreversible del SNC. Es la primera causa no traumática de discapacidad
neurológica en adultos jóvenes, lo que implica serias repercusiones personales, sociales y
económicas (106, 107). Existen 2,5 millones de enfermos de esclerosis múltiple en el mundo
(International Multiple Sclerosis Federation). En Chile, un estudio realizado en la región de
Magallanes mostró una prevalencia cercana a los 14 por 100.000 habitantes (108), mientras
que un estudio basado en registros hospitalarios estimó una incidencia promedio anual de 0.9
por 100.000 habitantes (109). La esclerosis múltiple es heterogénea en sus manifestaciones
clínicas, ya que dependen de la zona afectada del SNC y de su evolución en el tiempo. El
85% de los afectados presenta inicialmente la forma “remitente recurrente”, caracterizado
por la aparición errática de episodios de déficit neurológico de recuperación espontánea. De
estos, alrededor de un 65% evoluciona a una forma de deterioro neurológico gradual llamada
“secundariamente progresiva”. El 15% de los casos presenta la forma “primariamente
progresiva” que se caracteriza por un menoscabo neurológico continuo desde el inicio de la
enfermedad (110). La esclerosis múltiple es considerada una enfermedad de etiología
multifactorial, resultado de la interacción de factores genéticos, epigenéticos y ambientales
(111). Desafortunadamente, los tratamientos disponibles sólo modifican la evolución de la
enfermedad, sin ser curativos (107).

Debido a la etiopatogenia compleja de la esclerosis múltiple y la inaccesibilidad de

muestras histológicas de pacientes, gran parte del conocimiento sobre la patogénesis de la
esclerosis múltiple proviene del estudio del modelo animal de la EAE (112, 113). La EAE es
inducida en ratones genéticamente susceptibles a desarrollar la enfermedad. El
procedimiento consiste en la inmunización de los animales con una emulsión que contiene el
antígeno y coadyuvantes. Los antígenos más utilizados son proteínas de la mielina tales como
la proteína básica de la mielina (MBP), la proteína proteolipídica (PLP) y la glicoproteína de
la mielina del oligodendrocito (MOG), o péptidos de dichas proteínas (113). La inoculación
es complementada con la administración de toxina pertussis (TP) i.p., un coadyuvante que
facilita la inducción de la EAE mediante la diferenciación de células Th 1 y Th 17 (114, 115)
y el aumento de la permeabilidad de la BHE al paso de células inflamatorias al SNC (116).

38
8. Etiopatogenia de la esclerosis múltiple / encefalomielitis autoinmune experimental

Aunque se desconoce el evento que gatilla la esclerosis múltiple, se sabe que el

sistema inmune monta una respuesta inflamatoria local que produce la desmielinización y
muerte del oligodendrocito, lo que finalmente llevará al daño axonal y pérdida neuronal en
el SNC (117). Existen reportes de la existencia de linfocitos T autorreactivos contra MOG
(118), MBP (119-121) y PLP (121) dentro del repertorio de las células T en sangre y líquido
cefalorraquídeo, tanto de personas sanas como con esclerosis múltiple. Se piensa que estas
células serían re-activadas por células presentadoras de antígenos residentes (CPA) del SNC
(122, 123). Sin embargo, no está claro cómo estos linfocitos autorreactivos se activarían en
la periferia de los pacientes afectados por esclerosis múltiple (122, 123). Se sugiere que serían
activados por antígenos externos mediante una reacción antigénica cruzada iniciando así la
enfermedad (122, 123).

Basado en estudios realizados en EAE, se sabe que los linfocitos T CD4+

autorreactivos son activados en los linfonodos cervicales (124), luego se agrupan en el bazo
(125), y desde allí ingresan al SNC a través de los vasos meníngeos donde son reactivadas
por CPA locales (126-128). Esta interacción llevará a la producción de mediadores
inflamatorios, a la disrupción de la BHE (129, 130) y el reclutamiento de otras células
inflamatorias al SNC (131), produciendo así el daño directo al tejido (Figura 6). Diferentes
poblaciones de células inmunes están involucradas en la patogenia de la EAE, entre las que
destacan los monocitos, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, linfocitos B, linfocitos
T CD4+ y CD8+ (132-136).

39
 Activación de macrófagos/células
Parénquima SNC Macrófago/célula dendríticas locales y microglia
dendrítica
perivascular

Citoquinas
proinflamatorios

Reactivación
del linfocito T
Presentación Liberación de mediadores
antigénica solubles

Leyenda en la página siguiente

APC

Linfocitos
B

Linfocito T Monocitos Linfocitos Desmielinización

CD4+ inflamatorios / T CD4+ Neutrófilos
autorreactivo macrófagos /
células dendríticas
Linfocito T
regulador

Linfonodo cervical
Oligodendrocito
Neuronas con
mielina dañada

Espacio subaracnoideo
astrocitos

Vaso meníngeo
Activación de la BHE e
infiltración inflamatoria

40
Figura 6. Activación de los linfocitos T CD4+ autorreactivos y daño del SNC en la EAE.
Los linfocitos T CD4+ autorreactivos son activados por CPA en los linfonodos cervicales.
Los linfocitos T CD4+ ya activados ingresan al espacio subaracnoideo a través de los vasos
meníngeos, donde son re-activados por CPA locales (macrófagos perivasculares y células
dendríticas). La reactivación del linfocito T CD4+ lleva a la producción de citoquinas
inflamatorias que activan a otras CPA locales y microglía, las que liberaran mediadores
solubles capaces de iniciar el proceso de desmielinización. Además, estos mediadores activan
la BHE permitiendo el ingreso de otras células inmunes al parénquima del SNC (monocitos
inflamatorios, macrófagos, células dendrítcas, neutrófilos, linfocitos T y linfocitos B)
aumentando el daño a la mielina (modificado de (137)).

41
9. La barrera hematoencefálica en la esclerosis múltiple / encefalomielitis autoinmune
experimental

El SNC es considerado como un sitio “inmuno-privilegiado”, ya que la actividad

inmunológica local depende de la habilidad de las células inmunes de acceder y actuar en
este ambiente (138). Esta característica es atribuida principalmente a la existencia de la BHE,
ubicada en los capilares y vénulas post-capilares, que aísla al parénquima de la circulación
sanguínea controlando finamente la entrada y salida de moléculas y células al SNC (139). En
la superficie luminal, se encuentran células endoteliales altamente especializadas y
organizadas que están unidas entre sí por uniones estrechas o tight junctions y uniones
adherentes (140). Las tight junctions están formadas por las proteínas claudina, ocludina y
moléculas de adhesión de la unión, mientras que las uniones adherentes están formadas
principalmente por caderinas (140). En la superficie abluminal de las células endoteliales se
encuentran los pericitos y la lámina basal, la cual está compuesta por colágeno tipo IV,
lamininas, fibronectina, entactina, trombospondina y varios proteoglicanos (141-144). En
continuidad a la lámina basal se localizan los astrocitos, cuyo contacto/comunicación con las
células endoteliales es fundamental para la mantención de la integridad de la BHE (139, 144)
(Figura 7).

42
Figura 7. Estructura de la barrera hematoencefálica. (A) En la superficie abluminal de la
célula endotelial se encuentran la lámina basal y los pericitos. Los pies de los astrocitos entran
en contacto con las células endoteliales, manteniendo así la integridad de la BHE. (B) Las
células endoteliales se unen entre sí por tight junctions (TJ) y uniones adherentes (AJ). Las
TJ están formadas por claudina, ocludina y moléculas de adhesión de la unión (JAM).
Claudina y ocludina se unen a proteínas andamio de la zónula occludens, las que a través de
otras proteínas se anclan a los filamentos de actina del citoesqueleto. AJ están formadas por
caderina, la que se une a proteínas de andamio llamadas cateninas para unirse a los filamentos
de actina (Modificado de (140)).

43
 Se ha descrito que la permeabilidad de la BHE aumenta durante la esclerosis múltiple
y EAE, lo que incrementa la entrada de células inmunes al SNC (129, 145). Una de las
citoquinas efectoras importantes en la patogenia de la esclerosis múltiple y EAE es la IL- 17
(146-149). IL-17 ha mostrado tener un papel relevante en los cambios que ocurren en la BHE
-/-
durante la EAE (150). Huppert y cols. mostraron que ratones IL-17 al igual que ratones
wild type tratados con un anticuerpo anti-IL-17, presentan una disrupción menor de la BHE,
demostrado mediante una reducción de la extravasación del colorante EBD e
inmunoglobulina G (151). Estudios realizados tanto in vivo como in vitro muestran que IL-
17 estimula la producción de citoquinas y quimioquinas proinflamatorias en los astrocitos
(152-155). Por otra parte, estudios en cultivos de monocapas de células endoteliales de BHE
muestran que IL-17 aumenta la permeabilidad de estas “barreras” artificiales de manera dosis
dependiente (150), induce la secreción de ROS que llevan al desacoplamiento de las tight
junctions (151), induce la expresión de mediadores proinflamatorios y promueve la
transmigración de linfocitos T CD4+ (156).

Durante el desarrollo de la EAE, es posible detectar precozmente la secreción de IL-

17 en los linfonodos (133), al igual que la presencia de linfocitos Th 17 en el SNC (134).
-/-
Komiyama y cols. mostraron que ratones knock-out para el gen de la IL-17 (IL-17 )
presentaban una EAE más leve, de inicio más tardío y con menor infiltración de células
mononucleares en la médula espinal, comparado con los ratones controles (147). Por otra
parte, Tzartos y cols., en un estudio de muestras histológicas de pacientes con esclerosis
múltiple, encontraron un aumento significativo en el número de células Th17 y en la
expresión de IL-17 en las áreas activas de lesiones desmielinizantes (149).

Es interesante destacar que datos preliminares no publicados de nuestro laboratorio

muestran que los ratones gestados en HTX tienen niveles plasmáticos mayores de IL-17, en
condiciones basales, que los ratones gestados en eutiroidismo (Figura 5). Estos datos
sugieren que podría existir un aumento de la permeabilidad de la BHE de los ratones
gestados en HTX, que facilitaría el ingreso de células del sistema inmune al SNC y los
haría más susceptibles a desarrollar una respuesta inflamatoria al inducirles la EAE.

En condiciones fisiológicas, el ingreso de células del sistema inmune, principalmente

linfocitos T CD4+ de memoria, queda restringido al líquido cefalorraquídeo, donde tendrían

44
una función de inmunovigilancia ante potenciales agentes infecciosos (138, 157, 158). Al
mismo tiempo, la BHE restringe la entrada de leucocitos al parénquima del SNC (159). Por
el contrario, en situaciones patológicas, la activación de las células endoteliales y los
astrocitos de la BHE lleva a una reducción de las tight junctions y a la formación de canales
transendoteliales (160-162), facilitando así la migración de los leucocitos a través de la BHE
hacia el SNC (163-165). En el modelo de la EAE, se ha visto que diferentes subtipos de
células inmunes cruzan la BHE e ingresan al parénquima del SNC: linfocitos T, linfocitos B,
neutrófilos, monocitos, macrófagos y células dendríticas (166, 167). Esto se debe al aumento
en los niveles de citoquinas durante la enfermedad, las que activan a las células endoteliales
de la BHE para que secreten quimioquinas y moléculas de adhesión celular (139).
Inicialmente, las células inmunes circulantes entran en contacto transitorio con las
células endoteliales mediante selectinas, en un proceso llamado anclaje o tethering (168).
Luego, las células inmunes ruedan sobre la superficie de las células endoteliales en busca de
quimioquinas específicas, en un proceso llamado ruedo o rolling que llevará a la activación
de integrinas en las células inmunes (169-171). Este proceso resulta en el arresto y adhesión
de las células inmunes a la superficie de la célula endotelial mediante la interacción entre las
integrinas de superficie de las células inmunes y sus respectivos ligandos en la célula
endotelial (139). A continuación, se produce la extravasación de las células inmunes por rutas
paracelulares o transcelulares a través de la BHE (172). Finalmente, los leucocitos cruzan la
lámina basal e infiltran el parénquima del SNC (173). Este último paso se ve facilitado por
los linfocitos T que estimulan a los monocitos y macrófagos a secretar metaloproteinasas que
degradan la matriz extracelular (174) (Figura 8).

45
Leyenda en la página siguiente

46
Figura 8. Migración de las célula inmunes a través del endotelio de la BHE. Las células
circulantes del sistema inmune entran en contacto transitorio con las células endoteliales en
un proceso llamado anclaje y ruedo mediado por selectinas. Luego, se produce la activación
de integrinas en las células inmunes. Las integrinas interactúan con sus ligandos en la
superficie de las células endoteliales produciendo el arresto y adhesión de las células inmunes
al endotelio. Finalmente, se produce la transmigración de las células inmunes a través del
endotelio mediante rutas paracelulares o transcelulares. Las células inmunes atraviesan la
membrana basal endotelial, interactúan con células del espacio perivascular y luego cruzar
la membrana basal glial. Una vez que las células inmunes alcanzan el parénquima del SNC
interactúan interactuar con las neuronas y células gliales residentes (Modificado de (168-170,
172-175)).

47
10. Posibles mecanismos de la hipotiroxinemia gestacional en desarrollo de la
neuroinflamación

En condiciones fisiológicas, existe una comunicación y regulación bidireccional entre

las HT y el sistema inmune (176, 177). Esta interrelación se hace más evidente en situaciones
patológicas, donde la respuesta inmune puede verse afectada tanto por el déficit como por el
exceso de HT (178).

Existe evidencia que muestra que la participación de las HT en el desarrollo y la

regulación del sistema inmune se inicia durante la gestación (179-181). Lam y cols.
encontraron que embriones de pez cebra expuestos a un inhibidor de la síntesis de HT tenían
alteraciones en el desarrollo del timo y de la linfopoiesis (182). De manera similar, estudios
en ratas mostraron que el déficit de HT durante la gestación produce alteraciones en las
poblaciones de células inmunes en la sangre, el bazo y el timo de la progenie (183, 184).
Lamentablemente, estos estudios no incluyeron el análisis del sistema inmune en etapas
posteriores de la vida de la crías, por lo que no aportan indicios sobre los posibles
mecanismos mediante los cuales la progenie gestada en HTX desarrolla una EAE más precoz.

Sin embargo, existen datos que muestran que las HT producen cambios epigenéticos
que podrían estar relacionados con la génesis de enfermedades neuroinflamatorias (185,
186). Dong y cols. mostraron que el déficit transitorio de T4 materna durante la gestación en
ratas, antes del inicio del funcionamiento del eje hipotálamo-hipófisis-tiroides del feto,
potencia la respuesta transcripcional algunos miRNA en la corteza fetal ante la
administración exógena de HT (186). Entre estos, se observó que disminuía la expresión de
miR-301-a, miR-106-b y miR-181-b, todos miRNA relacionados con el desarrollo de la EAE
y la esclerosis múltiple (187, 188). miR-301a participa en la regulación de la secreción de
IL-17, la expresión del factor de transcripción ROR!t y la activación de los linfocitos T CD8+
(188). miR-106b modula la vía de transducción de señales del TGF-β regulando la función
de las Treg (187). miR-181-b reduce la expresión de genes proinflamatorios en los
monocitos-macrófagos e inhibe la diferenciación de los linfocitos T CD4+ al fenotipo Th1
(189).

48
11. Alcances del proyecto

La HTX gestacional es una condición asintomática para la madre, pero que cuenta
con evidencia epidemiológica y experimental que la asocia a alteraciones en el desarrollo
neurocognitivo de la progenie. Sin embargo, estudios realizados en nuestro laboratorio
muestran que la HTX gestacional produce también alteraciones en la respuesta inmune de la
progenie ante la inducción de la EAE. Estos hallazgos son de extrema importancia, ya que
aportan la primera evidencia experimental de que una condición materna durante el
desarrollo intrauterino puede ser un factor etiológico para el desarrollo de neuroinflamación
en la progenie durante su adultez.

La patología neuroinflamatoria del SNC más relevante es la esclerosis múltiple. Es la

principal causa de discapacidad no traumática en adultos jóvenes, por lo que constituye una
gran carga económica y social en todos los sistemas de salud a nivel mundial.

Actualmente, no existe suficiente evidencia clínica que apoye la pesquisa y el

tratamiento de la HTX materna durante el embarazo. Por este motivo, el desarrollo de esta
tesis contribuirá con información valiosa sobre los mecanismos por los que las HT maternas
afectan la permeabilidad de la BHE y la respuesta inmune de progenie. Los resultados
obtenidos permitirán conocer los riesgos de la HTX gestacional y los mecanismos
involucrados en el desarrollo de la neuroinflamación que podrían ser extensibles a la
compresión y prevención de la esclerosis múltiple.

Además, esto ayudará a impulsar el diagnóstico precoz de la HTX gestacional para el

diseño de estudios epidemiológicos enfocados en la detección de alteraciones inmunológicas
en la progenie y, eventualmente, para el desarrollo de protocolos de tratamiento de esta
condición materna durante el primer trimestre del embarazo.

49
 HIPÓTESIS

Ratones gestados en hipotiroxinemia tienen alterada la barrera hematoencefálica, lo que

permite un aumento de la migración de células del sistema inmune al sistema nervioso central
durante la encefalomielitis autoinmune experimental.

50
 OBJETIVOS

Objetivo general

Evaluar en la progenie gestada en hipotiroxinemia el ingreso de células inmunes al sistema

nervioso central durante el desarrollo de la encefalomielitis autoinmune experimental.

Objetivos específicos

1. Analizar si existe un aumento de permeabilidad de la barrera hematoencefálica de los

ratones gestados en hipotiroxinemia al colorante Evans blue en condiciones no inflamatorias,
en comparación a los animales gestados en eutiroidismo.

2. Probar si la barrera hematoencefálica de los ratones gestados en hipotiroxinemia permite

un mayor paso de células inmunes no inflamatorias al sistema nervioso central, que en los
animales controles.

3. Evaluar si existen diferencias en la infiltración de células inmunes al sistema nervioso

central en ratones gestados en hipotiroxinemia a diferentes tiempos de la fase inductiva y
aguda de la encefalomielitis autoinmune experimental, en comparación a los animales
controles.

51
 METODOLOGÍA

1. Animales

Se utilizó ratones C57BL/6 de dos cepas congénicas: CD45.2 y CD45.1. El bioterio

de la Universidad Andrés Bello posee una colonia estable para cada una de estas cepas de
ratones. Los animales son mantenidos a 21 ºC, con ciclos de luz-oscuridad de 12 h y
alimentación ad - libitum. Todos los procedimientos experimentales fueron realizados según
la normativa vigente del Comité de Bioética de la Universidad Andrés Bello y CONICYT
para el cuidado y uso de animales de laboratorio.

2. Inducción de hipotiroxinemia gestacional

Para obtener los ratones gestados en HTX (Figura 9), se cruzaron ratones hembras
de la cepa C57BL/6 CD45.2. Al día siguiente se les realizó un frotis vaginal para determinar
si hubo cruza con el macho. Aquellas hembras cuyo frotis vaginal contenía espermatozoides
al análisis microscópico se consideraron como preñadas y denominadas como en “día
embriónico 1” (E1). Las hembras preñadas fueron separadas aleatoriamente en 3 grupos. Al
primero se le indujo la HTX materna mediante la administración del inhibidor de la síntesis
de hormonas tiroideas 2-mercapto-1-metilimidazol (metimazol, MMI) (Sigma-Aldrich®) al
0,01% en el agua de beber durante los días E10-E15 (97, 99, 105, 190). El segundo grupo
recibió MMI más T4 (25 µg/mL) en el agua de beber para demostrar que el fenotipo
observado se debía a la falta de T4 y no a un efecto adverso del MMI. El tercer grupo fue el
control eutiroideo, que recibió agua sin MMI ni T4. El día del parto se denominó como “día
postnatal 1” (P1). El destete de las crías de los tres grupos se realizó en P30, mientras que los
experimentos se llevaron a cabo en P55. Las crías de los diferentes grupos experimentales se
denominaron según el tratamiento materno: MMI, MMI+T4 y control eutiroideo, por lo que
fueron identificados como HTX, HTX+T4 y CTRL, respectivamente.

52
 Inducción de HTX gestacional y obtención de grupos experimentales

wo
two
two
Desarrollo
embrionario
Desarrollo
post natal

nic
enic
enic P55
E0 E10 E15 E18-21 P30
Destete Experimentación
Medición de
ad
dad
dad TSH, T4 y T3
Parto

Progenie C57BL/6
5.1
5.1
45.1
are
are
are
(co-
co-
co- Ratones
C57BL/6
CTRL HTX HTX + T4

gestantes

mal
mal
mal Grupos
experimentales

lbe
be
be
able
able
ble
Bello
ello
ello Figure 1. 1. Hypothyroxinemia
Inducción de
induction in pregnant C57BL/6
Figure
Figure Hypothyroxinemia
1. Hypothyroxinemia
Hipotiroxinemia induction
induction in inpregnant
pregnantC57BL/6 C57BL/6
CD45.2 congenic
CD45.2 congenic mice.
mice. Transient
Transient HTX
HTX will
will bebe induced
induced in
CD45.2
pregnant congenic
mice by mice.
adding MMI Transient
to drinkingHTXwaterwill
from induced inin
beembryonic
pregnant mice
pregnant mice by by adding
adding MMI
MMI to drinking
drinkingwater
tophenotype water from embryonic
fromgroup
embryonic
d
d 10
10 (E10)
(E10) to
to E15.
E15. To
To revert
revert the
the phenotype aa second
second group willwill
dreceive
10 (E10) MMI to E15.
plus T Toin revert
the the
drinking phenotype
water whilea second
a control group
group will
receive MMI
receive MMI plusplus T T
4
4 in the drinking water while a control group
in the drinking water while a control group
thatFigura
that will 9. Inducción
will receive
receive tap de
tap 4 water HTXwithout
water en ratones
without gestantes
MMI.
MMI. Afterdetreatment,
After la cepa C57BL/6
treatment, the the CD45.2. Se indujo
that will
progeny
HTX aofreceive
the tap
three water without MMI. After treatment, the
progeny ofratones three experimental
the gestantes experimental groups
mediante el aporte will
de MMI
groups willalbe used
agua
be forfor
de beber
used desde el día E10 al
progeny
experiments of the
at three experimental groups will be used for
experiments at postnatal
E15. Para revertir
postnatal dd 55
el fenotipo, (P55).
55un The
segundo
(P55). progeny
grupo
The recibiógroups
progeny MMI más
groups willTbe
will 4 en
beel agua de beber. El
experiments
named at
according
grupoaccording postnatal
to
control eutiroideomaternal d 55 (P55).
treatment:
recibiótreatment: The progeny
Control,
agua sin MMI MMI groups
ni T4. Después and will
MMI
del MMI be
tratamiento, la progenie
named to maternal Control, MMI and
named according
plusobtenida
T4 willde be to
namedmaternal as treatment:
ET-offspring, Control,
HTX-offspringMMI andand MMI
plus T4 will los be tres grupos experimentales
named as ET-offspring, fue utilizada para experimentación
HTX-offspring and al día P55. La
plus
HTX+T T44-offspring
will be respectively.
named as ET-offspring, HTX-offspring and
HTX+T 4-offspring
progenie respectively.
fue denominada según el tratamiento materno: MMI, MMI+T4 y control como
HTX+T4-offspring respectively.
HTX, HTX+T4 y CTRL, respectivamente. E = día embriónico; P = día de desarrollo post
natal.

in mice gestated under hypothyroxinemia (HTX-offspring),

n mice gestated under hypothyroxinemia (HTX-offspring),
n mice gestated under hypothyroxinemia (HTX-offspring),
and a vaginal smear will be collected and analyzed every d
nd a vaginal smear will be collected and analyzed every d
nd a vaginal
positive smearsmear
will bewill be collected
considered mated and analyzed
and referred every
to as d
positive smear will be considered mated and referred to as
ositiveinto
rated smear
threewill be considered
groups. Maternal HTX mated and
will be referred
induced to as
in the
ated into three groups. Maternal HTX will be induced in the
ated into three
tly treated withgroups.
0.01%Maternal HTX will be induced in the
of 2-mercapto-1-methylimidazole
ly treated with 0.01% of 2-mercapto-1-methylimidazole
yingtreated
E10–E15 with
35 0.01% of 2-mercapto-1-methylimidazole
35. MMI inhibits thyroid hormone synthesis 95
95
.
ng E10–E15 35 . MMI inhibits thyroid hormone synthesis 95 .
ngve E10–E15
MMI plus T4. (25MMIµg/mL
inhibits
of Tthyroid hormone synthesis .
4) in the drinking water. This
ve MMI plus T4 (25 µg/mL of T4) in the drinking water. This
eand
MMI notplus T4 (25
a side effect of TThe
of MMI.
µg/mL 4) inthird
the drinking
group of water.
pregnantThis 53
and not a side effect of MMI. The third group of pregnant
and not a side
ter without MMI effect of After
(Fig, 1). MMI.MMIThe treatment
third group of pregnant
(E15), blood
3. Medición de hormonas tiroideas

La medición de las hormonas tiroideas se realizó en las madres gestantes después del
término del tratamiento con MMI (E15) y en la progenie adulta (P55). Se tomó una muestra
de sangre de la vena facial (200 µL) de los animales para analizar los niveles séricos totales
de T4, T3 y TSH, mediante radioinmunoanálisis y ELISA, respectivamente (16). La sangre
se mantuvo a temperatura ambiente por 15 min para la formación del coágulo. Luego, la
muestra se centrifugó a 1000 x g a 4 ºC por 45 min para obtener el suero. Posteriormente se
tomaron 50 µL y se determinó la concentración de T3 total (tT3) y T4 total (tT4) mediante el
uso de kit de RIA de fase sólida Coat-A-Count® Siemens Healthcare Diagnostics Kits
(TKT31 y TKT41) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La determinación de TSH se
realizó con 50 µL de suero mediante un kit de ensayo inmunoabsorbente acoplado a enzima
(ELISA) ultra sensible para ratón (mouse Ultrasensitive thyroid-stimulating Hormone, U-
TSH ELISA kit, MBS704901), de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La absorbancia
se midió a 450 nm en el lector de ELISA (EPOCH, Biotek).

4. Metodología específica para el desarrollo del objetivo 1: Análisis de la permeabilidad

basal de la barrera hematoencefálica al colorante Evans blue en ratones gestados en
hipotiroxinemia.

Para desarrollar este objetivo, se evaluó la permeabilidad de la BHE de la progenie

gestada en HTX al EBD. Se ha descrito que el EBD tiene alta afinidad por las proteínas,
principalmente por la albúmina, las que no atraviesan la BHE en condiciones fisiológicas
(191). Sin embargo, cuando la BHE se encuentra alterada la albúmina puede ingresar al SNC,
por lo que el EBD extravasado puede unirse proteínas y ser detectado en el parénquima (192).

4.1. Ensayo de permeabilidad al Evans blue

Se utilizó la progenie HTX, HTX+T4 y CTRL adultas (P55). Como control positivo,
se utilizó un ratón control P55 al que se le administró una dosis intraperitoneal de

54
lipopolisacárido (LPS) de Salmonella entérica serotipo typhimurium (L7261, Sigma-
Aldrich®) a una concentración de 3 mg LPS/kg, 12 horas antes del ensayo (193). Los
animales fueron colocados en una cámara de inducción anestésica (AM852, Beijing Eternity
Electronic Technology CO.) y anestesiados con isoflurano (Forene®, Abbvie) al 5% con un
flujo de oxígeno entre 0,5 y 1 L/min. Cuando el animal perdía consciencia, se evaluaba la
falta del reflejo de retirada ante el estímulo nociceptivo de la almohadilla plantar. Al
momento que el ratón no presentaba el reflejo de retirada, se consideraba anestesiado y se
cerraba la llave de entrada. El animal era sacado de la cámara y se le colocaba la mascarilla
con una dosis de mantención de isoflurano al 2% y oxígeno al 100%. Luego, se abrió la
cavidad torácica del animal con instrumental quirúrgico limpio y desinfectado con etanol
70% v/v. Se insertó una aguja mariposa de 23 gauge, ya conectada a una bomba de infusión
peristáltica (WPI), a través del ventrículo izquierdo hacia la aorta ascendente. Luego, se
realizó una incisión en la aurícula derecha para drenar la sangre venosa de retorno y permitir
que la solución de infusión ingresara al ventrículo izquierdo. Para los análisis de
espectrofotometría, cada animal fue perfundido con 50 mL de solución tampón fosfato (PBS
1X pH 7,4) a una velocidad de 5 mL/min, seguido de 50 mL de una solución de EBD 2% en
PBS 1X pH 7,4. Para los análisis de microscopía confocal, cada animal fue perfundido con
50 mL de PBS 1X pH 7,4 a una velocidad de 5 mL/min, seguido de 50 mL de una solución
de EBD 2% en paraformaldehído (PAF) 4% p/v en PBS 1X pH 7,4. Los cerebros y médulas
espinales fueron disecados y preparados para su posterior análisis (192) (Figura 10).

55
Objetivo 1.- Evaluar la permeabilidad basal a macromoléculas de la BHE
en ratones gestados en HTX

Perfusión con colorante Evans Blue

CTRL HTX HTX + T4 Control positivo

LPS i.p

Extracción inmediata de cerebros y médulas espinales

Espectrofotometría Microscopía confocal

Figura 10. Evaluación de la permeabilidad al EBD de la BHE de ratones gestados en

HTX. Se realizó una infusión intravenosa de EBD a las progenies HTX, HTX+T4 y CTRL
al día P55. Como control positivo se utilizó un ratón control P55 al que se le inyectó LPS i.p.
12 h antes del ensayo. Se extrajo el cerebro y médula espinal de los ratones para analizar el
ingreso de EBD al parénquima mediante espectrofotometría y microscopía confocal.

56
4.2. Espectrofotometría

Los cerebros y médulas espinales de los animales perfundidos con EBD fueron
masados para normalizar el resultado de la absorbancia por el peso del órgano. Luego, los
cerebros y médulas espinales fueron homogenizados individualmente y en su totalidad en 1
mL y 250 µL de ácido tricloroacético (TCA) al 50% p/v en PBS 1X pH 7,4, respectivamente.
Los tejidos homogenizados fueron centrifugados a 12000 g por 15 min a 4 ºC (centrífuga
Hettich® Universal 320R, rotor 1420-B). Luego, 200 µL de los sobrenadantes fueron puestos
en un placa de 96 pocillos (Corning®. BD) para analizar la absorbancia mediante
espectrofotometría a 620 nm en un lector de placas (EPOCH, Biotek) con el software Gen
5TM . Paralelamente, se preparó una curva de calibración con diluciones seriadas a partir de
una alícuota de EBD 1 ng/mL diluida en TCA 50% p/v en PBS 1X pH 7,4. Los valores de
absorbancia obtenidos se intrapolaron en la curva de calibración y se determinó la
concentración de EBD en cada muestra. Las concentraciones fueron normalizadas por el peso
del cerebro y médula espinal y expresadas en ng de EBD por mg de tejido (ng EBD/ mg
tejido) (Modificado de (194)).

4.3. Procesamiento de las muestras histológicas

Los cerebros y médulas espinales de los animales perfundidos con EBD fueron
postfijados en PAF 4% p/v en PBS 1X pH 7,4 por 4 horas y luego crioprotegidos por
inmersión en sacarosa 30% p/v en PBS 1X pH 7,4 por 24 h. Luego, los cerebros y médulas
espinales fueron incluidos en resina para crióstato Optimal Cutting Temperature - OCT
(Sakura® Finetek, USA) y cortados en secciones coronales y transversales de 20 µm,
respectivamente, en un criostato (Leica CM1510-1, Leica Biosystems) a -22 ºC. Las
secciones fueron montadas en portaobjetos silanizados (Silane-Prep Slides, Sigma-
Aldrich®) y congeladas a -20 ºC hasta su procesamiento en el ensayo de inmunohistoquímica
(192).

57
4.4. Inmunohistoquímica

Las secciones de cerebro y médula espinal montadas en los portaobjetos silanizados

fueron descongeladas a temperatura ambiente (RT) antes de ser rehidratadas con PBS 1X pH
7,4 por 5 min. Luego, las muestras fueron bloqueadas y permeabilizadas con albúmina sérica
bovina (BSA) al 1% p/v y Tritón® X-100 (Molecular Biology Grade, Promega) al 0,1 % v/v
por 20 min. Después de dos lavados de 5 min con PBS 1X pH 7,4, las muestras fueron
incubadas con el anticuerpo primario anti-claudina 5 (Abcam, ab131259), diluido en BSA al
1% p/v a razón 1:100 por 90 min a RT. Las muestras fueron lavadas nuevamente y luego
incubadas con el anticuerpo secundario hecho en cabra anti-conejo conjugado a Alexa 488
(Life technologies, A11034) diluido en BSA al 1% p/v a razón 1:500 por 1 h a RT.
Finalmente, las muestras fueron lavadas, dejadas secar a RT, montadas con ProLongTM Gold
Antifade Mounting with DAPI (InvitrogenTM, Thermo Fisher) y guardadas a 4 ºC en
oscuridad hasta su análisis en el microscopio confocal. Las muestras controles fueron
incubadas ya fuera con solución de bloqueo sola o con solución de bloqueo y el anticuerpo
secundario (192).

4.5. Microscopía confocal

Las muestras fueron analizadas bajo un microscopio confocal (Leica, TCS SP8). Para
cada área seleccionada, las imágenes fueron digitalizadas con diferentes filtros de láser para
el análisis posterior. La marcación del EBD fue visualizada como fluorescencia roja brillante
al estimular con el láser 553 nm de longitud de onda (λ) (zona verde. Emisión 600-733 nm)
(192). La marcación de los núcleos con DAPI fue excitada con el láser 405 nm (zona
ultravioleta. Emisión 410-483 nm)) y fue visualizada como fluorescencia azul. La marcación
claudina 5 + Alexa 488 fue excitada con el láser 488 nm (zona azul. Emisión 505-547 nm) y
visualizada como fluorescencia verde.
Las fotografías fueron tomadas con el programa LAS X Life Science (Leica,
Microsystems). Las imágenes obtenidas fueron analizadas con el programa ImageJ 1.48v. La
intensidad de fluorescencia del EBD fue cuantificada en unidades arbitrarias y luego
expresada como aumento relativo respecto al grupo control.

58
5. Metodología específica para el desarrollo del objetivo 2: Probar la permeabilidad
basal de la barrera hematoencefálica a células inmunes en ratones gestados en
hipotiroxinemia

Para desarrollar este objetivo, se evaluó la permeabilidad de la BHE al paso de células

del sistema inmune en condiciones basales, sin inducción de EAE, mediante la transferencia
adoptiva de esplenocitos totales de ratones donantes de la cepa congénica CD45.1 a ratones
receptores de la cepa CD45.2, basado en el protocolo adaptado de Quah y cols. (195). Dado
que CD45 se expresa en todas las células inmunes y que cada ratón transgénico expresa
solamente un alelo, es posible distinguir las células inmunes CD45.1+ del donante de las
células CD45.2+ del receptor utilizando un anticuerpo específico contra la molécula CD45.1
que no reconoce a la isoforma CD45.2.

5.1. Transferencia adoptiva de esplenocitos totales

Los ratones donantes de la cepa CD45.1 (P55) fueron anestesiados con isoflurano y
sacrificados mediante dislocación cervical. Luego, los bazos fueron extraídos mediante
técnica quirúrgica con instrumental limpio y autoclavado (Bell LDZX-75) bajo campana
(NuAire®), y procesados para la extracción de esplenocitos totales con buffer amonio-
cloruro-potasio (ACK). Obtenidas y cuantificadas las células inmunes, se prepararon
diluciones de 25 millones de células en un volumen total de 100 µL de PBS 1X pH 7,4 filtrado
al vacío (Sigma-Aldrich®) y se cargaron en jeringas de insulina (BD Ultra-fineTM).

Para la transferencia adoptiva de los esplenocitos totales CD45.1+, los animales

receptores CD45.2+ gestados en HTX, HTX + T4 y CTRL fueron anestesiados con isoflurano
al 2% (como se describió en la metodología del objetivo 1) e inmovilizados por un segundo
operador. Los esplenocitos CD45.1+ fueron inyectados a los animales receptores vía
intravenosa a través de la vena safena (196), previa desinfección del sitio de punción con
etanol 70% v/v. Como control positivo, se utilizó un ratón control P55 al que se le inyectó
TP i.p. al momento de la transferencia de esplenocitos CD45.1+, ya que existen datos que
sugieren que la TP aumenta la permeabilidad de la BHE (116). Como control interno, se

59
utilizó un segundo animal gestado en condiciones eutiroideas el que fue inyectado con LPS.
El LPS aumenta la permeabilidad de la BHE mediante la activación de la microglía y
astrocitos, y la disrupción de las tight junctions (193, 197). Decidimos utilizar el control con
LPS como un control interno para el grupo tratado con TP. Esto debido a que el protocolo
utilizado para este objetivo permite sólo una administración de TP, mientras que el protocolo
de inducción de la EAE crónica monofásica requiere de la administración de TP al día 0 y a
las 48 h p.i. con un péptido derivado de la glicoproteína de la mielina del oligodendrocito
(pMOG) (198). Posteriormente, los animales fueron procesados para la obtención del SNC,
sangre y bazo, y posterior extracción de células inmunes para análisis por citometría de flujo
(Figura 11).

60
 Estrategia experimental para el objetivo 2

Extracción de Transferencia i.v de

esplenocitos totales esplenocitos CD45.1+

CD45.1

CD45.2 CD45.2 CD45.2 Control positivo Control positivo

CTRL HTX HTX + T4 toxinaTP
pertussis
i.p. i.p. LPS i.p.

Extracción de células inmunes de la sangre, bazo y SNC

Identificación de células de la línea mieloide y linfoide en las poblaciones celulares CD45.1+ y CD45.2+
por citometría de flujo

Nat Protoc, 2007

Figura
Figura11.5.Evaluación
Evaluacióndedela lapermeabilidad
permeabilidad basal a células
basal inmunes
a células de la BHE
inmunes de laen ratones
barrera
gestados en HTX. Se realizó la transferencia adoptiva de esplenocitos totales de ratón
hematoencefálica en ratones gestados en hipotiroxinemia. Se realizó la transferencia
CD45.1+ a ratones receptores CD45.2+ de los grupos experimentales HTX, HTX+T4 y CTRL
+ +
aladoptiva
día P55.deComo
esplenocitos totales
controles de ratónse
positivos, CD45.1
utilizó aunratones
primerreceptores CD45.2P55
ratón control deal
losque
grupos
se le
inyectó TP i.p, yHTX,
experimentales un control
HTX +interno al que
T4 y CTRL al se
díaleP55.
inyectó
ComoLPS i.p. Doce
controles horas después
positivos, se utilizóde
unla
+
transferencia
primer ratón de los esplenocitos
control P55 al que seCD45.1
le inyectó, los animales
toxina receptores
pertussis i.p, y unfueron sacrificados
control para
interno al que
obtener las células inmunes del SNC, sangre y bazo. Las células inmunes obtenidas fueron
se le inyectó LPS 12 h antes de la transferencia adoptiva. Doce horas después de la
marcadas con anticuerpos específicos anti-CD45.1, anti-CD45.2 , la línea mieloide (anti-
+
trasnferencia
CD11b, de los esplenocitos
anti-CD11c, anti-Ly6C yCD45.1 , los animales
anti-Ly6G) y linfoidereceptores
(anti-CD3, fueron sacrificados
anti-CD4, para y
anti-CD8
anti-B220)
obtener laspara su identificación
células inmunes de la mediante
sangre, bazo citometría
y SNC. Lasde flujo.
células inmunes obtenidas fueron
marcadas con anticuerpos específicos para CD45.1, CD45.2 , la línea mieloide (anti-CD11b,
anti- CD11c, anti-Ly6C y anti-Ly6G) y linfoide (anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8 y Anti-B220)
para su identificación mediante citometría de flujo. LPS = lipopolisacárido; i.p =
intraperitoneal; HTX = hipotiroxinemia; HTX + T4 = hipotiroxinemia con aporte de T4;
CTRL = control gestado en condiciones eutiroideas.

39

61
5.2. Obtención de células inmunes

Los animales fueron anestesiados con isoflorano según lo descrito la metodología

para el objetivo 1. Luego de comprobar la ausencia del reflejo nociceptivo en la almohadilla
plantar, se realizó la extracción de sangre mediante punción cardíaca. Para este
procedimiento, cada animal ya anestesiado fue posicionado en decúbito supino y puncionado
con una jeringa de tuberculina (BD) lateral a la apófisis xifoides en dirección craneoventral
con un ángulo de 30º. Una vez introducida la aguja, se ejerció una ligera presión negativa en
la jeringa hasta la obtención de la sangre. La muestra fue depositada en un tubo Eppendorf
de 1,5 mL y dejada a 4 ºC, mientras se continuaba con la extracción del bazo y SNC. Una
vez terminada la extracción de la sangre, se abrió la cavidad torácica y abdominal del animal
con instrumental quirúrgico limpio y desinfectado con etanol 70% v/v. Inmediatamente se
extrajo el bazo, y se depositó en un tubo de 50 mL (Falcon®) con 5 mL de PBS 1X pH 7,4 a
4 ºC. Entonces, el animal fue perfundido con 50 mL de PBS 1X pH 7,4 a una velocidad de
5 mL/min, según lo descrito en la metodología para el objetivo 1. Finalmente, se extrajo el
encéfalo y la médula espinal y se depositaron en una placa de Petri 60 mm (Falcon®) con
PBS-EDTA 2 mM.

5.2.1. Obtención de células inmunes de la sangre

Para la extracción de las células inmunes de la sangre, la muestra fue depositada en

un tubo de 15 mL (Falcon®) y diluida en ACK hasta completar la capacidad máxima del
tubo. Luego, fue incubada por 5 min a RT y centrifugada a 300 g por 5 min a 4 ºC (centrífuga
Thermo ScientificTM HeraeusTM MegafugeTM 8R, rotor 75005701) El pellet obtenido fue
resupendido en 15 mL de ACK, incubado y centrifugado según lo descrito, por 3 veces.
Posteriormente, el pellet fue lavado con 15 mL de PBS 1X pH 7,4 y centrifugado a 300 g por
5 min a 4 ºC, por 3 veces. Las células obtenidas fueron resuspendidas en 200 µL de PBS 1X
pH 7,4 suplementado con suero fetal bovino al 5% v/v en (PBS-SFB 5%).

62
5.2.2. Obtención de células inmunes del bazo

Para la extracción de esplenocitos totales, cada bazo fue homogenizado con el émbolo
de una jeringa de insulina estéril (BD Ultra-fineTM) sobre un filtro celular de poro 70 µm
(Falcon®). El tejido macerado fue eluído con 5 mL de PBS 1X pH 7,4 en un tubo de 50 mL
(Falcon®) y centrifugado a 300 g por 5 min a 4 ºC (Centrífuga Thermo ScientificTM
HeraeusTM MegafugeTM 8R, rotor 75005701). El pellet obtenido fue resuspendido en 25 mL
de ACK y se incubó por 5 min a RT. Luego, se agregó 25 mL de PBS 1X pH 7,4 y se
centrifugó nuevamente a 300 g por 5 min a 4 ºC. Finalmente, el pellet obtenido fue lavado
en 50 mL de PBS 1X pH 7,4 y resuspendido en 1 mL de PBS 1X pH 7,4 para cuantificar las
células con el colorante azul tripán en un equipo contador de células ( CountessTM automated
cell counter, InvitrogenTM).

5.2.3. Obtención de células inmunes del sistema nervioso central

Para la extracción de células inmunes del SNC, las meninges del encéfalo y de la
médula espinal fueron removidas con un bastoncillo de algodón previamente autoclavado
(Bell LDZX-75). Las muestras fueron homogenizadas en una solución de PBS-EDTA 2 mM
con el émbolo de una jeringa de insulina estéril (BD Ultra-fineTM) sobre un filtro celular de
poro de 70 µm (Falcon®), previamente colocado sobre un tubo de 50 mL (Falcon®). El tejido
macerado fue eluído con 10 mL de PBS- EDTA 2 mM y luego centrifugado a 300 g por 5
min a 4 ºC (centrífuga Thermo ScientificTM HeraeusTM MegafugeTM 8R, rotor 75005701).
Paralelamente, se preparó una solución de Percoll® (GE Healthcare) al 30 % v/v y al 70%
v/v en PBS-EDTA 2 mM. El pellet obtenido de la centrifugación se resuspendió en 5 mL de
Percoll® 30 % v/v y se depositó cuidadosamente en un tubo de 15 mL (Falcon®) que
contenía 5 mL de una solución de Percoll® 70 % v/v. Luego, la columna fue centrifugada
sin freno a 700 g por 20 min a RT. Entonces, la interfase del gradiente fue extraída
cuidadosamente con una pipeta Pasteur plástica (Biologix®), se llevó a 10 mL con PBS 1X

63
pH 7,4 y se centrifugó a 300 g por 5 min a 4 ºC. Finalmente, el pellet obtenido fue
resuspendido en 200 µL de PBS-SFB 5%.

5.3. Citometría de flujo

Las células inmunes obtenidas de las muestras de sangre, bazo y SNC fueron
divididas en dos partes iguales, cargadas en una placa de 96 pocillos y centrifugadas a 300 g
por 5 min a 4 ºC (centrífuga Hettich® Universal 320R, rotor 1460). El pellet obtenido de
cada muestra fue resuspendido en 50 µL de una mezcla de anticuerpos para citometría de
flujo diluidos en PBS-SFB 5% e incubadas en oscuridad por 1 h a 4 ºC. Se utilizó una mezcla
A para identificar células de la línea mieloide (anti-CD45.1, anti-CD45.2, anti-CD11b, anti-
CD11c, anti-Ly6C, anti-Ly6G) y una mezcla B para identificar células de la línea linfoide
(anti-CD45.1, anti-CD45.2, anti-B220, anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8) (Tabla 1). Luego, las
células fueron centrifugadas a 300 g por 5 min a 4 ºC y el pellet obtenido de cada muestra
fue lavado con 200 µL de PBS-FBS 5%. Entonces, las muestras fueron fijadas con PAF 4%
por 15 min a RT, centrifugadas a 300 g por 5 min a 4 ºC y lavadas con 200 µL de PBS-FBS
5% por 2 veces. Finalmente, las células fueron centrifugadas a 300 g por 5 min a 4 ºC y las
células teñidas fueron resuspendidas en 80 µL de PBS. Paralelo a este procedimiento, se
realizaron los controles de color y Fluorecence Minus One (FMO) de cada uno de los
anticuerpos por separado, y los controles de autofluorescencia de las células del bazo, sangre
y SNC.

El análisis de las células se realizó en un citómetro de flujo (FACS CANTO II, BD)
de la Pontificia Universidad Católica. Antes de la lectura, se agregó 20 µL de una dilución
de cuentas magnéticas a cada muestra, según las indicaciones del fabricante (CountBrightTM
Absolute Counting Beads. Molecular ProbesTM). Los datos obtenidos fueron analizados
mediante el programa FlowJo (FlowJo 7.6.1). Las poblaciones celulares fueron identificadas
según la expresión de los marcadores correspondientes y luego cuantificadas en términos
absolutos y porcentuales.

La estrategia de selección consistió en separar primero las células inmunes según su

64
complejidad y tamaño (forward scatter v/s side scatter (FSC-A v/s SSC-A) y luego excluir
aquellas que formaban conglomerados o dobletes según el parámetro de selección de altura
(FSC-H). Entonces, se identificó las poblaciones positivas para cada uno de los anticuerpos
utilizados en base a los controles de colores y FMO. Posteriormente, se realizó la selección
de la población leucocitaria CD45.1+ y CD45.2+. Para cada una de estas poblaciones, primero
se seleccionaron las poblaciones de neutrófilos (CD11b+ Ly6G+), células CD11c+ y células
mieloides CD11b+ CD11c-. A partir de esta última, se realizó la identificación de los
monocitos inflamatorios (CD11b+ Ly6Chigh) y macrófagos (CD11b Ly6Clow). Luego, se
seleccionó la población de linfocitos B (B220+) y las células CD3+. Finalmente, se identificó
la población de linfocitos T CD4+ y T CD8+ a partir de la población CD3+ (Figura 12).

Cabe mencionar que el marcador CD11c+ expresado por las células dendrítica,
monocitos, macrófagos y la microglía y es altamente dependiente de la activación celular
(199). En esta tesis no se utilizó marcadores específicos para la identificación de cada una de
las poblaciones que expresaron este marcador, por lo que la ventana de selección incluyó a
todas las células CD11c+ para evitar excluir poblaciones que tuvieran baja expresión del
marcador por razones de activación.

La cuantificación absoluta fue realizada según la fórmula:

Número de células Concentración de cuentas/50 μL

X
Número de cuentas Volumen de la muestra (µL)

El resultado obtenido permitió cuantificar la relación entre las células inmunes

estudiadas y la totalidad del parénquima nervioso.

La cuantificación relativa se expresó en porcentaje respecto a la población de células

inmunes de la ventana precedente, según lo obtenido de la lectura del citómetro, lo que
permitió cuantificar la relación entre la subpoblación celular analizada y la totalidad de la
población de células inmunes estudiada.

65
 (A) (B) (C) (D)

CD45.1 CD45.2

Leyenda en la página siguiente

(E) (F) (G) (I)

CD45.1 CD45.2
CD3

Ly6C

CD11b
CD11b
Ly6G CD11c CD11c
Ly6G B220
(H) (J)
CD3

Ly6C
CD8
CD8

CD11b
Ly6G CD11c Ly6G CD4
B220

66
CD8
CD8
Figura 12. Estrategia de selección para la identificación de las poblaciones de células
inmunes por citometría de flujo. Análisis de citometría de flujo representativo de las células
inmunes aisladas del bazo de los grupos experimentales. (A) Selección de las células inmunes
según complejidad y tamaño (FSC-A v/s SSC-A). (B) Selección de las células inmunes que
no formen conglomerados ni dobletes a partir del parámetro de selección de altura (FSC-H).
(C) Selección de la población leucocitaria mediante el marcador CD45.1. (D) Selección de
la población leucocitaria mediante el marcador CD45.2. (E) Selección de la población de
neutrófilos (CD11b+ Ly6G+). (F) Selección de la población de células CD11c+. (G) Selección
de la población de células mieloides CD11b+ CD11c-. (H) Selección de la población de
monocitos inflamatorios (CD11b+ Ly6Chigh) y macrófagos (CD11b+ Ly6Clow). (I) Selección
de las poblaciones de células T (CD3+) y células B (B220+). (J) Selección de la subpoblación
de linfocitos T CD8+ (CD3+ CD8+) y linfocitos T CD4+ (CD3+ CD4+). Flechas rojas indican
la secuencia de los análisis de selección. Etiquetas amarillas indican los nombres de las
poblaciones seleccionadas.

67
Tabla 1. Anticuerpos y diluciones utilizados para análisis de citometría de flujo de las
células inmunes del sistema nervioso central, sangre y bazo

Anticuerpo Concentración Marca (número de catálogo) Dilución

Anti-CD45.1 de ratón – APC/Cy7 0,2 mg/mL BioLegend 1:200

(110716)

Anti-CD45.2 de ratón – FITC 0,5 mg/mL BioLegend 1:500

(109806)

Anti-CD11b de ratón – PE/Cy7 0,2 mg/mL BD Bioscience 1:200

(552850)

Anti-CD11c de ratón - PE 0,2 mg/mL BioLegend 1:200

(117308)

Anti-Ly6C de ratón – PERCP/Cy5.5 0,2 mg/mL BioLegend 1:200

(128012)

Anti-Ly6G de ratón - APC 0,2 mg/mL BioLegend 1:200

(127614)

Anti-CD45R/B220 de ratón – 0,2 mg/mL BioLegend 1:200

PERCP/Cy5.5 (103236)

Anti-CD3ε de ratón - APC 0,2 mg/mL BioLegend 1:200

(100312)

Anti-CD4 de ratón – PE/Cy7 0,2 mg/mL BioLegend 1:200

(552775)

Anti-CD8 de ratón – PE 0,2 mg/mL BD BioScience 1:200

(553033)

Anti-CD25 de ratón- FITC 0,5 mg/mL BD BioScience 1:500

(102005)

68
6. Metodología específica para el desarrollo del objetivo 3. Evaluar la infiltración de
células inmunes al sistema nervioso central de ratones gestados en hipotiroxinemia
durante la fase inductiva y aguda de la encefalomielitis autoinmune experimental

Este objetivo busca investigar un posible cambio en el patrón temporal de migración

de diferentes poblaciones de células inmunes desde la sangre al SNC de la progenie HTX
durante el desarrollo de la fase inductiva de la EAE. Para trabajar este objetivo, se realizaron
experimentos de transferencia adoptiva de células inmunes usando ratones congénicos
C57BL/6 de la cepa CD45.1 y CD45.2, como se describió en el objetivo 2. En una primera
etapa, ratones CD45.1 gestados en condiciones control fueron inducidos con la EAE crónica
monofásica para luego ser utilizados como donantes de células inmunes inflamatorias e
inducir EAE pasiva en ratones CD45.2 gestados en HTX y CTRL. Mediante esta técnica, se
buscó poner en evidencia posibles diferencias en la permeabilidad de la BHE a células
inmunes activadas entre los grupos experimentales, prescindiendo de la administración de la
TP debido a su efecto sobre la permeabilidad de la BHE (61) (Figura 13). En una segunda
instancia, se realizó un ensayo de transferencia adoptiva de esplenocitos CD45.1+ no
inflamatorios a ratones CD45.2 gestados en HTX y CTRL, para luego inducir la EAE crónica
monofásica a estos últimos. Mediante este ensayo, se buscó poner en evidencia posibles
diferencias en la migración de poblaciones de células inmunes desde la sangre al SNC en los
animales gestados en HTX y CTRL, al inducirles la enfermedad con la administración de TP
(Figura 14).

69
 Inducción de EAE Transferencia adoptiva de Generación de EAE pasiva
crónica monofásica esplenocitos reactivados en ratones CD45.2

5
5
CD45.1 4
4

Puntaje clínico
3
Puntaje clínico

3
2
2
1
1 CD45.2
CTRL 0
0 5 7 9 10 días p.t.
0 5 10 12 15 20 días p.i.

Extracción de células inmunes

de la sangre, bazo y SNC

Obtención de
esplenocitos totales y
células de linfonodos
para reestimulación in
vitro con pMOG Identificación de células de la línea
mieloide y linfoide en las poblaciones
celulares CD45.1+ y CD45.2+ por
CD45.2 citometría de flujo
HTX

Figura 13. Inducción de la EAE pasiva a ratones CD45.2 gestados en HTX. Se indujo la
EAE crónica monofásica a ratones congénicos CD45.1 adultos gestados en eutiroidismo, los
que fueron sacrificados al día 12 p.i para la extracción de esplenocitos totales y células de
linfonodos. Las células obtenidas fueron re-estimuladas in vitro con pMOG. Se realizó la
transferencia adoptiva de estas células a ratones de la progenie HTX y CTRL al día P55. Los
animales fueron sacrificados al día 5, 7 y 9 post transferencia adoptiva (p.t) para obtener las
células inmunes de la sangre, bazo y SNC. Las células inmunes obtenidas fueron marcadas
con anticuerpos específicos anti-CD45.1, anti-CD45.2, para la línea mieloide (anti-CD11b,
anti- CD11c, anti-Ly6C y anti-Ly6G) y linfoide (anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8 y anti-B220
para su posterior identificación por citometría de flujo.

70
 Estrategia experimental para el objetivo 3 (b)

Transferencia adoptiva de Inducción de EAE crónica

esplenocitos totales CD45.1+ monofásica en ratones CD45.2

Puntaje clínico
3

1
CD45.1 CD45.2
sano CTRL 0
5 7 9 10 días p.i.
Extracción de
esplenocitos totales
de rató
ratón
Extracción de células inmunes
de la sangre, bazo y SNC

Identificación de células de la línea

mieloide y linfoide en las poblaciones
celulares CD45.1+ y CD45.2+ por
CD45.2 citometría de flujo
HTX

Figura 14. Inducción de la EAE crónica monofásica a ratones CD45.2 gestados en HTX PLOS ONE, 2012
posterior a la transferencia adoptiva de esplenocitos de ratón CD45.1 sano. Se realizó la
transferencia adoptiva de esplenocitos totales de ratón CD45.1 sano a ratones receptores
CD45.2 HTX y CTRL al día P55. Veinticuatro horas después, se les indujo la EAE crónica
monofásica.
Figura 7. Los animales de
Inducción HTXla y encefalomielitis
CTRL fueron sacrificados
autoinmunea los días 5, 7 y 9crónica
experimental p.i. para
obtener las células
monofásica inmunes
a ratones de lagestados
CD45.2 sangre, bazo y SNC. Las células
en hipotiroxinemia inmunes
posterior a la obtenidas fueron
transferencia
marcadas con anticuerpos específicos anti-CD45.1, anti-CD45.2, para la línea mieloide (anti-
adoptiva de esplenocitos de ratón CD45.1 sano. Se realizó la transferencia adoptiva de
CD11b, anti- CD11c, anti-Ly6C y anti-Ly6G) y linfoide (anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8 y
esplenocitos
anti-B220) totales
para de ratón identificación
su posterior CD45.1 sano a por
ratones receptores
citometría CD45.2 HTX y CTRL al día
de flujo.
P55. Veinticuatro horas después, se les indujo la EAE crónica monofásica. Los animales
HTX y CTRL fueron sacrificados a diferentes tiempos post inducción de la EAE (día 5,7 y
9 p.i.) para obtener las células inmunes de la sangre, bazo y SNC. Las células inmunes
obtenidas fueron marcadas con anticuerpos específicos anti-CD45.1, anti- CD45.2 , para la
línea mieloide (anti-CD11b, anti- CD11c, anti-Ly6C y anti-Ly6G) y linfoide (anti-CD3, anti-
CD4, anti-CD8 y anti-B220) para su posterior identificación por citometría de flujo.. SNC =
sistema nervioso central; EAE = encefalomielitis autoinmune experimental; p.i = post
inducción; HTX = hipotiroxinemia; HTX+T4 = hipotiroxinemia con aporte de T4; CTRL =
control gestado en condiciones eutiroideas.

41
71
6.1. Inducción de la encefalomielitis autoinmune experimental activa crónica
monofásica

Para la inducción de EAE crónica monofásica, ratones P55 fueron inyectados vía
subcutánea con una emulsión que contiene 50 µg de un péptido de MOG
(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK) (Protein and Nucleic Acid Facility - PAN, Stanford
University) en adyuvante incompleto de Freund ImjectTM (77140, Thermo ScientificTM),
suplementado con Mycobacterium tuberculosis H37Ra inactivado (231141, DIFCO). La
emulsión fue preparada en jeringas de vidrio para EAE de 50 mL (Z314587) , 20 mL
(Z314560) y 5mL (Z314544) (FORTUNA®, Sigma-Aldrich®), dependiendo del número de
animales a inmunizar.

La mitad de la dosis se administró por vía subcutánea en la zona interescapular y la

otra mitad en la zona lumbar caudal. Además, los ratones recibieron una inyección i.p. de
500 ng de TP (#180, List Biological Laboratories, INC.) al momento de la inmunización y
48 h después. El estado neurológico de los ratones fue evaluado diariamente hasta el día 21
p.i. según la siguiente escala: 0 = asintomático; 1 = cola flácida; 2 = debilidad de las patas
traseras o marcha anormal; 3 = parálisis completa de las patas traseras; 4, parálisis completa
de las patas traseras y delanteras; 5, moribundo o muerto (198). El promedio del puntaje de
la EAE fue calculado de los puntajes de todos los ratones de un mismo grupo.

6.2. Inducción de la encefalomielitis autoinmune experimental pasiva

Ratones CD45.1 inmunizados para EAE activa crónica monofásica, y que

presentaban signos de la enfermedad, fueron sacrificados al día 12 p.i. para la extracción de
células inmunes del bazo y de los linfonodos de drenaje. La extracción de estos órganos se
realizó bajo campana y con técnica estéril. El bazo y linfonodos fueron homogenizados en
conjunto y luego procesados con ACK para la obtención de las células inmunes (como se
describió en la metodología del objetivo 2) Las células obtenidas fueron suspendidas en
medio de cultivo completo (Gibco®, Thermo Fisher) a una concentración de 1 x 107
células/mL. Para la re-estimulación de los linfocitos reactivos, se agregó a la suspensión
MOG 50 µg/mL p/v. Además, se agregó IL-23 10 ng/mL (589002, Biolegend) y anti-IFNγ

72
10µg/mL (505812, Biolegend) para inducir la diferenciación a linfocitos Th17 (200). Luego,
la suspensión fue dividida en alícuotas de 10 mL en botellas para cultivo celular T25 (BD).
Las células fueron cultivadas por 72 – 96 h a 37 ºC con CO2 al 5% v/v en una estufa (InCu
SaFe MCO-15AC, Sanyo). Posteriormente, las células ya activadas fueron centrifugadas
(centrífuga Thermo ScientificTM HeraeusTM MegafugeTM 8R, rotor 75005701) y
resuspendidas en PBS 1X pH 7,4. Finalmente, se prepararon diluciones de 25 millones de
células en un volumen total de 100 µL PBS 1X pH 7,4 y se cargaron en jeringas de insulina
(BD Ultra-fineTM). Para corroborar la activación de linfocitos en el cultivo, se realizó un
análisis de citometría de flujo con anticuerpos anti-CD4 y anti-CD25.

Animales de los grupos HTX y CTRL fueron transferidos con los linfocitos re-
activados. El día de la transferencia adoptiva se denominó “día 0”. La evolución de los signos
neurológicos de la EAE fueron analizados según el puntaje clínico ya descrito. (198). El
promedio del puntaje de la EAE fue calculado de los puntajes de todos los ratones de un
mismo grupo.

7. Metodología para el cálculo de n muestral

Para el cálculo del n muestral, se utilizó el método llamado “resource equation” (201-
203). Este método calcula el grado de libertad de la varianza (E) como:

E = número total de animales – número total de grupos

El valor de E debe ser entre 10 y 20. Valores inferiores a 10 indican que es necesario
aumentar el número de animales para incrementar la probabilidad de un resultado
estadísticamente significativo. Por el contrario, para valores superiores a 20, no es necesario
utilizar más animales ya que esto no aumenta la probabilidad de tener un resultado
estadísticamente significativo (201).

Ejemplo:

Para el objetivo 1, se utilizaron 4 grupos experimentales (HTX, HTX+T4, CTRL y

control positivo con LPS). Se estimó necesario incluir 4 ratones por grupo. Por tanto, E = (4

73
x 4) – 4, es decir, 12. Se consideró un 20% adicional por concepto de pérdidas. Por lo tanto,
el número de ratones necesario utilizar en cada grupo experimental fue: 4 + (4 x 0,2) = 4 +
0,8 = 5 ratones por grupo. En suma, se calculó un total de 20 animales para el análisis de
espectrofotometría y 20 animales para el análisis de microscopía confocal.

La Tabla 2 muestra el n muestral necesario para cada objetivo según este método.
Para todos los objetivos, el cálculo consideró un 20% adicional por concepto de pérdidas.
Para los objetivos donde se indujo EAE, se consideró una probabilidad de éxito de un 60%,
en base a la experiencia de nuestro laboratorio.

74
Tabla 2. N muestral estimado para los experimentos según objetivo

Objetivo. HTX HTX+T4 CTRL Control Ratón

experimento positivo CD45.1

Objetivo 1.
espectrofotometría de
cerebro y médula 5 5 5 5 0
espinal EBD

Objetivo 1.
microscopía confocal
de cerebro y médula 5 5 5 5 0
espinal EBD

#Objetivo 2.
transferencia adoptiva
de esplenocitos totales. 6 (9) 6 (9) 6 (9) 6 (9) 7 (12)
Citometría de flujo

Objetivo 3.
Inducción de EAE
pasiva. Citometría de 4 (12) 4 (12) 4 (12) 0 15
flujo

Objetivo 3. Inducción
de EAE crónica
monofásica post 6 6 6 6 7
transferencia adoptiva
de esplenocitos
CD45.1+. Citometría
de flujo

Dado que se desconoce el porcentaje de éxito de la inducción de EAE pasiva, se planeó

realizar 3 experimentos independientes de manera de aumentar la probabilidad de conseguir
los animales receptores enfermos necesarios para alcanzar significancia estadística. El n
muestral estimado considerando estos 3 experimentos independientes se indica entre
paréntesis.

#Para el objetivo 2, el análisis estadístico inicial con el n experimental calculado de 6, sólo

mostró tendencias, por lo que posteriormente se calculó un nuevo n experimental basados en
la desviación estándar observada en los grupos experimentales de este ensayo según Charan
y cols. (201) El n muestral estimado considerando este método se indica entre paréntesis.

75
8. Análisis estadístico

Para el análisis estadístico se utilizó el software Prism 4 (Graph Pad Software, Inc.)
TM
y Statistica (TIBCO Statistica ). Para la exclusión de outliers se utilizó QuickCals ®
(Graph Pad Software, Inc.), disponible en línea. Los resultados de los experimentos se
representaron como el promedio de cada n experimental y el error estándar de la media
(SEM). Se utilizó el test de análisis de varianza (ANOVA) de una vía y post test de Tukey o
Dunnet, ANOVA de dos vías y post test de Bonferroni, ANOVA multifactorial con post test
de LSD de Fisher, t- test no pareado y test de Mann-Whitney. Las diferencias fueron
consideradas estadísticamente significativas cuando p<0.05, y expresadas con letras
diferentes.

76
 RESULTADOS

1. El tratamiento con metimazol durante la preñez induce hipotiroxinemia en los

ratones gestantes

Para inducir HTX gestacional, ratones hembras preñadas de la cepa C57BL/6

recibieron MMI en el agua de beber desde el día E10 al día E15 (ver metodología). El MMI
se une a la TPO impidiendo la adición de I- a los residuos de tirosina, bloqueando la síntesis
de T4 (97, 99, 105). Con el objetivo de asegurar que los efectos observados en la progenie se
debían a la deficiencia de T4 y no a un efecto adverso del MMI durante la gestación, un
segundo grupo experimental de ratones gestantes recibió MMI junto con T4 en el agua de
beber (190). Finalmente, se obtuvo un grupo control eutiroideo que recibió agua sin MMI ni
T4.

Luego, para confirmar si el tratamiento con MMI indujo HTX en los ratones
gestantes, sin alterar la función tiroidea de la progenie, se realizó la medición de los niveles
séricos de hormonas tiroideas en los ratones gestantes al día E15 y de la progenie adulta a los
55 días de edad. La Figura 15 A muestra los resultados obtenidos de la medición de los
niveles de T3 total (tT3), T4 total (tT4) y TSH en el suero de los animales gestantes al final de
la administración del tratamiento. Se observó una disminución significativa de los niveles
séricos de T4 en los ratones gestantes que recibieron el tratamiento con MMI (grupo HTX)
en comparación a los grupos CTRL e HTX+T4. Este resultado confirma que el tratamiento
con MMI durante la gestación induce HTX en las madres y que este efecto puede ser revertido
mediante la suplementación con la hormona T4 en el agua de beber. De igual forma, se
midieron los niveles séricos de tT3, tT4 y TSH en la progenie adulta al día P55 (Figura 15
B). No se observaron diferencias significativas en ninguno de los grupos experimentales.
Este resultado indica que la progenie gestada en HTX es eutiroidea a los 55 días post natal.

77
 Concentración sérica (ng/dL) Concentración sérica (µg/dL) Concentración sérica (µUI/dL)
(A)

0
2
4
6

40
60
80
100
120
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
C C
TR TR C
L L TR

b
L

a
a

H H
TX TX H

a
TSH

TX
a

tT3
tT4
TSH

Células CD45.1+

Células CD45.2+
H H

Leyenda en la página siguiente

TX TX H
+T +T TX
4 4 +T

a
4
a

Concentración sérica (ng/dL) Concentración sérica (µg/dL) Concentración sérica (µUI/dL)

(B)

1.0
1.5
2.0
2.5

3.0
3.5
4.0
4.5
5.0

60
70
80
90
100
C C C
TR TR TR
L L L
a

a
a

H H H
TX
a

TX TX

tT3
tT4
TSH

a
a
Células CD45.2+

Células CD45.1+

Células CD45.1+
H
H H TX
TX TX +T
+T +T 4
a

4 4

a
a

78
Figura 15. El tratamiento con MMI induce HTX gestacional. (A) Niveles totales de TSH,
tT4 y tT3 en el suero de ratones preñadas al día E15, después del tratamiento con MMI (HTX),
MMI + T4 (HTX+T4) y control eutiroideo (CTRL). (B) Niveles totales de TSH, tT4 y tT3 en
el suero de la progenie de los grupos experimentales al día P55. Los gráficos muestran los
promedios de 4 mediciones independientes para cada uno de los grupos experimentales de
los ratones gestantes y de 3 mediciones independientes para cada uno de los grupos
experimentales de la progenie, ± SEM. Test de ANOVA de una vía, post test Tukey. Letras
diferentes indican p < 0.05.

79
2. Desarrollo del objetivo 1: Análisis de la permeabilidad basal de la barrera
hematoencefálica al colorante Evans blue en ratones gestados en hipotiroxinemia

Para el desarrollo de este objetivo, se utilizó el ensayo de permeabilidad de la BHE al

EBD (192). El EBD es un colorante de alto peso molecular muy utilizado para estudiar la
indemnidad de la BHE (204). Al momento de ingresar al intravascular, el EBD se une a las
proteínas circulantes en un equilibrio reversible (204). Estas proteínas, principalmente la
albúmina, no cruzan la BHE en condiciones fisiológicas, por lo que la extravasación de EBD
hacia el parénquima del SNC indica una disrupción de la BHE (192, 205-208). La
extravasación del EBD puede ser identificada macroscópicamente, mediante
autofluorescencia (192) o mediante espectrofotometría (194), por lo que es considerado un
método rápido, confiable y altamente sensible para el estudio de la permeabilidad global de
la BHE (205).

La Figura 16 A muestra imágenes representativas de cerebros y médulas espinales

luego de la perfusión con EBD. Al examen macroscópico, se observó que el cerebro de la
progenie HTX presentó una coloración azul en casi la totalidad del parénquima, tanto en la
convexidad como en las estructuras profundas (corte coronal en bregma), que no se observó
en los cerebros de los animales CTRL e HTX + T4. Es interesante destacar que los cerebros
de los animales CTRL e HTX + T4 presentaron algunas zonas pequeñas que captaron EBD
en los territorios periventriculares y ganglionares. Estas zonas correspondían a los órganos
circunventriculares y a los plexos coroideos, los que carecen de BHE (209, 210). Estos
hallazgos estuvieron en concordancia con lo observado en los cerebros de los controles
positivos con LPS que mostraron una coloración azul intensa generalizada, de acuerdo a lo
descrito en la literatura (193).

En el análisis por espectrofotometría, se observó un aumento significativo de la

concentración de EBD en los cerebros de los ratones gestados en HTX comparados con los
grupos CTRL y HTX + T4. (Figura 16 B). Este resultado apoyó lo observado en el análisis
cualitativo (Figura 16 A) y confirmó que los animales gestados en HTX tenían una alteración
de la BHE que permitía un mayor paso del EBD desde los vasos sanguíneos al parénquima
cerebral. Es interesante destacar que el resultado obtenido en el grupo HTX fue similar a lo
observado en el control positivo con LPS. El LPS induce una inflamación sistémica (211), lo

80
que sugiere que la progenie gestada en HTX podía tener un proceso inflamatorio basal capaz
de provocar el aumento de la permeabilidad de la BHE al trazador.

Por otra parte, las médulas espinales de los animales gestados en HTX mostraron una
coloración azul en todos los segmentos, desde cervical hasta el cono medular, similar al
control positivo con LPS. En contraste, las médulas espinales de los animales del grupo
CTRL e HTX + T4 sólo mostraron coloración azul en los segmentos más caudales, mientras
que la médula cervical y torácica no presentaron captación del colorante (Figura 16 A).

Estos hallazgos fueron confirmados por el estudio de espectrofotometría. Se observó

un aumento significativo de la concentración de EBD en las médulas espinales de los
animales gestados en HTX comparados con los grupos CTRL y HTX+T4 (Figura 16 C). Es
interesante destacar que las concentraciones de EBD / mg de tejido observadas en las médulas
espinales de los grupos experimentales fueron mayores que las observadas en los cerebros
respectivos (Figura 16 B y 16 C). Esto está en concordancia con datos de la literatura que
muestran que la BHE de la médula espinal es más permeable que la BHE del cerebro (212,
213).

81
 CTRL

HTX

HTX+T4

LPS

82
Objetivo 1 espectrofotometría
(B) Cerebro

CEREBRO
b bc
100
EB (ng) / tejido (mg) CTRL
80 HTX
HTX+T4
60 LPS

40 a a
20

S
4
TX
L

+T
TR

LP
H

TX
C

(C) Médula espinal

MEDULA
200 b bc
CTRL
EB (ng) / tejido (mg)

HTX
150
HTX+T4
LPS
100

50
a a

0
S
4
TX
L

+T
TR

LP
H

TX
C

Leyenda en la página siguiente

83
Figura 16. La HTX gestacional produce un aumento de la permeabilidad de la BHE al
EBD en la progenie. (A) Muestras anatómicas representativas de cerebros y médulas
espinales de los grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4 y LPS después de la perfusión
con EBD. Cerebro convexidad, cerebro corte coronal (bregma), médula espinal. (B)
Cuantificación de EBD en el parénquima cerebral por espectrofotometría (n=5). (C)
Cuantificación de EBD en la médula espinal por espectrofotometría (HTX n=4; CTRL,
HTX+T4, LPS n=3). Los gráficos muestran el promedio de cada n experimental ± SEM. Test
de ANOVA de una vía, post test Tukey. Letras diferentes indican p < 0.05.

84
 Estos resultados fueron corroborados por el estudio de microscopía confocal de la
corteza cerebral y del tálamo (Figura 17 A). Se observó que el colorante EBD se encontraba
en el tejido nervioso, fuera de los vasos sanguíneos los que fueron marcados con el anticuerpo
anti-claudina 5, una proteína presente en las tight junctions de la BHE. Esto confirmó que el
EBD ingresó al parénquima a través de la BHE. En concordancia, la corteza cerebral y el
tálamo de los animales gestados en HTX tuvieron una intensidad de fluorescencia del EBD
significativamente mayor que el grupo CTRL y HTX+T4 (Figura 17 C y 17 D,
respectivamente).

Por otra parte, la BHE de la médula espinal de los animales gestados en HTX también
mostró un aumento de la permeabilidad al EBD comparado con el grupo HTX y HTX+T4
(Figura 17 B), tanto en la sustancia blanca (Figura 17 E) como en la sustancia gris (Figura
17 F).

Es interesante destacar que las concentraciones de EBD / mg de tejido observadas en

las médulas espinales de los grupos experimentales fueron mayores que las observadas en el
cerebro (Figura 17 C y 17 D). Esto estuvo en concordancia con datos de la literatura que
muestran que la BHE de la médula espinal es más permeable que la BHE del cerebro (212,
213).

85
 (A)
HTX+T4

86
 (B)
HTX+T4

87
 (C)(C) (D)

(B) Cerebro

CEREBRO
bb bb
100 b bc
CTRL
EB (ng) / tejido (mg)

80 HTX
HTX+T4
60 LPS

40 a a
aa aa
20

S
4
TX
L

+T
TR

LP
H

TX
C

(E) (F)

(D)
(C) Médula espinal

MEDULA c
200 bb b
CTRL
b bc
b
bc
EB (ng) / tejido (mg)

HTX
150
b HTX+T4
LPS
100

50
aa aa
aa a
0
S
4
TX
L

+T
TR

LP
H

TX
C

(F)

88
 (E) (F)

(D) (B) Cerebro

CEREBRO
bb cbb
100
EB (ng) / tejido (mg)
b CTRL
HTX
80 bc
bc HTX+T4
60 b LPS

40 a a
20
a a

0 a a

S
4
TX
L

+T
TR

LP
H

TX
C

(F)
(C) Médula espinal

MEDULA
b
200
cbc CTRL
c
EB (ng) / tejido (mg)

HTX
150
HTX+T4
b LPS
100 b
50
a a

0
aa aa
S
4
TX
L

+T
TR

LP
H

TX
C

Leyenda en la página siguiente

89
Figura 17. La HTX gestacional produce un aumento de la permeabilidad de la BHE al
EBD en la progenie. (A) Muestras histológicas representativas de la fluorescencia del EBD
por microscopía confocal de la corteza cerebral y el tálamo de los grupos experimentales
CTRL, HTX, HTX+T4 y LPS. (B) Muestras histológicas representativas de la fluorescencia
del EBD por microscopía confocal de la sustancia blanca y sustancia gris de la médula espinal
de los grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4 y LPS. (C) Cuantificación de la
intensidad de fluorescencia de EBD en la corteza cerebral de los grupos experimentales
CTRL, HTX, HTX+T4 y LPS (n=3). (D) Cuantificación de la intensidad de fluorescencia de
EBD en el tálamo de los grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4 y LPS (n=3). (E)
Cuantificación de la intensidad de fluorescencia de EBD en la la sustancia blanca de la
médula espinal de los grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4 y LPS (n=3). (F)
Cuantificación de la intensidad de fluorescencia de EBD en la la sustancia gris de la médula
espinal de los grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4 y LPS (n=3). Amplificación
40X. Escala 50 µm. EBD (rojo), claudina-5 (verde), DAPI (azul). Los gráficos muestran el
promedio de cada n experimental ± SEM. Test de ANOVA de una vía, post test Tukey. Letras
diferentes indican p < 0.05.

90
 Como control interno, se analizó el plexo coroideo en los cerebros de los animales de
los grupos experimentales. Se observó que el EBD ingresaba al interior de las células
ependimarias de manera cualitativamente similar en todos los grupos (Figura 18). Esto
indicó que la perfusión del colorante había sido técnicamente satisfactoria en todos los
grupos.

91
 LPS

PC
V
PC
HTX+T4

PC
HTX

V
CTRL

V
PC

Leyenda en la página siguiente

92
Figura 18. La HTX gestacional no produce diferencias en la captación del EBD en el
plexo coroideo de la progenie. (A) Muestras histológicas representativas de la
fluorescencia del EBD por microscopía confocal del plexo de los grupos experimentales
CTRL, HTX, HTX+T4 y LPS. Amplificación 40X. Escala 100 µm. EBD (rojo), DAPI (azul).
PC = plexo coroideo, V = ventrículo.

93
3. Objetivo 2: Probar la permeabilidad basal de la barrera hematoencefálica a células
inmunes en ratones gestados en hipotiroxinemia

En este objetivo, estudiamos si la BHE de la progenie gestada en HTX era más

permeable al paso de células inmunes que el grupo CTRL, en condiciones no inflamatorias.
Para esto, se realizó un ensayo de transferencia adoptiva de esplenocitos totales de ratones
C56BL/6 CD45.1 a ratones de la cepa congénica CD45.2 de la progenie CTRL, HTX e HTX
+ T4. Como controles positivos se utilizó un ratón control inyectado con TP al momento de
la transferencia adoptiva de esplenocitos (TOX) y un control interno inyectado con LPS.
Posteriormente, se realizó el análisis por citometría de flujo para identificar los esplenocitos
CD45.1+ en el SNC, bazo y sangre de los grupos experimentales. Además, se identificaron
las subpoblaciones de la serie mieloide (CD11b+, CD11c+, Ly6C+ y Ly6G+) y de la serie
linfoide (CD3+, CD8+, CD4+ y B220+), según la estrategia de selección (Figura 12). Esta
estrategia experimental tenía la ventaja de que nos permitía estudiar la permeabilidad de la
BHE a célula inmunes in vivo de manera fácil y expedita (214). Los cálculos fueron
expresados en términos absolutos y porcentuales. La medición absoluta permitió cuantificar
la relación entre las células inmunes estudiadas y la totalidad del parénquima. La medición
porcentual dio una cuantificación de la relación entre la subpoblación celular analizada y la
totalidad de la población de células inmunes estudiada.

La Figura 19, muestra la cuantificación absoluta y relativa de las células CD45.1+ en

el SNC de los ratones CD45.2 de la progenie CTRL, HTX, HTX+T4 y los controles positivos
TOX y LPS, posterior a la transferencia adoptiva de esplenocitos totales CD45.1+. No se
observaron diferencias significativas en términos absolutos ni porcentuales en las células
CD45.1+ en el SNC en los animales HTX comparados con el control. Sin embargo, se observó
que ambos grupos experimentales tenían a su vez un subgrupo de alta infiltración y otro de
baja infiltración, probablemente por la variación intragrupal. No se observaron diferencias
entre los otros grupos experimentales.

94
 (A)
CTRL HTX HTX+T4 TOX LPS

CD45.1

95
 (B) Células CD45.1+

CD45.1 promedio
30 a a a a a
CTRL
HTX
HTX+T4
Células/µL

20
TOX
LPS
10

S
4
TX
L

X
+T
TR

LP
TO
H

TX
C

(C) Porcentaje CD45.1+

CD45.1 promedio
40 a a a a a
CTRL
HTX
30
HTX+T4
% Células

TOX
20
LPS

10

0
S
4
TX
L

X
+T
TR

LP
TO
H

TX
C

Leyenda en la página siguiente

96
Figura 19. : La migración de esplenocitos CD45.1+ al SNC es similar en la progenie
gestada en HTX con respecto al control en condiciones basales. (A) Citometrías de flujo
representativas para la identificación de los esplenocitos CD45.1+ transferidos en el SNC de
los grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. (B) Cuantificación absoluta
de los esplenocitos CD45.1+ en el SNC de los grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4,
TOX y LPS. (D) Porcentaje de esplenocitos CD45.1+ en el SNC de los grupos experimentales
CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. Los gráficos muestran el promedio de cada n
experimental ± SEM, n=9. Test de ANOVA de una vía, post test de Dunnett. Letras diferentes
indican p < 0.05.

97
 Estos resultados indicaron que no había diferencias en la permeabilidad de la BHE al
ingreso de los esplenocitos totales transferidos entre los grupos experimentales. Sin embargo,
no era posible descartar que la BHE de los animales gestados en HTX tuviese una
permeabilidad alterada selectiva a alguna subpoblación de las células inmunes transferidas.

Para esto, se evaluó inicialmente si existían diferencias en el ingreso al SNC de las

subpoblaciones de células mieloides CD45.1+ entre los grupos experimentales. Se realizó
primero la cuantificación absoluta y relativa de los neutrófilos (CD11b+ Ly6G+) (Figura 20).
No se observaron diferencias significativas en términos absolutos ni porcentuales en la
población de neutrófilos en el SNC en los animales HTX comparados con CTRL. Sólo se
observó un aumento significativo del porcentaje de neutrófilos en el SNC del grupo TOX
(Figura 20 C). Este hallazgo fue inesperado, ya que existen reportes que indican que la TP
inicialmente inhibe el reclutamiento de los neutrófilos (215). Sin embargo, este aumento
porcentual de neutrófilos CD45.1+ observado en el grupo TOX podía explicarse por la
presencia de esplenocitos inmaduros, fisiológicamente ausentes en la circulación sanguínea,
y que expresan Ly6G (216, 217).

98
 (A)
CTRL HTX HTX+T4 TOX LPS

CD11b
Ly6G

99
 (B) Neutrófilos

CD45.1+ Ly6G+
250 a a a a a CTRL
HTX
Células / 100 µL
200
HTX+T4
150 TOX
LPS
100

50

S
4
TX
L

X
+T
TR

LP
TO
H

TX
C

(C)

Porcentaje de neutrófilos
CD45.1+ Ly6G+
15
b CTRL
a a a a HTX
10 HTX+T4
% Células

TOX
LPS
5

0
S
4
TX
L

X
+T
TR

LP
TO
H

TX
C

Leyenda en la página siguiente

100
Figura 20. La migración de neutrófilos al SNC es similar en la progenie gestada en HTX
con respecto al control en condiciones basales. (A) Citometrías de flujo representativas
para la identificación de los neutrófilos (CD11b+Ly6G+) en la población CD45.1+ en el SNC
de los grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. (B) Cuantificación
absoluta de los neutrófilos en la población CD45.1+ en el SNC de los grupos experimentales
CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. (C) Porcentaje de neutrófilos en la población CD45.1+
en el SNC de los grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. Los gráficos
muestran el promedio de cada n experimental ± SEM, n=9. Test de ANOVA de una vía, post
test de Dunnett. Letras diferentes indican p < 0.05.

101
 A continuación, se realizó la cuantificación absoluta y relativa de la población de
células que expresaban el marcador CD11c (Figura 21). No se observaron diferencias
significativas en términos absolutos ni porcentuales en las células CD45.1+ CD11c+ en el
SNC en los animales HTX comparados con CTRL. Sólo se observó un aumento significativo
en la cuantificación absoluta (Figura 21 B) y porcentual (Figura 21 C) de estas células en
el grupo TOX. Este hallazgo estuvo de acuerdo con la literatura que muestra que la TP induce
la maduración (218) y promueve la migración de las células CD11c+ al tejido nervioso (219).

102
 (A)
CTRL HTX (A) HTX+T4 TOX LPS

CD11c

103
 (B) Células CD45.1+ CD11c+

CD45.1+ CD11c+
250
b
CTRL
Células / 100 µL 200 HTX
HTX+T4
150 a a a a TOX
LPS
100

50

S
4
TX
L

X
+T
TR

LP
TO
H

TX
C

(C)

Porcentaje CD45.1+ CD11c+

CD45.1+ CD11c+
a a a a a
15
CTRL
HTX
10 HTX+T4
% Células

TOX
LPS
5

0
S
4
TX
L

X
+T
TR

LP
TO
H

TX
C

Leyenda en la página siguiente

104
Figura 21. La migración de células CD11c+ al SNC es similar en la progenie gestada en
HTX con respecto al control en condiciones basales. (A) Citometrías de flujo
representativas para la identificación de las células CD11c+ en la población CD45.1+ en el
SNC de los grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. (B) Cuantificación
absoluta de las células CD11c+en la población CD45.1+ en el SNC en los grupos
experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. (C) Porcentaje de las células CD11c+
en la población CD45.1+ en el SNC en los grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4,
TOX y LPS. Los gráficos muestran el promedio de cada n experimental ± SEM, n=9. Test
de ANOVA de una vía, post test de Dunnett. Letras diferentes indican p < 0.05.

105
 Entonces, se realizó la cuantificación absoluta y relativa de las poblaciones de
monocitos inflamatorios (CD11b+ Ly6Chigh) y macrófagos (CD11b+ Ly6Clow) en la población
CD45.1+. Se encontró un aumento significativo de la cantidad (Figura 22 B) y porcentaje
(Figura 22 C) de monocitos inflamatorios en el SNC del grupo HTX comparado con el grupo
CTRL. Por el contrario, no se encontraron diferencias significativas en la cuantificación de
los macrófagos entre el grupo HTX y el CTRL (Figura 22 D y 22 E). Sólo se observó un
aumento significativo del porcentaje de macrófagos en el grupo TOX comparado con el
CTRL (Figura 22 E).

Este hallazgo es interesante ya que existe evidencia de que los monocitos que infiltran
al SNC durante la EAE son fundamentales para el desarrollo de la enfermedad (220-224).
Por una parte, actúan como CPA profesionales capaces de activar a los linfocitos T CD4+
específicos para la mielina (225). Además, promueven el daño tisular mediante la secreción
de mediadores (226) y la fagocitosis de la mielina (227). Los monocitos periféricos infiltran
tempranamente el SNC y su localización y densidad se asocia áreas de desmielinización,
progresión clínica, gravedad y remisión de la enfermedad (228, 229). Este resultado aporta
evidencia indirecta de un aumento de la permeabilidad de la BHE en los animales gestados
en HTX.

Es llamativa la dispersión de los datos obtenida en el grupo HTX. Esto está en

concordancia con estudios que muestran que el 50% de la progenie gestada en HTX expresa
daño neuronal (97), lo que sugiere que el efecto sobre la BHE podría afectar a un porcentaje
similar de la progenie.

El resultado obtenido en el grupo TOX estuvo de acuerdo con reportes de la literatura

que indican que la TP aumenta la permeabilidad de la BHE a los monocitos (116), los cuales
se transforman en macrófagos una vez ingresados al tejido nervioso (230).

106
107
 (A)
CTRL HTX HTX+T4 TOX LPS

Ly6C
Ly6G

108
(B) Monocitos inflamatorios

Monocitos inflamatorios
b
20
CTRL
Células / 100 µL
a a a a HTX
15
HTX+T4
TOX
10
LPS

S
4
TX
L

X
+T
TR

LP
TO
H

TX
C

(C)

Porcentaje monocitos inflamatorios

Monocitos inflamatorios
b
5
CTRL
4 HTX
a a a a HTX+T4
% Células

3 TOX
LPS
2

0
S
4
TX
L

X
+T
TR

LP
TO
H

TX
C

109
 (D) Macrófagos

Macrófagos
50 a a a a a CTRL
HTX
Células / 100 µL 40
HTX+T4
30 TOX
LPS
20

10

S
4
TX
L

X
+T
TR

LP
TO
H

TX
C

(E)

Porcentaje macrófagos

Macrófagos
3 a a a b a
CTRL
HTX
2 HTX+T4
% Células

TOX
LPS
1

0
S
4
TX
L

X
+T
TR

LP
TO
H

TX
C

Leyenda en la página siguiente

110
Figura 22. La HTX gestacional aumenta el ingreso de monocitos inflamatorios, pero no
de los macrófagos al SNC en condiciones no inflamatorias. (A) Citometrías de flujo
representativas para la identificación de monocitos inflamatorios (CD11b+ Ly6Chigh) y
macrófagos (CD11b+ Ly6Clow) en la población CD45.1+ en el SNC de los grupos
experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS, a partir de la selección de células
CD11b+ CD11c-. (B) Cuantificación absoluta de monocitos inflamatorios en la población
CD45.1+ en el SNC en los grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. (C)
Porcentaje de monocitos inflamatorios en la población CD45.1+ en el SNC en los grupos
experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. (D) Cuantificación absoluta de
macrófagos en la población CD45.1+ en el SNC en los grupos experimentales CTRL, HTX,
HTX+T4, TOX y LPS. (E) Porcentaje de macrófagos en la población CD45.1+ en el SNC en
los grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. Los gráficos muestran el
promedio de cada n experimental ± SEM, n=9. Test de ANOVA de una vía, post test de
Dunnett. Letras diferentes indican p < 0.05.

111
 Finalmente, se analizó las poblaciones de linfocitos B (B220+) (Figura 23), linfocitos
T CD4+ (CD3+ CD4+) y linfocitos T CD8+ (CD3+ CD8+) (Figura 24). Para los linfocitos B,
no se observaron diferencias significativas entre el grupo HTX y el CTRL. Sólo se observó
una disminución significativa en la cuantificación absoluta de esta población celular entre el
grupo CTRL y LPS (Figura 23 B) y un aumento significativo del porcentaje de linfocitos B
en el grupo TOX comparado con el CTRL (Figura 23 C).

Los resultados obtenidos en el control con LPS estuvieron de acuerdo con reportes
que indican que la infiltración linfocitaria al SNC es marginal en presencia de LPS (231). Por
el contrario, la TP se asocia a un aumento de los linfocitos en la sangre (232). Sin embargo,
la TP disminuye la capacidad de transmigración de estas células, sin interferir en su
adherencia al endotelio (233), por lo que es posible que el aumento porcentual de estas células
observado en el grupo TOX haya correspondido a linfocitos B adheridos al endotelio de los
vasos sanguíneos intraparenquimatosos.

112
 (A)
CTRL HTX HTX+T4 TOX LPS

CD3
B220

113
 (B) Linfocitos B

CD45.1+ B220+
100 a a a a b CTRL
Células / 100 µL 80 HTX
HTX+T4
60 TOX
LPS
40

20

S
4
TX
L

X
+T
TR

LP
TO
H

TX
C

(C)

Porcentaje linfocitos B

CD45.1+ B220+
10 a a a b a
CTRL
8 HTX
HTX+T4
% Células

6 TOX
LPS
4

0
S
4
TX
L

X
+T
TR

LP
TO
H

TX
C

Leyenda en la página siguiente

114
Figura 23. La migración de linfocitos B al SNC es similar en la progenie gestada en
HTX con respecto al control en condiciones basales. (A) Citometrías de flujo
representativas para la identificación de linfocitos B (B220+) en la población CD45.1+ en el
SNC de los grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. (B) Cuantificación
absoluta de linfocitos B en la población CD45.1+ en el SNC en los grupos experimentales
CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. (C) Porcentaje de linfocitos B en la población CD45.1+
en el SNC en los grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. Los gráficos
muestran el promedio de cada n experimental ± SEM, n=9. Test de ANOVA de una vía, post
test de Dunnett. Letras diferentes indican p < 0.05.

115
 En el análisis de los linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+, no se observó diferencias
significativas en la cuantificación absoluta ni relativa entre el grupo CTRL y el grupo HTX.
Sólo se observó una disminución estadísticamente significativa de la población CD4+ en el
grupo TOX comparado con el CTRL, tanto en la cuantificación absoluta como porcentual
(Figura 24 B y 24 C). En contraste, se observó un aumento estadísticamente significativo
de la población CD8+ en el grupo TOX comparado con el CTRL, tanto en la cuantificación
absoluta como porcentual (Figura 24 D y 24 E).

Similar a lo observado con los linfocitos B, es posible que los resultados obtenidos
en el grupo TOX hayan correspondido al aumento de los linfocitos en la sangre (232)
asociado a la disminución de la transmigración de estas células sin interferir en su adherencia
al endotelio (233). Además, existen reportes que indican que la TP induce la activación de
los linfocitos T CD8+, no así de los linfocitos T CD4+ (234).

116
 (A)
CTRL HTX HTX+T4 TOX LPS

CD8
CD4

117
 (B) Linfocitos T CD4+

Linf T CD4+
80 a a a a CTRL
Células / 10 µL HTX
60
HTX+T4
TOX
40 b LPS

20

S
4
TX
L

X
+T
TR

LP
TO
H

TX
C

(C)

Porcentaje linfocitos T CD4+

Linf T CD4+
a a a a
100
CTRL
80 HTX
b
HTX+T4
% Células

60 TOX
LPS
40

20

0
S
4
TX
L

X
+T
TR

LP
TO
H

TX
C

118
 (B) Linfocitos T CD8+

Linf T CD8+
50 b CTRL
Células / 100 µL 40 HTX
a a a a HTX+T4
30 TOX
LPS
20

10

S
4
TX
L

X
+T
TR

LP
TO
H

TX
C

(C)

Porcentaje linfocitos T CD8+

Linf T CD8+
b
50
CTRL
40 HTX
HTX+T4
% Células

30 TOX
a a a a
LPS
20

10

0
S
4
TX
L

X
+T
TR

LP
TO
H

TX
C

Leyenda en la página siguiente

119
Figura 24. La migración de linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+ al SNC es similar en
la progenie gestada en HTX con respecto al control en condiciones basales. (A)
Citometrías de flujo representativas para la identificación de linfocitos T CD4+ (CD3+ CD4+)
y linfocitos T CD8+ (CD3+ CD8+) en la población CD45.1+ en el SNC de los grupos
experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS, a partir de la selección de células CD3+
B220-. (B) Cuantificación absoluta de linfocitos T CD4+ en la población CD45.1+ en el SNC
en los grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. (C) Porcentaje de
linfocitos T CD4+ en la población CD45.1+ en el SNC en los grupos experimentales CTRL,
HTX, HTX+T4, TOX y LPS. (D) Cuantificación absoluta de linfocitos T CD8+ en la
población CD45.1+ en el SNC en los grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y
LPS. (E) Porcentaje de linfocitos T CD8+ en la población CD45.1+ en el SNC en los grupos
experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. Los gráficos muestran el promedio de
cada n experimental ± SEM, n=9. Test de ANOVA de una vía, post test de Dunnett. Letras
diferentes indican p < 0.05.

120
 Para comprobar si los esplenocitos totales transferidos habían ingresado
satisfactoriamente al torrente sanguíneo de los animales receptores, se analizó la presencia
de las células CD45.1+ en la sangre de los grupos CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. Se
observó un mayor número absoluto de estas células en el grupo TOX, que no se reflejó en el
análisis porcentual. Este hallazgo estuvo en concordancia con la literatura (232). No se
observaron diferencias significativas en términos absolutos ni relativos entre los otros grupos
experimentales (Anexo 1. Figura Suplementaria 1).

Asimismo, para corroborar que las células transferidas se habrían distribuido por todo
el organismo de los animales receptores, se cuantificó la presencia de las células CD45.1+
totales en el bazo de los animales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. No se observaron
diferencias entre los grupos experimentales (Anexo 1. Figura Suplementaria 2). Luego se
analizó las subpoblaciones mieloide y linfoide de la población CD45.1+ en el bazo de los
grupos experimentales. Se observó un aumento significativo tanto en términos absolutos
como porcentuales de las subpoblaciones de neutrófilos (Anexo 1. Figura Suplementaria 3
B y 3 C) y de células CD11c+ (Anexo 1. Figura Suplementaria 4 B y 4 C) en el grupo HTX
comparado con el CTRL. Por el contrario, se observó que el grupo HTX tenía disminuida,
en términos absolutos y porcentuales, la población de macrófagos respecto al CTRL (Anexo
1. Figura Suplementaria 5 D y 5 E). De acuerdo a lo esperado, se observó una disminución
absoluta y porcentual de la población de monocitos inflamatorios en el grupo TOX
comparado con CTRL (235) (Anexo 1. Figura Suplementaria 5 B y 5 C). El grupo LPS
mostró una disminución porcentual de la población de monocitos comparado con el CTRL
(236) (Anexo 1. Figura Suplementaria 5 C).

Por otra parte, el análisis de la subpoblación de células linfoides no mostró diferencias

absolutas ni porcentuales entre los animales gestados en HTX y el CTRL (Anexo 1. Figura
Suplementaria 6 B y 6 C). En coincidencia con los reportes de la literatura, se observó que
el grupo TOX tenía un aumento del porcentaje de linfocitos B comparado con el CTRL (232),
contrario al grupo LPS que mostró un porcentaje significativamente menor (237) (Anexo 1.
Figura Suplementaria 6 C). En el análisis de los linfocitos T CD4+ no se observaron
diferencias entre los grupos experimentales (Anexo 1. Figura Suplementaria 7 B y 7 C).
En la población de linfocitos T CD8+ se observó que los grupos TOX (238) y LPS tenían un

121
porcentaje significativamente menor de esta población que el grupo CTRL (239) (Anexo 1.
Figura Suplementaria 7 E).

Luego se realizó el análisis de las células inmunes CD45.2+, que correspondían a

población nativa, en el SNC de los animales receptores. No se observaron diferencias
significativas en términos absolutos ni porcentuales en la población de células CD45.2+
totales en el SNC en los animales HTX comparados con el control (Anexo 1. Figura
Suplementaria 8), que podía ser explicado por la activación de la microglía (240) (Anexo
1. Figura Suplementaria 8 B y 8 C).

Posteriormente, se analizó las subpoblaciones mieloide y linfoides en la población de

células CD45.2+ en el SNC de los animales receptores. Según lo esperado, sólo se observó
una disminución significativa absoluta y porcentual de los neutrófilos en el grupo LPS (241)
(Anexo 1. Figura Suplementaria 9 B y 9 C) y un aumento relativo significativo de los
linfocitos B en el grupo TOX (233) (Anexo 1. Figura Suplementaria 10 C).

Finalmente, se analizó la población de células CD45.2+ en la sangre y bazo de los

grupos experimentales. En la sangre, no se observaron diferencias significativas en la
cuantificación absoluta ni relativa de estas células entre el grupo HTX y el control (Anexo 1.
Figura Suplementaria 11). Sólo se observó un aumento en la cuantificación absoluta de las
células CD45.2+ en el grupo TOX (232) (Anexo 1. Figura Suplementaria 11 B). En el bazo,
no se encontraron diferencias absolutas ni porcentuales en la población de células CD45.2+
entre los grupos experimentales (Anexo 1. Figura Suplementaria 12).

En el análisis de la línea mieloide en la población CD45.2+ del bazo de los grupos

experimentales, se observó que los animales HTX tenían un aumento significativo del
porcentaje de los neutrófilos (Anexo 1. Figura Suplementaria 13 C) y de las células CD11c+
(Anexo 1. Figura Suplementaria 14 C) comparados con el grupo CTRL. El grupo TOX
mostró un aumento absoluto y porcentual significativo de la población de neutrófilos en
relación al CTRL (242) (Anexo 1. Figura Suplementaria 13 B y 13 C).

En la cuantificación de la subpoblación de monocitos inflamatorios y macrófagos en

la población CD45.2+, no se observaron diferencias entre los animales gestados en HTX y el

122
control (Anexo 1. Figura Suplementaria 15). De acuerdo con la literatura, los grupos TOX
y LPS tuvieron una disminución relativa de los monocitos inflamatorios y macrófagos
comparado con el grupo CTRL (235, 236) (Anexo 1. Figura Suplementaria 15 C y 15 E).

Por otro lado, el análisis de la línea linfoide en la población CD45.2+ en el bazo de

los grupos experimentales mostró que los animales HTX tenían una disminución relativa de
los linfocitos B respecto al grupo CTRL (Anexo 1. Figura Suplementaria 16 C) y de los
linfocitos T CD4+ (Anexo 1. Figura Suplementaria 17 C), mientras que los linfocitos T
CD8+ mostraron un aumento en su porcentaje en comparación con el grupo CTRL (Anexo
1. Figura Suplementaria 17 E). En el grupo LPS, se observó un aumento porcentual de los
linfocitos B comparados con el CTRL (243) (Anexo 1. Figura Suplementaria 16 C). En el
grupo TOX se observó una disminución relativa de los linfocitos T CD4+ asociado a un
aumento porcentual de los linfocitos T CD8+ comparado con el control (234) (Anexo 1.
Figura Suplementaria 17 C y 17 E).

Aunque se desconoce el papel que estas diferencias tienen en condiciones no

inflamatorias, podrían ser relevantes en el contexto de la EAE. Similar a los monocitos y
macrófagos, los neutrófilos (244) y las células CD11c+ (199) han mostrado tener un papel
importante en e desarrollo de esta enfermedad.

4. Objetivo 3: Evaluar la infiltración de células inmunes al sistema nervioso central de

ratones gestados en hipotiroxinemia durante la fase inductiva y aguda de la
encefalomielitis autoinmune experimental

Para determinar si la BHE de la progenie gestada en HTX es más permeable al paso

de células inmunes inflamatorias, se realizó experimentos de inducción pasiva de la EAE
mediante la transferencia adoptiva de esplenocitos y células de linfonodos provenientes de
ratones C57BL/6 CD45.1 que cursaban con la EAE crónica monofásica. Las células,
previamente re-estimuladas in vitro, fueron analizadas para los marcadores CD4 y CD25 para
corroborar su activación (Figura 25 A) y luego inyectadas a los animales receptores CTRL

123
e HTX, ambos CD45.2+. Luego, los animales transferidos fueron monitoreados diariamente
para la aparición de manifestaciones clínicas. La Figura 25 B muestra la progresión de la
enfermedad en los animales receptores de la progenie CTRL e HTX, después de la
transferencia de las células inmunes CD45.1+ reactivadas in vitro. Ambos grupos
experimentales fueron seguidos hasta el día 25 p.i. No se observaron signos de enfermedad
en los grupos experimentales durante todo el período de seguimiento.

124
Leyenda en la página siguiente

125
Figura 25. La transferencia adoptiva de linfocitos CD45.1+ encefalitogénicos no induce
la EAE a los animales receptores. (A) Citometría de flujo representativa para la
identificación de los linfocitos CD45.1+ activados in vitro con pMOG. Caja roja muestra la
población de linfocitos T CD4+ activados. (B) Seguimiento del puntaje clínico de los grupos
experimentales CTRL e HTX post transferencia adoptiva de los linfocitos T CD4+ activados
in vitro con pMOG, El gráfico muestra el promedio de cada n experimental ± SEM, n=6.
Análisis de ANOVA de dos vías, post test de Bonferroni.

126
 La ausencia de síntomas neurológicos en los ratones transferidos con células CD45.1+
provenientes de ratones con EAE hizo suponer que la modificación del protocolo de
Stromnes y cols. (200) utilizada para este objetivo no habría sido de utilidad para poner en
evidencia diferencias en la permeabilidad de la BHE entre ambos grupos experimentales.

Esto pudo deberse, por una parte, a que la técnica de la EAE pasiva se fundamenta en
la transferencia de linfocitos activados contra MOG, sin considerar la transferencia de otras
poblaciones celulares presentes en el cultivo de re-estimulación. Esta observación fue
relevante, ya que los resultados obtenidos en el objetivo 2 mostraron que existía un mayor
ingreso de monocitos transferidos al SNC de los animales gestados en HTX en condiciones
no inflamatorias, no así de la población de linfocitos. Por otro lado, el protocolo de Stromnes
y cols. (200) requiere de la inyección de TP a los animales receptores. Existen datos que
sugieren que la TP aumenta la permeabilidad de la BHE (116), por lo que no fue administrada
en este ensayo para evitar alterar el fenotipo basal de los animales gestados en HTX.

Ante los resultados obtenidos con el ensayo de EAE pasiva, diseñamos una segunda
estrategia experimental que nos permitiera evaluar la infiltración tanto de células inmunes
mieloides como linfoides al SNC de los animales gestados en HTX, sin prescindir de la
utilización de TP. Para esto, se realizó la transferencia adoptiva de esplenocitos totales de
ratones C56BL/6 CD45.1+ a ratones de la cepa congénica CD45.2+ de la progenie CTRL y
HTX. Al día siguiente, se indujo EAE crónica monofásica a los animales receptores. Para
monitorizar la actividad de la enfermedad, los animales fueron revisados diariamente para la
pérdida de peso y la aparición de manifestaciones clínicas. Ensayos preliminares de nuestro
laboratorio habían mostrado que los esplenocitos CD45.1+ transferidos a animales CD45.2,
previo a la inducción de la EAE, podrían ser detectados por citometría de flujo hasta el día
12 p.i., lo que permitía realizar el seguimiento de estas células durante la fase inductiva y
aguda de la EAE (datos no aportados).

Este nuevo diseño experimental se basó en la hipótesis del “fenotipo ahorrador”

(“thrifty phenotype”) acuñada por Hales y Barker en 1992 (14). Esta hipótesis propone que
las adaptaciones de la fisiología fetal producidas por el ambiente intrauterino adverso sólo
llegan a ser dañinas cuando la progenie es “desafiada” en el ambiente postnatal (14). En este
contexto, los efectos producidos por la HTX gestacional sobre el sistema inmune de la

127
progenie se manifestarían al inducir la EAE en la etapa adulta, es decir, cuando el sistema
inmune de la progenie fuera desafiado con la noxa. Por lo tanto, se hacía necesario someter
a los animales gestados en HTX a la EAE crónica monofásica para poner en evidencia las
diferencias en la permeabilidad de la BHE a las diferentes subpoblaciones celulares.

La Figura 26 A muestra los cambios en el peso de los animales receptores inducidos

para EAE durante los días de experimentación. De acuerdo a lo esperado, no se observó
diferencias significativas entre ambos grupos experimentales (245). La Figura 26 B muestra
la progresión de la enfermedad en los animales receptores de la progenie CTRL e HTX
después de la transferencia de las células inmunes CD45.1+. Similar a lo reportado por
Haensgen y cols. (105), el grupo HTX mostró manifestaciones clínicas al día 8 p.i, mientras
que el grupo CTRL se mantuvo asintomático durante los días de experimentación. Los
animales gestados en HTX mostraron un aumento significativo del puntaje clínico de la EAE
al día 8 y 9 p.i, comparado con el control.

128
 Peso de los animales post inducción de la EAE

(B)

Progresión de la EAE crónica monofásica

a
a

Leyenda en la página siguiente

129
Figura 26. Los animales gestados en HTX desarrollan la EAE de manera más precoz.
(A) Seguimiento de los cambios en el peso de los grupos experimentales CTRL e HTX
transferidos con esplenocitos totales CD45.1+ y posterior inmunización con pMOG. (B)
Seguimiento del puntaje clínico de los grupos experimentales CTRL e HTX transferidos con
esplenocitos totales CD45.1+ y posterior inmunización con pMOG. Los gráficos muestran el
promedio de cada n experimental ± SEM. Día 0-5 n=16, día 6-7 n=11, día 8-9 n=5. Análisis
de ANOVA multifactorial, post test de LSD de Fisher. Letra a indica p<0.05.

130
 Posteriormente, animales del grupo CTRL e HTX fueron sacrificados a los días 5, 7
y 9 p.i. y se realizó un análisis por citometría de flujo para identificar las poblaciones CD45.1+
(células del donante) en el SNC, bazo y sangre de los grupos experimentales. Para cada una
de estas poblaciones, se identificaron las subpoblaciones de la serie mieloide (CD11b+,
CD11c+, Ly6C+ y Ly6G+) y de la serie linfoide (CD3+, CD8+, CD4+, B220+), siguiendo la
misma estrategia de selección e identificación utilizada para el objetivo 2 (Figura 12).

La Figura 27, muestra la cuantificación absoluta y porcentual de las células CD45.1+

en el SNC de los ratones de la progenie HTX y CTRL cursando EAE, previamente
transferidos con esplenocitos CD45.1+, al día 5, 7 y 9 p.i. No se observaron diferencias
significativas en términos absolutos ni porcentuales en las células CD45.1+ en el SNC de los
animales gestados en HTX en relación al control en los días analizados.

131
132
Leyenda en la página siguiente

133
Figura 27. La migración de los esplenocitos CD45.1+ al SNC es similar en la progenie
gestada en HTX en relación al control durante la EAE. (A) Citometrías de flujo
representativas para la identificación de los esplenocitos CD45.1+ transferidos en el SNC de
los grupos experimentales HTX y CTRL al día 5, 7 y 9 p.i. (B) Cuantificación absoluta de
los esplenocitos CD45.1+ en el SNC de los grupos experimentales HTX y CTRL al día 5, 7
y 9 p.i. (C) Porcentaje de las células inmunes transferidas CD45.1+ en el SNC de los grupos
experimentales HTX y CTRL al día 5, 7 y 9 p.i. de la EAE. Los gráficos muestran el promedio
de cada n experimental ±SEM, n=5. Análisis de Mann-Whitney.

134
 Para evaluar si existían diferencias en el ingreso al SNC de las subpoblaciones de
células mieloides CD45.1+ entre los grupos experimentales, se realizó primero la
cuantificación absoluta y porcentual de la población de neutrófilos (CD11b+ Ly6G+). No se
observaron diferencias significativas en términos absolutos ni relativos en la población de
neutrófilos en el SNC en los animales HTX comparados con CTRL, en ninguno de los días
analizados (Figura 28).

135
(A)

136
 Neutrófilos
SNC CD45.1 Neutrófilos
60
CTRL
HTX
Células / 10 µL

40

20

0
5 7 9
Días postinmunización

Leyenda en la página siguiente

137
Figura 28. El ingreso de neutrófilos al SNC es similar en la progenie gestada en HTX
en relación al control durante la EAE. (A) Citometrías de flujo representativas para la
identificación de los neutrófilos (CD11b+ Ly6G+) en la población CD45.1+ transferidos en el
SNC de los grupos experimentales HTX y CTRL al día 5, 7 y 9 p.i. (B) Cuantificación
absoluta de los los neutrófilos en la población CD45.1+ en el SNC de los grupos
experimentales HTX y CTRL al día 5, 7 y 9 p.i. (C) Porcentaje de los neutrófilos en la
población CD45.1+ transferidos en el SNC de los grupos experimentales HTX y CTRL al día
5, 7 y 9 p.i. de la EAE. Los gráficos muestran el promedio de cada n experimental ± SEM,
n=5. Análisis de Mann-Whitney.

138
 Luego, se cuantificó la presencia de células CD45.1+ CD11c+ transferidas en el SNC
de los grupos experimentales. No se observaron diferencias significativas absolutas ni
porcentuales entre los animales receptores HTX y CTRL en los días 5, 7 y 9 p.i. de la EAE
(Figura 29).

139
(A)

140
 Células CD11c+
SNC CD45.1 CD11c+
25
CTRL
20 HTX
Células / 10 µL

15

10

0
5 7 9
Días postinmunización

Leyenda en la página siguiente

141
Figura 29. El ingreso de de las células CD11c+ al SNC es similar en la progenie gestada
en HTX en relación al control durante la EAE. (A) Citometrías de flujo representativas
para la identificación de las células CD45.1+ CD11c+ en la población CD45.1+ en el SNC de
los grupos experimentales HTX y CTRL al día 5, 7 y 9 p.i. (B) Cuantificación absoluta de
células CD45.1+ en la población CD45.1+ en el SNC de los grupos experimentales HTX y
CTRL al día 5, 7 y 9 p.i. (C) Porcentaje de células CD45.1+ en la población CD45.1+ en el
SNC de los grupos experimentales HTX y CTRL al día 5, 7 y 9 p.i. Los gráficos muestran el
promedio de cada n experimental ±SEM), n=5. Análisis de Mann-Whitney.

142
 A continuación, se realizó la cuantificación absoluta y relativa de las poblaciones de
monocitos inflamatorios (CD11b+ Ly6Chigh) y macrófagos (CD11b+ Ly6Clow) en la población
CD45.1+ transferida. Los animales del grupo HTX mostraron un aumento significativo de la
cantidad absoluta (Figura 30 D) y porcentaje de macrófagos (Figura 30 E) en el SNC
comparado con el grupo CTRL al día 7 p.i. Sin embargo, no se observó diferencias
significativas en la cuantificación absoluta ni relativa de los monocitos inflamatorios
transferidos entre ambos grupos (Figura 30 B y 30 C).

Este hallazgo es de interés ya que podría tener relación con el aumento de

permeabilidad a los monocitos inflamatorios que mostró la progenie gestada en HTX en
ausencia de EAE. Existen reportes que indican que los monocitos pueden diferenciarse a
macrófagos al ingresar al SNC durante la neuroinflamación (246).

143
 (A)
5 PI 7 PI 9 PI

CTRL

Ly6C
HTX

Ly6C
Ly6G

144
 (D)

SNC CD45.1 Monocitos

15
CTRL
HTX
Células / 100 µL

10

0
5 7 9
Días postinmunización

(C)
Porcentaje monocitos inflamatorios
%SNC CD45.1 Monocitos
2.5
CTRL
2.0 HTX
% Células

1.5

1.0

0.5

0.0
5 7 9
Días postinmunización

145
 (D)

Macrófagos
SNC CD45.1 Macrófagos
20 a
CTRL CTRL
HTX
Células / 100 µL
HTX
15

10

0
5 7 9
Días postinmunización

Porcentaje macrófagos
%SNC CD45.1 Macrófagos
a
2.5
CTRL CTRL
HTX 2.0 HTX
% Células

1.5

1.0

0.5

0.0
5 7 9
Días postinmunización

Leyenda en la página siguiente

146
Figura 30. La HTX gestacional aumenta el ingreso de macrófagos transferidos al SNC
en relación al control durante la EAE. (A) Citometrías de flujo representativas para la
identificación de monocitos inflamatorios (CD11b+ Ly6Chigh) y macrófagos (CD11b+
Ly6Clow) en la población CD45.1+ en el SNC de los grupos experimentales HTX y CTRL al
día 5, 7 y 9 p.i., a partir de la selección de células CD11b+ CD11c-. (B) Cuantificación
absoluta de monocitos inflamatorios en la población CD45.1+ en el SNC en los grupos
experimentales HTX y CTRL al día 5, 7 y 9 p.i. (C) Porcentaje de monocitos inflamatorios
en la población CD45.1+ en el SNC en los grupos experimentales HTX y CTRL al día 5, 7
y 9 p.i. (D) Cuantificación absoluta de macrófagos en la población CD45.1+ en el SNC en
los grupos experimentales HTX y CTRL al día 5, 7 y 9 p.i. (E) Porcentaje de macrófagos en
la población CD45.1+ en el SNC en los grupos experimentales HTX y CTRL al día 5, 7 y 9
p.i. Los gráficos muestran el promedio de cada n experimental ± SEM, n=5. Análisis de
Mann-Whitney. Letra a indica p<0.05.

147
 Finalmente, se analizaron las subpoblaciones de linfocitos B (B220+) (Figura 31),
linfocitos T CD4+ (CD3+ CD4) y linfocitos T CD8+ (CD3+ CD8+) (Figura 32) en la población
CD45.1+ en el SNC de los animales HTX y CTRL. No se encontraron diferencias en la
cuantificación absoluta ni porcentual de los linfocitos B transferidos en el SNC de los
animales HTX comparados con el grupo CTRL al día 5, 7 y 9 p.i. de la EAE (Figura 31 B y
31 C). Sin embargo, se observó una disminución estadísticamente significativa en la
cuantificación absoluta y relativa de los linfocitos T CD8+ en el SNC de los animales HTX
al día 5 p.i., comparado con el grupo CTRL (Figura 32 D y 32 E).

Este resultado es interesante ya que existen datos que muestran que los linfocitos T
CD8+ pueden tener una función regulatoria en la EAE (247-249)

148
(A)

149
 Linfocitos B

SNC CD45.1 B220+

3
CTRL
HTX
Células / 100 µL

0
5 7 9
Días postinmunización

Leyenda en la página siguiente

150
Figura 31. El ingreso de de las linfocitos B al SNC es similar en la progenie gestada en
HTX en relación al control durante la EAE. (A) Citometrías de flujo representativas para
la identificación de linfocitos B (B220+) en la población CD45.1+ en el SNC de los grupos
experimentales HTX y CTRL al día 5, 7 y 9 p.i. (B) Cuantificación absoluta de linfocitos B
en la población CD45.1+ en el SNC en los grupos experimentales HTX y CTRL al día 5, 7 y
9 p.i. (C) Porcentaje de linfocitos B en la población CD45.1+ en el SNC en los grupos
experimentales HTX y CTRL al día 5, 7 y 9 p.i. Los gráficos muestran el promedio de cada
n experimental ± SEM, n=5. Análisis de Mann-Whitney.

151
 (A)
5 PI 7 PI 9 PI

CTRL

CD8
HTX

CD8
CD4

152
 Linfocitos T CD4+

SNC CD45.1 CD4+

50
CTRL
40 HTX
Células / 10µL

30

20

10

0
5 7 9
Días postinmunización

Porcentaje de linfocitos T CD4+

%SNC CD45.1 CD4+
80
CTRL
HTX
60
% Células

40

20

0
5 7 9
Días postinmunización

Leyenda en la página siguiente

153
 (D)
Linfocitos T CD8+

SNC CD45.1 CD8+

30
CTRL
HTX
Células / 100 µL

20
a

10

0
5 7 9
Días postinmunización

(E)
Porcentaje de linfocitos T CD8+
%SNC CD45.1 CD8+
10
CTRL
8 HTX

a
% Células

0
5 7 9
Días postinmunización

Leyenda en la página siguiente

154
Figura 32. La HTX gestacional disminuye el ingreso linfocitos T CD8+ transferidos al
SNC en relación al control durante la EAE. (A) Citometrías de flujo representativas para
la identificación de linfocitos T CD4+ (CD3+ CD4+) y linfocitos T CD8+ (CD3+ CD8+) en la
población CD45.1+ en el SNC de los grupos experimentales HTX y CTRL al día 5, 7 y 9 p.i.,
a partir de la selección de células CD3+ B220-. (B) Cuantificación absoluta de linfocitos T
CD4+ en la población CD45.1+ en el SNC en los grupos experimentales HTX y CTRL al día
5, 7 y 9 p.i. (C) Porcentaje de linfocitos T CD4+ en la población CD45.1+ en el SNC en los
grupos experimentales HTX y CTRL al día 5, 7 y 9 p.i. (D) Cuantificación absoluta de
linfocitos T CD8+ en la población CD45.1+ en el SNC en los grupos experimentales HTX y
CTRL al día 5, 7 y 9 p.i. (E) Porcentaje de linfocitos T CD8+ en la población CD45.1+ en el
SNC en los grupos experimentales HTX y CTRL al día 5, 7 y 9 p.i. Los gráficos muestran el
promedio de cada n experimental ± SEM, n=5. Análisis de Mann-Whitney. Letra a indica
p<0.05.

155
 Para comprobar si los esplenocitos CD45.1+ transferidos habían ingresado
satisfactoriamente al torrente sanguíneo y habían permanecido en el organismo de los
animales receptores durante la fase de la EAE estudiada, se analizó la presencia de las células
CD45.1+ en la sangre de los grupos HTX y CTRL al día 5, 7 y 9 p.i. No se observaron
diferencias significativas en términos absolutos ni porcentuales entre el grupo HTX y el
CTRL en ninguno de los días estudiados (Anexo 2. Figura Suplementaria 1).

Además, para corroborar que las células transferidas se habrían distribuido por todo
el organismo de los animales receptores, se cuantificó la presencia de las células CD45.1+
totales, la subpoblación mieloide y linfoide en el bazo de los animales HTX y CTRL
transferidos, a los días 5, 7 y 9 p.i. No hubo diferencias significativas en la población de
células CD45.1+ totales en el bazo entre el grupo HTX y el CTRL (Anexo 2. Figura
Suplementaria 2). Tampoco se encontraron diferencias significativas en las subpoblaciones
celulares mieloides (Anexo 2. Figura Suplementaria 3) y linfoides analizadas (Anexo 2.
Figura Suplementaria 4) en el bazo entre los grupos experimentales HTX y CTRL en los
días de evolución de la EAE observados.

Posteriormente, se realizó el análisis de la población de células inmunes CD45.2+ en

el SNC de los grupos experimentales, las que correspondían a población nativa de los
animales receptores. No se observaron diferencias absolutas ni porcentuales en esta
población celular entre el grupo HTX y CTRL en los días de EAE analizados (Anexo 2.
Figura Suplementaria 5).

En el análisis de la subpoblación mieloide en la población CD45.2+, se observó un

aumento en la cantidad y en el porcentaje de los neutrófilos en el SNC en el grupo HTX al
día 7 p.i., comparado con el grupo CTRL (Anexo 2. Figura Suplementaria 6 B y 6 C).
Además, se observó una disminución significativa de la población de células CD45.2+
CD11c+ en el SNC en el grupo HTX comparado con el CTRL, tanto en términos absolutos
como relativos, al día 5 p.i. (Anexo 2. Figura Suplementaria 7 B y 7 C). No se observaron
diferencias en la población de monocitos inflamatorios ni macrófagos en la el grupo HTX en
comparación con el control (Anexo 2. Figura Suplementaria 8).

En el análisis de la subpoblación de células linfoides en la población CD45.2+, se

156
observó que los animales gestados en HTX tenían una disminución absoluta de la población
de linfocitos B en la población CD45.2+ en el SNC, comparado con el CTRL al día 5 p.i.
(Anexo 2. Figura Suplementaria 9 B). También se observó una disminución absoluta y
porcentual de los linfocitos T CD8+ en la población CD45.2+ en el SNC de los animales HTX
comparados con el grupo CTRL (Anexo 2. Figura Suplementaria 10 D y 10 E).

Luego, se analizó la población de células CD45.2+ en la sangre y bazo de los grupos

experimentales al día 5, 7 y 9 p.i de la EAE. En la sangre, no se encontraron diferencias en
esta población entre los grupos experimentales (Anexo 2. Figura Suplementaria 11).
Igualmente, los animales gestados en HTX no mostraron diferencias en la población de
células CD45.2+ en el bazo respecto al grupo CTRL (Anexo 2. Figura Suplementaria 12).

Finalmente, se analizó la subpoblación de células mieloides y células linfoides en la

población CD45.2+ en el bazo en los grupos experimentales. No se encontraron diferencias
en la población de neutrófilos, células CD11c+, monocitos inflamatorios y macrófagos entre
el grupo HTX y el CTRL (Anexo 2. Figura Suplementaria 13). Asimismo, no se observaron
diferencias en la población de linfocitos B, linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+ entre el
grupo HTX y el CTRL (Anexo 2. Figura Suplementaria 14).

Estos datos sugieren que la BHE de los animales gestados en HTX tendría una
permeabilidad diferente a las distintas poblaciones celulares durante el desarrollo de la EAE
comparado con el control.

157
 DISCUSIÓN

El propósito de esta tesis fue evaluar si la progenie gestada en HTX tenía un aumento
de la permeabilidad de la BHE que facilitara el desarrollo de enfermedades autoinmunes del
SNC durante la etapa adulta.

La hipótesis se basó en los hallazgos publicados por Haengsen y cols. que muestran
que los animales gestados en HTX desarrollan una EAE más precoz que los animales
gestados en condiciones eutiroideas (105). Además, estudios no publicados de nuestro
laboratorio muestran que la progenie gestada en HTX tiene niveles séricos de IL-17 mayores
que los animales gestados en condiciones control en ausencia de EAE. IL-17 es una de las
citoquinas efectoras más relevantes en la patogenia de la esclerosis múltiple y la EAE (146-
149), principalmente por su efecto sobre la permeabilidad de la BHE (150) y el ingreso de
células inmunes al SNC (151, 156).

Inicialmente, se estudió la permeabilidad de la BHE al paso de moléculas mediante

el ensayo de extravasación del EBD en los grupos experimentales sin EAE (TABLA 3).

158
Tabla 3. Resumen de los resultados de permeabilidad de la BHE al EBD

Análisis HTX

Espectrofotometría Cerebro ↑
(ng EBD/mg tejido)
Médula espinal ↑

Corteza cerebral ↑
Microcopía confocal
(aumento relativo de la Tálamo ↑
intensidad de fluorescencia
en relación al control) Médula espinal - SB ↑

Médula espinal - SG ↑
↑ = aumento respecto al grupo CTRL; SB = sustancia blanca; SG = sustancia gris.

Se observó que los animales gestados en HTX tenían mayor concentración del
colorante en el parénquima del cerebro y de la médula espinal comparado con los animales
gestados en eurtiroidismo (Figura 16 y Figura 17). La apariencia macroscópica del cerebro
y médula espinal de estos animales era similar a la observada tras realizar una criolesión que
provoca una disrupción de la BHE y el consecuente ingreso del EDB a las zonas lesionadas
(192, 250). Estos resultados fueron de gran relevancia porque existen datos que muestran que
el EBD puede teñir las zonas de desmielinización en el SNC durante la EAE, debido a que
estas áreas tienen un aumento de la permeabilidad vascular (251-254). Estas observaciones
eran consistentes con un aumento de la permeabilidad al EBD de la BHE de la progenie
gestada en HTX.

Es interesante destacar que la progenie gestada en HTX mostró un aumento de la

permeabilidad al EBD similar al observado en el control positivo con LPS (Figura 16 y
Figura 17). El LPS induce una inflamación sistémica en estos animales que permite el paso
del EBD a través de la BHE (211), lo que sugería que la progenie gestada en HTX podía
tener un proceso inflamatorio capaz de provocar un aumento de la permeabilidad de la BHE
al trazador. Esta condición inflamatoria podría ser explicada por los altos niveles de IL-17

159
que presentan estos animales.

Las principales fuentes de IL-17 son las células T CD4+, células T γδ, células NK,
macrófagos, células dendríticas, neutrófilos y mastocitos (255). IL-17 se une a su receptor en
las células endoteliales de la BHE activando la producción de ROS mediada por las enzimas
NADPH oxidasa y xantina oxidasa (151). El estrés oxidativo induce la fosforilación de la
cadena liviana de la miosina, el reordenamiento del citoesqueleto, la reorganización de la
zona occludens, la disminución de la expresión de ocludina (151) y de claudina-5 (256). Estos
cambios llevan a la contracción de la célula endotelial, al desacoplamiento de las tight
junctions y al aumento del espacio intercelular, lo que explicaría la mayor permeabilidad de
la BHE al EBD en la progenie gestada en HTX (151, 156).

Estas observaciones serían importantes para explicar la precocidad de la EAE en la

progenie gestada en HTX. Existen reportes que muestran que el aumento de la permeabilidad
de la BHE es un evento precoz en el desarrollo de la EAE y precede a la infiltración de las
células inflamatorias (257). Por lo tanto, la inducción de la EAE en los animales gestados en
HTX encontraría a la BHE en un estado “pre-activado”, facilitando la invasión del infiltrado
inflamatorio en el SNC. Esto acortaría la fase inductiva y explicaría por qué estos animales
presentan síntomas antes que el control.

Por otro lado, el EBD tiene un peso molecular de 961 Da (204), lo que sugiere que la
BHE de los animales gestados en HTX podría permitir el paso de otras moléculas. Existen
datos que muestran que el EBD tiene una alta afinidad por la albúmina (204), por lo que es
posible que el colorante que cruzó la BHE se encuentre unido a moléculas de albúmina
extravasadas al tejido nervioso. Esto sería de gran relevancia, ya que existen datos que
muestran que la extravasación de albúmina precede al infiltrado inflamatorio y a los síntomas
neurológicos durante la EAE (258). Además, se estima que el 25% de los pacientes con
esclerosis múltiple tienen un aumento de la albúmina en el SNC, la que se asocia a la atrofia
de las estructuras encefálicas (259).

Existen antecedentes que muestran que la albúmina puede alterar la concentración

intracelular de calcio en los astrocitos (260), generando una regulación negativa (down
regulation) de los canales de potasio Kir4.1 (261). Esto provoca una alteración en la

160
homeotasis del potasio que aumenta la sensibilidad de los receptores NMDA de las neuronas
(261). Por otra parte, la albúmina puede incrementar la síntesis de glutamato (262),
perpetuando este ciclo. La citotoxicidad por glutamato está implicada en la
neurodegeneración observada en la esclerosis múltiple (263), por lo que el aumento de la
permeabilidad de la BHE en la progenie gestada en HTX podría además favorecer el
desarrollo de procesos neurodegenerativos.

Sin embargo, en esta tesis no se estudió la ultraestructura de la BHE de estos animales,

por lo que será necesario realizar estudios complementarios que apoyen esta idea. Estos
análisis deberán incluir estudios morfológicos de la BHE de la progenie gestada en HTX,
principalmente de las proteínas de las tight junctions mediante microscopía de fluorescencia
y western blot.

Es interesante comentar que estos resultados planteaban la interrogante si el EBD

había ingresado al SNC a través del líquido cefalorraquídeo. Parecía poco probable que el
ingreso del EBD hubiese ocurrido por difusión desde el LCR hacia el parénquima cerebral,
ya que las paredes del sistema ventricular de los cerebros de los animales gestados en HTX
tenían una coloración azul menos intensa que el resto del parénquima cerebral. Esto sugería
que la cantidad de EBD que podía haber fluido desde el líquido cefalorraquídeo hacia las
paredes de los ventrículos cerebrales no era significativa. Otra posibilidad planteaba que el
EBD se hubiese diluido en el líquido cefalorraquídeo. Sin embargo, esta idea tenía poco
sustento fisiológico debido a que el tiempo transcurrido desde el inicio de la perfusión hasta
la extracción del SNC no fue mayor a 10 min, tiempo que no permite el recambio completo
del líquido cefalorraquídeo. En condiciones normales, el ratón tiene 100 µL de líquido
cefalorraquídeo y su tasa de recambio son 0,3 µL / min aproximadamente, por lo que se
habrían necesitado aproximadamente 5,5 h para eluir el contenido de EBD del sistema
ventricular (264, 265). Además, era poco probable que el EBD encontrado en el parénquima
cerebral hubiese venido del líquido cefalorraquídeo, ya que el líquido intersticial fluye en
dirección al sistema ventricular y a los ganglios linfáticos, no en sentido opuesto (266). Por
lo tanto, estos resultados apoyan la idea de que el EBD observado en el parénquima cerebral
de los animales gestados en HTX provenía desde la sangre, ingresó a través de la BHE y
viajó por el líquido intersticial hasta llegar al sistema ventricular.

161
 El aumento de la permeabilidad al EBD observado en la BHE de la progenie gestada
en HTX planteaba la posibilidad de que también existiera un aumento de la permeabilidad a
las células del sistema inmune (151, 156). Para esto, se estudió la permeabilidad de la BHE
de la progenie gestada en HTX al paso de células inmunes mediante el ensayo de
transferencia adoptiva de esplenocitos de la cepa congénica CD45.1, sin inducir la EAE.

Se observó que los animales gestados en HTX tenían un aumento de los monocitos
inflamatorios transferidos en el SNC comparados con el grupo control (Figura 22). Este
hallazgo fue muy importante ya que el ingreso de los monocitos al SNC es un proceso muy
regulado que depende de la interacción con las células endoteliales y los astrocitos, así como
de la liberación de mediadores que activen a la BHE (267). Esto implicaba necesariamente
que la BHE de los animales gestados en HTX no sólo tendría diferencias anatómicas, sino
también funcionales respecto a los controles.

Esta diferencia también podría explicarse por la acción de la IL-17. Además de la

activación de la maquinaria contráctil, la generación de ROS inducida por la IL-17 aumenta
la expresión de la molécula de adhesión celular ICAM-1 (151) y la transmigración de
monocitos a través de la BHE mediado por la proteína quimioatractante de monocitos 1
(MCP-1) (151, 268).

Es interesante destacar que los ratones gestados en HTX también tienen niveles
plasmáticos de TNF-α mayores que los animales gestados en eutiroidismo (datos no
publicados de nuestro laboratorio). Además, los astrocitos de los animales gestados en HTX
son más reactivos al estímulo con TNF-α que aquellos provenientes de animales gestados en
condiciones de eutiroidismo (269). TNF-α estimula la secreción de MCP-1 a través de la
activación del factor de transcripción NF-kB (270). Esto sugiere que los animales gestados
en HTX podrían tener niveles mayores de quimioatractantes de monocitos en el SNC.

Sin embargo, no se observaron diferencias en la población de monocitos inflamatorios

CD45.2+ en los animales gestados en HTX comparados con el control. Es posible que esto se
haya debido a que las células CD45.1+ fueron activadas durante la manipulación
experimental, permitiendo así que cruzaran la BHE (271).

162
 Aunque los resultados de esta tesis no permiten inferir las implicancias que este
hallazgo tendría en ausencia de la EAE, es posible que sea de relevancia al momento de
inducir la EAE. Existen datos que muestran que los monocitos infiltran tempranamente el
SNC durante la EAE y se diferencian a macrófagos (246). La localización y densidad de estas
células se asocia con las áreas de desmielinización, la progresión clínica, la gravedad y
remisión de la enfermedad (228, 229). Estudios basados en la eliminación de los monocitos
periféricos (220, 223, 224), eliminación genética de MCP-1 (222) o de su receptor CCR2
(221) resultan en resistencia a EAE. Los monocitos se transforman en macrófagos en el SNC
durante la neuroinflamación

Estos resultados aportan evidencia indirecta de un aumento de la expresión de

moléculas de adhesión celular y quimioatractantes que aumentan la permeabilidad de la BHE
a los monocitos en los animales gestados en HTX. Será necesario realizar futuros estudios
que incluyan la cuantificación de MCP-1 en el SNC de estos animales y citoquinas
relacionadas con la migración de monocitos a través de la BHE, como CXCL12 (272).
Además, será de gran interés incluir el estudio de la expresión de moléculas de adhesión
celular en la BHE de los animales gestados en HTX. Existen datos que muestran que TNF-α
induce la expresión de las moléculas de adhesión celular ICAM-1 y VCAM-1 (174). ICAM-
1 y VCAM-1 se expresan precozmente en la BHE activada durante la EAE y se correlacionan
con la infiltración inflamatoria del parénquima (273, 274).

Por otra parte, es interesante destacar que los animales gestados en HTX mostraron
diferencias en las poblaciones de células inmunes en el bazo comparados con el control. Se
observó un aumento de los neutrófilos (Anexo 1. Figura Suplementaria 3 y 13), células
CD11c+ (Anexo 1. Figura Suplementaria 4 y 14) y linfocitos T CD8+ (Anexo 1. Figura
Suplementaria 17 E), asociado a una disminución de los linfocitos B (Anexo 1. Figura
Suplementaria 16 C) y linfocitos T CD4+ (Anexo 1. Figura Suplementaria 17 C).

Estas diferencias corroboran la idea de que los animales gestados en HTX tendrían
un ambiente inflamatorio en condiciones basales. Existen datos que muestran que los
neutrófilos esplénicos son fundamentales en la respuesta inmune contra Streptococcus
pneumoniae (275). De igual forma, ciertas condiciones inflamatorias se asocian a la
expresión de CD11c+ en el bazo (276, 277), al aumento de linfocitos T CD8 (234), a la

163
disminución de linfocitos T CD4 (234)y linfocitos B (278). Aunque se desconoce el papel
que estas diferencias tienen en ausencia de EAE, podrían ser relevantes al inducir la
enfermedad. Similar a los monocitos y macrófagos, los neutrófilos (244) y las células
CD11c+ (199) han mostrado tener un papel importante en el desarrollo de la EAE.

Estos resultados sugieren que los efectos del déficit de T4 materna son sistémicos
(Tabla 4). Será necesario complementar estos datos con futuros análisis que caractericen las
poblaciones y subpoblaciones del bazo de estos animales, su estado funcional y posibles
diferencias en los niveles séricos de otras citoquinas.

164
Tabla 4. Resumen de los resultados obtenidos en el SNC y bazo del grupo HTX en el
ensayo de transferencia adoptiva de esplenocitos CD45.1+.

SNC BAZO

CD45.1+ CD45.2+ CD45.1+ CD45.2+

Abs % Abs % Abs % Abs %

Población total ns ns ns ns ns ns ns ns

Neutrófilos ns ns ns ns ↑ ↑ ↑ ↑
(CD11b+ Ly6G+)

Células CD11c+ ns ns ns ns ↑ ↑ ↑ ↑
(CD11c+)

Monocitos
inflamatorios ↑ ↑ ns ns ns ns ns ns
(CD11b+ Ly6Chigh)

Macrófagos ns ns ns ns ↓ ↓ ns ns
(CD11b+ Ly6Clow)

Linfocitos B ns ns ns ns ns ns ns ↓
(B220+)

Linfocitos T CD4+ ns ns ns ns ns ns ns ↓
(CD3+ CD4+)

Linfocitos T CD8+ ns ns ns ns ns ns ns ↑
(CD3+ CD8+)

Abs = cuantificación absoluta; % = cuantificación porcentual; ↑ = aumento respecto al grupo

CTRL; ↓ = disminución respecto al grupo CTRL; ns = sin diferencia significativa respecto
del grupo CTRL.

165
 Finalmente, se estudió si la BHE de la progenie gestada en HTX era más permeable
a las células inmunes en condiciones inflamatorias, mediante el ensayo de transferencia
adoptiva de esplenocitos de la cepa congénica CD45.1 y posterior inducción de la EAE a los
animales receptores.

Los animales gestados en HTX mostraron un infiltrado inflamatorio al SNC donde

predominaban los neutrófilos nativos (Anexo 2. Figura Suplementaria 6) y macrófagos
transferidos al día 7 p.i. (Figura 30). Por el contrario, disminuían las poblaciones de
linfocitos T CD8+ transferidos y nativos (Figura 32), células CD11c+ nativas (Anexo 2.
Figura Suplementaria 7) y linfocitos B nativos (Anexo 2. Figura Suplementaria 7) al día
5 p.i.

Estos resultados son interesantes, ya que sugieren que los animales gestados en HTX
montan una respuesta inflamatoria con predominio de células efectoras y disminución de
células con potencial acción regulatoria en comparación al grupo control.

Existe evidencia que muestra de que los linfocitos T CD8+ pueden ejercer un papel
regulatorio en la patogénesis de la la EAE (247-249). Ortega y cols. mostraron que la
transferencia adoptiva de linfocitos T CD8+ reactivos contra MOG pueden disminuir la
severidad de la EAE (279). Esto tendría relación con datos que muestran que los linfocitos T
CD8+ pueden regular la activación de los linfocitos T CD4+ naïve mediante la disminución
de la expresión de moléculas coestimuladoras en las CPA (247) y la estimulación de la
producción de IL-10 por las células dendríticas (280).

Además, existen datos que sugieren que los linfocitos T CD8+ también regulan a los
monocitos-macrófagos. Tyler y cols. demostraron que los linfocitos T CD8+ son
fundamentales para que el acetato de glatiramero, un fármaco utilizado en el tratamiento de
la esclerosis múltiple, sea efectivo en mejorar los síntomas de la EAE en ratones (281). En la
EAE, acetato de glatiramero promueve la diferenciación de los monocitos-macrófagos a un
fenotipo antiinflamatorio productor de secreción de IL-10 y TGF-β (282). La transferencia
adoptiva de estos monocitos a ratones con EAE suprime el desarrollo de linfocitos Th17 y
promueve la expansión de linfocitos T reguladores (Treg) en los animales receptores,
disminuyendo los síntomas de la enfermedad (282).

166
 Estas observaciones se correlacionan con resultados que muestran que los animales
gestados en HTX tienen células T CD4+CD25+ con una menor capacidad de diferenciarse a
linfocitos Treg in vitro y de suprimir la proliferación de los linfocitos T efectores (105).
Además, la transferencia adoptiva de células T CD4+CD25+ de animales gestados en HTX
con EAE a ratones control con EAE empeora los síntomas de la enfermedad en estos últimos
(105).

En este contexto, existen reportes que muestran que las células CD11c+ también
pueden ejercer funciones reguladoras en el desarrollo de la EAE. Paterka y cols. reportaron
que la ablación condicional de las células CD11c+ durante la fase inductiva de la EAE impide
la generación de linfocitos Treg inducibles, sin alterar la inducción de linfocitos Th 17 (283).
Por otra parte, las células CD11b+ CD11c+ en el modelo de la EAE producen más IL-10,
TGF-β y menos IL-12, por lo que son capaces de inhibir la proliferación de linfocitos T
encefalitogénicos, e incrementar la generación de células Th 2 y células Treg (284). Además,
estas células son capaces de suprimir el desarrollo de la EAE después de la transferencia
adoptiva (284).

En esta tesis no se utilizaron marcadores específicos para analizar las subpoblaciones

contenidas en el grupo de células CD11c+. Sin embargo, es posible que estas células
correspondan a células dendríticas. Bailey-Bucktrout y cols., demostraron que la disminución
de la subpoblación de células dendríticas plasmocitoides durante la fase aguda de la EAE
resulta en un aumento de la severidad de la enfermedad (285).

Por otra parte, la disminución de la población de linfocitos B contribuye a explicar la

precocidad de la EAE en la progenie gestada en HTX. Existen estudios que muestran que
ratones que carecen de linfocitos B desarrollan una EAE más severa y prolongada que los
animales controles, lo que sugiere que los linfocitos B participan en la remisión del proceso
neuroinflamatorio (286, 287). En este contexto, es necesario realizar futuros estudios hagan
un seguimiento prolongado de la EAE en los animales gestados en HTX, ya que el
seguimiento realizado por Haensgen y cols. finalizó al día 20 p.i., sin ver diferencias entre
los grupos experimentales (105).

167
 En contraste, los neutrófilos son efectores y amplificadores de la respuesta
inflamatoria durante la EAE (244, 288, 289). Simmons y col. observaron que la erradicación
de los neutrófilos antes de la inducción de la EAE inhibe la infiltración de las células
inflamatorias al parénquima del SNC, quedando detenidas en el espacio perivascular (290),
lo que sugiere que los neutrófilos son importantes en la rotura de la BHE en la EAE (166).
Además, los neutrófilos producen pro-IL-1β durante la invasión al SNC, una pro-citoquina
que estimula a las células endoteliales a producir mediadores inflamatorios que reclutan y
activan a otras células mieloides, aumentando la severidad de la EAE (291).

Por otra parte, la erradicación de los neutrófilos después de la inducción de la EAE

inhibe la diferenciación de la microglía y monocitos-macrófagos a CPA maduras (244).
Steinbach y cols. mostraron que los neutrófilos inducen la maduración de células dendríticas
en el SNC durante la EAE, aumentando su capacidad de re-estimular a los linfocitos T
específicos para la mielina al ingresar el SNC (244).

El aumento temprano de la infiltración de neutrófilos al SNC observado en la

progenie gestada en HTX podría tener relación con la mayor reactividad que presentan los
astrocitos en estos animales. El estímulo con TNF-α induce una mayor producción de las
citoquinas quimioatractantes de neutrófilos CINC-1, CINC-2 α/β y CINC-3 (269). Esto
explicaría, en parte, el acortamiento de la fase inductiva de la EAE que presentan estos
animales observado por Haensgen y cols (105).

Es importante destacar que no se observaron diferencias en el análisis de las

subpoblaciones de células mieloides ni células linfoides en el bazo entre los grupos
experimentales en la población CD45.1+ (Anexo 2. Figura Suplementaria 3 y Figura
Suplementaria 4, respectivamente) ni en la población CD45.2+ (Anexo 2. Figura
Suplementaria 12 y Figura Suplementaria 13, respectivamente). Esto sugiere, de forma
indirecta, que las diferencias observadas en las poblaciones de células inmunes analizadas en
el SNC de los animales HTX durante la EAE podrían responder a una respuesta de activación
diferente de la BHE y/o a diferencias en la secreción de quimioatractantes en estos animales.

Los hallazgos en el desarrollo de este objetivo son una evidencia directa que los
animales gestados en HTX desarrollan una respuesta inflamatoria con predominio de

168
poblaciones celulares mieloides efectoras (macrófagos y neutrófilos) y disminución de
poblaciones celulares con capacidad regulatoria (linfocitos T CD8+, linfocitos B y células
CD11c+) durante la EAE. Por otra parte, estos datos son una evidencia indirecta que sugiere
una activación más precoz de la BHE durante la EAE. Se hace necesario continuar con
estudios futuros que caractericen la funcionalidad de estas poblaciones celulares y la
activación de la BHE durante la EAE en estos animales.

La Tabla 5 resume los resultados obtenidos del análisis de las poblaciones de células
inmunes en el SNC del grupo HTX con respecto al grupo CTRL los días 5, 7 y 9 p.i. de la
EAE.

169
Tabla 5. Resumen de los resultados obtenidos en el SNC del grupo HTX en el ensayo de
transferencia adoptiva de esplenocitos durante la fase inductiva de la EAE.

CD45.1+ CD45.2+

5 p.i 7 p.i 9 p.i 5 p.i 7 p.i 9 p.i.

Abs % Abs % Abs % Abs % Abs % Abs %

Población ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns
total

Neutrófilos ns ns ns ns ns ns ns ns ↑ ↑ ns ns
(CD11b+
Ly6G+)

Células ns ns ns ns ns ns ↓ ↓ ns ns ns ns
CD11c+
(CD11c+)

Monocitos
inflamatorios ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns
(CD11b+
Ly6Chigh)

Macrófagos ns ns ↑ ↑ ns ns ns ns ns ns ns ns
(CD11b+
Ly6Clow)

Linfocitos B ns ns ns ns ns ns ↓ ns ns ns ns ns
(B220+)

Linfocitos T ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns
CD4+
(CD3+ CD4+)

Linfocitos T ↓ ↓ ns ns ns ns ↓ ↓ ns ns ns ns
CD8+
(CD3+ CD8+)
5 p.i. = día 5 post inducción de la EAE; 7 p.i. = día 7 post inducción de la EAE; 9 p.i. = día
9 post inducción de la EAE; Abs = cuantificación absoluta; % = cuantificación porcentual; ↑
= aumento respecto al grupo CTRL; ↓ = disminución respecto al grupo CTRL; ns = sin
diferencia significativa respecto del grupo CTRL.

170
 En base a los resultados obtenidos en esta tesis, se propone un modelo fisiopatológico
que plantea que la HTX gestacional produce una “impronta” en la BHE y el sistema inmune
de la progenie. El déficit de T4 materna durante la gestación tendría efectos epigenéticos sobre
el sistema inmune. Disminuye la expresión del miR-106b (186), lo que afecta la función de las
Treg (292). Se altera la expresión de miR-301-a (186), induciendo variaciones en la
diferenciación de los linfocitos Th 17 (188). Además, disminuye la expresión del miR-181-b
(186), lo que aumenta la expresión de genes proinflamatorios en los macrófagos y promoviendo
la generación del fenotipo Th1(189).

Esta adaptación produciría un “estado proinflamatorio basal” en estos animales,

caracterizado por la presencia de astrocitos reactivos en el SNC , un aumento de IL-17 sérica
y de TNF-α (datos no publicados de nuestro laboratorio). IL-17 se une a su receptor en las
células endoteliales de la BHE activando la producción de ROS mediada por las enzimas
NADPH oxidasa y xantina oxidasa. El estrés oxidativo induce la activación de la maquinaria
contráctil mediante el aumento de la fosforilación de la cadena liviana de la miosina,
aumentando el espacio intercelular. Además, ROS lleva al desacoplamiento de las tight
junctions consecuencia de la reorganización de la zona occludens, la disminución de la
expresión de ocludina y de claudina-5. Estos cambios provocarían el aumento de la
permeabilidad de la BHE en la progenie gestada en HTX, lo que permite el paso de moléculas
como el EBD y, posiblemente de la albúmina. Asimismo, el aumento de la permeabilidad de
la BHE permitiría el ingreso de monocitos inflamatorios al SNC. Estas células serían atraídas
por la quimioquina MCP-1 liberada por los astrocitos reactivos ante el estímulo de TNF-α. Por
otra parte, al inducir la EAE el sistema inmune inicia una respuesta que favorece el crecimiento
de la población de células mieloides efectoras (neutrófilos y macrófagos) en el SNC. Se
produce además una disminución del tamaño de las poblaciones de células con capacidad
regulatoria (linfocitos T CD8+, linfocitos B y células CD11c+). Esto último contribuye a reducir
aún más la actividad supresora del sistema, ya en deficiencia por el desarrollo de células Treg
con capacidad supresora disminuida. En conjunto, estos eventos explicarían, en parte, el
desarrollo de una EAE más precoz y severa en los animales gestados en HTX.

171
 CONCLUSIÓN

Los resultados obtenidos en esta tesis constituyen la primera evidencia experimental

de que la HTX gestacional produce un aumento en la permeabilidad de la BHE en la progenie.
Asimismo, apoyan la idea de que estos animales desarrollan una respuesta inflamatoria más
temprana ante la inducción de la EAE, con predominio de las poblaciones de células efectoras
por sobre las regulatorias. Esto ayuda a explicar, en parte, por que la progenie gestada en
HTX desarrolla síntomas más precoces que los gestados en eutiroidismo.

El déficit materno de T4 durante la gestación tiene efectos sobre la programación fetal,

lo que refuerza la idea de que la HTX gestacional es un posible factor de riesgo para el
desarrollo de enfermedades neuroinflamatorias en la progenie adulta.

Se requieren futuros estudios para analizar la estructura de la BHE y estado funcional

de las subpoblaciones mieloides y linfoides de los animales gestados en HTX. Asimismo, se
requiere futuros experimentos que permitan estudiar los mecanismos moleculares mediante
los cuales la HTX materna produce estas adaptaciones en la progenie.

De esta forma, se espera impulsar el diagnóstico precoz de la HTX gestacional en el

humano y el diseño de nuevos estudios clínicos con énfasis en el tratamiento de la HTX
materna durante el primer trimestre del embarazo.

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198
ANEXO 1

199
Figura Suplementaria 1. El ingreso de las células inmunes CD45.1+ a la sangre es similar
en la progenie gestada en HTX con respecto al control en condiciones basales. (A)
Citometrías de flujo representativas para la identificación de los esplenocitos CD45.1+
transferidos en la sangre de los grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS.
(B) Cuantificación absoluta de los esplenocitos CD45.1+ en la sangre de los grupos
experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. (C) Porcentaje de esplenocitos CD45.1+
en la sangre de los grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. Los gráficos
muestran el promedio de cada n experimental ± SEM, n=9. Test de ANOVA de una vía, post
test de Dunnett. Letras diferentes indican p < 0.05.

200
 (A) CTRL HTX HTX+T4 TOX LPS

CD45.1

(B) Células CD45.1+ (C) Porcentaje CD45.1+

Células CD45.1+ en bazo BAZO % CD45.1

10000 20
CTRL CTRL
8000 HTX HTX
15
HTX+T4 HTX+T4
Células/µL

% Células
6000 TOX TOX
10
LPS LPS
4000
5
2000

0 0
S

S
4

4
TX

TX
L

L
X

X
+T

+T
TR

TR
LP

LP
TO

TO
H

H
TX

TX
C

C
H

H
Figura Suplementaria 2. El ingreso de las células inmunes CD45.1+ al bazo es similar en
CD45.1
la progenie gestada en HTX con respecto al control en condiciones basales. (A)
Citometrías de flujo representativas para la identificación de los esplenocitos CD45.1+
transferidos en el bazo de los grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS.
(B) Cuantificación absoluta de los esplenocitos CD45.1+ en el bazo de los grupos
experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. (C) Porcentaje de esplenocitos CD45.1+
en el bazo de los grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. Los gráficos
muestran el promedio de cada n experimental ± SEM, n=9. Test de ANOVA de una vía, post
test de Dunnett.

201
Figura Suplementaria 3. La HTX gestacional aumenta el ingreso de neutrófilos al bazo
con respecto al control en condiciones basales. (A) Citometrías de flujo representativas
para la identificación neutrófilos (CD11b+Ly6G+) en la población CD45.1+ en el bazo de los
grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. (B) Cuantificación absoluta de
los neutrófilos en la población CD45.1+ en el bazo de los grupos experimentales CTRL, HTX,
HTX+T4, TOX y LPS. (C) Porcentaje de neutrófilos en la población CD45.1+ en el bazo de
los grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. Los gráficos muestran el
promedio de cada n experimental ± SEM, n=9. Test de ANOVA de una vía, post test de
Dunnett. Letras diferentes indican p < 0.05.

202
Figura Suplementaria 4. La HTX gestacional aumenta el ingreso de células CD11c+ al
bazo con respecto al control en condiciones basales. (A) Citometrías de flujo
representativas para la identificación de las células CD11c+ en la población CD45.1+ en el
bazo de los grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. (B) Cuantificación
absoluta de las células CD11c+en la población CD45.1+ en el bazo en los grupos
experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. (C) Porcentaje de las células CD11c+
en la población CD45.1+ en el bazo en los grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4,
TOX y LPS. Los gráficos muestran el promedio de cada n experimental ± SEM, n=9. Test
de ANOVA de una vía, post test de Dunnett. Letras diferentes indican p < 0.05.

203
Figura Suplementaria 5. La HTX gestacional disminuye el ingreso de macrófagos al
bazo con respecto al control en condiciones basales. (A) Citometrías de flujo
representativas para la identificación de monocitos inflamatorios (CD11b+ Ly6Chigh) y
macrófagos (CD11b+ Ly6Clow) en la población CD45.1+ en el bazo de los grupos
experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS, a partir de la selección de células
CD11b+ CD11c-. (B) Cuantificación absoluta de monocitos inflamatorios en la población
CD45.1+ en el bazo en los grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. (C)
Porcentaje de monocitos inflamatorios en la población CD45.1+ en el bazo en los grupos
experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. (D) Cuantificación absoluta de
macrófagos en la población CD45.1+ en el bazo en los grupos experimentales CTRL, HTX,
HTX+T4, TOX y LPS. (E) Porcentaje de macrófagos en la población CD45.1+ en el bazo en
los grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. Los gráficos muestran el
promedio de cada n experimental ± SEM, n=9. Test de ANOVA de una vía, post test de
Dunnett. Letras diferentes indican p < 0.05.

204
Figura Suplementaria 6. El ingreso de los linfocitos B al bazo es similar en la progenie
gestada en HTX con respecto al control en condiciones basales. (A) Citometrías de flujo
representativas para la identificación de linfocitos B (B220+) en la población CD45.1+ en el
bazo de los grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. (B) Cuantificación
absoluta de linfocitos B en la población CD45.1+ en el bazo en los grupos experimentales
CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. (C) Porcentaje de linfocitos B en la población CD45.1+
en el bazo en los grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. Los gráficos
muestran el promedio de cada n experimental ± SEM, n=9. Test de ANOVA de una vía, post
test de Dunnett. Letras diferentes indican p < 0.05.

205
Figura Suplementaria 7. El ingreso de los linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+ al bazo
es similar en la progenie gestada en HTX con respecto al control en condiciones basales.
(A) Citometrías de flujo representativas para la identificación de linfocitos T CD4+ (CD3+
CD4+) y linfocitos T CD8+ (CD3+ CD8+) en la población CD45.1+ en el bazo de los grupos
experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS, a partir de la selección de células CD3+
B220- . (B) Cuantificación absoluta de linfocitos T CD4+ en la población CD45.1+ en el bazo
en los grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. (C) Porcentaje de
linfocitos T CD4+ en la población CD45.1+ en el bazo en los grupos experimentales CTRL,
HTX, HTX+T4, TOX y LPS. (D) Cuantificación absoluta de linfocitos T CD8+ en la
población CD45.1+ en el bazo en los grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y
LPS. (E) Porcentaje de linfocitos T CD8+ en la población CD45.1+ en el bazo en los grupos
experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. Los gráficos muestran el promedio de
cada n experimental ± SEM, n=9. Test de ANOVA de una vía, post test de Dunnett. Letras
diferentes indican p < 0.05.

206
Figura Suplementaria 8. El tamaño de la población de células inmunes nativas en el
SNC es similar en la progenie gestada en HTX con respecto al control en condiciones
basales. (A) Citometrías de flujo representativas para la identificación de las células CD45.2+
en el SNC de los grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. (B)
Cuantificación absoluta de las células CD45.2+ en el SNC de los grupos experimentales
CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. (D) Porcentaje de las células CD45.2+ en el SNC de los
grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. Los gráficos muestran el
promedio de cada n experimental ± SEM, n=9. Test de ANOVA de una vía, post test de
Dunnett. Letras diferentes indican p < 0.05.

207
Figura Suplementaria 9. El tamaño de la población de neutrófilos nativos en el SNC es
similar en la progenie gestada en HTX con respecto al control en condiciones basales.
(A) Citometrías de flujo representativas para la identificación de los neutrófilos
(CD11b+Ly6G+) en la población CD45.2+ en el SNC de los grupos experimentales CTRL,
HTX, HTX+T4, TOX y LPS. (B) Cuantificación absoluta de los neutrófilos en la población
CD45.2+ en el SNC de los grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. (C)
Porcentaje de neutrófilos en la población CD45.2+ en el SNC de los grupos experimentales
CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. Los gráficos muestran el promedio de cada n
experimental ± SEM, n=9. Test de ANOVA de una vía, post test de Dunnett. Letras diferentes
indican p < 0.05.

208
Figura Suplementaria 10. El tamaño de la población de linfocitos B nativos en el SNC
es similar en la progenie gestada en HTX con respecto al control en condiciones basales.
(A) Citometrías de flujo representativas para la identificación de linfocitos B (B220+) en la
población CD45.2+ en el bazo de los grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y
LPS. (B) Cuantificación absoluta de linfocitos B en la población CD45.2+ en el bazo en los
grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. (C) Porcentaje de linfocitos B
en la población CD45.2+ en el bazo en los grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4,
TOX y LPS. Los gráficos muestran el promedio de cada n experimental ± SEM, n=9. Test
de ANOVA de una vía, post test de Dunnett. Letras diferentes indican p < 0.05.

209
Figura Suplementaria 11. El tamaño de la población de células inmunes nativas en la
sangre es similar en la progenie gestada en HTX con respecto al control en condiciones
basales. (A) Citometrías de flujo representativas para la identificación de las células CD45.2+
en la sangre de los grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. (B)
Cuantificación absoluta de las células CD45.2+ en la sangre de los grupos experimentales
CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. (C) Porcentaje de las células CD45.2+ en la sangre de
los grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. Los gráficos muestran el
promedio de cada n experimental ± SEM, n=9. Test de ANOVA de una vía, post test de
Dunnett. Letras diferentes indican p < 0.05.

210
 (A) CTRL HTX HTX+T4 TOX LPS

(A) CD45.2
CTRL HTX HTX+T4 TOX LPS

(B) Células CD45.2+ (C) Porcentaje CD45.2+

BAZO CD45.2 BAZO % CD45.2

20000 100
CTRL CTRL
HTX 95 HTX
15000
Células/µL HTX+T4 HTX+T4

% Células
TOX 90 TOX
10000 LPS
LPS
85
5000
80

0 75

S
TX

TX

4
L

L
X

X
+T

+T
TR

TR
LP

LP
TO

TO
H

H
TX

TX
C

C
H

H
CD45.2

(B) Células CD45.2+ (C) Porcentaje CD45.2+

BAZO CD45.2 BAZO % CD45.2

20000 100
CTRL CTRL
HTX 95 HTX
15000
HTX+T4 HTX+T4
Células/µL

% Células
TOX 90 TOX
10000 LPS
LPS
85
5000
80

0 75
S

S
4

4
TX

TX
L

L
X

X
+T

+T
TR

TR
LP

LP
TO

TO
H

H
TX

TX
C

C
H

H
Figura Suplementaria 12. El tamaño de la población de células inmunes nativas en el
bazo es similar en la progenie gestada en HTX con respecto al control en condiciones
basales. (A) Citometrías de flujo representativas para la identificación de las células CD45.2+
en el bazo de los grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. (B)
Cuantificación absoluta de las células CD45.2+ en el bazo de los grupos experimentales
CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. (C) Porcentaje de las células CD45.2+ en el bazo de los
grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. Los gráficos muestran el
promedio de cada n experimental ± SEM, n=9. Test de ANOVA de una vía, post test de
Dunnett.

211
Figura Suplementaria 13. La HTX gestacional aumenta el porcentaje de neutrófilos
nativos en el bazo con respecto al control en condiciones basales. (A) Citometrías de flujo
representativas para la identificación de los neutrófilos (CD11b+Ly6G+) en la población
CD45.2+ en el bazo de los grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. (B)
Cuantificación absoluta de los neutrófilos en la población CD45.2+ en el bazo de los grupos
experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. (C) Porcentaje de neutrófilos en la
población CD45.2+ en el bazo de los grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y
LPS. Los gráficos muestran el promedio de cada n experimental ± SEM, n=9. Test de
ANOVA de una vía, post test de Dunnett. Letras diferentes indican p < 0.05.

212
Figura Suplementaria 14. La HTX gestacional aumenta el porcentaje de células CD11c+
nativas en el bazo con respecto al control en condiciones basales. (A) Citometrías de flujo
representativas para la identificación de las células CD11c+ en la población CD45.2+ en el
bazo de los grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. (B) Cuantificación
absoluta de las células CD11c+en la población CD45.2+ en el bazo en los grupos
experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. (C) Porcentaje de las células CD11c+
en la población CD45.2+ en el bazo en los grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4,
TOX y LPS. Los gráficos muestran el promedio de cada n experimental ± SEM, n=9. Test
de ANOVA de una vía, post test de Dunnett. Letras diferentes indican p < 0.05.

213
Figura Suplementaria 15. El tamaño de la población de monocitos inflamatorios y
macrófagos nativos en el bazo es similar en la progenie gestada en HTX con respecto al
control en condiciones basales. (A) Citometrías de flujo representativas para la
identificación de monocitos inflamatorios (CD11b+ Ly6Chigh) y macrófagos (CD11b+
Ly6Clow) en la población CD45.2+ en el bazo de los grupos experimentales CTRL, HTX,
HTX+T4, TOX y LPS, a partir de la selección de las células CD11b+ CD11c-. (B)
Cuantificación absoluta de monocitos inflamatorios en la población CD45.2+ en el bazo en
los grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. (C) Porcentaje de monocitos
inflamatorios en la población CD45.2+ en el bazo en los grupos experimentales CTRL,
HTX, HTX+T4, TOX y LPS. (D) Cuantificación absoluta de macrófagos en la población
CD45.2+ en el bazo en los grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. (E)
Porcentaje de macrófagos en la población CD45.2+ en el bazo en los grupos experimentales
CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. Los gráficos muestran el promedio de cada n
experimental ± SEM, n=9. Test de ANOVA de una vía, post test de Dunnett. Letras diferentes
indican p < 0.05.

214
Figura Suplementaria 16. La HTX gestacional disminuye la población de linfocitos B
nativos en el bazo con respecto al control en condiciones basales. (A) Citometrías de flujo
representativas para la identificación de linfocitos B (B220+) en la población CD45.2+ en el
bazo de los grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. (B) Cuantificación
absoluta de linfocitos B en la población CD45.2+ en el bazo en los grupos experimentales
CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. (C) Porcentaje de linfocitos B en la población CD45.2+
en el bazo en los grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. Los gráficos
muestran el promedio de cada n experimental ± SEM, n=9. Test de ANOVA de una vía, post
test de Dunnett. Letras diferentes indican p < 0.05.

215
Figura Suplementaria 17. La HTX gestacional disminuye el porcentaje de linfocitos T
CD4+ y aumenta el porcentaje de los linfocitos T CD8+ nativos en el bazo con respecto
al control en condiciones no inflamatorias. (A) Citometrías de flujo representativas para la
identificación de linfocitos T CD4+ (CD3+ CD4+) y linfocitos T CD8+ (CD3+ CD8+) en la
población CD45.2+ en el bazo de los grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y
LPS, a partir de la selección de las células CD3+ B220-. (B) Cuantificación absoluta de
linfocitos T CD4+ en la población CD45.2+ en el bazo en los grupos experimentales CTRL,
HTX, HTX+T4, TOX y LPS. (C) Porcentaje de linfocitos T CD4+ en la población CD45.2+
en el bazo en los grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. (D)
Cuantificación absoluta de linfocitos T CD8+ en la población CD45.2+ en el bazo en los
grupos experimentales CTRL, HTX, HTX+T4, TOX y LPS. (E) Porcentaje de linfocitos T
CD8+ en la población CD45.2+ en el bazo en los grupos experimentales CTRL, HTX,
HTX+T4, TOX y LPS. Los gráficos muestran el promedio de cada n experimental ± SEM,
n=9. Test de ANOVA de una vía, post test de Dunnett. Letras diferentes indican p < 0.05.

216
ANEXO 2

217
 (A) CTRL HTX (B)

Células CD45.1
SANGRE CD45.1
5000
5 PI CTRL
4000 HTX

Células /µL
3000

2000

1000

0
5 7 9

7 PI Días postinmunización

(C)
Porcentaje de células CD45.1
%SANGRE CD45.1
15
CTRL
HTX
10

% Células
9 PI
5

0
5 7 9
Días postinmunización
CD45.1

Figura Suplementaria 1. El ingreso de las células inmunes CD45.1+ a la sangre es similar

en la progenie gestada en HTX con respecto al control durante la EAE. (A) Citometrías
de flujo representativas para la identificación de los esplenocitos CD45.1+ transferidos en la
sangre de los grupos experimentales HTX y CTRL al día 5, 7 y 9 p.i. (B) Cuantificación
absoluta de los esplenocitos CD45.1+ en la sangre de los grupos experimentales HTX y CTRL
al día 5, 7 y 9 p.i. (C) Porcentaje de esplenocitos CD45.1+ en la sangre de los grupos
experimentales HTX y CTRL al día 5, 7 y 9 p.i. Los gráficos muestran el promedio de cada
n experimental ± SEM, n=5. Análisis de Mann-Whitney.

218
 (A) CTRL HTX (B)

Células CD45.1
BAZO CD45.1
4000
5 PI CTRL
HTX
3000

Células /µL
2000

1000

(A) CTRL
0
5
HTX 7 9 (B)
7 PI Días postinmunización

(C)
Porcentaje de células CD45.1
%BAZO CD45.1
Células CD45.1
30
CTRL BAZO CD45.1
HTX
20
4000

% Células
(A) CTRL HTX 9 PI (B)
5 PI CTRL
Células CD45.1 10

BAZO CD45.1
HTX
3000

Células /µL
4000 0
5 PI CTRL 5 7 9
HTX Días postinmunización
CD45.1 3000
Células /µL

2000
2000

1000

0
1000
5 7 9

7 PI Días postinmunización

(C) 0
Porcentaje de células CD45.1
%BAZO CD45.1
5 7 9

7 PI 30
CTRL
Días postinmunización
HTX
20
% Células

9 PI
10
(C)
Porcentaje de células CD45.1
0
5 7 9
%BAZO CD45.1
CD45.1 Días postinmunización
30
CTRL
HTX
20

% Células
9 PI
10

0
5 7 9

CD45.1 Días postinmunización

Figura Suplementaria 2. El ingreso de las células inmunes CD45.1+ al bazo es similar en

la progenie gestada en HTX con respecto al control durante la EAE. (A) Citometrías de
flujo representativas para la identificación de los esplenocitos CD45.1+ transferidos en el
bazo de los grupos experimentales HTX y CTRL al día 5, 7 y 9 p.i. (B) Cuantificación
absoluta de los esplenocitos CD45.1+ en el bazo de los grupos experimentales HTX y CTRL
al día 5, 7 y 9 p.i. (C) Porcentaje de esplenocitos CD45.1+ en el bazo de los grupos
experimentales HTX y CTRL al día 5, 7 y 9 p.i. Los gráficos muestran el promedio de cada
n experimental ± SEM, n=5. Análisis de Mann-Whitney.

219
 (A) (B)
Neutrófilos Porcentaje de neutrófilos
BAZO CD45.1 Neutrófilos %BAZO CD45.1 Neutrófilos
4000 100
CTRL CTRL
HTX 80 HTX
3000
Células/µL

% Células
60
2000
40
1000
20

0 0
5 7 9 5 7 9
Días postinmunización Días postinmunización

(C) (D)
Células CD11c+ Porcentaje de células CD11c+
BAZO CD45.1 CD11c+ %BAZO CD45.1 CD11c+
200 10
CTRL CTRL
HTX 8 HTX
150
Células/µL

% Células
6
100
4
50
2

0 0
5 7 9 5 7 9
Días postinmunización Días postinmunización

(E) (F)
Monocitos inflamatorios
BAZO CD45.1 Monocitos Porcentaje
%BAZO de monocitos inflamatorios
CD45.1 Monocitos
300 15
CTRL CTRL
HTX HTX
Células/µL

200 10
% Células

100 5

0 0
5 7 9 5 7 9
Días postinmunización Días postinmunización

(G) (H)
Macrófagos Porcentaje de macrófagos
BAZO CD45.1 Macrófagos %BAZO CD45.1 Macrófagos
400 20
CTRL CTRL
HTX HTX
300 15
Células/µL

% Células

200 10

100 5

0 0
5 7 9 5 7 9
Días postinmunización Días postinmunización

Leyenda en la página siguiente

220
Figura Suplementaria 3. El ingreso de la subpoblación de células mieloides CD45.1+ al
bazo es similar en la progenie gestada en HTX con respecto al control durante la EAE.
(A) Cuantificación absoluta de los neutrófilos (CD11b+ Ly6G+) en la población CD45.1+ en
el bazo de los grupos experimentales HTX y CTRL al día 5, 7 y 9 p.i. (B) Porcentaje de
neutrófilos en la población CD45.1+ en el bazo de los grupos experimentales HTX y CTRL
al día 5, 7 y 9 p.i. (C) Cuantificación absoluta de las células CD11c+ en la población CD45.1+
en el bazo de los grupos experimentales HTX y CTRL al día 5, 7 y 9 p.i. (D) Porcentaje de
las células CD11c+ en la población CD45.1+ en el bazo de los grupos experimentales HTX
y CTRL al día 5, 7 y 9 p.i. (E) Cuantificación absoluta de monocitos inflamatorios (CD11b+
Ly6Chigh) en la población CD45.1+ en el bazo de los grupos experimentales HTX y CTRL
al día 5, 7 y 9 p.i. (F) Porcentaje de monocitos inflamatorios en la población CD45.1+ en el
bazo de los grupos experimentales HTX y CTRL al día 5, 7 y 9 p.i. (G) Cuantificación
absoluta de macrófagos (CD11b+ Ly6Clow) en la población CD45.1+ en el bazo de los grupos
experimentales HTX y CTRL al día 5, 7 y 9 p.i. (H) Porcentaje de macrófagos en la
población CD45.1+ en el bazo de los grupos experimentales HTX y CTRL al día 5, 7 y 9 p.i.
Los gráficos muestran el promedio de cada n experimental ± SEM, n=5. Análisis de Mann-
Whitney.

221
 (A) Linfocitos B (B) Porcentaje de linfocitos B
Neutrófilos
BAZO CD45.1 B220+ %BAZO CD45.1 B220+
200 30
CTRL CTRL
HTX HTX
150
Células/µL

20

% Células
100

10
50

0 0
5 7 9 5 7 9
Días postinmunización Días postinmunización

(C) Linfocitos T CD4+ (D) Porcentaje de linfocitos T CD4+

BAZO CD45.1 CD4+ %BAZO CD45.1 CD4+
400 100
CTRL CTRL
HTX 80 HTX
300
Células/µL

% Células
60
200
40
100
20

0 0
5 7 9 5 7 9
Días postinmunización Días postinmunización

(E) (F)
Linfocitos T CD8+ Porcentaje de linfocitos T CD8+
BAZO CD45.1 CD8+ %BAZO CD45.1 CD8+
150 50
CTRL CTRL
HTX 40 HTX
Células/µL

100
% Células

30

20
50
10

0 0
5 7 9 5 7 9
Días postinmunización Días postinmunización

Leyenda en la página siguiente

222
Figura Suplementaria 4. El ingreso de la subpoblación de células linfoides CD45.1+ al
bazo es similar en la progenie gestada en HTX con respecto al control durante la EAE.
(A) Cuantificación absoluta de los linfocitos B (B220+) en la población CD45.1+ en el bazo
de los grupos experimentales HTX y CTRL al día 5, 7 y 9 p.i. (B) Porcentaje de linfocitos B
en la población CD45.1+ en el bazo de los grupos experimentales HTX y CTRL al día 5, 7
y 9 p.i. (C) Cuantificación absoluta de linfocitos T CD4+ en la población CD45.1+ en el bazo
de los grupos experimentales HTX y CTRL al día 5, 7 y 9 p.i. (D) Porcentaje de linfocitos T
CD4+ en la población CD45.1+ en el bazo de los grupos experimentales HTX y CTRL al
día 5, 7 y 9 p.i. (E) Cuantificación absoluta de linfocitos T CD8+ en la población CD45.1+ en
el bazo de los grupos experimentales HTX y CTRL al día 5, 7 y 9 p.i. (F) Porcentaje de
linfocitos T CD8+ en la población CD45.1+ en el bazo de los grupos experimentales HTX y
CTRL al día 5, 7 y 9 p.i. Los gráficos muestran el promedio de cada n experimental ± SEM,
n=5. Análisis de Mann-Whitney.

223
 (A) CTRL HTX (B)

SNC CD45.2
Células CD45.2
80
CTRL
HTX
5 PI 60

Células/µL
40

20

0
5 7 9
Días postinmunización

7 PI

(C)
Porcentaje
%SNC de CD45.2
células CD45.2
100
CTRL
80 HTX

% Células
60
9 PI
40

20

0
5 7 9

CD45.2 Días postinmunización

Figura Suplementaria 5. La población de células CD45.2+ en el SNC es similar en la

progenie gestada en HTX con respecto al control durante la EAE. (A) Citometrías de
flujo representativas para la identificación de las células CD45.2+ en el SNC de los grupos
experimentales CTRL y HTX al día 5, 7 y 9 p.i. (B) Cuantificación absoluta de las células
CD45.2+ en el SNC de los grupos experimentales CTRL y HTX al día 5, 7 y 9 p.i. (C)
Porcentaje de las células CD45.2+ en el SNC de los grupos CTRL y HTX al día 5, 7 y 9 p.i.
Los gráficos muestran el promedio de cada n experimental ± SEM, n=5. Análisis de Mann-
Whitney.

224
Figura Suplementaria 6. La HTX gestacional aumenta el ingreso de neutrófilos nativos
al SNC al día 7 p.i. de la EAE. (A) Citometrías de flujo representativas para la identificación
de los neutrófilos (CD11b+ Ly6G+) en la población CD45.2+ en el SNC de los grupos
experimentales CTRL y HTX al día 5, 7 y 9 p.i. (B) Cuantificación absoluta de los neutrófilos
en la población CD45.2+ en el SNC de los grupos experimentales CTRL y HTX al día 5, 7
y 9 p.i. (C) Porcentaje de los neutrófilos en la población CD45.2+ en el SNC de los grupos
experimentales CTRL y HTX al día 5, 7 y 9 p.i. de la EAE. Los gráficos muestran el promedio
de cada n experimental ± SEM, n=5. Análisis de Mann-Whitney. Letra a indica p < 0.05.

225
Figura Suplementaria 7. La HTX gestacional disminuye la población de células CD11c+
nativas en el SNC al día 5 p.i. de la EAE. (A) Citometrías de flujo representativas para la
identificación de las células CD11c+ en la población CD45.2+ en el SNC de los grupos
experimentales CTRL y HTX al día 5, 7 y 9 p.i. (B) Cuantificación absoluta de las células
CD11c+ en la población CD45.2+ en el SNC de los grupos experimentales CTRL y HTX al
día 5, 7 y 9 p.i.(C) Porcentaje de las células CD11c+ en la población CD45.2+ en el SNC de
los grupos experimentales CTRL y HTX al día 5, 7 y 9 p.i. de la EAE. Los gráficos muestran
el promedio de cada n experimental ± SEM, n=5. Análisis de Mann-Whitney. Letra a indica
p < 0.05.

226
 Ly6G 5

Ly6C
Ly
Ly6G (A) CTRL HTX

Ly6C
5
7
5 Ly6G

Ly6C
5
5 Ly6G
X Ly6G

Ly6C
(A) 5 CTRL HTX
5
Ly6C
(A) CTRL HTX
HTX 7
5
7
Ly6G
5 (A)
5 PI 7 PI 9 PI
Ly6C
7 Ly6G
7
Ly6C
(A) CTRL HTX 9
7 (A) 7
CTRL (A) HTX
(A)
(A)
5 PI 7 PI 9 PI

5 7
5
7 9
9
5 PI
5 PI 7 PI 9 PI
7 PI 9 PI
5 7 7 CTRL CTRL
Ly6G 7 CTRL
Ly6C

Ly6G (A)

Ly6C
Ly6C

5 PI 7 PI 9 PI

Ly6C
Ly6C
(A)
9 9 5 PI 7 PI 9 PI
9 9
9 9
95 5 7 9 HTX
7 HTX

CTRL CTRL

Ly6C
Ly6C
CTRL 9
7 Ly6G HTX
Ly6C

Ly6G
Ly6C
Ly6C

9
9

Ly6C
7 7

Ly6G

9
HTX
9
9 HTX
Ly6C
Ly6C

Ly6G
Ly6G HTX
Ly6C

Ly6G

(B) (C)

Monocitos inflamatorios Porcentaje de monocitos inflamatorios

SNC CD45.2 Monocitos %SNC CD45.2 Monocitos

25
1.0 CTRL
CTRL
20 HTX
0.8 HTX
% Células
Células/µL

15
0.6

10
0.4

5
0.2

0
0.0
5 7 9
5 7 9
Días postinmunización
Días postinmunización

(D) (E)
Macrófagos Porcentaje de macrófagos
SNC CD45.2 Macrófagos %SNC CD45.2 Macrófagos
0.5 10
CTRL CTRL
0.4 HTX 8 HTX
Células/µL

% Células

0.3 6

0.2 4

0.1 2

0.0 0
5 7 9 5 7 9
Días postinmunización Días postinmunización

Leyenda en la página siguiente

227
Figura Suplementaria 8. El tamaño de la población de monocitos inflamatorios y
macrófagos nativos en el SNC es similar en la progenie gestada en HTX con respecto al
control durante la EAE. (A) Citometrías de flujo representativas para la identificación de
monocitos inflamatorios (CD11b+ Ly6Chigh) y macrófagos (CD11b+ Ly6Clow) en la población
CD45.2+ en el SNC de los grupos experimentales CTRL y HTX al día 5, 7 y 9 p.i., a partir
de la selección de células CD11b+ CD11c-. (B) Cuantificación absoluta de monocitos
inflamatorios en la población CD45.2+ en el SNC en los grupos experimentales CTRL y
HTX al día 5, 7 y 9 p.i. (C) Porcentaje de monocitos inflamatorios en la población CD45.2+
en el SNC de los grupos experimentales CTRL y HTX al día 5, 7 y 9 p.i. (D) Cuantificación
absoluta de macrófagos en la población CD45.2+ en el SNC de los grupos experimentales
CTRL y HTX al día 5, 7 y 9 p.i. (E) Porcentaje de macrófagos en la población CD45.2+ en
el SNC de los grupos experimentales CTRL y HTX al día 5, 7 y 9 p.i. Los gráficos muestran
el promedio de cada n experimental ± SEM, n=5. Análisis de Mann-Whitney.

228
Figura Suplementaria 9. La HTX gestacional disminuye la población de linfocitos B
nativos en el SNC al día 5 p.i. de la EAE. (A) Citometrías de flujo representativas para la
identificación de los linfocitos B (B220+) en la población CD45.2+ en el SNC de los grupos
experimentales CTRL y HTX al día 5, 7 y 9 p.i. (B) Cuantificación absoluta de linfocitos B
en la población CD45.2+ en el SNC de los grupos experimentales CTRL y HTX al día 5, 7
y 9 p.i. (C) Porcentaje de linfocitos B en la población CD45.2+ en el SNC de los grupos
experimentales CTRL y HTX al día 5, 7 y 9 p.i. de la EAE. Los gráficos muestran el promedio
de cada n experimental ± SEM, n=5. Análisis de Mann-Whitney. Letra a indica p < 0.05.

229
 1.0

Células/µ

% Célula
30

20
0.5
(B) (C)
10

Linfocitos T CD4+ 0.0 Porcentaje de linfocitos

0 T CD4+
5 7 9 5 7 9
SNC CD45.2 CD4+ Días postinmunización %SNC CD45.2 CD4+
Días postinmunización

1.5 50
CTRL
(D) HTX 40 (E)
Linfocitos T CD8+ Porcentaje de linfocitos T CD8+

Células/µL
1.0

% Células
30
(A) *
SNC CD45.2 CD8+
*
%SNC CD45.2 CD8+

5 PI (B)
0.5
7 PI 1.5 (C) 9 PI CTRL 20 60

Linfocitos T CD4+ Porcentaje de linfocitosHTX

T CD4+
10
(B) (C)

Células/µL
1.0 40

% Células
SNC CD45.2 CD4+ %SNC CD45.2 CD4+

(B) 0.0 1.5 (C) CTRL

50 0
CTRL
5 7 9HTX 0.5 20 7 5 9
Linfocitos T CD4+ Días postinmunización
Porcentaje
40 de linfocitos T CD4+
Días postinmunización
HTX

Linfocitos T CD4+ Porcentaje de linfocitos T CD4+

Células/µL
1.0

% Células
30

SNC CD45.2 CD4+ 0.0

20
%SNC CD45.2 CD4+ 0
SNC CD45.2 CD4+ 0.5 5 7 %SNC9CD45.2 CD4+ 5 7 9

CTRL 1.5 (D)

Días postinmunización
10
50 (E)
Días postinmunización
1.5 0.0 CTRL 50 0 CTRL
5CTRL CTRL
Linfocitos
DíasHTX
7
T 9CD8+ 40
5 7 9
Porcentaje de linfocitos T CD8+
HTX
HTX postinmunización 40
Días postinmunización
HTX
SNC CD45.2 CD8+ %SNC CD45.2 CD8+
Células/µL

CD8

1.01.0
Células/µL

% Células
* *

% Células
(D) 1.5 (E)30
30 60
CTRL
Linfocitos T CD8+ Porcentaje de linfocitos T CD8+
SNC CD45.2 CD8+ 20HTX 20 %SNC CD45.2 CD8+
0.50.5

Células/µL
1.0 * * 40

% Células
1.5 60
CTRL CTRL
10 10
(C) HTX HTX

Células/µL
1.0 40

% Células
0.0 0.5 0 20
0.0 5 7 9 05 7 9
Linfocitos T CD4+ 5 7 9 0.5 Porcentaje de linfocitos T CD4+ 20 5 7 9
Días postinmunización Días postinmunización
SNC CD45.2 CD4+ Días postinmunización 0.0
%SNC CD45.2 Días postinmunización
0
0.0 5 7 9 CD4+ 0 5 7 9
5 7 9 5 7 9

1.5 HTX 50
Días
Días postinmunización
postinmunización Días postinmunización Días postinmunización
CTRL CTRL
(D) (E)
HTX 40 HTX
(D) Linfocitos T CD8+ (E) Porcentaje de linfocitos T CD8+
Células/µL

1.0
% Células
CD8

Linfocitos
SNC CD45.2T CD8+
CD8+ 30 Porcentaje
%SNC CD45.2de linfocitos T CD8+
CD8+
* *
1.5 SNC CD45.2 CD8+ 20 60 %SNC CD45.2 CD8+
0.5 CTRL CTRL
* *
1.5 HTX 60 HTX
10 CTRL CTRL
CD4
Células/µL

1.0 40

% Células
0.0 0
HTX HTX
Células/µL

5 7 9 1.0 5 7 9 40

% Células
Días postinmunización 0.5 Días postinmunización 20

0.5 20
0.0 0
5 7 9 5 7 9
(E)
Días postinmunización Días postinmunización
Linfocitos T CD8+ 0.0 Porcentaje de linfocitos T CD8+ 0
5 7 9 5 7 9
SNC CD45.2 CD8+ %SNC CD45.2 CD8+
* Días postinmunización * Días postinmunización
1.5 60
CTRL CTRL
HTX HTX
Células/µL

1.0 40
% Células

0.5 20

0.0 0
5 7 9 5 7 9
Días postinmunización Días postinmunización

Leyenda en la página siguiente

230
Figura Suplementaria 10. La HTX gestacional disminuye la población de linfocitos T
CD8+ nativos en el SNC al día 5 p.i. de la EAE. (A) Citometrías de flujo representativas
para la identificación de los linfocitos T CD4+ (CD3+ CD4+) y linfocitos T CD8+ (CD3+
CD8+) en la población CD45.2+ en el SNC de los grupos experimentales HTX y CTRL al día
5, 7 y 9 p.i., a partir de la selección de células CD3+ B220-. (B) Cuantificación absoluta de
los linfocitos T CD4+ en la población CD45.2+ en el SNC de los grupos experimentales HTX
y CTRL al día 5, 7 y 9 p.i. (C) Porcentaje de los linfocitos T CD4+ en la población CD45.2+
en el SNC de los grupos experimentales HTX y CTRL al día 5, 7 y 9 p.i. (D) Cuantificación
absoluta de los linfocitos T CD8+ en la población CD45.2+ en el SNC de los grupos
experimentales HTX y CTRL al día 5, 7 y 9 p.i. (E) Porcentaje de los linfocitos T CD8+ en
la población CD45.2+ en el SNC de los grupos experimentales HTX y CTRL al día 5, 7 y 9
p.i. Los gráficos muestran el promedio de cada n experimental ± SEM, n=5. Análisis de
Mann-Whitney. Letra a indica p < 0.05.

231
 Células CD45.2
SANGRE CD45.2
15000
5 PI CTRL
HTX

Células/µL
10000

5000
(A) CTRL HTX (B)

0 Células CD45.2
5
SANGRE 7
CD45.2 9

7 PI Días postinmunización
15000
5 PI CTRL
(C) HTX

Células/µL
10000 Porcentaje de células CD45.2
%SANGRE CD45.2
110
5000 CTRL
HTX
100

% Células
0
5 7 9
9 PI (A) CTRL HTX (B) 90
7 PI Días postinmunización
Células CD45.2
SANGRE CD45.2
15000 80
5 PI
(C) CTRL
HTX

Células/µL
Porcentaje de células CD45.2
10000

70 %SANGRE CD45.2
5000
5 7 9
110
CD45.1 0
5 7 9
Días postinmunización CTRL
7 PI Días postinmunización
HTX
(C)
100

% Células
Porcentaje de células CD45.2
%SANGRE CD45.2

9 PI
110
90 CTRL
HTX
100

% Células
9 PI 90
80
80

70
5 7
Días postinmunización
70 9

CD45.1
5 7 9

CD45.2 Días postinmunización

Figura Suplementaria 11. La población de células CD45.2+ en la sangre es similar en la

progenie gestada en HTX con respecto al control durante la EAE. (A) Citometrías de
flujo representativas para la identificación de las células CD45.2+ en la sangre de los grupos
experimentales CTRL y HTX al día 5, 7 y 9 p.i. (B) Cuantificación absoluta de las células
CD45.2+ en la sangre de los grupos experimentales CTRL y HTX al día 5, 7 y 9 p.i. (C)
Porcentaje de las células CD45.2+ en la sangre de los grupos CTRL y HTX al día 5, 7 y 9 p.i.
Los gráficos muestran el promedio de cada n experimental ± SEM, n=5. Análisis de Mann-
Whitney.

232
 (A) CTRL HTX (B)

Células
Copy CD45.2
of %BAZO CD45.2
105
CTRL
5 PI 100 HTX
95

% Células
90

85

80

75
5 7 9
Días postinmunización
7 PI

(C)
Porcentaje
BAZOdeCD45.2
células CD45.2
40000
CTRL
HTX
30000

Células/µL
20000
9 PI

10000

0
5 7 9
Días postinmunización
CD45.2

Figura Suplementaria 12. La población de células CD45.2+ en el bazo es similar en la

progenie gestada en HTX con respecto al control durante la EAE. (A) Citometrías de
flujo representativas para la identificación de las células CD45.2+ en el bazo de los grupos
experimentales CTRL y HTX al día 5, 7 y 9 p.i. (B) Cuantificación absoluta de las células
CD45.2+ en el bazo de los grupos experimentales CTRL y HTX al día 5, 7 y 9 p.i. (C)
Porcentaje de las células CD45.2+ en el bazo de los grupos CTRL y HTX al día 5, 7 y 9 p.i.
Los gráficos muestran el promedio de cada n experimental ± SEM, n=5. Análisis de Mann-
Whitney.

233
 (A) (B)
Neutrófilos Porcentaje de neutrófilos
BAZO CD45.2 Neutrófilos %BAZO CD45.2 Neutrófilos
10000 60
CTRL CTRL
8000 HTX HTX
50
Células/µL

% Células
6000
40
4000

30
2000

0 20
5 7 9 5 7 9
Días postinmunización Días postinmunización

(C) (D)
Células CD11c+ Porcentaje de células CD11c+
BAZO CD45.2 CD11c+ %BAZO CD45.2 CD11c+
1000 8
CTRL CTRL
800 HTX HTX
6
Células/µL

% Células
600
4
400

2
200

0 0
5 7 9 5 7 9
Días postinmunización Días postinmunización

(E) (F)
Monocitos
BAZO inflamatorios
CD45.2 Monocitos Porcentaje
%BAZO de monocitos inflamatorios
CD45.2 Monocitos
1500 15
CTRL CTRL
HTX HTX
Células/µL

1000 10
% Células

500 5

0 0
5 7 9 5 7 9
Días postinmunización Días postinmunización

(G) (H)
Macrófagos Porcentaje de macrófagos
BAZO CD45.2 Macrófagos %BAZO CD45.2 Macrófagos
1500 20
CTRL CTRL
HTX HTX
15
Células/µL

1000
% Células

10

500
5

0 0
5 7 9 5 7 9
Días postinmunización Días postinmunización

Leyenda en la próxima página

234
Figura Suplementaria 13. El tamaño de las subpoblaciones de las células mieloides
CD45.2+ en el bazo es similar en la progenie gestada en HTX con respecto al control
durante la EAE. (A) Cuantificación absoluta de los neutrófilos (CD11b+ Ly6G+) en la
población CD45.2+ en el bazo de los grupos experimentales HTX y CTRL al día 5, 7 y 9 p.i.
(B) Porcentaje de neutrófilos en la población CD45.2+ en el bazo de los grupos
experimentales HTX y CTRL al día 5, 7 y 9 p.i. (C) Cuantificación absoluta de las células
CD11c+ en la población CD45.2+ en el bazo de los grupos experimentales HTX y CTRL al
día 5, 7 y 9 p.i. (D) Porcentaje de las células CD11c+ en la población CD45.2+ en el bazo de
los grupos experimentales HTX y CTRL al día 5, 7 y 9 p.i. (E) Cuantificación absoluta de
monocitos inflamatorios (CD11b+ Ly6Chigh) en la población CD45.2+ en el bazo de los
grupos experimentales HTX y CTRL al día 5, 7 y 9 p.i. (F) Porcentaje de monocitos
inflamatorios en la población CD45.2+ en el bazo de los grupos experimentales HTX y CTRL
al día 5, 7 y 9 p.i. (G) Cuantificación absoluta de macrófagos (CD11b+ Ly6Clow) en la
población CD45.2+ en el bazo de los grupos experimentales HTX y CTRL al día 5, 7 y 9 p.i.
(G) Porcentaje de macrófagos en la población CD45.2+ en el bazo de los grupos
experimentales HTX y CTRL al día 5, 7 y 9 p.i. Los gráficos muestran el promedio de cada
n experimental ± SEM, n=5. Análisis de Mann-Whitney.

235
 (A) Linfocitos B (B) Porcentaje de linfocitos B
BAZONeutrófilos
CD45.2 B220+ %BAZO CD45.2 B220+
10000 40
CTRL CTRL
8000 HTX HTX
30
Células/µL

% Células
6000
20
4000
10
2000

0 0
5 7 9 5 7 9
Días postinmunización Días postinmunización

(C) Linfocitos T CD4+ (D) Porcentaje de linfocitos T CD4+

BAZO CD45.2 CD4+ %BAZO CD45.2 CD4+
3000 60
CTRL CTRL
HTX HTX
55
Células/µL

2000

% Células
50

1000
45

0 40
5 7 9 5 7 9
Días postinmunización Días postinmunización

(E) (F)
Linfocitos T CD8+ Porcentaje de linfocitos T CD8+
BAZO CD45.2 CD8+ %BAZO CD45.2 CD8+
3000 50
CTRL CTRL
HTX 45 HTX
Células/µL

2000 40
% Células

35

1000 30

25

0 20
5 7 9 5 7 9
Días postinmunización Días postinmunización

Leyenda en la página siguiente

236
Figura Suplementaria 14. El tamaño de las subpoblaciones de las células linfoides
CD45.2+ en el bazo es similar en la progenie gestada en HTX con respecto al control
durante la EAE. (A) Cuantificación absoluta de los linfocitos B (B220+) en la población
CD45.2+ en el bazo de los grupos experimentales HTX y CTRL al día 5, 7 y 9 p.i. (B)
Porcentaje de linfocitos B en la población CD45.2+ en el bazo de los grupos experimentales
HTX y CTRL al día 5, 7 y 9 p.i. (C) Cuantificación absoluta de linfocitos T CD4+ en la
población CD45.2+ en el bazo de los grupos experimentales HTX y CTRL al día 5, 7 y 9 p.i.
(D) Porcentaje de linfocitos T CD4+ en la población CD45.2+ en el bazo de los grupos
experimentales HTX y CTRL al día 5, 7 y 9 p.i. (E) Cuantificación absoluta de linfocitos T
CD8+ en la población CD45.2+ en el bazo de los grupos experimentales HTX y CTRL al día
5, 7 y 9 p.i. (F) Porcentaje de linfocitos T CD8+ en la población CD45.2+ en el bazo de los
grupos experimentales HTX y CTRL al día 5, 7 y 9 p.i. Los gráficos muestran el promedio
de cada n experimental ± SEM, n=5. Análisis de Mann-Whitney.

237