METODOS PARA DETERMINAR

EL CRECIMIENTO MICROBIANO

DRA. JOSEFINA PEREZ

 Fuente de Fuente de Fuente de
Tipo de nutrición Ejemplo
energía electrones carbono
quimiotrofos química - - -
fototrofo luz - - -
comp.
organotrofo - - -
orgánico
comp.
litotrofo - - -
inorgánico
autotrofo - - inorgánico -
heterotrofo - - orgánico -
comp. bacterias, hongos,
quimioorgano(hetro)trofo química orgánico
orgánico animales
comp.
quimioliot(auto)trofo química inorgánico algunas bacterias
inorgánico
comp. bacterias, plantas,
fotolito(auto)trofo luz inorgánico
inorgánico algas
comp. algunas bacterias,
fotoorgano(hetero)trofo luz orgánico
orgánico algas
Hay cuatro técnicas biológicas
básicas técnicas de recuento de
viables

1.- Conteo en Placa Standard (Standard Plate Count).

2.- Determinación del número más probable.
3.- Métodos basados en la reducción de colorantes por
viables.
4.- Conteo microscópico directo.
 Conteo en Placa:

Consiste en el plaqueo de una muestra de volumen

conocido del alimento que se analiza.
El resultado es función de una serie de factores como son
el método de muestreo, el tipo de microorganismo, el tipo
de alimento y las características del medio de cultivo.
Los cultivos pueden hacerse tanto en masa como en
superficie, aunque hay que considerar que los cultivos en
masa son letales para la flora psicotrofa. Cada bacteria
viable formará una colonia, el plaqueo puede hacerse en
una placa normal o por medio de un plaqueador en
espiral que va depositando concentraciones
progresivamente más diluídas de la muestra.
 Filtros de membrana
Utilizados cuando el número de bacterias es bajo.
Son filtros con un poro de 0,45 mm que retienen las
bacterias.
Se filtra un volumen dado y se coloca el filtro sobre
una placa del medio de cultivo apropiado.
La muestra puede haber sido procesada para
epifluorescencia previamente, lo que facilita el
recuento
(la epifluorescencia se puede provocar con naranja de
acridina que tiñe específicamente los ácidos nucleicos).
 Microcolonias en DEFT
DEFT son las iniciales en inglés de Direct Epifluorescence Filter
Technique (técnica de epifluorescencia directa en filtro).

En esta técnica las bacterias se filtran para retenerlas en una

membrana apropiada que posteriormente se trata con un agente
fluorescente (como la naranja de acridina) para teñir las células
bacterianas (se somete el filtrado a un tratamiento previo con
detergentes para destruir las células somáticas).

La detección de los microorganismos ha de hacerse mediante

microscopía de fluorescencia o por cualquier otro método de medida
de la epifluorescencia.

En ciertos casos, las membranas se incuban para producir colonias

que son más fácilmente detectables.
 Conteo de microcolonias al microscopio:

Se añade un pequeño volumen de agar-

cultivo a un porta y se incuba para seguir
la formación de microcolonias al
microscopio.
 Gotitas de agar:

Se hacen diluciones de la muestra

(solución madre) y se depositan gotitas de
10 ml en una placa Petri (gotitas de cultivo
+ agar). Se examina el crecimiento de las
colonias en las gotitas tras la incubación.
 Films secos (Petrifilm):

Son películas deshidratadas de medios

de cultivos generales o selectivos en las
que se deposita 1 ml de la muestra que
rehidrata el medio.

Tras la incubación se hace el recuento.

 Método del número más probable:

Basado en series de diluciones y cálculo

estadístico del número de bacterias presentes
en las diluciones más altas.

Se puede hacer con 3 ó 5 tubos.

El método es popular aunque poco exacto

 Métodos basados en la
reducción de colorantes:

Usando azul de metileno o

resazurina.

Colorantes reducidos por las

bacterias; al reducirse cambian de
color y esto es medible.

Usado en medios líquidos (lácteos).

 Tubos rodantes:

Son tubos herméticamente cerrados en

los que haciéndolos girar se forma una
fina capa de agua.

Utiles para recuento de anaerobios.

 Conteo microscópico directo:

Usando cámaras de Newbauer, se

coloca un volumen determinado de
acuerdo a las especificaciones de la
cámara, se recuentan las bacterias de
acuerdo a los campos que deben leerse
al hacer la observación al microscopio.
- Además de las técnicas de recuento basadas en la formación de
colonias observable (técnicas biológicas) hay una serie de
procedimientos de recuento basado en técnicas químicas, físicas e
inmunológicas.
Métodos físicos para la detención de microorganismos.
A) Impedancia: Es la resistencia aparente presentada a la corriente alterna. En un
cultivo los microorganismos alteran las substratos cambiando su conductividad
eléctrica y esto varía la impedancia. El método se basa en detectar estos
cambios y la cantidad de microorganismos se expresa como función del tiempo
que tarda el cultivo en alcanzar unos valores de impedancia correspondientes a
106 - 107 células por ml-1. (IDT: Imdepedance Detection Time). Es necesario que
el medio de cultivo permite un crecimiento homogéneo sin «escalones».

B) Microcalorimetria: Estudio de los pequeños cambios de calor producidos como

consecuencia del antabolismo de nutrientes. Los diferentes tipos de
microorganismos metabolizan los substratos de forma diferente y, por ello, se ha
usado la microcalorimetría para poder identificar las especies presentes en un
alimento: usando un medio de cultivo con una composición definida de azúcares
pueden llegar a identificarse diferentes tipos de bacterias lácticas mediante los
termogramas de su metabolización de los azúcares presentes en el medio.

C) Citometria de flujo: Método basado en hacer pasar una a una las células de una
suspensión por un sistema de detección; este sistema puede contener un
detector capaz de medir diferentes parámetros (diferentes tipos de fluorescencia,
absobancia, dispersión de luz, etc.) lo que permite identificar las bacterias
durante su paso por el detector.
 Métodos químicos de detección de microorganismos.
A) Nucleasa Termoestable: S. aureus produce una nucleasa termoestable con mayor rapidez
y en mayor cantidad que la enterotoxina responsable de la intoxicación. La endonucleasa
puede detectarse experimentalmente como un índice de la presencia de S. aureus incluso en
concentraciones demasiado bajas para que hayan producido unas cantidades detectables de
enterotoxina.
B) Lisado de Limulus: Usado para detección de endotoxinas (derivadas del lipopolisacárido
LPS de las bacterias Gram negativas). Se basa en la aglutinación de extractos de amebocito
de sangre de Limulus (cangrejo de mar) producido por cantidades del orden de picogramos
de LPS. Puede detectar 300 células de E. coli. El método detecta células viables y no-viables.
Es muy rápido.
C) Sondas de ácidos nucleicos: Sirven para identificar microorganismo desconocidos por
medio de Southern.
D) PCR: Método para detectar número extremadamente bajos de microorganismos con una
cierta rapidez basado de la producción de copias de genes específicos de un microorganismo
en cuestión.
E) Medida de ATP-: Se detecta la presencia de ATP usando luciferasa, aunque hay algunos
problemas experimentales que hacen que la técnica sea controvertida.
F) Radiometria: Medida de la transformación de un substrato con 14C en 14CO2: el tiempo
necesario para detectar el 14CO2 es inversamente proporcional a la cantidad de
microorganismos presente.
G) Substratos Fluoro y Cromogénicos: Se añaden como aditivos a los medios de cultivos
para facilitar y acelerar la detección de los microorganismos.
 Métodos inmunológicos
A) Anticuerpo fluorescentes: Se utiliza anticuerpo marcado con una molécula fluorescente
o un segundo anticuerpo que reconozca el primero. Se pueden usar antisueros complejos
en el primer anticuerpo y de esta forma detectar cualquier tipo de Salmonella sin
necesidad de aislarlas. El método también se ha usado para Clostridios aunque su mayor
aplicación ha sido en Salmonella donde es muy conveniente por la sensibilidad y rapidez.
B) Serologia de enriquecimiento: En este procedimiento especialmente desarrollado para
la detección de Salmonella, el antisuero no se añade al alimento sino que se efectúa un
paso previo de enriquecimiento del cultivo y de selección para evitar falsos positivos.
C) Test 1 - 2 de Salmonella: Sistema con dos cámaras de agar blando. Una de las
cámaras (la de siembra) contiene un medio selectivo para Salmonella, las bacterias
móviles de este género atraviesan la cámara selectiva y pasan a la no selectiva pero
portadora de un anticuerpo específico por lo que se forma una banda de aglutinación
cuando entre Salmonella.
D) Radioinmunoensayo: se basa en el marcaje con un radioisótopo de un antígeno
determinado (toxina producida por una bactería patógena) y su posterior detección por
anticuerpos específicos fijados sobre un soporte sólido.
E) ELISA: El método es similar al radioinmunoensayo: el antígeno se fija en un soporte
sólido, se trata con el antisuero correspondiente y la interacción se detecta mediante una
actividad marcadora (peroxidasa) unida al anticuerpo en cuestión o a un segundo
anticuerpo de revelado.
 El método se ha usado para detección de Salmonellas. Toxinas
de S aureus, micotoxinas, toxinas de C. botulinum, enterotoxinas
de E. coli.

F) Difusión en gel: Método de Ouchterlony para detección de

antígenos.
5. Examen de superficies.
- Métodos dirigidos a detectar y medir los números de microorganismos
presentes en superficies contaminadas.
- Algunas veces es necesario añadir agentes neutralizantes para eliminar
el efecto de detergentes que han sido utilizados para limpiar la superficie.
- El método más clásico de obtención de muestra es el uso de torundas
de algodón o de alginato cálcico. Las muestras se recogen en seco o en
húmedo y se depositan sobre medios de cultivo líquido (generales o de
enriquecimiento).
-En algunos casos se usan otros metodos como el contacto con placa o
la jeringa de agar.

6. Recuento de mohos y levaduras.

Se realiza o bien directamente en el alimento humedecido e incubado a
22ºC o bien mediante diluciones sucesivas y siembra en placa en
superficie. Es necesario añadir agentes antibacterianos al medio de
cultivo para evitar el crecimiento de las bacterias, que es más rápido que
el de los mohos.
 Tipo de Temp. Temp. Temp.
microorganismo mínima óptima máxima

Psicrófilo -5 +5 12 - 15 15 - 20

Psicrótrofo -5 +5 25 - 30 30 - 35

Mesófilo 5 - 15 30 - 45 35 - 47

Termófilo 40 - 45 55 - 75 60 - 90