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Francisco Conejero Lara, Obdulio López Mayorga y Mourad Sadqi. Departamento de Química Física.
Universidad de Granada.
Este documento corresponde a los materiales y métodos de la memoria “ESTUDIO

TERMODINÁMICO DE LOS ESTADOS PARCIALMENTE PLEGADOS DEL
DOMINIO SH3 DE α-ESPECTRINA”, presentada para aspirar al grado de Doctor en
Ciencias Químicas por Mourad Sadqi, visada en Granada, a 8 de septiembre de 2000 y
codirigida por los profesores Obdulio López Mayorga y Francisco Conejero Lara.
3.1. CALORIMETRIA DE DIFERENCIAL DE BARRIDO.
3.1.1. Introducción a la calorimetría diferencial de barrido.
La calorimetría diferencial de barrido (CDB) es generalmente considerada hoy en

día como la técnica más adecuada para estudiar la energética de las transiciones de
plegamiento-desplegamiento de las proteínas. Esta técnica permite la caracterización
termodinámica de los cambios conformacionales inducidos por cambios de temperatura en
proteínas (Privalov y Khechinashvili, 1974; Privalov y Potekhin 1986), ácidos nucleicos
(Privalov y Filimonov, 1978) y biomembranas (Mabrey y Sturtevant, 1978; Bach y
Chapman, 1980). Revisiones detalladas sobre los aspectos más interesantes de la CDB
pueden encontrarse en las siguientes referencias: Privalov, 1979, 1982, 1989; Mateo, 1984;
Sturtevant, 1987; Sanchez-Ruiz y Mateo 1987; Chowdry y Cole, 1989; Freire et al., 1990,
Cooper et al., 1994 a y b; Sanchez-Ruiz, 1995.
En un experimento de calorimetría diferencial de barrido se registra de forma
continua la capacidad calorífica aparente de una disolución de proteína o de cualquier
macromolécula en función de la temperatura, obteniéndose lo que comúnmente se
denomina termograma. Éste generalmente está caracterizado por un pico de absorción de
calor correspondiente a un proceso o transición térmicamente inducida, por lo que, de
acuerdo con el segundo principio de la termodinámica (supuesto el proceso de equilibrio),
corresponde a un proceso endotérmico.
La información fundamental que proporciona la CDB es la capacidad calorífica
relativa de un sistema en función de la temperatura. El procesamiento subsiguiente de esta
magnitud nos puede proporcionar una caracterización termodinámica completa del proceso
investigado. En general, hay tres tipos de información que se pueden obtener a partir de la
CDB:
1. La capacidad calorífica parcial absoluta del compuesto de interés.
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2. Los parámetros termodinámicos globales (los cambios de entalpía [∆H], de entropía

[∆S], de energía de Gibbs [∆G] y de la capacidad calorífica [∆Cp ]) asociados a la
transición inducida por temperatura.
3. La función de la partición y concomitantemente la población de los estados
relevantes del sistema y sus parámetros termodinámicos.
3.1.2. El calorímetro diferencial de barrido.
Desde hace más de dos décadas la microcalorimetría se ha utilizado cada vez más
para la caracterización termodinámica de biopolímeros de varios tipos, particularmente
proteínas y polinucleótidos. El rápido crecimiento del uso de las técnicas
microcalorimétricas en esta área de investigación puede deberse en parte a la
disponibilidad de instrumentos de cada vez mayor sensibilidad, capaces de detectar los
pequeños calores puestos en juego durante los procesos implicados, y también en parte a su
mayor fiabilidad y facilidad de uso. Aún así, se continúa realizando un esfuerzo para
mejorar los microcalorímetros tratando de lograr una sensibilidad aún mayor que permita
el uso de cantidades menores de materiales biológicos muy valiosos, lo cual abriría nuevas
áreas de aplicación.
Varias compañías comercializan calorímetros diferenciales de barrido en la
actualidad. Todos estos microcalorímetros tienen en común varias características; la más
importante, por la cual se denominan microcalorímetros diferenciales de barrido, es que la
medida de la capacidad calorífica se hace en modo diferencial (se mide la diferencia de
capacidad calorífica entre dos células lo más idénticas posible) y de una manera continua,
es decir, calentando o enfriando la muestra a una velocidad constante. La principal
desventaja de este modo de operación es que la muestra nunca está estrictamente en
equilibrio térmico (en este aspecto el diseño de las células es fundamental).
Otras características comunes que presentan los microcalorímetros diferenciales de
barrido utilizados actualmente son:
1) No poseen agitación mecánica para evitar aportar cantidades de calor por efecto
Joule que podrían ser mayores, incluso, que el efecto calorífico medido si el
líquido tiene una elevada viscosidad.
2) Funcionan de modo adiabático, como veremos a continuación.
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3) El conjunto de células es fijo (no desmontable), lo que permite una mayor

reproducibilidad en los datos.
En general, un microcalorímetro de CDB consiste básicamente en dos células

gemelas, una actúa de referencia (que se llena con la disolución tampón en la que se dializa
la biomolécula), y la otra contiene la muestra (la disolución de biomolécula en el tampón
de referencia), ambas situadas simétricamente dentro de un caparazón metálico diseñado
para crear un entorno casi adiabático. La temperatura de este caparazón se controla a través
de termosensores y efectores apropiados para que esté en todo momento muy próxima a la
temperatura de las células. Una termopila de elevada sensibilidad (múltiples uniones
bimetal o de semiconductor) mide la diferencia de temperatura entre las células
calorimétricas.
Al comenzar un barrido se disipa la misma potencia térmica en cada célula
mediante la apropiada intensidad de corriente que alimenta a dos resistencias eléctricas de
valor idéntico, en íntimo contacto térmico con la superficie de cada célula; el valor de esta
corriente está fijado por la velocidad de barrido seleccionada. La medida de la diferencia
de capacidad calorífica se realiza utilizando un método de compensación simétrica. Este
método consiste en un sistema de retroalimentación que usa como señal de error la señal
eléctrica generada por la termopila de células cuando se produce algún efecto térmico en
una de ellas; el lazo de control se cierra disipando en la resistencia calefactora de la célula
mas fría la potencia térmica necesaria para reestablecer la igualdad de temperaturas. De
esta forma las dos células se mantienen prácticamente a la misma temperatura durante todo
el barrido. Para una velocidad de barrido constante el exceso de potencia disipada en la
célula de medida es directamente proporcional a la diferencia de capacidad calorífica entre
ambas células y constituye la magnitud fundamental medida en este instrumento.
Existen varios modelos comerciales de estos microcalorimetros; los más utilizados
en los últimos años eran el DASM-1 y el DASM-4 de fabricación rusa, pero, tras la
suspensión de la fabricación de estos instrumentos y con la aparición en el mercado del
modelo VP-DSC de Microcal Inc., parece ser este último calorímetro la mejor opción
como instrumento de alta sensibilidad, adecuado para estudiar biopolímeros en disolución.
Para el desarrollo de los experimentos calorimétricos incluidos en este trabajo se han
utilizado dos modelos de calorímetro: el DASM-4, que se ha utilizado sólo para la
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realización de experimentos de alta concentración, y el VP-DSC, adquirido recientemente

por nuestro grupo de investigación, en el que se llevaron a cabo casi todos los
experimentos.
A continuación describimos brevemente algunos aspectos más relevantes de cada
uno de los aparatos utilizados en el trabajo expuesto en esta Memoria.
El modelo DASM-4 (Differential Adiabatic Scanning Microcalorimeter) (Privalov,
1980) ha sido hasta muy recientemente el calorímetro de mayor sensibilidad y
reproducibilidad en la determinación de la capacidad calorífica. La característica esencial
de este aparato es la geometría de sus células, que son dos tubos capilares construidos en
platino, de aproximadamente 1.2 mm de diámetro interno, formando sendas bobinas
helicoidales enfrentadas por sus secciones transversales, y entre las que se sitúa una
termopila de multiples uniones bimetal Las células están situadas dentro de un bloque
adiabático, formado por dos corazas metálicas concéntricas, como se muestra en la Figura
3.1.1. Está geometría de las células presenta la ventaja frente a otros calorímetros de una
gran facilidad para llenarlas y lavarlas y proporciona un campo térmico muy homogéneo
sin apenas gradientes de temperatura en las disoluciones en estudio. Esto permite utilizar
mayores velocidades de barrido, lo que a su vez repercute en un incremento de la
sensibilidad del instrumento. Además, en este tipo de células capilares la convección
térmica durante el calentamiento, que es una de las principales fuentes de artefactos en
calorimetría diferencial de barrido, es muy pequeña.
Otras características instrumentales de esté aparato son las siguientes: El volumen
operacional de las células es de 0.5 mL, el intervalo de temperaturas de trabajo va de 0 a
120 ºC, las velocidades de barrido de 0.1 a 2 K/min, y el nivel de ruido se sitúa en 0.2 µW.
(Privalov y Potekhin, 1986). La adquisición de datos, temperatura y potencia de
compensación, se realiza mediante un ordenador conectado directamente al calorímetro a
través de un conversor analógico-digital.
El otro instrumento adquirido recientemente por nuestro grupo es el calorímetro
modelo VP-DSC (Valery Plotnikov Differential Scanning Calorimeter). Representa un
gran avance en sensibilidad, reproducibilidad y estabilidad de la línea base, basado en una
gran mejora en la adiabaticidad del sistema. La relación señal-ruido mejora un orden de
magnitud y además presenta gran facilidad de manejo con respecto a otros calorímetros
disponibles en el mercado. Se pueden obtener termogramas adecuados y reproducibles con
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sólo 50 µg de proteína en la célula de muestra, algo impensable con las generaciones

anteriores de calorímetros.
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Figura 3.1.1: Bloque calorimétrico del DASM-4. (1) Tubos capilares para llenar
las células, (2) Termolámina o resistencia eléctrica laminar para calentar la célula
capilar, (3) coraza interna, (4) termopila y (5)coraza externa.
Las células tienen forma de moneda, con tubos capilares de 1.5 mm de diámetro
interno, para llenarlas. Están construídas con tántalo 61, un material de gran resistencia
frente a la corrosión para casi todos los ácidos, similar al vidrio, aunque es sensible al
ataque por medios fuertemente alcalinos. El volumen efectivo de ambas células es de 0.5
mL, aproximadamente. Estás células se encuentran fijadas en el interior de una coraza
cilíndrica, que asegura la adiabaticidad del sistema. El intervalo operativo de la
temperatura del VP-DSC es de –10 hasta 130 ºC, y puede registrar barridos tanto
calentando como enfriando (en este caso en modo no adiabático), sin necesidad de ningún
dispositivo exterior. Las velocidades de barrido son seleccionadas por el operador en un
rango de 0 a 2 K/min. Para barridos por encima del punto de ebullición de las disoluciones,
el VP-DSC tiene un sistema de presurización que permite alcanzar presiones de hasta 35
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psi, evitando así la ebullición de las muestras. Un esquema del instrumento se muestra en
la Figura 3.1.2.
El VP-DSC es el primer calorímetro que permite al operador seleccionar el tiempo
de respuesta entre 5 y 30 segundos. Sensibilidad y tiempo de respuesta están relacionados,
a mayor tiempo de respuesta mayor sensibilidad. Esto representa una ventaja ya que para
estudiar las transiciones anchas que se suelen observar en la mayoría de las proteínas, y
para las que se requiere una alta sensibilidad, es aconsejable usar tiempos de respuesta
mayores. Por el contrario para transiciones agudas se aconseja un tiempo de respuesta
corto para evitar distorsiones en la forma del termograma. También permite trabajar en
modo isotermo, para poder seguir cinéticas de procesos a diferentes temperaturas. Por otra
parte, el VP-DSC está gobernado a través de dos sistemas electrónicos conectados al “bus”
de un ordenador Pentium-PC estandar, que contienen los conversores análogico-digital
(A/D) y digital_analógico (D/A) y las puertas digitales necesarias. Estos circuitos son
preconfigurados y calibrados en la factoría de MicroCal, por lo que no se necesita ningún
ajuste previo a su funcionamiento. La adquisición de datos y el control del
microcalorímetro están automatizados por el programa VPViewer que hace posible los
barridos cíclicos sin la intervención del operador. Por último, con esté programa podemos
modificar los parámetros experimentales tales como la temperatura de inicio y final, la
velocidad de barrido, etc. Los datos experimentales se almacenan en un archivo en código
ASCII con el nombre establecido por el usuario.
3.1.3. Experimento calorimétrico.
3.1.3.1. Preparación del experimento.
En general, para la realización de un experimento de CDB, las disoluciones de

proteína deben prepararse de una manera rigurosa, de modo que la proteína debe estar
esencialmente pura y las medidas de concentración de las disoluciones deben realizarse
con la máxima precisión. Por lo general la disolución de proteína se dializa durante 24
horas frente al tampón en el cual se quiere realizar la experiencia. Sin embargo, para los
experimentos en disoluciones deuteradas, la proteína se dializa frente a agua pura, se
liofiliza para eliminar el agua, y se disuelve en la cantidad del tampón deuterado
apropiado. Después se determina la concentración de la disolución de la proteína mediante
la medida de la absorbancia a 280 nm (ver apartado 3.5.3).
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Figura 3.1.2: Esquema del calorímetro diferencial de barrido VP-DSC: 1,2: Células de
muestra y referencia con los tubos capilares de entrada para llenar y limpiar. 3,4: calentadores
principales situados sobre las células, controlados por el voltaje VII de la fuente de alimentación, 5;
ésta a su vez está conectada al computador, 6, a través de una tarjeta conversora analógico/digital
(A/D), 30. Los elementos auxiliares de calentamiento, 18 y 19, que se alimentan a través de la tarjeta
A/D se utilizan para la calibración y para la retroalimentación. El dispositivo de medida del efecto
térmico, 7, y el termosensorl, 8, para medir la diferencia de temperatura ∆T1 entre las dos células, son
parte del sistema de medida por compensación. Rodeando a las dos células se encuentra una coraza,
9, con dispositivos de calentamiento/enfriamiento, 10, dirigidos por un controlador, 11, que responde
a una señal que procede de un amplificador sumador 15. El amplificador sumador tiene como una
de las entradas la señal, 20, procedente del sensor, 12, que mide la diferencia de temperatura ∆T2
entre las células y la coraza. La otra entrada, 16, es un voltaje VI de una fuente de alimentación, 17,
controlada por el computador a través de la tarjeta A/D, 30. La coraza tiene además un dispositivo,
13, para la medida de temperaturas mediante un sensor, 14, dispuesto en la coraza térmica; la señal
de salida del dispositivo se digitaliza en el conversor A/D, 30. Las señales calibradas ∆T1 y ∆T2 así
como la temperatura se registran continuadamente durante el experimento y se almacenan das en la
memoria del computador, 40, con un periodo de muestreo seleccionado por el usuario.
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Una vez preparada la disolución y antes de comenzar el experimento, se procede al

lavado de las células con agua Milli-Q, mediante el accesorio destinado a tal fin que viene
con el instrumento. Está operación debe ser bastante exhaustiva, sobre todo si ha producido
alguna agregación de la muestra en experimentos anteriores, en cuyo caso puede ser
necesario realizar una limpieza más profunda de las células, utilizando una mezcla 1:10
ácido fórmico-agua, seguida de un lavado exhaustivo con agua Milli-Q. Después, se llenan
las dos células con la disolución tampón con el fin de registrar la línea base instrumental, y
finalmente, introducimos los parámetros de control del experimento en el programa de
adquisición del calorímetro.
3.1.3.2. Línea base instrumental
En la práctica los dos células del calorímetro no son exactamente idénticas y por
tanto es necesario registrar un termograma con las dos células llenas con la disolución
tampón, que representa la señal introducida por esta asimetría y otros factores
instrumentales, a la que llamaremos línea base instrumental y que será la referencia que
permitirá eliminar el artefacto o contribución instrumental de un termograma. Se registran
barridos de temperatura consecutivos, para asegurarnos de la reproducibilidad de la línea
base, de manera que la diferencia entre dos termogramas consecutivos se encuentre dentro
del rango de las especificaciones del instrumento.
Un protocolo importante en nuestro procedimiento experimental es la preparación
para asegurar la reproducibilidad de la respuesta térmica del instrumento. Esto se consigue
dejando el mismo ciclo térmico durante varios barridos sucesivos con los mismos
parámetros como la temperatura de inicio y final de barrido, la velocidad de barrido, y el
mismo tiempo de equilibrado entre el final de un barrido y el comienzo del siguiente.
3.1.3.3. Barrido con la muestra de proteína.
Una vez termina la adquisición de la línea base, esperamos a que el calorímetro

llegue a la fase de enfriamiento, a una temperatura próxima a la ambiente, generalmente
entre 20 y 30 ºC, y se llena la célula de muestra con la disolución de proteína.
Por lo general el termograma de CDB de una proteína es una curva que contiene
una transición, en forma de pico endotérmico, que se debe a la absorción de calor asociado
con la desnaturalización de la proteína inducida por la temperatura (en el caso de algunas
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proteínas se obtiene varios picos). Los valores de la señal en la zona pre- y post-transición
corresponden respectivamente a las capacidades caloríficas de los estados nativo y
desnaturalizado de la proteína. Hay que hacer notar que el termograma de barrido con la
muestra aparece normalmente por debajo de la línea base debido a que la capacidad
calorífica absoluta de la proteína es menor que la del agua que desplaza (Privalov y
Khechinashvili, 1974). A partir del termograma resultante de restar la línea base
instrumental, podemos obtener algunos parámetros termodinámicos significativos de la
transición calorimétrica, como se indica en la Figura 3.1.3.
Figura 3.1.3: Curva de capacidad calorífica (trazo continuo) en función de

temperatura para la desnaturalización térmica de una proteína hipotética.
C Np representa la capacidad calorífica del estado nativo y C Dp la del estado desplegado.
En trazo discontinuo se representa la capacidad calorífica intrínseca. El área
encerrada entre las dos curvas equivale a la entalpía de desnaturalización, ∆H. Tm es
la temperatura del máximo de la transición y ∆Cp es el incremento de capacidad
calorífica entre el estado nativo y el desplegado.
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Una vez terminado el primer barrido con la proteína, se deja registrar otro barrido
sin extraer la muestra de la célula. Esto permite comprobar el grado de la reversibilidad del
proceso responsable de la transición calorimétrica observada, lo que se suele expresar en
términos de porcentaje del área bajo la curva que se recupera en el segundo barrido. Esto
es de relevancia para un análisis posterior de los datos, ya que no se puede aplicar un
análisis basado en la termodinámica de equilibrio si el proceso observado es irreversible y
no transcurre en equilibrio termodinámico. Existen, sin embargo, criterios más fiables en
CDB para comprobar si una transición corresponde a un proceso de equilibrio o no
(Sánchez-Ruiz et al., 1988; Conejero-Lara et al., 1991 a y b).
Un vez finalizado el experimento, se deben lavar las células inmediatamente con
abundante agua Milli-Q para evitar los depósitos sobre las paredes de los posibles restos de
la proteína y por ultimo se dejan llenas con agua Milli-Q.
3.1.3.4. Calibrado y corrección dinámica.
Para transformar los datos de la señal de voltaje (mV) que proporciona el

calorímetro en valores de capacidad calorífica (J/K) es necesario determinar el valor de la
constante de proporcionalidad entre la potencia de compensación (µW) y la señal
registrada (mV) conocida como constante de calibrado (k) del instrumento. Por ello se
aplica un pulso de potencia conocida a la resistencia de una de las células, midiendo la
variación en la señal que se origina como consecuencia (ver Figura 3.1.4).
Conocida la constante de calibrado (mV/µW) y la velocidad de barrido del
experimento (v en K/min) podemos convertir la señal en unidades de capacidad calorífica
(kJ/K). Posteriormente se normalizan los valores para el numero de moles de proteína
presentes en el interior de la célula, utilizando el volumen efectivo de la célula (Vcel), la
concentración de proteína (c) y su peso molecular (M). Toda esta operación se reduce a
utilizar el siguiente factor de conversión, f:
M ( g / mol ) ⋅ 60( s / min) ⋅10 −6 (W / µW )

f = (3-1-1)
k ( mV / µW ) ⋅ Vcel (ml ) ⋅ c ( mg / ml ) ⋅ν ( K / min)
por el cual se multiplica la señal original en mV para transformarla en capacidad calorífica

molar en kJ/(K·mol).
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Las potencias que se disponen para la calibración en el DASM-4 son 25, 50 y 100
µW. En el caso del VP-DSC, el programa de adquisición utiliza una constante de
calibración determinada por Microcal Inc. para registrar la señal en unidades de mcal/K,
aunque se aconseja llevar a cabo una calibración eléctrica cada seis meses
aproximadamente.
También se aconseja una calibración de la temperatura periódicamente cada seis
meses. Para ello se dispone de dos muestras estándares con puntos de fusión de 28.2 y 75.9
ºC, que consisten en cantidades pequeñas de parafinas contenidas en unos tubos capilares
de acero.
Como todo instrumento de medida, el calorímetro tiene un cierto tiempo de
respuesta, de manera que las curvas obtenidas se encuentran ligeramente distorsionadas.
Por ello es necesario corregir los termogramas para la respuesta dinámica del instrumento.
Para un calorímetro que presenta una dinámica de primer orden basta realizar la siguiente
operación:
dC *p (T )
C p (T ) = C (T ) + τ ⋅ν ⋅
*
p (3-1-2)
dT
donde C p (T) es la señal real producida por el sistema en estudio, C *p (T) la obtenida
experimentalmente y que se encuentra distorsionada por respuesta del instrumento, v la

velocidad de barrido y τ es el tiempo de respuesta del instrumento que previamente se ha
determinado en el proceso de caracterización dinámica del mismo (López-Mayorga, 1983;
Lechuga, 1986; López-Mayorga y Freire, 1987). En el caso del calorímetro DASM-4 el
valor de τ es de 12 segundos, prácticamente independiente de la velocidad de barrido. Para
el VP-DSC la corrección dinámica del termograma se hace de manera automática de
acuerdo con el tiempo de respuesta preseleccionado.
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Figura 3.1.4: Panel A: Perfiles experimentales de capacidad calorífica frente a la

temperatura. En la línea base se muestra un calibrado de 25 µW. El primer y segundo
barrido con la muestra son prácticamente indistinguibles, salvo que la altura de la
endoterma en el segundo es un poco menor. El panel B representa el resultado de restar
al primer barrido la línea base instrumental y el panel C el resultado después de la
conversión de unidades a valores de capacidad calorífica parcial absoluta.
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3.1.3.5. Obtención de la capacidad calorífica molar parcial de la proteína.
Esta bien establecido que una proteína desnaturalizada es acompañada con un

aumento de la capacidad calorífica, es decir, que la capacidad calorífica de la proteína en el
estado desnaturalizado es significativamente mayor que en el estado nativo.
La diferencia de capacidad calorífica entre una disolución de macromoléculas
biológicas y el disolvente correspondiente es normalmente negativa. (ver Figura 3.1.4 (A)).
Para esta diferencia tenemos:
∆C p , p (T ) = C p , p (T ) ⋅ m p − C p , s (T ) ⋅ ∆ms (3-1-3)
en la que Cp,p y Cp,s son las capacidades caloríficas parciales de la proteína y del disolvente
respectivamente, mp la cantidad de la proteína en la célula calorimétrica y ∆ms la cantidad
de disolvente desplazado por la proteína en la disolución.
Teniendo en cuenta que:
Vp (T )
∆m s = m p ⋅ (3-1-4)
Vs (T )
donde Vp (T) y Vs(T) son los correspondientes volúmenes específicos parciales de la
proteína en disolución y del disolvente, obtenemos lo siguiente:
V p (T ) ∆C p , p (T )
C p , p = C p , s (T ) ⋅ + (3-1-5)
Vs (T ) mp
Se puede considerar en el caso de disoluciones acuosas que la capacidad calorífica

del disolvente y su volumen específico, Cp,s (T) y Vs(T), son los del agua pura, 1 cal/K·g y
1 mL/g respectivamente (Privalov y Potekhin, 1986). Por tanto, podemos transformar la
expresión (3-1-5) de la siguiente manera:
C p , p = 4.186.10 −3 ⋅V p (T ) ⋅ M + ∆C p , p (T ) ⋅ f (kJ / K ⋅ mol ) (3-1-6)
donde M es el peso molecular de la proteína en Dalton y f es el factor de conversión de

unidades descrito en la ecuación (3-1-1).
Podemos considerar en buena aproximación el volumen específico parcial de la
proteína igual a 0.73 mL/g, valor promedio para todas las proteínas globulares, confirmado
por los cálculos realizados por Makhatadze et al. (1990) a partir de los volúmenes
específicos de cada aminoácido. El resultado de estos cálculos para nuestro ejemplo
podemos verlo en la Figura 3.1.4 (C).
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3.1.4. Análisis de los termogramas.
Una vez realizadas todas estas correcciones descritas en el apartado anterior,

disponemos de la función capacidad calorífica molar parcial de la proteína en disolución en
función de la temperatura, C p (T ) , para las condiciones experimentales de estudio. A partir
de esta función es posible, en principio, obtener toda la información termodinámica del

proceso de desnaturalización térmica. Para ello, en el caso de que el proceso de
desnaturalización transcurra en equilibrio, es necesario suponer un modelo. A continuación
vamos a resumir brevemente la formulación matemática del modelo más sencillo que se
utiliza para el análisis de los termogramas de CDB, para posteriormente extender la
formulación a modelos más complejos.
3.1.4.1. El modelo de equilibrio de dos estados.
Para muchas proteínas globulares pequeñas se ha observado que en el proceso de

desplegamiento existen únicamente dos estados significativamente poblados: el estado
nativo (N), con una estructura plegada, y el estado desnaturalizado o desplegado (D).
Desde el punto de vista termodinámico-estadístico, estos estados N y D son en realidad dos
macroestados formados cada uno de ellos por multitud de microestados que difieren muy
poco en entalpía. El desplegamiento de estas proteínas puede describirse cuantitativamente
mediante el llamado modelo de equilibrio de dos estados, que se puede esquematizar de la
siguiente forma:
N↔D (3-1-7)
Los dos estados N y D se encuentran en equilibrio en todo momento. La constante de
equilibrio aparente, KD de desplegamiento, viene dada por:
KD =
[N ] (3-1-8)
[D]
y la fracción de proteína que se encuentra en el estado D, x D , será:
xD =
[D] = K D (3-1-9)
[ N ] + [D] 1 + K D
La entalpía molar parcial del sistema viene dada por:
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KD
H = x N ⋅ H N + x D ·H D = H N + xD ⋅ ∆H D = H N + ⋅ ∆H D (3-1-10)
1 + KD
donde ∆HD=HD−HN, es decir, la diferencia de entalpía de desplegamiento. Por

consiguiente, la capacidad calorífica molar parcial viene definida por:
∂ H ∆H D  ∂K  KD  ∂∆H D 
Cp = = C p, N + ⋅ D+ ⋅ (3-1-11)
∂T (1 + K D )2  ∂T  (1 + K D )  ∂T 
donde Cp,N es la capacidad calorífica molar parcial del estado nativo.
Es ahora necesario expresar las dependencias de KD y ∆HD con la temperatura. Para
ello se utilizan las siguientes ecuaciones:
∂∆ H D
= ∆C p (3-1-12)
∂T
∂∆SD ∆C p
= (3-1-13)
∂T T
∆GD 
K = exp  −  (3-1-14)
 RT 
siendo ∆SD, ∆GD y ∆Cp las diferencias de entropía, energía de Gibbs y de capacidad
calorífica molares parciales entre los estados D y N, respectivamente.
Tradicionalmente, ∆Cp se ha considerado aproximadamente constante dentro del
intervalo de temperatura en el que ocurre la desnaturalización de la mayoría de las
proteínas. Sin embargo, un análisis detallado de las curvas de capacidad calorífica de
varias proteínas globulares realizado por Privalov y colaboradores (Privalov et al., 1989)
reveló que la capacidad calorífica del estado desplegado es una función no lineal de la
temperatura, y como consecuencia ∆Cp no es constante. El efecto de la variación de ∆Cp
con la temperatura puede ser importante en transiciones que ocurren en intervalos de
temperatura relativamente amplios. Posteriormente se ha propuesto que es posible estimar
la función capacidad calorífica molar parcial de una cadena polipeptídica desplegada a
partir de su contenido aminoacídico (Makhatadze y Privalov, 1990; Privalov y
Makhatadze, 1990). Así, la función Cp del estado desplegado de una proteína puede
describirse apropiadamente mediante un polinomio de segundo grado. En cambio, la
función Cp del estado nativo es muy aproximadamente lineal en el intervalo de temperatura
previo a la transición de desnaturalización y esta línea recta suele extrapolarse a
temperaturas superiores.
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Consecuentemente, es posible describir las funciones capacidad calorífica molar

parcial de los estados nativo y desplegado mediante las siguientes ecuaciones:
C p , D = a + b·T + c·T 2 (3-1-15)
C p , N = d + e·T (3-1-16)
∆C p = ( a − d ) + (b − e )·T + c·T 2 (3-1-17)
Este tipo de análisis basado en una función ∆Cp cuadrática ya ha sido realizado con
éxito previamente para varias proteínas y dominios en nuestro grupo de investigación
(Viguera et al., 1994; Azuaga et al., 1995).
Conocida la dependencia de ∆Cp con la temperatura es posible integrar las
ecuaciones 3-1-12 y 3-1-13 para obtener las dependencias de ∆HD y ∆SD con la
temperatura a través de las expresiones:
∆H D = ∆ H m + ∫ ∆C p ⋅ dT
T
Tm
∆C p (3-1-18)
∆S D = ∆Sm + ∫
T
⋅ dT
Tm T
donde ∆Hm y ∆Sm son los incrementos de entalpía y entropía de desplegamiento a la
temperatura de transición (Tm). Esta temperatura de transición se define como la
temperatura a la que x D = 0.5 y, por tanto, KD = 1. El valor de Tm corresponde
aproximadamente al máximo de la capacidad calorífica cuando las transiciones son
simétricas y estrechas. A T = Tm, ∆GD = 0, por lo cual el cambio de entropía a la
temperatura Tm, ∆Sm, puede calcularse por a partir de esta ecuación:

∆H m
∆S m = (3-1-19)
Tm
Las formas integradas para la dependencia de ∆HD y ∆SD con la temperatura, a
partir de las ecuaciones (3-1-18), quedan como:
∆H D = ∆H m + (a − d ) ⋅ (T − Tm ) +
(b − e ) 2
( c
)
· T − Tm2 + · T 3 − Tm3 ( )
2 3
T 
∆S D =
∆H m
(
+ ( a − d ) ⋅ ln   + (b − e)·(T − Tm ) + · T 2 − Tm2
c
) (3-1-20)
Tm  Tm  2
∆GD = ∆H − T ⋅ ∆S
54
Finalmente, la capacidad calorífica molar parcial se expresa de la siguiente forma:
(∆ H D )2 KD
C p = C p, N + ⋅ + x ⋅ ∆C p (3-1-21)
RT 2
(1 + K D )2 D
Para la desnaturalización de una proteína, la dependencia de ∆GD con la
temperatura se denomina curva de estabilidad (ver Figura 3.1.5).
Figura 3.1.5: Panel A: Dependencia con la temperatura de los incrementos de

entalpía, entropía y energía libre de Gibbs de desnaturalización de una proteína
hipotética. Panel B: Ampliación del eje de ordenadas de la gráfica A, que muestra las
características esenciales de la curva de estabilidad de la proteína, ∆GD (T). Se indican
las temperaturas correspondientes a la desnaturalización caliente Tm , y fría, Tm* , así
como las temperaturas de inversión de entalpía TH y TS a las que ∆HD y ∆SD se hacen
cero, respectivamente.
55
Varios trabajos han destacado sus propiedades más importantes, que se resumen a
continuación (Bercket y Schellman, 1987; Schellman, 1987): La pendiente de la curva de
estabilidad viene dada por la expresión − ∂∆GD ∂T = ∆S D y muestra un único máximo
precisamente a la temperatura TS en la que ∆SD es igual a cero. Además se define la
temperatura TH a la cual la entalpía de desnaturalización es cero (TH es ligeramente más
baja que TS). Por otra parte la curvatura viene dada por ∂ 2∆GD ∂T 2 = − ∆C p T y sólo
adquiere valores negativos, dado que el ∆Cp de desnaturalización es siempre positivo (ver
Figura 3.1.3). También podemos ver en la Figura 3.1.5-B, que el máximo de ∆GD se
presenta a temperaturas relativamente bajas, cercanas a la fisiológica, estando favorecido el
estado nativo en estas condiciones. El valor de ∆GD a temperatura ambiente (generalmente
25 ºC) constituye una medida de la estabilidad de la proteína. El punto de corte con cero
alta temperatura corresponde a la temperatura de desnaturalización, Tm, definida
anteriormente, mientras que el punto de corte con cero a baja temperatura, Tm* , es el
resultado de la extrapolación de la curva, por lo que podría esperarse que hubiera una
desnaturalización de la proteína por “frío”. Este fenómeno fue predicho hace unos 30 años
por Brandts (1964) y demostrado experimentalmente por Privalov et al (1986). Varios
estudios de CDB (Privalov et al., 1986; Griko et al., 1988, 1989; Tamura et al., 1991;
Griko y Privalov, 1992; Azuaga et al., 1992) sugieren que la desnaturalización fría es una
propiedad común de las proteínas globulares, confirmando así las características ya
mencionadas de la curva de estabilidad.
Hay que hacer énfasis en este momento en que la formulación matemática descrita
hasta ahora solo es aplicable al análisis de las curvas de Cp en el caso de que el modelo de
equilibrio de dos estados describa adecuadamente el proceso de desnaturalización en
estudio.
Hasta muy recientemente, la CDB se ha venido considerando una técnica suficiente
para comprobar la aplicabilidad del modelo de dos estados al análisis del proceso de
desnaturalización de una proteína (Tanford, 1968; Privalov, 1979: Schellman, 1987;
Jackson y Fersht, 1991; Viguera et al., 1994). Esto ha sido debido a que la CDB es capaz
de medir de forma directa e indirectamente el incremento de entalpía del proceso de
desnaturalización. El valor de la entalpía de desnaturalización se refleja no sólo en el área
bajo la curva de la transición de desnaturalización (Figura 3.1.6), llamada entalpía
56
calorimétrica, sino que además se manifiesta en la anchura de la transición, es decir,

controla la forma de la curva de Cp, según se deduce de la ecuación de van´t Hoff, que
proporciona la variación de la constante de equilibrio con la temperatura:
d ln K D ∆H vH
= (3-1-22)
dT RT 2
∆HvH se llama entalpía de van´t Hoff.
50
400 kJ/mol
40
·K )
-1
300 kJ/mol
-1
30
Cp (kJ·mol
20
200 kJ/mol
10
20 30 40 50 60 70 80 90
T(ºC)
Figura 3.1.6: Curvas simuladas de capacidad calorífica de exceso en función de

la temperatura mediante las ecuaciones del modelo de equilibrio de dos estados para un
∆Cp = 5 kJ/mol·K, la temperatura de transición Tm = 50 ºC y los valores de entalpía
∆HD en kJ/mol se muestran en la figura para cada curva.
La determinación de ambas entalpías (calorimétrica y de van’t Hoff) a partir de las

curvas de Cp es relativamente sencilla (Privalov et al., 1979), de forma que el criterio
calorimétrico para una transición de dos estados consiste en la coincidencia entre ambas
entalpías. Para un cierto numero de proteínas globulares pequeñas, Privalov y
57
colaboradores (Privalov et al., 1979) encontraron que la relación entre la entalpía

calorimétrica y la de vant’ Hoff, r = 1.05±0.03, lo que indica una baja proporción de
estados intermedios y, por tanto, una buena concordancia con el modelo de dos estados.
Sin embargo, estos cálculos requieren una manipulación previa de las curvas de Cp
bastante acusada, que puede conducir a errores importantes, especialmente en transiciones
relativamente anchas, como es el caso del dominio SH3 objeto de estudio de esta Memoria.
Esa es la razón de que la forma más fiable del criterio calorimétrico consista en realizar
directamente el ajuste por métodos de mínimos cuadrados no lineales de la curva
experimental de Cp al modelo de dos estados, utilizando las ecuaciones 3-1-7 a 3-1-21,
como se describe en el apartado siguiente. La buena concordancia del ajuste suele tomarse
como prueba suficiente de la validez del modelo de dos estados (Viguera et al., 1994;
Freire, 1995; Privalov et al., 1995).
Recientemente han aparecido, sin embargo, dudas sobre la validez del criterio
calorimétrico como condición suficiente para la aplicación del modelo de dos estados.
Karplus y colaboradores (Zhou et al., 1999) han demostrado que es posible ajustar al
modelo de dos estados curvas de CDB que han sido simuladas utilizando un modelo de tres
estados significativamente poblados en equilibrio. Estos autores plantean que la CDB no
siempre es sensible a la presencia de estados intermedios de equilibrio de plegamiento, y
esto depende de sus magnitudes termodinámicas con relación a los estados nativo y
desplegado.
Para validar el modelo de dos estados u otros modelos de desplegamiento más
complejos, parece ser conveniente, por lo tanto, complementar los estudios de
desplegamiento de proteínas por CDB con otras técnicas experimentales, como por
ejemplo, electroforesis en gel (Creighton, 1986), espectroscopia de dicroísmo circular o
fluorescencia (Filimonov et al., 1993; Viguera et al., 1994b; van Nuland et al., 1998;
Azuaga et al., 1999) cromatografía de exclusión molecular (Uversky, 1993; Conejero-Lara
y Mateo, 1996), ultracentrifugación analítica (Azuaga et al., 1995), intercambio hidrógeno-
deuterio (Yi y Baker, 1996; Sadqi et al., 1999) así como estudios cinéticos de los procesos
de plegamiento y desplegamiento (Jackson y Fersht, 1991; Viguera et al., 1994b).
58
3.1.4.2. Otros modelos de equilibrio.
Se han encontrado gran cantidad de proteínas, especialmente las más complejas,

para las que el modelo de dos estados no es válido al tratar de explicar los datos obtenidos
por CDB para su desnaturalización térmica de equilibrio. Esto puede deberse a: i) una
población apreciable de estados intermedios de plegamiento en equilibrio con los estados
nativo y desplegado (Xie et al., 1991; Montgomery et al., 1993); ii) cambios en el grado de
asociación de la proteína concomitantes con su desplegamiento (Conejero-Lara et al.,
1994); iii) ambas situaciones ocurriendo simultáneamente (Thompson et al., 1993; Sanz et
al., 1994; Azuaga et al., 1995; Conejero-Lara y Mateo, 1996; Filimonov y Rogov, 1996).
Un método general para el análisis de equilibrio de los datos de CDB fue propuesto
originalmente por Friere y Biltonen (1978) para equilibrios sin cambios en el grado de
asociación.
En un esquema general de equilibrio se suponen una serie de estados poblados
monoméricos de la proteína en el proceso de desnaturalización:
I 0 ↔ I 1 ↔ I 2 ↔ ... ↔ I n −1 ↔ I n
I0 es el estado nativo, In es el estado completamente desplegado y existen n-1 estados

intermedios.
La función de partición del sistema se puede definir, utilizando el estado nativo, I0 ,
como estado de referencia:
n
Z (T ) = 1 + ∑ exp (− ∆Gi RT ) (3-1-23)
i =1
donde ∆Gi es la energía de Gibbs del estado Ii, reférida al estado I0 . La fracción de
moléculas de proteína, xi, que se encuentran en el estado Ii será:
xi =
[I i ] = exp (− ∆ Gi RT )
(3-1-24)
Z (T )
∑ [I i ]
n
i= 0
y la entalpía media del sistema <∆H> será el promedio de las contribuciones de todos los
estados presentes:
n n
 exp (− ∆Gi RT ) 
< ∆H >= ∑ ∆H i ⋅ xi =∑  ∆H i ⋅  (3-1-25)
i =1 i =1  Z (T ) 
59
La capacidad calorífica se obtiene derivando la ecuación 3-1-25 respecto a T:
C p = C p (I 0 ) + =
(
∂ < ∆H > < ∆H 2 > − < ∆H > 2 )
+ < ∆C p > (3-1-26)
∂T RT 2
donde <∆H2 > es el valor medio de H2 = Σxi·Hi2 . El primer término en el lado derecho de la
ecuación (3-1-26) es debido a los cambios inducidos por la temperatura en el equilibrio de
desnaturalización, mientras el segundo termino es la capacidad calorífica promedio de la
proteína <∆Cp > = Σxi·∆Cp,i.
A partir del desarrollo de este formalismo, utilizando la CDB es posible caracterizar
completamente el procesos de desnaturalización en equilibrio (ver Freire y Biltonen, 1978,
para más detalles). Estos autores llegaron mediante un procedimiento recursivo a
determinar el número de estados intermedios significativamente poblados y a
caracterizarlos termodinámicamente. En la literatura, se pueden encontrar modificaciones
de este procedimiento para el análisis de los termogramas de CDB (Filimonov et al., 1982;
Gill et al., 1985; Xie et al. 1991). También existen modificaciones de este procedimiento
para el análisis de equilibrios en los que ocurren cambios del grado de asociación de la
proteína (Thompson, et al., 1993; Filimonov et al., 1993; Azuaga et al., 1995) o unión de
ligandos (Ramsay y Freire, 1990).
3.1.4.3. Ajuste de las curvas de capacidad calorífica molar parcial.
Como se ha mencionado anteriormente, la forma más correcta de llevar a cabo el

análisis de las curvas de Cp obtenidas para la desnaturalización térmica de una proteína
consiste en ajustar los datos experimentales por métodos de mínimos cuadrados no lineales
utilizando las ecuaciones derivadas del modelo elegido.
Los ajustes realizados en esta Memoria se han llevado a cabo utilizando el
programa Origin 5.0 (Microcal Inc.). Para el caso más común de ajuste utilizando el
modelo de dos estados, las curvas de Cp se ajustan con la ecuación 3-1-21. Es necesario,
sin embargo, definir previamente en función de la temperatura todas las magnitudes en las
que depende Cp en la ecuación 3-1-21. Esto se realiza utilizando las ecuaciones del modelo
dentro de un conjunto de sentencias o “script” en la subrutina de ajuste del programa
Origin. En el Apéndice A se ha incluido el script utilizado para el ajuste de las curvas de
Cp . De esta forma, la Cp queda expresada en función de la temperatura y de una serie de
60
parámetros de ajuste apropiados. Para los ajustes realizados en esta Memoria se han
elegido los siguientes:
- Tm: Temperatura a la que ∆GD = 0.
- ∆Hm: Incremento de entalpía de desnaturalización a T = Tm.

- ∆Cp,m: Incremento de capacidad calorífica a T = Tm.
- a : Ordenada en el origen de la función Cp,D (ecuación 3-1-15).
- e : Pendiente de la función Cp,N (ecuación 3-1-16).
Los parámetros b y c de la ecuación 3-1-15 se mantienen fijos en los ajustes
utilizando los valores obtenidos mediante la regresión cuadrática de los datos de Cp,D
calculados a partir de la secuencia de la proteína (Makhatazde y Privalov, 1990). Todas las
demás magnitudes en las ecuaciones del modelo son dependientes de los parámetros
anteriores. De esta forma, cada curva de Cp se ajusta utilizando 5 parámetros
independientes.
El programa Origin 5.0 proporciona intervalos de error bastante rigurosos en la
determinación de cada parámetros en un ajuste, basándose en el análisis de la matriz de
varianza-covarianza del ajuste para un intervalo de confianza del 95% (ver el Manual de
Usuario del programa Origin 5.0).
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Francisco Conejero Lara, Obdulio López Mayorga y Mourad Sadqi. Departamento de Química Física.

Este documento corresponde a los materiales y métodos de la memoria “ESTUDIO

3.1. CALORIMETRIA DE DIFERENCIAL DE BARRIDO.

3.1.1. Introducción a la calorimetría diferencial de barrido.

La calorimetría diferencial de barrido (CDB) es generalmente considerada hoy en

2. Los parámetros termodinámicos globales (los cambios de entalpía [∆H], de entropía

3.1.2. El calorímetro diferencial de barrido.

3) El conjunto de células es fijo (no desmontable), lo que permite una mayor

En general, un microcalorímetro de CDB consiste básicamente en dos células

realización de experimentos de alta concentración, y el VP-DSC, adquirido recientemente

sólo 50 µg de proteína en la célula de muestra, algo impensable con las generaciones

3.1.3. Experimento calorimétrico.

3.1.3.1. Preparación del experimento.

En general, para la realización de un experimento de CDB, las disoluciones de

Una vez preparada la disolución y antes de comenzar el experimento, se procede al

3.1.3.2. Línea base instrumental

3.1.3.3. Barrido con la muestra de proteína.

Una vez termina la adquisición de la línea base, esperamos a que el calorímetro

Figura 3.1.3: Curva de capacidad calorífica (trazo continuo) en función de

3.1.3.4. Calibrado y corrección dinámica.

Para transformar los datos de la señal de voltaje (mV) que proporciona el

M ( g / mol ) ⋅ 60( s / min) ⋅10 −6 (W / µW )

por el cual se multiplica la señal original en mV para transformarla en capacidad calorífica

experimentalmente y que se encuentra distorsionada por respuesta del instrumento, v la

Figura 3.1.4: Panel A: Perfiles experimentales de capacidad calorífica frente a la

3.1.3.5. Obtención de la capacidad calorífica molar parcial de la proteína.

Esta bien establecido que una proteína desnaturalizada es acompañada con un

Se puede considerar en el caso de disoluciones acuosas que la capacidad calorífica

donde M es el peso molecular de la proteína en Dalton y f es el factor de conversión de

3.1.4. Análisis de los termogramas.

Una vez realizadas todas estas correcciones descritas en el apartado anterior,

de esta función es posible, en principio, obtener toda la información termodinámica del

3.1.4.1. El modelo de equilibrio de dos estados.

Para muchas proteínas globulares pequeñas se ha observado que en el proceso de

donde ∆HD=HD−HN, es decir, la diferencia de entalpía de desplegamiento. Por

Consecuentemente, es posible describir las funciones capacidad calorífica molar

∆C p = ( a − d ) + (b − e )·T + c·T 2 (3-1-17)

temperatura Tm, ∆Sm, puede calcularse por a partir de esta ecuación:

Finalmente, la capacidad calorífica molar parcial se expresa de la siguiente forma:

Figura 3.1.5: Panel A: Dependencia con la temperatura de los incrementos de

calorimétrica, sino que además se manifiesta en la anchura de la transición, es decir,

Figura 3.1.6: Curvas simuladas de capacidad calorífica de exceso en función de

La determinación de ambas entalpías (calorimétrica y de van’t Hoff) a partir de las

colaboradores (Privalov et al., 1979) encontraron que la relación entre la entalpía

3.1.4.2. Otros modelos de equilibrio.

Se han encontrado gran cantidad de proteínas, especialmente las más complejas,

I0 es el estado nativo, In es el estado completamente desplegado y existen n-1 estados

La capacidad calorífica se obtiene derivando la ecuación 3-1-25 respecto a T:

3.1.4.3. Ajuste de las curvas de capacidad calorífica molar parcial.

Como se ha mencionado anteriormente, la forma más correcta de llevar a cabo el

- ∆Hm: Incremento de entalpía de desnaturalización a T = Tm.

Privalov, P.L. y Filimonov, V.V. (1978) J. Mol. Biol. 122, 447.

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