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3patogenos3 No Normados - 6425 PDF
3patogenos3 No Normados - 6425 PDF
OBJETIVOS:
• Desarrollar y/o implementar una técnica para la detección del Bacillus cereus.
• Desarrollar el método de enumeración en placa de Bacillus cereus.
FUNDAMENTO:
Los medios de cultivo recomendados para su determinación son, el agar selectivo para
Bacillus cereus según MOSSEL, agar yema de huevo-polimixina-rojo de fenol, agar yema de
huevo piruvato, agar selectivo según REUTER y agar sangre de caballo en el cual se puede
observar la hemólisis provocar por cepas de B cereus.
Y es aplicable a cualquier alimento en el cual
Este procedimiento analítico especifica el método de enumeración en placa de B. cereus y es
aplicable a cualquier alimento en el cual B cereus esté viable y presente.
5 placas (ó 10 placas si se desea efectuar las siembras por duplicado) de agar MYP estéril ó
su equivalente según fabricante (p. ejemplo selectivo para B cereus de OXID) a.
1 matraz de 500 mL con450 mL de diluyente de fosfatos pH 7 estéril a.
4 matraces de 250 mL con 90 mL de diluyente de fosfatos pH 7 estéril ó 4 tubos de 16x150
mm con 9 mL de diluyente de fosfatos pH 7 estéril b.
2 tubos de 13x100 mm con 3.5 mL de agar nutritivo c
2 tiras API 50 CH para Bacillus * (o bioquímicas tradicionales en tubo) c.
2 tiras API 20E, * (o bioquímicas tradicionales en tubo) c.
*
2 tubos de 13x100 mm con 3.5mL de caldo glucosa más rojo de fenol c.
*
2 tubos de 13x100 mm con 3.5mL de caldo nitratos c.
*
2 tubos de 13x100 mm con 3.5mL de RMVP c.
*
2 tubos de 13x100 mm con 3.5mL de agar tirosina inclinado c.
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*
2 tubos de 13x100 mm con 3.5mL de medio SIM c.
2 placas de agar soya tripticaseína-sangre d.
2 placas de agar tirosina d.
2 placas de agar nutritivo completamente secas d.
Reactivos para tinción de Gram b, c, d, e
Reactivos para detección de nitratos A (ácido sulfánico) y B (N-(1, naftil) etiléndiamina) e.
Reactivo para la pruebe de Voges –Proskauere.
Creatinina.
MATERIAL
NOTAS:
a
Material necesario al inicio de la práctica.
b
Material necesario a las 24 horas de iniciada la práctica.
c
Material necesario a las 48 horas de iniciada la práctica.
d
Material necesario a las 72 horas de iniciada la práctica.
e
Material necesario a las 96 horas de iniciada la práctica.
PROCEDIMIENTO
A) Preparación de la muestra.
En condiciones asépticas, pesar 50g de muestra y depositarla en 450mL de buffer de
fosfatos (dilución1:10) y licuar durante 2 minutos.
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Transferir 10 mL de la dilución 1:10 a 90mL de diluyente, mezclar bien y continuar hasta
llegar a la dilución 10-4. Inocular por duplicado placas de agar MYP (o de medios de cultivo
equivalentes) con 0.1mL de cada una de las diluciones de la muestra y extender con varilla
estéril. Incubar las placas a 30˚C/24 horas.
Observar si existe la presencia de colonias rodeadas por zonas claras que indican la
presencia de la lecitinasa. Las colonias de B. cereus en agar MYP generalmente son de color
rosa, el cual se intensifica conforme continua la incubación.
En agar selectivo para B. cereus (OXOID), las colonias presentes presentan un tamaño
aproximado de 5mm de diámetro con precipitación en su entorno, debido a la hidrólisis de la
lecitina. Al no utilizar manitol, las colonias se presentan de color azul turquesa rodeadas por
un precipitado, debido a la yema de huevo.
Si la reacción no es clara, incubar las placas 24 horas más antes de efectuar el cómputo.
Seleccionar placas que tengan en promedio de 15-150 colonias productoras de lecitinasa y
de coloración rosa (MYP) o azules (agar selectivo para B. cereus, OXOID); esta será la
cuenta presuntiva de B. cereus en placa.
Seleccionar 5 o más colonias características de las placas y transferir a tubos con agar
nutritivo para confirmar la presencia de B. cereus, siguiendo la técnica que se describe en los
puntos C y D. Calcular el número de B. cereus/g de muestra, basado en el porcentaje de
colonias , probadas y confirmadas.
Nota: el factor de dilución es 10 veces mayor, debido a que solamente se inoculó 0.1 mL de
cada dilución, en lugar de 1mL.
C) Confirmación de B. cereus
Tomar 5 o más colonias sospechosas provenientes de agar MYP (o su equivalente) y
transferir a tubos con agar nutritivo. Incubar 24 horas a 30˚C. Preparar una tinción de Gram y
observar microscópicamente. El B. cereus, en el microscopio se presenta como bacilo Gram-
positivo corto, forma cadenas, las esporas pueden ser elipsoidales, centrales o
subterminales.
Transferir 3 asa as de cada tubo de agar nutritivo a 0.5mL de buffer de fosfatos y mezclar en
el vórtex. Utilizar esta suspensión e inocular los siguientes medios confirmatorios, (también
se puede utilizar el inóculo del tubo de agar nutritivo sin diluir en buffer).
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C. 3. Medio VP
Inocular 5 mL del medio VP con una asada de cultivo descrito en el inciso C. incubar 48+ 2
horas a
35˚C. A cada mL de cultivo añadir 0.6 mL de α-naftol y 0.2 mL de KOH. Agitar y observar el
resultado después de 1 hora a temperatura ambiente. La prueba es positiva de producción
de acetil metil carbinol, si se desarrolla un color rosa o violeta.
D. pruebas para diferenciar a tres miembros del grupo B. cereus, incluyendo B. cereus
variedad mycoides, B thuringiensis, B. anthracis.
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D.3. Actividad hemolítica
Inocular palcas de agar soya tripticaseína con sangre. Incubar 24 horas a 35˚C.
Posteriormente se observa que B. cereus, es fuertemente hemolítico, la mayoría de los
biotipos de B. thuringiensis y B. cereus variedad mycoides son β-hemolíticos, en contraste
con B anthracis generalmente no presenta hemólisis después de 24 horas.
Nota: se puede utilizar API 50CHB Y API 20E en la caracterización bioquímica de los
cultivos sospechosos.
F. Informe de resultados
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Determinación de Clostridium perfringens en alimentos
OBJETIVOS:
FUNDAMENTO:
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10 tubos 13x100 mm con 3.5 mL de caldo tioglicolato mas 1% de sacarosa c ó d
MATERIAL
-Pipetas de 1.5 y 10 mLa
-cuenta coloniasb, c
-licuadora con vaso o Stomacher con bolsas estériles.a
-jarras de anaerobiosisd
-incubadora de 35+ 1° C a, b, c, d
-cajas petri estérilesa, b, c
-asa microbiológicab, c , d
-baño de agua a 45 + 1° Cd
-gradillas a, b, c, d
NOTAS:
a
Material necesario al inicio de la práctica.
b
Material necesario a las 24 horas de iniciada la práctica.
c
Material necesario a las 48 horas de iniciada la práctica.
d
Material necesario a las 72 horas de iniciada la práctica.
e
Material necesario a las 96 horas de iniciada la práctica.
PROCEDIMIENTO
A.-PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
Pesar en condiciones de asepsia , 25 g del alimento y añadir 225mL de diluyente, en este
caso de agua peptonada al 0.1% dilución 1:10
Homogeneizar durante 1-2 minutos a velocidad baja y efectuar diluciones decimales hasta
10-4 con la menor aireación posible, en caso de no tener colonias sospechosas en agar TSC,
guardar en refrigeración específicamente la dilución 1:10-
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perfectamente y dejar que se basorba por completo la muestra.
Después de que el inóculo se ha absorbido, añadir una sobrecapa de 8mL de agar TSC sin
emulsión con yema de huevo. Dejar solidificar.
Colocar las placas sin invertir dentro de una jarra para anaerobios con generador y
catalizador para incubar de 20-24 h a 35° C
D.-PROCEDIMIENTO COMPLEMENTO
Éste inciso no se realiza cuando existan colonias sospechosas en el agar TSC. En caso
contrario:
Preparar caldo hígado o bien medio carne, previamente calentado durante 10 minutos en
agua hirviente y enfriado rápidamente. Inocular en los medios antes mencionados , 3 tubos
con 2mL de la dilución 1:10, e incubar los tubos durante 24-48 horas a 35 + 2 ° C
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desarrolladas.
La colonias sobre la superficie del agar TSC , son de color amarillo grisáceo, con zonas
opacas de 2-4mm de diámetro , por la actividad de la lecitinasa. Este procedimiento
también es usado para aislar C. perfringens de los tubos de cakdo hígado cocido o medio de
carne.
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Inocular caldo para esporulación, 1 mL de caldo tioglicolato fluido. Incubar 24 horas a 35 +
2 ° C al término establecido preparar una tinción de Gram , en el caso de existir desarrollo
microbiano y observar microscópicamente las esporas.
Refrigerar los cultivos esporulados por si se requieren pruebas adicionales.
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Fementación de la lactosa +
Fermentación tormentosa de la leche +
Hidrólisis dela esculina _
G.-INFORME DE RESULTADOS
Calcular el número de células C. perfringens en la muestra sobre la base del porcentaje de
colonias probadas y confirmadas.
EJEMPLO:
En el caso de haber inoculado 0.1mL de cada una de las diluciones:
El cómputo promedio de la placa para la dilución 10-4 es de 85 colonias y 8 de 10 colonias
se confirmaron para C. perfringens, el número de microorganismo por g de alimento es:
Nota:
El factor de dilución en las placas que contienen yema de huevo y que solamente se sembró
0.1mL de las siluciones, es diez veces mayor como se observa en el ejemplo previamente
descrito.
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Determinación de Campylobacter jejuni en alimentos.
OBJETIVOS:
FUNDAMENTO:
MATERIAL
1 bolsa para Stomacher o vaso de licuadora estéril.a
Mechero Bunsen.a
1 balanza granataríaa
1 jarra de anaerobiosisa
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Propipeta.a
Microscopiob
Incubadora a 42°C con termostato calibrado que evite variaciones mayores a ±0.1 °Ca
NOTAS:
a
Material necesario al inicio de la práctica.
b
Material necesario a las 24 horas de iniciada la práctica.
c
Material necesario a las 48 horas de iniciada la práctica.
d
Material necesario a las 72 horas de iniciada la práctica.
e
Material necesario a las 96 horas de iniciada la práctica.
PROCEDIMIENTO.
Aislamiento selectivo.
1.- Para el caso de muestras solidas colocar 25 g de la muestra, para muestras liquidas 25
mL de la muestra
2.- Transferir la muestra pesada o medida a una bolsa de Stomacher o vaso de licuadora
estéril.
3.- Adicionar 90.0 mL de diluyente estéril al 0.1% a la licuadora o bolsa Stomacher.
4.- Homogenizar 30 segundos en Stomacher a velocidad media o 10 segundos en licuadora
o velocidad mínima.
5.-Realizar diluciones decimales hasta 10-4 (el numero de diluciones está en función de la
procedencia de la muestra) en tubos de 16 X 150 mm conteniendo cada tubo 9.0 mL del
mismo diluyente.
6.- Transferir 0.1 mL de las diluciones 10-1,10-2, 10-3 y 10-4 a cajas petri con agar selectivo
para Campylobacter.
7.- Extender el volumen inoculado a cada una de las cajas de Petri con una varilla de vidrio
estéril, en forma de “L”, iniciando a partir de la mayor dilución (Método de inoculación por
extensión en superficie).
8.- Mantener las placas en su posición hasta que el inoculo sea absorbido por el agar, entre 5
y 10 minutos aproximadamente.
9.- Invertir las placas e incubar en condiciones microaerofílicas 42-43°C, durante 24 a 48
horas.
10.- Después de incubar observar las colonias características de este microorganismo en el
agar selectivo para Campylobacter. Estas se presentan como gotas de agua extendidas a lo
largo de la estría.
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Pruebas bioquímicas
Realizar la confirmación bioquímica del microorganismo, haciendo las pruebas de presencia
de las enzimas citocromo oxidasa, catalasa, producción de H2S, reducción de nitratos a
nitritos, e hidrólisis de purato.
Prueba de oxidasa.
1.- Colocar un círculo de papel filtro en una caja de Petri y humedecerlo con algunas gotas
de reactivo de oxidasa. Alternativamente se puede utilizar un disco reactivo comercial.
2.- Tomar suavemente una porción del cultivo desarrollado en agar Skirrow y depositarlo en
el papel filtro anterior.
NOTA
Para los microorganismos oxidasa positivos, el papel se torna púrpura oscuro o azul en
pocos segundos.
Prueba catalasa.
1.- Emulsificar un cultivo puro, con una gota de solución de peróxido al 3%.
2.- la formación inmediata de burbujas indica que la prueba es positiva.
3.- ¡Precauciones, la emulsión debe realizarse con un asada platico o palillo de madera
estéril evitando el contacto del metal con el reactivo. Si las colonias provienen de agar base
con sangre, cualquier contaminación con eritrocitos puede dar pruebas falsas positivas.
Reducción de nitratos.
1.- Inocular los tubos conteniendo caldo nitratos, incubar a 35C por 5 días. Para la lectura se
debe agregar 0.2 mL de reactivo A y 0.2 mL de reactivo B, un color rojo indica una prueba
positiva (presencia de nitritos). Si esta coloración no se observa, adicionar zinc en polvo. El
desarrollo de color rojo después de una hora confirma una prueba negativa (presencia de
nitratos).
2.- en forma alternativa adicionar al cultivo en caldo nitratos 0.2 mL del reactivo B y 0.2 mL
del reactivo C. Un color naranja indica una prueba positiva ( presencia de nitritos). Si esta
coloración no se observa, adicionar 0.2 mL del reactivo de cadmio, el desarrollo de un color
naranja confirma una prueba negativa (presencia de nitratos). Este procedimiento alternativo
elimina el uso del alfa-naftilamina, que es carcinogénica.
Movilidad en agar.
1.- Inocular en medio SIM, incubar por 48 horas a una temperatura de 37 °C. Observar si el
microorganismo inoculado es móvil.
Producción de H2S
1.- Inocular en medio SIM, incubar por 48 horas a una temperatura de 37C. Observar si el
microorganismo es productos de un precipitado negro.
NOTA
Para los microorganismos catalasa positivos en el medio se observa un burbujeo al rededor
de la estría.
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CUADRO 2. Características mínimas para la identificación de Campylobacter jejuni
Resultados.
Interpretación de resultados.
Consultar los resultados obtenidos en el cuadro de identificación de Campylobacter jejuni y
concluir acerca del tipo de microorganismos que se aisló.
USO
Para el aislamiento primario y cultivo de Campylobacter, a partir de muestras clínicas,
alimentos, aguas, etc.
PRINCIPIO
La base y la sangre de carnero junto con la atmósfera deficiente en oxígeno producen un
buen crecimiento de Campylobacter. El suplemento con agentes antimicrobianos inhibe
marcadamente el crecimiento de las bacterias acompañantes y facilita la recuperación de
Campylobacter.
Sembrar la muestra de prueba en la superficie del medio de cultivo por estría cruzada.
Incubar 24 – 48 h en atmósfera de CO2. De acuerdo a la temperatura de incubación, es
posible hacer diferenciación de especies:
TEMPERATURA DE INCUBACION
MICROORGANISMO 25ºC 35ºC 42ºC
Campylobacter fetus ssp fetus + + -
Campylobacter jejuni - + +
Campylobacter coli - + -
Campylobacter fetus ssp venerealis + + -
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FORMULA EN GRAMOS POR LITRO DE AGUA DESTILADA BASE
Agar 15.0
Extracto de levadura 2.0
Bisulfito de sodio 0.1
Dextrosa 1.0
Cloruro de sodio 5.0
Polipeptona 20.0
SUPLEMENTO
Anfotericina B 0.002
Vancomicina 0.010
Cefalotina 0.015
Polimixina B 2500 Unidades
Trimetoprim 0.005
Sangre de carnero estéril desfibrinada 100 mL
PH 7.2 ± 0.2
PREPARACION
Rehidratar 43.1 g del medio en un litro de agua destilada. Reposar 10 a 15 minutos. Calentar
agitando frecuentemente hasta el punto de ebullición durante 1 minuto para disolverlo por
completo. Esterilizar en autoclave a 121ºC (15 lbs de presión) durante 15 minutos. Enfriar
aproximadamente a 45ºC. Adicionar la sangre de carnero estéril desfibrinada, homogeneizar
perfectamente. Agregar los suplementos previamente hidratados, según las especificaciones
del fabricante en condiciones de esterilidad, mezclar sin producir burbujas. Vaciar en cajas
de Petri estériles. Conservar en refrigeración de 2º a 8ºC.
CONTROL DE ACTIVIDAD
MICROORGANISMO CEPA CRECIMIENTO
Campylobacter jejuni ATCC 33291 Bueno
Escherichia coli ATCC 25922 Parcial a completa inhibición
Enterococcus faecalis ATCC 29212 Parcial a completa inhibición
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Determinación de Shigella spp. en alimentos.
OBJETIVOS:
FUNDAMENTO:
MEDIOS DE CULTIVO
1 matraz Erlenmeyer con 225 mL de caldo para Gram-negativos con 0.5 mg y/o 3 mg de
novobiocina cuyo pH final sea 7.0 (caldo GN+novobiocina)a
2 cajas Petri con 20mL de agar Mac Conkey (MC)b
2 tubos de 13x 100 mm con 3mL de agar Kligler (KIA) inclinadosc
2 tubos de 13x 100 mm con 3mL de agar hierro lisina (LIA) inclinadosc
2 tubos de 13x 100 mm con 3mL de caldo rojo de metilo Voges Proskauer (RMVP)e
2 tubos de 13x 100 mm con 3mL de medio sulfuro indol movilidad (SIM)e
2 tubos de 13x 100 mm con 3mL de caldo glucosa más rojo de fenol y conteniendo campana
de Durhame
2 tubos de 13x 100 mm con 3mL de caldo surraco o caldo ureae
2 tubos de 13x 100 mm con 3mL de caldo malonatoe
2 tubos de 13x 100 mm con 3mL de agar citrato de Simmonse
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2 tubos de 13x 100 mm con 3mL de caldo KCN
2 tubos con caldo sacarosa más rojo de fenole
2 tubos con caldo adonitol más rojo de fenole
2 tubos con caldo inositol más rojo de fenole
2 tubos con caldo salicina más rojo de fenole
2 tubos con caldo mucato (sólo en el aislamiento de otras especies diferentesa S. sonnei )e
2 tubos con agar acetato de sodio (sólo en el aislamiento de otras especies diferentesa S.
sonnei )e
BIOLÓGICOS
Antisuero polivalente somático “O”
MATERIAL Y EQUIPO.
Balanza granatariaa.
1 caja de Petri de vidrio estérila.
1 bolasa de Stomacher o un vaso de licuadora estérila.
Utensilios necesarios para la manipulación de la muestra: cucharas, cuchillos, tenedores,
estérilesa.
Stomacher o motor para licuadoraa.
Pipetas de vidrio de 1.0 y 5 mL, estériles con filtro de algodónd.
Pipetas Pasteur estérilesc.
Asa microbiológica b.
Mechero de Bunsena, b, c,d,e
Portaobjetosc.
Microscópio ópticod,e.
Jarra para anaerobiosis a
Incubadora a 35ºC con termostato calibrado que evite variaciones mayores a +/-0.1ºC a,b,c,
Incubadora a 42 y 44ºC con termostato calibrado que evite variaciones mayores a +/-0.1ºC a.
NOTAS.
a Material necesario al inicio de la práctica.
b Material necesario a las 24 h. de iniciada la práctica.
c Material necesario a las 48 h. de iniciada la práctica.
d Material necesario a las 72 h. de iniciada la práctica.
e Material necesario a las 96 h. de iniciada la práctica.
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PROCEDIMIENTO:
D) Caracterización fisiológica.
Realizar tinción de Gram e inocular los cultivos sospechosos en diferentes pruebas
bioquímicas, en tiras de API 20 E. Las características de Shigella se resumen en: bacilos
Gram-negativos, negativos para H2S, ureasa, glucosa (gas), mitilidad, descarboxilación lisina,
sacarosa, adnitol, inositol, lactosa (2 días), KCN (Caldo cianuro de potasio), malonato, citrato,
salicina y acetato. Es positivo para rojo de metilo en RM/VP. Utiliar antisuero para identificar
el serotipo. Las especies de Shigella tieneden a dar negativas las reacciones de acetato de
sodio, citrato y mucato, mientras que la E. coli , anaerógena tiende a dar positiva al menos
una de estas 3 últimas reacciones.
E) Pruebas bioquímicas
1.Agar triple azúcar hierro o agar Kligler hierro.
Registrar las características del medio TSI o KIA antes de la inoculación (color del medio).
Por duplicado tomar suavemente una porción del centro de la colonia con asa bacteriológica
recta y estéril e inocular por picadura y estría en un tubo con agar triple azúcar hierro (TSI) o
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agar Kligler (KIA) inclinado.
Incubar el medio TSI o KIA a 35+/-2ºC durante 24 h.
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reacción se lleve a cabo en presencia de oxígeno.
F) Identificación serológica:
1. Colocar con un asa bacteriológica, 2 gotas separadas de solición salina estéril (NaCl
0.85%) sobre un portaobjetos; en donde una gota será el control.
2. Suspender en cada una de las gotas, una porción de cultivo desarrollado en agar Kliger.
3. Agragar a una de ellas, una gota de antisuro polivalente somatico “O” y mezclar
perfectamente bien.
4. Inclinar la lámina hacia atrás u hacia delante, durante aproximadamente un minuto para
posteriormente observar bajo buena iluminación y fondo obscuro los resultados de esta
prueba.
5. Considerar el grado de aglutación de acuerdo a:
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0 = no aglutinación
1+ = aglutinación escasa
2+ = aglutinación con un 50% de claridad
3+ = aglutinación con 75% de claridad
4+ = aglutinación total
Notas:
a) Cuando la aglutinación es positiva con el suero polivalente “O”, puede determinarse el
subgrupo, empleando antisueros especificos como son el A, B, C y D
b) Si la aglutinación con el antisuero “O” es negativa, calentar a ebullición a baño María
durante 30 min. para hidrolizar el antigeno capsular que interfiere en la reacción.
Después repetir la prueba con el antisuero polivanete “O”.
G) Informe de resultados
Reportar presencia o ausencia de Shigella spp. (identificación de especie) en 25 gramos de
alimento.
Bibliografía:
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