Re-10-Lab-035-001 Microbiologia Ii PDF

GUIA DE PRÁCTICA CIENCIAS DE LA SALUD
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UNIVERSIDAD DEL VALLE

FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD
LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA II
PRÁCTICA Nº 1
TOMA DE MUESTRA
ESTRUCTURA CELULAR
1. CONOCIMIENTO TEÓRICO REQUERIDO.-

. Recomendaciones generales para la recolección de muestras:
 Si el paciente recolectara la muestra las instrucciones deberán ser claras (Mejor si son por
escrito)
 La muestra deberá ser representativa del proceso infeccioso
 La recolección deberá relazarse antes de comenzar la terapia antimicrobiana o suspender el
antibiótico 48-72 horas antes de la toma de muestra
 Cuando se realice cultivo y aislamiento de gérmenes el material deberá recolectarse en
recipientes estériles
 Una vez recolectada la muestra deberá ser llevada al laboratorio lo más rápido posible
 Etiquetar correctamente las muestras
 Toda muestra deberá como si fuera patógena
 Cuando se realiza cultivo de material deberá conocerse el lugar de donde proviene la muestra:
Zonas corporales que normalmente son estériles (sangre, punción de medula ósea, líquido
cefalorraquídeo, liquido sinovial, liquido pleural, liquido peritoneal, tracto respiratorio inferior,
orina recolectada por punción suprapúbica), Zonas corporales que poseen flora normal
comensal (boca, nariz, tracto respiratorio superior, piel, tracto genital, tracto gastrointestinal,
orina recolectada por micción media, sondas o bolsas recolectoras)
Fuente. P. Murray
2. COMPETENCIA (S)
 Emplea y describe métodos y técnicas para la obtención adecuada de muestras para el diagnóstico
microbiológico.
 Conoce los diferentes medios de transporte y técnicas de envío de muestras al laboratorio
microbiológico.
 Realiza una solicitud correcta para el examen microbiológico y su relación con el campo de trabajo del
profesional.
3. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS

 Bajalenguas
 Hisopos de algodón estériles
 Portaobjetos
 Mechero de alcohol
 Pinzas metálicas
 Colorantes de Gram
 Varillas de tinción
 Guantes
 Frascos para muestra de orina
4. TECNICA O PROCEDIMIENTO
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Trabajo en grupos 5 estudiantes para la extracción de muestras

Muestra Preparación del paciente Instrucciones especiales
Orina chorro medio Mujeres: limpiar la El recipiente donde se
previa higiene zona con agua y jabón, luego recolecta la muestra deberá ser
enjuagar con agua, colocar estéril y no tocar la piel del
tampón vaginal, paciente.
manteniendo separados los En el caso de niños se
labios mayores y comenzar e podrá emplear bolsa
evacuar en el inodoro; recolectora.
recoger el chorro medio
después de eliminar los
primeros ml de orina.
Varones: limpiar el
glande con agua y jabón,
luego enjuagar con agua;
retraer la piel del glande;
recoger el chorro medio
después de eliminar varios
mL.
Orina por Punción Punción en la vejiga,
suprapúbica previa asepsia de la región
con alcohol yodado
Sangre venosa Limpiar el sitio de Extraer sangre durante el
punción venosa con alcohol episodio febril, extraer dos
al 70 % o con alcohol muestras, de brazo izquierdo y
yodado. derecho, no extraer más de tres
muestras en un periodo de 24
horas.
Tracto genital Limpiar la piel antes de Se puede aspirar el
femenino la recolección. líquido o se puede realizar un
hisopado, o recolectar las
secreciones con ayuda de un
hisopo.
Tracto genital Limpiar el glande con Recolectar las
masculino agua y jabón. secreciones con hisopo o en
tubo.
Vías respiratorias Enjuagar con agua Pasar el hisopo por la
superiores faringe antes de la recolección de la faringe posterior y las
muestra amígdalas, con la ayuda de un
baja lengua, sin tocar paladar,
úvula y dientes.
Vías respiratorias La muestra recolectada El paciente debe
inferiores es Esputo. Enjuagar o hacer obtenerlo por tos profunda.
gárgaras con agua antes de la
recolección.
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Muestra Preparación del paciente Instrucciones especiales

Liquido Se realiza mediante
cefalorraquídeo (LCR) punción lumbar (PL) entre la
3º y 4º vértebra lumbar,
previa asepsia de la zona con
alcohol yodado
5. TIEMPO DE DURACION DE LA PRÁCTICA

Dos periodos de 50 minutos
6. MEDICION, CALCULOS Y GRAFICOS

El estudiante anotara los posibles errores cometidos en la toma de muestra
7. CUESTIONARIO
1.- Llenar el cuadro que muestra son representativas en las siguientes patologías:
Enfermedad Agente etiológico muestra tratamiento
Meningitis neonatal
tuberculosis
Fiebre tifoidea
Amigdalitis
Micosis sistémicas
Infecciones urinarias
otitis
Gonorrea
Sífilis
Disentería bacilar
Chancroide
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PRÁCTICA Nº 2
TINCIÓN DE GRAM
CLASIFICACION BACTERIANA

Debido a que las bacterias y otros microorganismos son muy pequeños, se requieren generalmente
tinciones biológicas para visualizarlos adecuadamente y demostrar el fino detalle de sus estructuras internas
y su morfología. En la coloración de Gram el Cristal Violeta actúa como colorante primario o básico, que se
une a la pared celular bacteriana, luego de un tratamiento con una solución débil de lugol (Mordiente).
Algunas especies bacterianas debido a la naturaleza química de sus paredes celulares, poseen la capacidad
de retener el colorante primario o básico (Cristal Violeta), luego de una decoloración con una mezcla de
alcohol y acetona o con alcohol al 95 %. Tales bacterias se denominan Gram positivas. Las bacterias Gram
negativas, debido a su mayor contenido lipídico en su pared celular, pierden la coloración primaria (Cristal
Violeta) cuando son tratadas con el decolorante y por lo tanto deben tomar el colorante secundario o de
contraste que es la Fucsina o Safranina. Las bacterias Gram negativas aparecen de color rosadas o rojas
vistas al microscopio y las bacterias Gram positivas aparecen de color violeta purpúreo.
1.1 Fundamento de la coloración de Gram:
Este método divide las bacterias en dos grupos: Gram positivos y Gram negativas. Al colocar los agentes
como cristal violeta o violeta de genciana y añadirles una solución lugol, se combinan con algunos
componentes de la celular bacteriana que son retenidos por la membrana citoplasmática cuando se
tratan con alcohol acetona; otros, en cambio liberan rápidamente el colorante, por lo que no aparecerán
a la visión microscópica a no ser que se contrasten con algún otro tinte biológico como safranina o
fucsina. Por lo tanto los microorganismos que conservan el cristal violeta o violeta de genciana se
observa de violeta Gram positivo y los que no lo hacen Gram negativos muestran un color que
corresponde al colorante de contraste de color rosado.
1.2 Integridad de la Pared Bacteriana
Si bien se ha demostrado que la pared no toma el colorante, desempeña un importante papel en el

equilibrio de pasaje y retención del colorante primario (Cristal Violeta). Se ha observado que las células
mutiladas en su pared no se tiñen por el Gram y pese a ser Gram positivas, aparecen como Gram
negativas. La pared intacta constituye una barrera importante para la elusión del colorante por el alcohol.
Las células Gram positivas y Gram negativas acumulan el colorante primario por medio de un eslabón
iónico entre los grupos básicos del colorante y los grupos ácidos de la célula.
1.3 Intervención de los componentes químicos:
Es muy probable que la composición química y la permeabilidad de la bacteria, intervengan en la

diferenciación del Gram. Los lípidos, polisacáridos, ácidos grasos, nucleoproteínas y ciertos ésteres
fosfóricos, intervienen en la coloración. La presencia de mucopéptidos en las Gram positivas y de mayor
cantidad de lípidos en las Gram negativas, podrían ser factores para tener en cuenta. En las Gram
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negativas los lípidos serian disueltos en gran parte por el alcohol, facilitando la salida del colorante
primario.
1.4 Importancia de Otros Componentes:
a. Lugol: actúa penetrando en ambos tipos de bacterias, formando un precipitado Cristal Violeta-
Yodo.
b. Alcohol-acetona: es en esta etapa donde realmente tiene lugar la diferenciación. En las Gram
negativas, el alcohol no encuentra obstáculos en las capas bacterianas y disuelve o disocia
el precipitado Cristal Violeta-Yodo, el que puede fácilmente escapar al exterior. Las bacterias
Gram negativas al perder el compuesto Cristal Violeta-Yodo, quedan libres, y pueden tomar
el colorante secundario o de contraste (Fucsina o Safranina) y aparecer de color rosado o
rojo. En las Gram positivas, el alcohol atraviesa con dificultad las capas bacterianas debido a
la deshidratación que produce y reduce los poros de la pared.
c. En consecuencia, la disolución del precipitado Cristal Violeta-Yodo se efectúa lentamente, y

el proceso de arrastre tiene lugar aún con mayor lentitud. Por lo tanto, después de transcurrido
el tiempo usual de decoloración, la mayor parte del precipitado Cristal Violeta-Yodo se queda
en las células y estas pueden observarse en el microscopio de color violeta purpúreo.
2. COMPETENCIA (S).-
 Analiza el fundamento de la tinción de Gram, para la solución de problemas en el campo de trabajo
del profesional.
 Interpreta los resultados de la coloración de Gram, reconociendo la morfología y características
tintoriales de los diferentes microorganismos.
 Reconoce la importancia de la tinción de Gram en la práctica médica diaria.

o Microscopio
o Portaobjetos
o Hisopos de algodón
o Mechero de alcohol
o Colorantes de Gram (Cristal Violeta, Lugol de Gram, Alcohol-Acetona y safranina)
o Frasco lavador
o Varillas para coloración
o Aceite de inmersión
o Baja lengua
o Láminas coloreadas
.
 Preparar un extendido fino en portaobjetos y dejarlo secar al aire
 Fijar el material al portaobjetos de manera que no sea arrastrado durante el proceso de tinción,
pasando el portaobjetos 3 o 4 veces por la llama de un mechero de alcohol. El calor del portaobjetos
debe ser tolerado por las manos del operador.
 Colocar el preparado sobre un soporte de tinción y cubrirlo con Cristal Violeta por 1 minutos.
 Lavar con agua a chorro débil.
 Recubrir la preparación con Lugol de Gram y dejar por 1 minutos.
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 Bañar la superficie del portaobjetos con alcohol de 95 % o con Alcohol-Acetona por 30 segundos.
 Lavar con agua a chorro débil hasta que la decoloración sea total, es decir que no escurra más
alcohol coloreado.
 Cubrir la preparación con safranina por 1 minuto.
 Dejar secar.
 Observar al microscopio con lente de inmersión (100X)

El estudiante anotara los resultados y compara con tablas de referencia
7. CUESTIONARIO.-
1. Complete el siguiente esquema:

PASOS METODO GRAM (+) GRAM (-)
1. Colorante básico
1. Mordiente
2. Decolorante
4. Colorante de
contraste
2. Llenar el siguiente cuadro

Género Morfología Gram habitad
Staphylococcus aureus
Streptococcus
pneumoniae
Neisseria meningitidis
Bacillus cereus
Escherichia coli
Clostridium perfringens
Staphylococus epidermidis
Klebsiella ozaenae
Enterobacter aerogenes
Corynebacterium
diphtheriae
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UNIVERSIDAD PRIVADA DEL VALLE

SERVICIOS DE LABORATORIO
LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA I
PRÁCTICA NO. 3
ESTERILIZACIÓN Y PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO
CULTIVO DE MICROORGANISMOS
1. CONOCIMIENTO TEORICO REQUERIDO:
ESTERILIZACIÓN: Es un proceso por el que se eliminan todas las formas de vida microbiana (Microorganismos
patógenos y no patógenos), incluso las esporas bacterianas, se logra por medios físicos y químicos (Óxido de
Etileno).
Aire caliente
Esto se realiza en los Hornos Pasteur a temperaturas superior a los 180ºC por hora y media. Se pueden
esterilizar pipetas, varillas de vidrio, espátulas de vidrio, material metálico como tijeras, pinzas, polvos
termoestables, etc.
Ebullición
Tomar un recipiente y llenar con agua, proceder a colocar el material que se desee esterilizar ejemplo:
agujas y jeringas de vidrio, pinzas, mangos de bisturí, etc.
Dejar hervir el agua por 30 minutos. Posteriormente apagar y dejar enfriar.
Pasteurización
Este método fue descubierto por Louis Pasteur en 1860 y se emplea para algunos líquidos termolábiles que
no se pueden someter a temperaturas elevadas porque el calor desnaturaliza sus componentes. Este método
de utiliza para disminuir el número de microorganismos patógenos. La temperatura y el tiempo de
pasteurización dependen del microorganismo patógeno más resistente que se quiera destruir. Se emplea
principalmente para lácteos, jugos y cerveza
Tindalización
Se conoce como la esterilización fraccionada y consiste en aplicar temperaturas correspondientes a 90ºC
y 100ºC por un tiempo, luego incubar y al día siguiente otra vez el mismo proceso. Esto se realiza tres
veces.
Uso de radiaciones
Se utiliza radiación U.V y radiación ionizante como por ejemplo: la gamma. La radiación U.V puede ser letal
sin embargo no atraviesa eficazmente el vidrio debido a esto se lo utiliza en pocas situaciones; como en
lámparas que se puede colocar en una habitación o en una campana de seguridad biológica. Se debe tener
cuidado en el manejo de radiación U.V.
La radiación gamma es excelente porque penetra profundamente los objetos, con esta radiación se pueden
esterilizar en frío antibiótico, hormonas, suturas, jeringas de plástico.
Filtración
Se emplea cuando la sustancia a esterilizar son alteradas en sus propiedades físicas y químicas si son
sometidas a la acción del calor. Por ejemplo: Enzimas, Toxinas bacterianas, etc.
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Óxido de Etileno
Es un gas reactivo, inflamable, incoloro, se combina con el agua dando etilenglicol (Producto toxico). Tiene
gran poder de penetración y no produce calor por lo que se pueden esterilizar materiales plásticos. Como es
muy toxico luego de su ciclo de esterilización se debe dejar el material esterilizado airear en cámara por 8
horas antes de ser empleado.
METODOS DE ESTERILIZACION
Incineración
Flama directa
Calor seco
(fuego)
Aire caliente
(estufa)
Vapor de agua
Ebullición
Calor húmedo
Metodos fisicos
Pasteurización
Tindalización
Rayos UV
Radiaciones
Rayos Gamma
Filtración
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Métodos químicos Oxido de etileno
CONTROLES DE ESTERILIZACION
Estos controles son necesarios para cerciorarnos de la correcta esterilización del material:
 Controles Físicos: Son los más simples y menos precisos. Ej: Termómetro, Manómetro, Reloj.
 Controles Químicos: Son más precisos. Son cintas que cambian de color con la correcta esterilización.
 Controles Biológicos: Son los más exactos, pero lleva más tiempo realizarlos. Son bolsas selladas que
contienen microorganismos. Estas bolsas se colocan conjuntamente con el material a esterilizar, y luego
de finalizado el proceso de esterilización se cultivan.
MEDIOS DE CULTIVO
Un medio de cultivo es un sustrato o solución de nutrientes en condiciones ambientales adecuadas en los

que crecen y se multiplican los microorganismos in vitro con el objeto de aislarlos, identificarlos y poder
realizar otros estudios complementarios.
Constituyentes de los Medios de Cultivo:
Los medios de cultivos están compuestos por:
 Base de amino-nitrógeno (proteína digerida. Ej. Peptona)

 Factores de crecimiento. Ej. Sangre, suero, extracto de levadura
 Sales para tamponamiento. Ej. Fosfato, citrato
 Fuente de energía. Ej. Azúcares e hidratos de carbono
 Sales minerales. Ej. calcio, magnesio, hierro
 Agentes selectivos. Ej. Colorantes, antimicrobianos
 Indicadores. Ej. Rojo fenol
 Agentes gelificantes (para los medios sólidos). Ej. Agar
Clasificación de los Medios de Cultivo:
a. Medios Enriquecidos: Favorece el crecimiento de un determinado tipo de microorganismo, sin

llegar a inhibir totalmente el crecimiento del resto
Agar Sangre (AS): Permite el crecimiento de Gram (+) y (-) y permite observar el tipo de
hemólisis. Sirve para: Estreptococos, Estafilococos, Haemophillus influenzae, Gardnerella
vaginalis.
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Agar Chocolate (AC): Este medio es más rico en nutrientes que el anterior y resulta adecuado
para el cultivo de organismos delicados, por ejemplo Estreptococos.
Müller Hinton (MH): Es utilizado para antibiogramas porque desarrollan tanto Gram (+) y (-).
b. Medios Selectivos: Permiten el crecimiento de un determinado tipo de microorganismos,

inhibiendo el desarrollo de los demás
Mac Conkey (Mac): Útil para Enterobacterias
Medio de Cisteina y Lactosa deficiente en electrolitos (CLDE):Para bacterias patógenas en

orina.
Azul de Metileno (AME): Los tres son selectivos para Enterobacterias, contienen lactosa y un
indicador, por lo tanto permiten la diferenciación entre gérmenes que fermentan y que no
fermentan la lactosa, una reacción importante para la identificación de las Enterobacterias.
Salmonella- Shigella (S-S): Para desarrollo de Salmonella o Shigella.
Thayer Martin (TM): Para desarrollo de Neisseria Gonorrhoeae y Neisseria Meningitidis.
Agar sangre con Violeta Cristal: Sirve para la diferenciación de Estreptococos cuando en la
muestra pueden existir otros gérmenes.
c. Medios Para Microorganismos Anaerobios:
Caldo de Tiogliconato:
Caldo para Anaerobios delicados (CAD): Ambos medios contienen agentes reductores que
ayudan a mantener el estado anaerobio .sirven para Clostridium.
d. Medios Especiales: Son aquellos en los que se ponen de relieve propiedades que un
determinado tipo de microorganismo posee.
Sabouraud (Sap): Este medio tiene pH bajo que facilita el desarrollo de hongos e inhibe el
desarrollo de la mayoría de las bacterias.
Lowenstein Jensen y Middlebrook: Ambos medios contienen glicerol y verde malaquita

constituyentes que favorecen el crecimiento de la Micobacterias como el Mycobacterium
tuberculosis.
Agar con Tiosulfito, Citrato, Sales Biliares y Sacarosa (TCBS): Para desarrollo de Vibrio
cholerae.
e. Medios de Identificación y/o Pruebas Bioquímicas:

Kligler o TSI (agar triple, azúcar, hierro): Sirve para observar la fermentación de azúcares y
producción de ácido sulfhídrico.
Urea: Para observar la utilización de urea.
Citrato: Para ver la utilización de citrato.

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Indol: Para observar el uso de triptófano.
Fenilalanina: Para ver la utilización de fenilalanina.
f. Medios de Transporte:
Stuart: Para transportar las muestras hasta el laboratorio.
2. COMPETENCIA(S)
 Identifica las características de esterilización, métodos físicos como calor seco, calor húmedo y su
uso en el campo de trabajo profesional
 Identifica la composición, esterilización y clasificación de los medios de cultivo y su relación en el
campo de trabajo del profesional.
 Aplica el métodos esterilización por presión de vapor para la esterilización de los medios de
cultivo
3. MATERIAL, REACTIVOS
 Autoclave de Chamberland
 Mechero Bunsen
 Cajas Petri
 Papel madera o papel sábana
 Hilo de caña
 Pipetas
 Tubos de ensayo
 Algodón
 Mechero de Bunsen
 Frasco lavador
 Balanza
 Probeta
 Algodón
 Estufa de esterilización
 Papel aluminio
 Frascos Scott 250 - 500 ml
 Agar Mac Conkey
 Agar Müller Hinton
 Agar Kligler
 Agar EMB
 Agar citrato de Simmons
 Agar SIM
 Jeringas
 Ligaduras
 Alcohol
4. TÉCNICA O PROCEDIMIENTO
 Trabajo en grupos pequeños

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 Flama directa
La flama directa empleada para esterilizar el asa bacteriológica, se flamea con un mechero de alcohol o Bunsen,
hasta que el filamento del asa tome color Rojo vivo. De atrás hacia delante.
Calor húmedo
Para esto se utiliza el autoclave.

Se debe colocar agua en el fondo de la caldera. Acomodar el material en la cesta metálica. Adaptar la tapa y
ajustar los tornillos para asegurar el cierre hermético del autoclave. Verificar si el orificio de escape está abierto.
Encender el autoclave y calentar hasta la salida de un chorro continuo de vapor de agua por la válvula de
escape, (para eliminar el aire residual). Cerrar la válvula de escape.
Cuando se alcance la Temperatura deseada por ejemplo 121ºC, regular la temperatura del autoclave,
manteniendo la misma por 15 a 20 minutos. Concluida la esterilización, apagar el autoclave y dejar enfriar
espontáneamente. Esperar que la presión del manómetro marque 0. Abrir la válvula de escape para asegurarse
de que no hay presión en el autoclave.
Abrir el autoclave y retirar el material esterilizado. Dispensar los medios de cultivo en el material de laboratorio.
En autoclave se pueden esterilizar: material de vidrio, materiales metálicos, medios de cultivos, sustancias
oleosas liquidas, pijamas médicos, hisopos de algodón, etc.
PRECAUCION
No abrir nunca la válvula de escape del autoclave antes de que enfríe, porque la presión elevada podría
proyectar la tapa y el agua caliente hasta el exterior, con riesgo para el operador, además los líquidos podrían
entrar en ebullición expulsando los tapones de algodón y mojarlos.
PREPARACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.-

En la actualidad, la mayoría de los medios de cultivo se encuentran comercializados, normalmente bajo la forma
de liofilizados que es preciso rehidratar. En general, la preparación de un medio de cultivo se reduce
simplemente a pesar la cantidad deseada del mismo y redisolverla en agua destilada (libre de inhibidores del
crecimiento microbiano) siguiendo las instrucciones del fabricante.

El estudiante registrara en una tabla las características de cada medio preparado.
7. CUESTIONARIO
1. ¿De qué forma se esterilizarían mejor los siguientes materiales

MATERIAL MÉTODO DE TIPO DE OTROS
ESTERILIZACIÓN CALOR-TIEMPO (ESPECIFIQUE)
Pipeta vidrio
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Caja petri de vidrio

Medios de cultivo
solido
Guantes
Jeringas desechables
Ropa quirúrgica
Pinzas quirúrgicas
tijeras
Hojas de bisturí
Mango de bisturí
Asa bacteriológica
Sala de quirófano
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PRACTICA Nº 4
CULTIVO DE MICROORGANISMOS Y SIEMBRA

METABOLISMO MICROBIANO
Las bacterias y los hongos crecen en la superficie de medios nutrientes sólidos, para producir colonias
compuestas por miles de células procedentes de una sola célula implantada en la superficie del agar. Las
colonias de las diferentes especies tienen con frecuencia aspectos característicos, que pueden proporcionar un
indicio sobre su probable identidad. Las colonias de la mayoría de las especies tardan de 12-48 horas en
hacerse visibles a simple vista, pero algunos organismos se multiplican con mucha más lentitud y pueden
requerir varias semanas para producir colonias visibles. Los cultivos se pueden hacer también en medios
líquidos (caldo) y el crecimiento se detecta por desarrollo de turbidez. Sin embargo, no es posible saber si existe
más de una especie en un cultivo líquido, ni si existen pocos o muchos organismos y, por tanto, los medios
sólidos tienen más utilidad en microbiología diagnóstica. Es posible cultivar la mayoría de las especies de
bacterias y hongos con importancia médica en medios artificiales, pero no existe un medio de cultivo universal
que permita el desarrollo de todas ellas, y hay algunas especies que solo pueden cultivarse en animales de
experimentación, por ejemplo, Mycobacterium leprae y Treponema pallidum. Ciertas bacterias imposibles de
cultivar en medios artificiales, por ejemplo, las clamidias y las rickettsias, crecen en cultivos de células. Muchos
medios de cultivos están diseñados no sólo para prestar soporte al crecimiento de los organismos deseados,
sino también para inhibir el crecimiento de los demás, es decir, son medios selectivos.
El cultivo es el proceso de proliferación de microorganismos al proporcionarles un entorno con condiciones

apropiadas. Los microorganismos en proliferación producen réplicas de sí mismos y necesitan los elementos
presentes en su composición química. Los nutrientes deben proporcionar estos elementos en una forma que
sea accesible desde el punto de vista metabólico. Además, los microorganismos requieren energía metabólica
para sintetizar macromoléculas y mantener gradientes químicos esenciales a través de sus membranas. Los
factores que deben controlarse durante la proliferación incluyen nutrientes, pH, temperatura, aireación,
concentración de sales y fuerza iónica del medio.
TÉCNICAS DE SIEMBRA.-
La siembra del material en los medios de cultivo puede hacerse por distintas técnicas:
Agar inclinado
En tubo Pruebas bioquímicas
Pico de flauta
En superficie Barrido con hisopo Antibiograma
En placa Agotamiento por estrías Recuento de colonias
Siembra con pipeta Aislamiento
En tubo Punción o Picadura Pruebas bioquímicas

En profundidad
En placa Siembra con pipeta Recuento de colonias
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2. COMPETENCIA (S):
 Realiza los diferentes tipos de siembra que se presentan en el campo de trabajo profesional.
 Aplica la metodología para realizar un cultivo bacteriológico de una muestra biología
o Placas con medios de cultivo preparados

o Estufa de cultivo
o Asa bacteriológica
o Aguja bacteriológica
Trabajo en grupos de 5, sembrando en los medios de cultivo y cultivando por 24 a 48 h.
Lectura de las placas cultivadas
Inoculación Por Estría en la Placa de Agar:
a. Flamear el asa bacteriológica hasta la incandescencia en el mechero Bunsen, manteniéndola

verticalmente y dejar enfriar.
b. Disponer la caja de Petri sobre la mesa de trabajo detrás del mechero con la tapa hacia abajo.
c. Quitar el tapón del tubo que contiene la muestra con el dedo meñique de la mano derecha.
d. Tomar con el asa bacteriológica una porción del espécimen.
e. Pasar la boca del tubo por la llama del mechero.
f. Colocar el tapón en el tubo que contiene la muestra.
g. Levantar el fondo de la caja y sostener con la mano izquierda.
h. Estriar con el asa cargada en la cuarta parte de la superficie del medio.
i. Girar la placa un cuarto de vuelta y estriar nuevamente arrastrando inicialmente la muestra tres
veces y realizando a continuación estrías perpendicularmente a la siembra anterior.
j. Girar nuevamente la base de la caja sobre la tapa.
k. Colocar nuevamente la base de la caja sobre la tapa.
l. Flamear el asa bacteriológica para esterilizar.
m. Incubar.
Inoculación en Medio de Cultivo en Tubo:
a. Flamear el asa bacteriológica como se describió anteriormente y dejar enfriar.

b. Quitar el tapón del tubo que contiene la muestra.
c. Flamear la boca del tubo en el mechero.
d. Tomar el tubo donde se va realizar la siembra y quitar el tapón.
e. Pasar la boca del tubo por la llama del mechero.
f. Introducir en el tubo de siembra el asa bacteriológica con la muestra hasta aproximadamente un cuarto
de la profundidad.
g. Flamear la boca del tubo en el mechero.
h. Tapar el tubo flamear el asa bacteriológica para esterilizar.
i. Incubar.
Nota: si el material ha sido tomado con hisopo, hacer rodar éste en un tercio de la superficie del medio de
cultivo y continuar como se describe. Trabajar abrasando la llama del mechero Bunsen.
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El estudiante registrara en una tabla las características de cada medio preparado.
7. CUESTIONARIO
1. Diga que medios de cultivo utilizaría para cultivar los siguientes microorganismos:
Agente etiológico enfermedades Medio Muestra

Staphylococcus
aureus
Neisseria
gonorrhoeae
Streptococcus
pyogenes
Salmonella typhi
Escherichia coli
Mycobacterium
tuberculosis
Clostridium tetani
Neisseria
meningitidis
Pseudomona
aeroginosa
Giardia lamblia
2. Llene la siguiente tabla:

Muestra biológica Medio
Heces con sospecha de cólera
Sangre con sospecha de salmonella
Aspirado traqueal
Secreción faríngea
Secreción de herida postquirúrgica
(paciente que recibe ciprofloxacina y
ceftriaxona)
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PRACTICA Nº 5
FLORA NORMAL DEL CUERPO

PATOGENIA BACTERIANA- FLORA NORMAL DEL CUERPO
La población comensal normal de microorganismos participa en la metabolización de los productos

alimentarios, proporciona factores esenciales para el crecimiento, protege frente a las infecciones
provocadas por gérmenes de alta virulencia y estimula la respuesta inmunitaria. En ausencia de estos
microorganismos, la vida tal como la conocemos sería del todo imposible.
La flora microbiana presente tanto en la superficie como en el interior del organismo humano se encuentra
en un continuo estado de flujo determinado por factores diversos como edad, dieta, estado hormonal, estado
de salud e higiene personal. Mientras que el feto humano se desarrolla en un ambiente estéril y protegido,
el recién nacido se ve expuesto a microorganismos procedentes tanto de la madre como del
medio ambiente. Lo primero que colonizan los microorganismos es la piel del lactante, seguida de la
bucofaringe, el aparato digestivo y otras mucosas. Asimismo, esta población de microorganismos
experimenta cambios continuos durante toda la vida de una persona. Los cambios del estado de salud
también pueden alterar de forma espectacular el delicado equilibrio que existe entre el ser humano y los
microorganismos heterogéneos que subsisten en su interior. Por ejemplo, la hospitalización de un paciente
puede hacer que microorganismos normalmente no virulentos de la bucofaringe sean sustituidos por bacilos
gramnegativos (p. ej., Klebsíella, Pseudomonas) que invaden los pulmones y producen la aparición de una
neumonía. De igual modo, la proliferación de Clostrídium difflcile en el aparato digestivo se encuentra
controlada por las bacterias presentes en el intestino.
La comprensión de la microbiología médica exige conocer no sólo las diferentes clases de microorganismos
existentes, sino también su predisposición a causar enfermedades. Unas pocas infecciones se deben a
patógenos estrictos, es decir, microorganismos que se asocian siempre a enfermedad en el ser humano.
Algunos ejemplos de patógenos estrictos y la enfermedad que provocan son Mycobacte-ríum tuberculosis
(tuberculosis), Neisseria gonorrhoeae (go-norrea), Francisella tularensis (tularemia) y otros.
2. COMPETENCIA (S)
 Identifica la flora normal presente en la piel y mucosas

 Determina la importancia de la flora normal del cuerpo
 Diferencia la flora normal de la patógena

Muestra de secreción faríngea
Colorantes de Gram
Trabajos en grupos de 5 estudiantes para realizar una tinción de Gram y observar la flora normal de la
faringe

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6.MEDICION, CALCULOS Y GRAFICOS
El estudiante elaborara un cuadro comparativo de lo observado
7. CUESTIONARIO
1.- llene el siguiente cuadro
Microorganismo Flora normal del Que lugar del

cuerpo Si o No cuerpo
Staphylococcus
epidermidis
Peptostreptoccus
Corynebacterium
Enterococcus
Difteroides
Fusobacterium
Candida albicans
Escherichia coli
Enterobacter
Neiserria
Staphylococcus
aureus
Propionobacterium
Neisseria
meningitidis
Acinetobacter
Streptococcus alfa
hemoliticos
Mycoplasma
Moraxella catarrhalis
Streptococcus
pyogenes
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PRÁCTICA Nº 6
SEMINARIO DE ANTIMICROBIANOS
QUIMIOTERAPIA ANTIMICROBIANA

Las enfermedades infecciosas, por su número, severidad y frecuencia, constituyen una prioridad de salud en
Latinoamérica y en particular en Bolivia. Los avances en este campo son constantes. En las últimas décadas
se han descubiertos o reconocido nuevos patógenos capaces de producir severas infecciones. Nuevas
alternativas terapéuticas han sido desarrolladas introducidas a la práctica cotidiana incluyendo múltiples
antimicrobianos y vacunas. Sin embargo, el entusiasmo generado por dichos avances ha sido por fuerza
moderado por la aparición de cepas multiresistentes y aparición de enfermedades como el SIDA para la cual no
existe tratamiento curativo.
Por la aparición de resistencia, la mortalidad y morbilidad van en aumento. Es por ello que de este proceso de
rápido cambio, emerge la necesidad de actualizar los conocimientos médicos en infectología en forma casi
constante
2. COMPETENCIA (S)
 Clasifica a los antimicrobianos de acuerdo a su mecanismo de acción

 Indica el uso de los principales antimicrobianos que se presentan en la resolución de problemas
3. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS.-
 Data display
 Discusión en grupos pequeños.

El estudiante registrara en una tabla los antimicrobianos más empleados
7 CUESTIONARIO
1.- Llenar el siguiente cuadro:
Enfermedad Agente etiológico primera elección Segunda

elección
Faringitis
Meningitis
Osteomielitis
Pielonefritis
Gonorrea
Fiebre tifoidea
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Gastroenteritis
Tuberculosis
Acné
Septicemia
2. Investigue el esquema de antibióticos de elección en el tratamiento de la meningitis bacteriana en niños,

mencione el tratamiento de acuerdo con agente etiológico (neumococo, meningococo, tuberculosis, H.
influenzae)
3. Antibiótico de elección para Salmonella Tiphy aislada de un hemocultivo.
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PRÁCTICA Nº 7
PRUEBA DE SENSIBILIDAD A LOS AGENTES ANTIMICROBIANOS

QUIMIOTERAPIA ANTIMICROBIANA
Una vez aisladas las bacterias en cultivo puro es posible determinar su sensibilidad o resistencia a los
antibióticos en el laboratorio. Eso se suele hacer exponiendo una cepa de los organismos sometidos a
prueba, sembrados en una placa de agar, a los antibióticos contenidos en discos de papel de filtro. Durante
la incubación por 18 a 24 horas, los organismos crecen y se multiplican, y los antibióticos difunden desde
los discos e inhiben el crecimiento alrededor del disco
Esta prueba está basada en la inhibición del crecimiento de un microorganismo en la superficie de un medio
de cultivo inoculado alrededor de un disco de papel de filtro impregnado con un agente antimicrobiano. El
germen aislado se siembra en un medio de cultivo cuya composición asegura el desarrollo óptimo del
microorganismo y no interfiere con la acción del antibiótico, se pone en contacto con discos de papel de filtro
impregnados con agentes antimicrobianos en concentraciones ya establecidas y se miden los diámetros de
las zonas de inhibición del desarrollo del microorganismo. Los tamaños de las zonas se comparan con las
tablas de referencia llamadas CLSI (clinical and laboratory standards institute actualizado), y los resultados
se registran como: S (susceptible o sensible), I (intermedio) o R (resistente).
2. COMPETENCIA (S)
 Interpreta y analiza la repuesta de los microorganismos a los antimicrobianos a través de la resolución

de problemas en relación con su contexto.
 Determina la importancia del antibiograma en el análisis microbiológico y su aplicación en el tratamiento.
 Selecciona en antibiótico más adecuado de acuerdo con los resultados de un antibiograma, a través de
la resolución de problemas en relación con su contexto.
o Placas de Petri
o Agar Müller Hinton
o Discos para Antibiogramas
o Estufa de cultivo
o Pipetas
Preparación del inóculo:
La cepa se obtiene de la placa original donde se sembró el material problema. La colonia aislada se
suspende en solución fisiológica de manera de obtener una turbiedad final equivalente al 0,5 de la
escala de Mac Farland, es decir, 150 millones de gérmenes por ml
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Preparación de la placa:
Antes de la siembra la placa deberá estar a temperatura ambiente.

Siembra en placa:
Por escobilladura: Se distribuye el material uniformemente en tres direcciones, con hisopo de algodón
previamente mojado en el inóculo y eliminado el exceso de caldo por presión contra las paredes del
tubo.
Aplicación de los Discos:
Se los coloca sobre la superficie, oprimiéndolos suavemente contra ella. La distancia que separe los
discos debe ser suficiente para impedir una superposición de los halos de inhibición, y nunca será
inferior a 1,5 cm del borde de la placa.
Incubación:
Debe ser de 18 a 24 horas a 37 C, colocada la cápsula en posición invertida. Dependiendo del tipo
de bacteria identificada.
Lectura e Interpretación de los Resultados:
Con una regla se miden los halos de inhibición al milímetro más cercano, recurriéndose luego a la tabla
correspondiente para determinar si el germen es sensible, resistente o intermedio para cada antibiótico.
Así cepa sensible es aquella que, después de ser tratada en el curso de una infección general a las
dosis habituales del antibiótico, responde favorablemente al tratamiento, cepa intermedia es la que en
las mismas condiciones necesita dosis superiores a las habituales para obtener una respuesta
terapéutica adecuada y cepa resistente es la que en las condiciones antedichas no se obtiene ninguna
respuesta terapéutica.
5. . TIEMPO DE DURACION DE LA PRÁCTICA


Medición de los halos de inhibición y comparación con tablas de referencia
7. CUESTIONARIO.-
Interprete los resultados de los siguientes antibiogramas comparándolos con la tabla que aparece al final e
indique el tratamiento antimicrobiano adecuado:
1. Paciente femenino de 24 años, se solicita urocultivo el cual reporta crecimiento de Escherichia coli, el
antibiograma:
 Trimetoprim y Sulfametoxazol: Resistente

 Ceftriaxona: Sensible
 Ampicilina: Resistente
 Gentamicina: Sensible
 Acido Nalidixico: Sensible
 Amikacina: Sensible
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 Nitrofurantoína: Sensible
¿Que antibiótico elige? Debe justificar su elección ( vía de administración, costo, toxicidad, etc)
2. Paciente masculino de 18 años, en un coprocultivo se Salmonella tiphy , el antibiograma reporta:
 Trimetoprim y Sulfametoxazol: Resistente

 Cloranfenicol: Sensible
 Gentamicina: Sensible
 Ampicilina: Resistente
 Ciprofloxacina: Sensible
 Amoxicilina- acido clavulanico: Sensible
¿Que antibiótico elige? Debe justificar su elección (vía de administración, costo, toxicidad, etc.)
El paciente le solicita que como antibiótico de gentamicina, porque lo tiene en su casa usted que le respondería?
3. Paciente femenino de 9 años, con faringoamigdalitis, refiere 3 episodios al año. Solicita estudio de
secreción faríngea: especie encontrada Streptococcus pyogenes, el antibiograma reporta:
 Penicilina: sensible
 Eritromicina: sensible
 Cefalexina: sensible
 Vancomicina: sensible
¿Cree usted que está justificado un antibiograma en este caso, porque?

¿Cuál es la conducta que seguiría con su paciente?
4. Paciente femenino de 28 años, embarazada. Muestra de flujo vaginal, reporta Enterococcus ssp
 Es necesario un antibiograma, por que?
 Que tratamiento indicaría?
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PRACTICA Nº 8
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE COCOS GRAM POSITIVOS

COCOS GRAM POSITIVOS
Los cocos Gram positivos son células esféricas que se tiñen fundamentalmente con colorantes derivados
de la anilina, se acumulan formando cadenas o racimos. Pertenecen a dos géneros: Staphylococcus y
Streptococcus. En las placas de agar sangre, éstos crecen formando colonias características específicas
que posibilitan la clasificación preliminar del género.
La capacidad de los Staphylococcus de producir una enzima llamada catalasa permite diferenciarlos de los
Streptococcus , que se caracterizan por ser catalasa negativa.
STAPHYLOCOCCUS.-
Este género es el responsable de la mayoría de las infecciones supurativas y de gran porcentaje de casos
de envenenamiento alimentario. Los más comunes en la patología humana son: St. aureus, St. Epidermidis,
St. Saprophyticus y St. Haemolyticus.
a. Muestras:
Heridas varias, en lesiones cerradas se recolecta por punción, en casos de meningitis LCR.
b. Examen Microscópico:
Se presentan como células esféricas, Gram positivas, agrupadas en racimos. Este examen es
presuntivo.
c. Cultivo:
Se realiza en Agar sangre donde producen hemólisis y en agar manitol. Se debe especificar para
que bacteria es el cultivo.
d. Prueba de Coagulasa:
Esta prueba se basa en la capacidad que poseen los estafilococos patógenos de producir la enzima
coagulasa que transforma el fibrinógeno en fibrina. Esta prueba es positiva si se forma una coagulo.
En un tubo se realiza una suspensión del germen y se agrega 1 ml de plasma citratado estéril y se
incuba a 37 C y se observa a la hora y a las 4 horas. Esta prueba sólo es positiva para St. Aureus.
e. Prueba de Catalasa:
Se realiza con un asa estéril con la que se recoge del centro de la colonia y se coloca sobre un
portaobjetos y se agrega una gota de peróxido de hidrógeno al 30% con pipeta estéril o gotero.
Observar la formación de burbujas, si hay burbujas es catalasa positiva y son Staphylococcus. Solo
confirma género.
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f. Resistencia a la Novobiocina:
Es para confirmar al St. saprophyticus, pues es el único que presenta resistencia a este agente
antimicrobiano.
STREPTOCOCCUS.-
Son células esféricas, Gram positivas, agrupadas es cadenas o en pares. Pueden producir distintos tipos
de hemólisis:
Estructura antigénica de estreptococo
Hemólisis: Se produce destrucción parcial de eritrocitos alrededor de las colonias, dando una coloración
verde-marrón en el medio agar sangre géneros
Hemólisis: Se observa una zona clara decolorada alrededor de la colonia en la placa de agar sangre por
destrucción total de eritrocitos
Hemólisis: No hay actividad hemolítica, hay falta de hemólisis
a. Muestras:
Nariz, garganta, lesiones de piel, LCR, esputo, secreción bronquial, etc.
b. Examen Directo:
Células esféricas u ovoideas dispuestas en cadenas, Gram positivos. Esto no permite diferenciar
especies patógenas de las no patógenas.
c. Cultivo:
Se realiza en agar sangre de carnero.
Prueba de susceptibilidad a la Bacitracina:
Se basa en la inhibición del crecimiento del germen por la Bacitracina que difunde desde discos
de papel de filtro. La prueba es utilizada para la identificación de Streptococcus beta hemolítico
del grupo A. (Streptococcus pyogenes)
Streptococcus pyogenes
Causa faringitis, escarlatina, pyoderma, erisipela, celulitis, fascitis necrosante, síndrome del shock
toxico estreptocócica, septicemia puerperal, linfangitis, neumonía, infecciones no supurativas fiebre
reumática y glomérulo nefritis.
Streptococcus pneumoniae:
Causa neumonía, otitis, sinusitis, bronquitis, meningitis y otros procesos. Es una célula esférica, Gram
positiva, lanceolada y agrupada en pares y en cadenas. Poseen una cápsula formada de polisacáridos
que permite una fácil tipificación con antisueros. Las muestras pueden ser: esputo, LCR, hisopado de
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oído, etc. Se cultiva en agar sangre dando colonias pequeñas, redondas y  hemolíticas. Para
diferenciarlo del Streptococcus viridans se realiza la prueba de Optoquina (utiliza discos de
Etilhidrocupreína) y la prueba de solubilidad en bilis (utiliza Deoxicolato de sodio).
Streptococcus viridans
Causa formación de abscesos en tejidos profundos, septicemia en pacientes neutropenicos,

endocarditis subaguda, caries dental, neoplasias del aparato digestivo, meningitis.
2. COMPETENCIA(S)
 Explica los procedimientos empleados para la obtención de muestras destinadas a la investigación de

Staphylococcus.
 Determina la importancia clínica de los cocos Gram positivos.
 Indica el fundamento de las pruebas bioquímicas utilizadas en el laboratorio para la identificación de
estos gérmenes.
 Indica tratamiento y profilaxis de las diferentes patologías producidas por estos microorganismos
3. MATERIALES,REACTIVOS Y EQUIPOS.-
o Laminas teñidas
o Peróxido de hidrógeno 30 %
o Plasma de conejo
o Colorantes de Gram
o Asas bacteriológicas
o Microscopio
o Discos de Novobiocina
o Discos de Bacitracina
o Agar sangre
o Portaobjetos
o Cajas petri
o Hisopos
o Baja lenguas
o Jeringas
o Agujas
o Algodón
o Alcohol
o Ligaduras
o Mechero bunsen
o Estufa de cultivo
 Trabajo en grupos pequeños.

 Observación al microscopio de las placas teñidas
 Realización de la prueba de la catalasa.
 Realización de la prueba de la coagulasa
5. TIEMPO DE DURACION DE LA PRACTICA

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6. MEDICION; CALCULOS Y GRAFICOS
El estudiante medirá los halos de inhibición y compara con tablas referencia

7. CUESTIONARIO.-
1. Enumere 5 enfermedades y tratamiento para Staphylococcus aureus.

2. Cite y explique los mecanismos de resistencia de Staphylococcus aureus.
3. Investigue la sensibilidad a los antimicrobianos actualmente de Staphylococcus aureus.
4. Enumere 5 enfermedades y tratamiento actual para Streptoccocus pyogenes.
5. Cite 3 fármacos para el tratamiento de neumonía neumococica.
6. Enumere 5 enfermedades y tratamiento para Streptococcus viridans.
7. Un frotis de LCR reporta diplococos gram positivos intracelulares lanceolados y abundantes PMN y MN,
¿Cuál sería sus sospecha diagnostica y posible tratamiento?.
8. Complete el siguiente cuadro:
Casos Antibiótico
Posible colonización de un catéter central en un
paciente con leucemia: Staphylococcus
coagulasa negativa.
Neumonía comunitaria: Streptococcus
pneumoniae y Haemophylus influenzae.
Bacteriemia polimicrobiana en un paciente con
absceso hepático al que todavía no se ha
practicado un drenaje quirúrgico: Enterococcus
faecalis y Bacilos aerobios.
Endocarditis aguda: Staphylococcus aureus
(oxacilino resistente)
Bacteriemia en una mujer joven con cistitis y
pielonefritis: Escherichia coli y Klebsiella oxytoca
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PRACTICA Nº 9
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE COCOS GRAMNEGATIVOS

COCOS GRAM NEGATIVOS
Los microorganismos integrantes del género Neisseria, son cocos que tienen forma característica de granos
de café o arriñonada. Las especies patógenas para el hombre son: Neisseria gonorrhoeae (gonorrea) y
Neisseria meningitidis (meningitis cerebro espinal).
Ambas especies de Neisserias son semejantes en su morfología, se encuentran de manera típica dentro de
los polimorfonucleares.
Estructura de N. gonorrhoeae, mostrando los pelos (fimbrias) y las tres capas de la envoltura celular.
(Tomado de Brooks y col.9).
NEISSERIA MENINGITIDIS.-
Los meningococos son aislados comúnmente de la garganta o nasofaringe de portadores asintomáticos.

Puede causar cuadros de meningococemia, siendo la meningitis la complicación más grave. Las muestras
que se obtienen son: nasofaringe, LCR. En el examen directo se observan diplococos lanceolados, Gram
negativos intra o extracelulares en los polimorfonucleares. Se cultiva en agar Thayer Martin. Se realiza la
prueba de Oxidasa que se basa en que los miembros del género Neisseria producen una enzima oxidasa
que en presencia del aire actúa sobre ciertas aminas aromáticas produciendo compuestos coloreados.
También se realiza la prueba de la fermentación de azúcares, que es importante cuando se desea confirmar
el diagnóstico. La Neisseria meningitidis fermenta la glucosa y la maltosa.
NEISSERIA GONORRHOEAE.-
El gonococo es el agente etiológico de la Gonorrea. La infección se contrae por regla general mediante
relaciones sexuales. Las complicaciones más frecuentes son: orquitis, epididimitis, cervicitis, proctitis, etc.
Las muestras obtenidas son las siguientes: en el hombre (secreción uretral, en los casos crónicos tratados
o asintomáticos es necesario un masaje prostático previo. Se puede recolectar el primer chorro de orina
matinal), en la mujer (secreción de uretra o endocervix). Dependiendo del hábito sexual del paciente también
se puede obtener muestra de: recto, ojo y garganta. En el examen directo se observan diplococos
lanceolados, Gram negativos, preferentemente intracelulares. El cultivo se realiza en agar Thayer Martin.
Son oxidasa positiva. Fermenta solamente la glucosa.
2. COMPETENCIA (S):
 Explica los procedimientos empleados para obtener muestras destinadas a la investigación de

Neisseria meningitidis y Neisseria gonorrhoeae.
 Determina la importancia clínica de los cocos Gramnegativos a través de la resolución de
problemas
 Indicara tratamiento y profilaxis de las diferentes patologías producidas por estos microorganismos
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o Laminas teñidas
o Diapositivas
o Peróxido de hidrógeno 30 %
o Plasma de conejo
o Microscopio
o Discos de Novobiocina
o Discos de Bacitracina
o Agar sangre
o Portaobjetos
o Cajas petri
o Hisopos
o Baja lenguas
o Jeringas
o Agujas
o Algodón
o Alcohol
o Ligaduras
o Mechero bunsen
o Estufa de cultivo
4. TECNICA O PROCEDIMIENTO.
 Observación al microscopio.

6. MEDICION, CALCULO Y GRAFICOS
El estudiante registrara las características de cocos Gram negativos y comparara con tablas de
Referencia
7. CUESTIONARIO
1. Como diagnostica una gonorrea (tipos de muestras y la observación microscópica en una infección
aguda y crónica).
2. Enumere 5 fármacos actuales para el tratamiento de la gonorrea
3. mencione los factores de riesgo y medidas preventivas para la gonorrea
4. ¿Cuáles son los agentes etiológicos de la meningitis?
5. Realiza un esquema de tratamiento para la meningitis y justifique
6. Un frotis de LCR reporta diplococos gram negativos intracelulares y abundantes polimorfonucleares
(PMN), ¿Cual sería sus sospecha diagnostica y posible tratamiento?.
7. Un frotis de secreción vaginal reporta diplococos gram negativos intracelulares sin polimorfonucleares.
¿Cual sería sus sospecha diagnostica y posible tratamiento?
8. Un frotis de secreción uretral reporta diplococos gram negativos intracelulares y abundantes PMN, ¿Cual
sería sus sospecha diagnostica y posible conducta?
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9. Mencione los antibióticos, medio de cultivo para realizar antibiograma y tratamiento para las siguientes
bacterias ( si corresponde)
a. S. Pyogenes aislado de secreción faríngea.
b. S, aureus aislado de un paciente con prótesis de rodilla.
c. S. pneumoniae aislado de líquido pleural en un niño de 3 años y que recibía ceftriexona.
d. N. meningitidis aislada de LCR en un paciente inmunodeprimido.
e. N. gonorrheae aislada de secreción uretral de un paciente de 50 años y que recibía hace 3 días atrás
azitromicina. Por que cree usted que recibía este antibiótico?.
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PRÁCTICA Nº 10
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM POSITIVOS

BACILOS GRAM POSITIVOS ESPORULADOS Y NO ESPORULADOS
Estos dos géneros pertenecen a la familia Bacillaceae que está formada por bacilos grandes y esporulados.
El esporo está formado por una parte central, rodeado de una capa de peptidoglucano y otra externa con
ácido dipicolínico. La mayoría son móviles, aunque hay especies inmóviles. Son aerobios facultativos y
anaerobios.
BACILLUS ANTHRACIS.-
La enfermedad que produce se denomina Carbunco y es una zoonosis (enfermedad transmitida por un
animal vertebrado al hombre). Se obtiene material de la zona vesiculosa de la pústula o por punción del
edema. Se efectúan extendidos, coloración de Gram y cultivos. La presencia de bacilos Gram positivos, en
cadenas y capsulados, nos da casi la seguridad de un diagnóstico positivo.
Son bacilos rectos, esporulados, Gram positivos, rodeados por una cápsula que puede envolver a un solo
bacilo, aunque lo más común es que rodee a varios. Es un germen de desarrollo fácil, no es exigente,
aerobio. Desarrolla en caldo nutritivo o agar nutritivo.
CLOSTRIDIUM TETANI.-
Es el agente etiológico del Tétano. Se obtiene material de las heridas y debe ser obtenido en profundidad
con jeringa o con hisopo cuidando la anaerobiosis. Son bacilos de lados paralelos y extremos redondeados,
Gram positivos, esporulado (la espora deforma la bacteria como palillo de tambor). Es un germen anaerobio
estricto. Se lo puede cultivar en agar sangre con tiogliconato, donde produce  hemólisis que luego pasa a
 hemólisis por la producción de tetanolisina.
CLOSTRIDIUM BOTULINUM:
Produce Botulismo. El material a cultivar puede ser: restos de alimentos y vómito del paciente intoxicado.
La toxina puede manifestarse por Hemoaglutinación pasiva o RIA. Son bacilos grandes aislados o en
cadenas cortas, ciliado, esporulado, Gram positivo, anaerobio. Su cultivo puede hacerse en: caldo nutritivo,
agar nutritivo en anaerobiosis
CLOSTRIDIUM PERFRINGENS.-
Es el agente etiológico de la Gangrena gaseosa debido a infecciones asociadas con heridas de accidentes
o post operatorios con complicaciones. También puede producir Intoxicaciones alimentarias por ingestión
de carne dando: diarrea, sin vómito ni fiebre que suele durar solo 1-2 días. Son bacilos gruesos, inmóviles,
capsulados, Gram positivos, no son anaerobios estrictos ya que pueden desarrollarse en presencia de
pequeñas cantidades de oxígeno.
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CLOSTRIDIUM DIFFICILE.-
Es el productor de Colitis Pseudomembranosa
2. COMPETENCIA (S)
 Indica que tipos de muestras recolectaría para las patologías producidas por estos microorganismos.
 Determina la importancia clínica de los bacilos Gram positivos en la resolución de problemas que se
presentan en el campo de trabajo del profesional.
 Establece tratamientos y profilaxis adecuados para las patologías producidas por estos
microorganismos.
3. MATERIALES Y REACTIVOS.
o Láminas teñidas
o Diapositivas
o Microscopio

 Observación al microscopio. De placas teñidas
 Observación de placas bacilos Gram positivos
5. DURACION DE LA PRACTICA
El estudiante registrara las características de bacilos Gram positivos y comparara con tablas de
Referencia
7. CUESTIONARIO.-
1. .- Llene el siguiente cuadro

enfermedad Agente etiológico Tratamiento prevención
2.- Resuelva casos clínicos planteados por el docente.

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PRÁCTICA Nº 11
IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM NEGATIVOS

BACILOS GRAM NEGATIVOS FERMENTADORES
Los bacilos Gram negativos pertenecientes a la familia de la Enterobacterias son los microorganismos que
con más frecuencia se hallan en el laboratorio de microbiología clínica. No son esporulados, pueden ser
móviles o no, reducen los nitratos a nitritos, son oxidasa negativa. Como su nombre lo indica, miembros de
este grupo son naturales del tracto gastrointestinal sin embargo, las Enterobacterias se pueden recuperar
de todos los sitios anatómicos. La morfología observada por la coloración de Gram no es útil para separar
a las Enterobacterias de otros microorganismos Gram negativos, ni para identificar la especie. La
clasificación está basada en la determinación de la presencia o ausencia de diferentes enzimas. Los
sustratos sobre los que estas enzimas actúan son incorporados al medio de cultivo, junto con un sistema
indicador que detecta ya sea la utilización del sustrato o la presencia de productos metabólicos específicos.
Todos los miembros de la familia Enterobacteriaceae exhiben las siguientes características bioquímicas:
a. Metabolizan la glucosa por fermentación.

b. Carecen de actividad de la citocromo-oxidasa (son oxidasa negativa).
c. Reducen los nitratos a nitritos.
En cuanto a la selección de los medios de cultivo se pueden elegir:
a. Agares de aislamiento primario: Mac Conkey y EAM, todos estos medios contienen en general
peptona, lactosa y un indicador de pH.
b. Agares de aislamiento selectivo: Salmonella-Shigella, CLDE y Agar sulfito de bismuto. Los medios
se hacen selectivos agregándoles a sus fórmulas inhibidores
c. Agares de enriquecimiento: Caldo de selenito. Se utilizan para acrecentar el desarrollo de
ciertas especies bacterianas inhibiendo el de los microorganismos superfluos.
Pseudomona
a. Bacilo Gram negativos, se dispone en pares.

b. Móviles, no esporulados.
c. Distribuyen ampliamente en suelo, agua, plantas, animales, materia orgánica en descomposición, en
la vegetación
d. Medio ambiente hospitalario reservorio húmedo como alimentos, sumideros, equipo de terapia
respiratoria, soluciones desinfectantes, equipos de diálisis.
e. Medios de cultivo produciendo olor dulzor semejante a jugo de uva o de maíz, formando colonias
redondas y lisas de color verde fluorescente
f. Oxidasa positivo. Aerobios, crecen a 37ºC.
g. Pigmentos: piocianina (azul), fluoresceína ( Amarillo), pioverdina (verde amarillento), piorrubina (pardo
rojizo), piomelanina(negro)
34
2 COMPETENCIA (S):
 Indica que tipos de muestras recolectaría para las patologías producidas por estos microorganismos.
 Determina la importancia clínica de los bacilos Gram positivos y Enterobacterias a través de la
resolución de problemas
 Interpreta adecuadamente un informe microbiológico sobre dicho grupo bacteriano y su relacon con el
campo de trabajo del profesional
 Establece tratamientos y profilaxis adecuados para las patologías producidas por estos
microorganismos.
3 MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS.
o Láminas teñidas
o Diapositivas
o Agar Mac Conkey
o Agar EMB
o Portaobjetos
o Placas de Petri
o Microscopio
o Enteropruebas
4 TECNICA O PROCEDIMIENTO
Cultivo de orina, heces, líquidos orgánicos, heridas.
Identificación bioquímica:
a. Kligler o TSI:
Esta prueba sirve para ver la acción de las Enterobacterias sobre los azúcares, el azufre de los
aminoácidos y la producción de gas. La aparición de coloración amarilla tanto en profundidad como
en superficie indica que el microorganismo fermenta la lactosa, la aparición de color rojo en la
superficie y amarillo en profundidad indica que el microorganismo no fermenta la lactosa.
b. Test de Urea: Sirve para ver la presencia de ureasa. Color púrpura indica una prueba positiva.
c. Test de Citrato: Sirve para observar la utilización del citrato. Una coloración azul intensa es un
resultado positivo.
d. Test de SIM: Para ver la producción de ácido sulfhídrico, producción de indol y motilidad.

Dos periodos académicos de 50 minutos
6. MEDICION, CÁLCULO Y GRAFICOS
El estudiante registrara las características bioquímicas de enterobacterias y comparara con tablas de

35
Referencia
7. CUESTIONARIO
1.- Llene el siguiente cuadro
Agente etiológico Enfermedad Tratamiento

Salmonella typhi
Escherichia coli
Shigella dysenterie
Pseudomona aeroginosa
Yersinia enterocolitica
Helicobacter pylori
Klebsiella pneumoniae
Serratia marcenscens
Vibrion cholerae
Campylobacter yeyuni
Klebsiella oxytoca
2.- Paciente femenino de 85 años con diabetes y fractura de cadera, se encuentra en cama durante los
últimos 3 meses. El resultado de la prueba a la glucosa en sangre es de 250 mg/ dl y su médico solicita análisis
de orina y urocultivo.
Los resultados son:
Examen químico:
Color: Amarillo oscuro
Aspecto: Turbio
Densidad. 1.025
pH. 7.5
Examen Microscópico: Células descamadas 10 x campo
Leucocitos 30 x campo
Levaduras abundante
Flora microbiana abundante
Cultivo: Germen aislado: Proteus mirabilis
Numero de colonias 100.000 colonias/ ml
Antibiograma:
Sensible: Acido nalidixico, nitrofurantoina, ciprofloxacino
Resistente: Acido pipemidico, norfloxacino, ampicilina, cefalexina, ceftriaxona,ceftazidima, gentamicina,
sulfatrimetoprima
a) Porque la infecciones por levaduras son comunes en los pacientes con diabetes mellitus.
b) Que antibiótico elige para realizar el tratamiento a la paciente y cual la dosis.
c) El antibiótico que elige que mecanismos de acción tiene
d) La bacteria aislada del cultivo tienen relación con el pH de la orina. Fundamenta
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PRÁCTICA Nº12
UROCULTIVO
PSEUDOMONA Y OTROS INFRECUENTES
En general, se define como una infección urinaria que afecta el sistema colector y los riñones (pielonefritis)
o tan solo a la vejiga (cistitis). En los últimos años se prefiere utilizar el término infección urinaria a
pielonefritis o cistitis, ya que en muchos de los casos el médico no tiene la seguridad, si la infección se halla
limitada a la vejiga o involucra también uno o ambos riñones. La infección de la uretra sola o Uretritis se
relaciona frecuentemente con enfermedades de transmisión sexual.
a. Factores defensivos:
 pH urinario: ácido, evita la proliferación de gérmenes y evita que los gérmenes de la uretra anterior
y media lleguen a la uretra posterior que es estéril
 Frecuencia miccional: a medida que aumenta el tiempo de retención urinaria existe mayor tiempo
para colonizar
 Urea: la concentración en que se elimina urea por orina es toxica para las bacterias
 Tonicidad muscular
 Presencia de Ig As
 Poder bactericida del líquido prostático en el hombre
 Osmolaridad: cuando esta aumentada predispone a infecciones urinarias. Por ello cuando existe
infección urinaria se debe tomar mucho liquido
b. Factores predisponentes:
 Retención urinaria: puede deberse a obstrucción por cálculos o divertículos o reflujo vesicoureteral
(común en niños y niñas)
 Edad y sexo: en la lactancia por el uso de pañal es igual la frecuencia de infecciones en niños que
en niñas. En la infancia son más frecuentes las infecciones urinarias en las niñas por poseer una
uretra más corta. En ancianos existe más frecuencia en hombre debido a hipertrofia prostática que
obstruye los conductos quedando restos de orina. Con el comienzo de la actividad sexual aumenta
la frecuencia de infecciones urinarias
 Embarazo: el pH urinario es alcalino, la vejiga se aprisiona, el tono muscular aumenta
 Presencia de obstrucciones: obstrucciones en uréteres congénitos o anatómicos y presencia de
cálculos urinarios
 Presencia de instrumentación: como sondas.
 Presencia de bacteriuria como complicación de otras enfermedades: Diabetes (existe glucosuria y
la innervación de la vejiga esta alterada)
c. Indicaciones previas:
Recordar recolección y valores de toma de muestra de MBL I.
d. Falsos positivos:
 Muestra no refrigerada y mantenida a temperatura ambiente
 Contaminación por NO realizar higiene
 NO recolección de chorro medio
e. Falsos negativos:
 NO suspension de antibiótico
 Restos de jaboncillo
 Orina con menos de 3 horas de retención
 Orina refrigerada por mas de 48 horas
37
2. COMPETENCIA(S):
 Identifica los gérmenes que causan infecciones urinarias y su relación con el contexto de trabajo que le
permita diferentes formas de intervención clínica al problema.
 Emplea la técnica adecuada para efectuar Urocultivo, como proceso de análisis de casos clínicos
 Determina la importancia clínica del Urocultivo a través de la resolución de problemas
 Agar EMB
 Agar Mac Conkey
 Estufa
 Asas bacteriológicas
 Coloración de Gram
 Enteropruebas
 Placas de Petri
 Discos de antibiogramas
Se realizará siembra de la orina obtenida por micción media según las indicaciones del práctico de medios
de cultivo y cultivo de muestras, para ello el alumno deberá saber todos los tipos de siembras que pueden
realizarse y deberá recordar de Microbiología I como debe recolectarse un urocultivo
Pasos a realizar:
 Análisis físico químico de orina (pH, aspecto, color, densidad, nitritos)
 Sedimento en fresco (leucocitos, eritrocitos, células descamadas, flora microbiana)
 Dilución de la orina
 Siembra de la orina
 Incubación en estufa de cultivo
 Recuento de colonias
 Identificación
 Antibiograma

El estudiante registrara las bacterias causantes de infección urinarias y realizara una gráfica de
comparacion
7. CUESTIONARIO.-
1. Enumere los agentes etiológicos responsables de las infecciones urinarias

2. En caso de sospechas de infecciones urinarias que examen solicita y que instrucciones debe dar al
paciente.
3. Caso clínico: Paciente femenino de 30 años tratada por una infección urinaria con un antimicrobiano
de amplio espectro por 7 días, trae una muestra de orina al laboratorio del hospital Univalle de “urgencia”
a las 4:00 p.m. El técnico que recibe la muestra, refrigera hasta el día siguiente. Los resultados del
laboratorio:
38
Examen químico:
Color: Ámbar
Aspecto: Turbio
Examen microscópico: Células descamadas 10 x campo
Leucocitos 5 x campo
Flora microbiana abundante
Cultivo: negativo en 48 horas de incubación
a. Justifique el resultado negativo del cultivo
b. Porque persisten los síntomas de infección urinaria a pesar del tratamiento por 7 días.
c. Es recomendable refrigerar la muestra de orina. Explique.
4. Paciente femenino de 80 años, con sonda uretral durante 7 días, presenta bacteriuria crónica:
a. ¿Qué bacterias se aísla de esta muestra?
b. ¿Qué recomendaciones para la toma de muestra?
c. Si el paciente ya recibió imipenem y no sede al tratamiento ¿cual la alternativa de tratamiento,
fundamente?
d. Si la bacteria aislada es Klebsiella pneumoniae productora de BLEE ¿Cuál la alternativa de
tratamiento?
39

PRÁCTICA Nº 13
COPROCULTIVO
VIBRION, YERSINIA, CAMPYLOBACTER
Se entiende por diarrea al aumento de la masa de las heces, la frecuencia de las deposiciones o del contenido
líquido de estas, se acompaña con frecuencia con dolor, urgencia, molestias perianales e incontinencia. Una
diarrea con poco volumen, dolorosa y hemática se conoce como disentería.
Recordar:
 La frecuencia con que aparecen bacterias causantes de diarreas en los cultivos solo es del 30%.
 Gran porcentaje de diarreas es de origen viral
 En muchos casos el régimen dietario, el reposo transitorio del tubo digestivo y la medicación
sintomática resulta útil.
 Tener en cuenta que algunos antibióticos tiene asociados caolín o carbón o algún otro
antidiarreico.
a. Flora patógena: (agentes más comunes implicados en diarreas)
 Salmonella
 Shigella
 Escherichia coli (algunas)
 Vibrio cholerae
 Yersinia enterocolitica
 Staphylococcus aureus
 Pseudomona aeruginosa
 Candida albicans
 Rotavirus
 Giardia
 Ascaris
 Trichuris
 Entamoeba
CLASIFICACIÓN DE LAS DIARREAS
 DIARREA ACUOSA: La diarrea acuosa puede ser secretora u osmótica y la diarrea con sangre
puede ser invasiva o no invasiva.
 DIARREA SECRETORA: Se define como un cuadro diarreico, que se caracteriza por la
secreción de líquido intestinal, que es isotónico con el plasma y persiste durante el ayuno.
 DIARREA OSMÓTICA: La diarrea osmótica es aquélla que se produce por un incremento de
solutos (carbohidratos) en el lumen intestinal, y disminuye con el ayuno.
 DIARREA CON SANGRE O EXUDATIVA: La diarrea con sangre se presenta con una elevada
frecuencia en niños menores de 5 años. Constituye un problema de salud en los países
subdesarrollados y puede expresarse con manifestaciones clínicas severas que pueden llevar
al paciente a la muerte y, en otras ocasiones, su cuadro clínico es más benigno por tener sus
agentes causales una vida autolimitada. Es la emisión de heces purulentas y hemáticas que
40
persisten con el ayuno, son frecuentes las deposiciones pero su volumen puede ser pequeño o
grande. De una manera práctica, la diarrea con sangre puede ser invasiva y no invasiva.
 DIARREA POR MALA ABSORCIÓN: Son deposiciones con heces voluminosas, con osmolaridad
aumentada que son el resultado de nutrientes no absorbidos y exceso de grasa (esteatorrea), usualmente
disminuye con el ayuno. (Giardiasis)
 DIARREA POR MOTILIDAD ALTERADA: Características muy variables de las deposiciones, volumen
y consistencia; Deben descartarse otras formas de diarrea. (Colon irritable, estrés, medicamentos, etc.)
De acuerdo con el tiempo de evolución las diarreas pueden clasificarse en;

 Agudas: Cuando la diarrea tiene una evolución de menos de 15 días.
 Crónicas: Cuando la diarrea persiste por más de 28 días.
2. COMPETENCIA (S):
 Identifica los gérmenes que causan diarrea. a través de la resolución de problemas que se presentan en
el campo de trabajo del profesional.
 Reconoce las diferentes clases de diarrea y su tratamiento, a través de la resolución de problemas que
se presentan en el campo de trabajo del profesional.
 Analiza la importancia para efectuar un coprocultivo en la práctica médica diaria, a través de la resolución
de problemas que se presentan en el campo de trabajo del profesional.
o Placas Agar Salmonella-Shigella

o Placas Xilosa lisina desoxicolato
o Estufa
o Placas de Petri
4. TECNICA O PROCEDIMIENTO.
Se recogerá materia fecal en frasco estéril, en papel de filtro o por medio de un hisopo estéril. Se siembre
el material en un medio enriquecido y en una selectivo. Del medio selectivo se observa desarrollo y del
enriquecido se siembra en medios sólidos específicos para Salmonella. Al mismo tiempo de la siembra debe
realizarse un recuento de leucocitos en directo con Azul de Metileno o Solución fisiológica, se considera un
resultado positivo más de 5 leucocitos por campo
Si hay desarrollo de colonias se hace un Gram, pruebas bioquímicas acordes al Gram y Antibiograma

El estudiante registrara las bacterias causantes de gastroenteritis bacteriana y realizará una gráfica de
Comparación.
41
7. CUESTIONARIO.-
1. Llene el siguiente cuadro
Enfermedad Agente etiológico Tratamiento

Disentería bacilar
Salmonelosis
Cólera
Disentería amebiana
Síndrome de mala absorción
Diarrea del viajero
Colitis hemorrágica
Gastritis
Gastroenteritis
2. ¿Qué tipo de flora patógena se puede encontrar en una diarrea y cual es su posible tratamiento?
3. El diagnostico de una infección gastrointestinal se hace:
a. Por interrogatorio y examen clínico, justifique
b. Por coprocultivo, jusfique
4. En que situaciones clínicas se indica el coprocultivo, mencione por lo menos dos.
5. Indique la resistencia natural de shigella y salmonella spp.
6. Complete el cuadro:
Agente etiológico Tratamiento antimicrobiano

E. Coli enteropatogenica
Shigella dysenteriae
Salmonella spp
Campylobacter spp
7. Esta recomendado administrar antibióticos en diarreas en forma empírica, justifique su respuesta.

8. Elabore un algoritmo de tratamiento de diarrea aguda ( moco y sangre) en un niño sano de 3 años de
edad, considerando que se aisló del coprocultivo las siguientes bacterias:
a. Shigella spp
b. Salmonella spp
c. E. Coli enterohemorragica
42

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA ii
PRÁCTICA Nº 14
HEMOCULTIVO
HAEMOPHILUS, BORDETELLA, BRUCELLA
La bacteriemia produce sepsis, dando como resultado fiebre intermitente, decaimiento y postración, llegando
hasta la muerte por septicemia. En los niños y lactantes el porcentaje de bacteriemias es elevado, no siendo
así en adultos.
Podemos considerar la sepsis como una severa enfermedad sistémica caracterizada por alteraciones
hemodinámicas y mal funcionamiento orgánico, provocada por la interacción de ciertos productos
microbianos con las células fagocíticas mononucleares del huésped. La sepsis no deja indemne ningún
órgano o aparato.
Para que se produzca sepsis parecen ser necesarios tres factores: Una gran población de microorganismos
infecciosos o colonizadores, la presencia de productos bacterianos capaces de estimular la liberación de las
citoquinas del huésped y una amplia diseminación de estos productos microbianos hacia el sistema
fagocítico mononuclear del huésped.
a. Focos:
 Focos exógenos: inyecciones repetidas, transfusiones, catéteres urinarios (Sondas), catéteres
permanentes, respiradores, traqueotomías, endoscopias repetidas, flebotomías, prótesis, válvulas
hidrocefálicas, válvulas cardiacas, abortos sépticos
 Focos endónenos: Forúnculos, abscesos (pulmón, hígado, riñón), obstrucción a nivel de las vías
biliares, neumonías, salpingitis, endometritis, endocarditis, peritonitis
b. ¿Cuando se realiza hemocultivo?
 Sepsis del recién nacidos y niños o adultos comprometidos inmunológicamente.
 Infecciones severas: meningitis, neumonía, abscesos profundos o infecciones biliares
 Infecciones crónicas: gonorrea y meningitis
 Infecciones intravasculares localizada: válvula cardiaca o vaso sanguíneo trombosado o infectado.
Endocarditis subaguda
 Fiebre entérica, brucelosis, fiebre de origen desconocido
 Traumatismos o cirugías de superficies infectadas
 Episodios traumáticos menores: extracción dentaria o endoscopias
c. Interpretación de resultados:
 Dos hemocultivos por paciente, previos al tratamiento antimicrobiano. El intervalo de tiempo entre
las extracciones es suficiente con una hora, pero cuando exista una gran urgencia en iniciar el
tratamiento, este intervalo puede acortase hasta 15 minutos, o se pueden extraer dos muestras
simultaneas de diferentes sitios de punción. En casos de endocarditis subaguda se recomienda
aumentar a tres frasco de hemocultivo repartidos en 24 horas.
 Si las 2 o 3 muestras indican un mismo microorganismo: Es una bacteriemia.
 Si las 2 o 3 muestras indican diferentes microorganismos y entre ellos encontramos flora normal
de piel: contaminación
 Si las 2 o 3 muestras indican diferentes microorganismos y es un paciente inmunocomprometido:
Bacteriemia multimicrobiana
 Si dentro encontramos gérmenes anaerobios y aerobios diferentes y el paciente ha tenido una
cirugía abdominal no programada: Bacteriemia
43
2. COMPETENCIA(S):
 Aplica la técnica apropiada para la toma de muestra de sangre a través de la resolución de problemas
que se presentan en el campo de trabajo del profesional.
 Realiza correctamente un Hemocultivo a través de la resolución de problemas que se presentan en el
campo de trabajo del profesional.
 Interpreta los resultados posibles obtenidos a través de la resolución de problemas que se presentan
en el campo de trabajo del profesional.
3. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS.

o Jeringas de 10 ml
o Torniquete
o Algodón
o Alcohol yodado
o Estufa
o Caldo Tripticase-soya
o Caldo Tiogliconato
Se debe desinfectar previamente la zona antes de la punción venosa. Cuando se ha extraído la sangre se
introduce en condiciones de asepsia en el caldo de cultivo y se lleva a estufa. Se recomienda tomar tres
muestras con intervalo de media hora y en el pico de fiebre.
Una vez incubado por 24 horas en estufa a 37 C se debe observar el resultado, si hay desarrollo se deberá
ver la morfología, coloración, tipo de hemólisis y realizar las pruebas bioquímicas correspondientes de
acuerdo al cuadro que se coloca al final del práctico

El estudiante registrara las bacterias causantes de gastroenteritis bacteriana y realizará una gráfica de
Comparación.
7. CUESTIONARIO.-
1. ¿Cuáles son las precauciones que se deben tomar al obtener muestras de sangre con sospecha de
sepsis?
2. ¿Qué entiende por sepsis?
3. Enumere los agentes etiológicos causante de septicemia.
4. ¿Cuándo debe realizarse un Hemocultivo?
5. ¿Qué volumen de sangre se debe tomar para realizar un hemocultivo en: Neonatos, niños de 5 años y
adultos?
6. Caso clínico: Paciente masculino de 45 años que presenta síntomas y signos de endocarditis, en los
resultados de laboratorio se observa elevación de la VSG y PCR, el hemocultivo dio negativo.
a. ¿ Porque el cultivo de sangre es negativo?
44
b. ¿Qué bacteria habitualmente se aíslan?

c. ¿Qué medios de cultivo se deberían usar para realizar la siembra en caso de sospecha de una
endocarditis aguda?
d. ¿Existen medios de cultivo especiales para realizar el hemocultivo cuando el paciente recibe
tratamiento antimicrobiano?
7. Se toma una muestra de sangre para hemocultivo y no se dispone del medio de cultivo, se envía al
laboratorio de microbiología en la jeringa con anticoagulante (EDTA).
a. Es correcto el uso de este anticoagulante, ¿Por qué?
b. ¿Cuál es el anticoagulante ideal?
45

Código de registro: R-10-LAB-019-001 Version 2.0
PRÁCTICA Nº 15
TUBERCULOSIS
MYCOBACTERIUM

Las micobacterias continúan siendo una causa muy importante de morbilidad y mortalidad, especialmente en
los países con recursos sanitarios limitados. En la actualidad, se han identificado aproximadamente 100
especies de micobacterias, muchas de las cuales están asociadas a enfermedad en el ser humano. A pesar de
la abundancia de especies micobacterianas, los grupos o especies que se enumeran a continuación causan la
mayor parte de las infecciones en el ser humano: M. tuberculosis, M. leprae, complejo M. avium y otros.
Los signos y síntomas clínicos de la tuberculosis son el reflejo de la localización de la infección y la enfermedad
primaria normalmente se restringe a las vías respiratorias inferiores. La enfermedad tiene un comienzo insidioso.
Los pacientes suelen
tener síntomas inespecíficos como malestar general, adelgazamiento, tos y sudoración nocturna. El esputo
puede ser escaso o hemoptísico y purulento. La producción de esputos hemoptísicos se asocia a la destrucción
tisular (enfermedad cavitada).
El diagnóstico clínico se apoya en: 1) indicios radiológicos de enfermedad pulmonar; resultados positivos en la
prueba de reactividad cutánea, y 3) detección en el laboratorio de micobacterias al microscopio o en cultivo.
En los pacientes con enfermedad activa, como neumonitis o formación de abscesos y cavitación, suelen estar
afectados los dos lóbulos superiores o tan sólo uno de ellos.
La baciloscopia es el examen básico para el diagnóstico de tuberculosis humana, especialmente en su forma

broncopulmonar. Esta técnica realizada en condiciones adecuadas permite visualizar a la bacteria causante de
la enfermedad. Esta bacteria tiene la forma de bastoncillo delgado, ligeramente curvo y se tiñe de color rosado
o rojo con la Tinción de Ziehl Neelsen. Las partículas de esputo secas, son capaces de flotar con el polvo en el
aire y ser infectantes por ello se debe tener mucho cuidado en la manipulación de muestras sospechosas de
tuberculosis.
Las micobacterias tienen la propiedad ácido alcohol - resistencia, debido a un contenido elevado de lípidos de
la pared bacteriana con relación a otras bacterias. El colorante primario es la fucsina básica fenicada. Éste forma
con el soma bacteriano un complejo proteico de color rojo, insoluble y fijo, resistente a la acción del alcohol
ácido que se solubiliza en la decoloración, el colorante secundario o colorante de contraste es el azul de
metileno.
Los componentes de la pared celular de las bacterias ácido alcohol - resistentes son: Lípidos (como: ácido
micólico, ceras y fosfátidos y estos lípidos son los causantes de la ácidoalcohol-resistencia9, Proteínas y
Polisacáridos.
Fundamento de la Tinción de Ziehl Neelsen:
Se sabe que el fenol, que forma parte del colorante, es soluble en los lípidos, los cuales son componentes
sobresalientes de las bacterias ácido alcohol - resistentes, como el bacilo de la tuberculosis. También es soluble
en alcohol y agua, más en lípidos y menos en agua. El fenol con la Fucsina forma el compuesto fenol-color (FC).
46
Al ponerse este compuesto en presencia del citoplasma bacteriano, el fenol se encuentra en un medio donde
su coeficiente de solubilidad es mayor y, por lo tanto, el compuesto fenol-color se fijará fuertemente y coloreará
de rojo la bacteria. Luego se agrega, el decolorante (ácido y alcohol), los que debido a una permeabilidad de la
membrana citoplasmática, penetran con dificultad y se encuentran con el compuesto fenol-color. El fenol se
halla entonces frente a dos sustancias en las cuales es soluble, pero, como lo es más en lípidos, la mayor parte
del color quedará en el citoplasma y una pequeña cantidad se perderá por solubilización en ácidos y alcohol. Si
se destruye la integridad de la bacteriana por cualquier método, la bacteria pierde su ácido alcohol - resistencia,
pero no su virulencia.
2 COMPETENCIA (S):
 Identifica los síntomas de la tuberculosis.

 Reconoce los métodos de diagnóstico.
 Aplicada los antimicrobianos antituberculosos
3. MATERIAL Y REACTIVOS Y EQUIPOS.-
 Microscopio
 Portaobjetos
 Mechero de alcohol
 Solución de Fucsina Básica Fenicada
 Solución de Azul de Metileno
 Alcohol-ácido al 3 %
 Frascos lavadores
 Varillas de tinción
 Aceite de inmersión
 Baja lengua
 Hisopos
 Láminas coloreadas
4 TECNICA O PROCEDIMIENTO
 Preparar el extendido en un portaobjetos utilizando asa bacteriológica o hisopo.

 Dejar secar al aire.
 Fijar el extendido pasando 3 o 4 veces por la llama de un mechero de alcohol. El calor del portaobjetos
debe ser soportado por las manos del operador.
 Colocar el preparado sobre un soporte de Tinción y cubrir con Fucsina Básica Fenicada.
 Calentar por 3 veces hasta la emisión de vapores blancos sin llegar a la ebullición, con un mechero de
alcohol, o con un hisopo de algodón embebido en alcohol, en el lapso de 5 minutos
 Escurrir el colorante y lavar con chorro fino de agua.
 Cubrir el preparado con Alcohol-ácido al 3 % (decolorante) por 5 minutos o hasta que la preparación
esté completamente decolorada.
 Lavar con chorro fino de agua.
 Recubrir la lámina con la solución de Azul de Metileno por 1 minutos.
 Escurrir el colorante y dejar secar al ambiente
 Observar con lente de inmersión.
47

El estudiante compara los resultados obtenidos con las siguiente tabla.
 (-) No se encuentran bacilos ácidoalcohol-resistentes en 100 campos.

 (+) Menos de un bacilo ácidoalcohol-resistente por campo, en la observación de 100 campos.
 (++) Uno a diez bacilos ácidoalcohol-resistentes por campo, en la observación de 50 campos.
 (+++) Más de diez bacilos ácidoalcohol-resistentes por campo, en la observación de 20 campos.
7 CUESTIONARIO
1. Complete el siguiente esquema:
PASOS METODO AC-OL-RESIST NO AC-OL-REISIS

1. Colorante Básico
2. Mordiente
3. Decolorante
4. Colorante de
Contraste
Nota: AC-OL-RESIST significa bacilos ácidoalcohol-resistentes
2.- Llene el siguiente cuadro
Farmaco Dosis Tiempo

Estreptomicina
Etambutol
Isoniacida
Rifampicina
Pirazinamida
48

PRÁCTICA Nº 16
ENFERMEDADES TRANSMITIDAS SEXUALMENTE: SEMINARIO

TREPONEMA, CLAMIDIA, MYCOPLASMA
Se entiende por enfermedad transmitida sexualmente aquellas adquiridas por contacto sexual, que son
importantes, porque son muchos los agentes implicados en estas afecciones.
Las enfermedades de transmisión sexual tienen gran importancia medica en todo el mundo, debido al aumento
en vez de disminuir, por diversas causas.
Como aumento de la densidad de la población y la movilidad de las poblaciones humanas
Dificultad para introducir cambios en el comportamiento sexual humano
Ausencia de vacunas para esas infecciones.
Los agentes causantes de estas enfermedades son:
o Úlceras genitales: Treponema pallidum, Haemophilus ducreyi, Chlamydia trachomatis, Francisella

tularensis, Klebsiella granutomatis, Mycobacterium tuberculosis
o Uretritis: Neissería gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum
o Vaginitis: Especies de Mobiluncus, Gardnerella vaginalis, Mycoplasma hominis
o Cervicitis: Neissería gonorrhoeae, Neissería meningitidis, Chlamydia trachomatis, Streptococcus del
grupo B, Mycobacterium.rium, especies de Actinomyces
2 COMPETENCIA (S):
 Identifica los gérmenes que transmiten por vía sexual.

 Diferenciar los síntomas de cada una estas enfermedades.
 Aplicar el tratamiento y la prevención de cada de estas enfermedades.
3 MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS.-
o Data display
4 TECNICA O PROCEDIMIENTO.
Trabajo en grupos de 5 personas

49
El estudiante realizara un cuadro comparativo de las enfermedades de transmisión sexual
7. CUESTIONARIO
Llene el siguiente cuadro
Enfermedad Agente etiológico Tratamiento

Sífilis
Gonorrea
Chancroide
Uretritis no gonocócica
Vaginitis
Cervicitis
Hespes genital

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GUIA DE PRÁCTICA CIENCIAS DE LA SALUD

Código de registro: RE-10-LAB-035-001 Version 1.0

UNIVERSIDAD DEL VALLE

1. CONOCIMIENTO TEÓRICO REQUERIDO.-

3. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS

Trabajo en grupos 5 estudiantes para la extracción de muestras

Muestra Preparación del paciente Instrucciones especiales

5. TIEMPO DE DURACION DE LA PRÁCTICA

6. MEDICION, CALCULOS Y GRAFICOS

UNIVERSIDAD DEL VALLE

1. CONOCIMIENTO TEÓRICO REQUERIDO.-

1.1 Fundamento de la coloración de Gram:

1.2 Integridad de la Pared Bacteriana

Si bien se ha demostrado que la pared no toma el colorante, desempeña un importante papel en el

1.3 Intervención de los componentes químicos:

Es muy probable que la composición química y la permeabilidad de la bacteria, intervengan en la

1.4 Importancia de Otros Componentes:

c. En consecuencia, la disolución del precipitado Cristal Violeta-Yodo se efectúa lentamente, y

3. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS

5. TIEMPO DE DURACION DE LA PRÁCTICA

1. Complete el siguiente esquema:

2. Llenar el siguiente cuadro

UNIVERSIDAD PRIVADA DEL VALLE

1. CONOCIMIENTO TEORICO REQUERIDO:

Métodos químicos Oxido de etileno

Un medio de cultivo es un sustrato o solución de nutrientes en condiciones ambientales adecuadas en los

Constituyentes de los Medios de Cultivo:

Los medios de cultivos están compuestos por:

 Base de amino-nitrógeno (proteína digerida. Ej. Peptona)

Clasificación de los Medios de Cultivo:

a. Medios Enriquecidos: Favorece el crecimiento de un determinado tipo de microorganismo, sin

b. Medios Selectivos: Permiten el crecimiento de un determinado tipo de microorganismos,

Mac Conkey (Mac): Útil para Enterobacterias

Medio de Cisteina y Lactosa deficiente en electrolitos (CLDE):Para bacterias patógenas en

Salmonella- Shigella (S-S): Para desarrollo de Salmonella o Shigella.

Thayer Martin (TM): Para desarrollo de Neisseria Gonorrhoeae y Neisseria Meningitidis.

c. Medios Para Microorganismos Anaerobios:

Lowenstein Jensen y Middlebrook: Ambos medios contienen glicerol y verde malaquita

e. Medios de Identificación y/o Pruebas Bioquímicas:

Urea: Para observar la utilización de urea.

Citrato: Para ver la utilización de citrato.

Indol: Para observar el uso de triptófano.

Fenilalanina: Para ver la utilización de fenilalanina.

 Trabajo en grupos pequeños

Para esto se utiliza el autoclave.

PREPARACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.-

5. TIEMPO DE DURACION DE LA PRÁCTICA

El estudiante registrara en una tabla las características de cada medio preparado.

1. ¿De qué forma se esterilizarían mejor los siguientes materiales

Caja petri de vidrio

UNIVERSIDAD DEL VALLE

CULTIVO DE MICROORGANISMOS Y SIEMBRA

El cultivo es el proceso de proliferación de microorganismos al proporcionarles un entorno con condiciones

En tubo Punción o Picadura Pruebas bioquímicas

3. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS

o Placas con medios de cultivo preparados

Inoculación Por Estría en la Placa de Agar:

a. Flamear el asa bacteriológica hasta la incandescencia en el mechero Bunsen, manteniéndola

Inoculación en Medio de Cultivo en Tubo:

a. Flamear el asa bacteriológica como se describió anteriormente y dejar enfriar.

5. TIEMPO DE DURACION DE LA PRÁCTICA

El estudiante registrara en una tabla las características de cada medio preparado.

Agente etiológico enfermedades Medio Muestra