Tecnología del DNA

recombinante
Curso: Biología Celular y Molecular
Oscar Nolasco Cárdenas MSc.
oscarnol@hotmail.com
Noviembre 2017
 Tecnología del DNA recombinante
DNA recombinante: Es el DNA compuesto por
segmentos de DNA de diferentes orígenes

Dos importantes enzimas en la generación de

DNA recombinate

 Enzimas de restricción:
Corta el DNA de un organismo en una secuencia
especifica.
 DNA Ligasas:
Une fragmentos de DNA produciendo DNA
recombinates.
 Enzima de
Mecanismo para restricción
cortar y unir DNA

Enzima de restricción: EcoRI

Secuencia de reconocimiento
palindrome

5` GAAT T C 3` 5` G AAT T C 3`
3` C T TAAG 5` 3` C T TAA G 5`
Corte Extremos
cohesivos

Enzima de restricción: HpaI

5` G T TAAC 3` 5` GT T A AC 3`
3` CAAT T G 5` 3` CA A T T G 5`

Extremos
Corte Romos
 Mecanismo para
cortar y unir DNA

5` OH
3` T T A A P Extremos
DNA Ligasa OH cohesivos
5` A A T T 3`
+
3`
P
T T A A
P
5` +
Unión por OH
5` OH Fragmentos
A complementaridad
3` T T A A P de pares de bases B y C no
DNA apareados
ligasas

B
5` OH
3` C G P
5` A A T T 3`
5` OH
C 3` T T A A 5`
3` T A C G P
Métodos para marcar ADN in vitro
Métodos para marcar ADN in vitro
 Clonación
 Generar copias idénticas de un organismo,
células o secuencias de ácidos nucleicos de un
organismo
La oveja Dolly Genes clonados
• Tecnología desarrollada para clonar genes

 Involucra la intervención humana.

 Origina una nueva generación
 Elementos necesarios para una clonación
de secuencias
 Vector
segmento de DNA con propiedad de replicarse y ser
funcional dentro de un organismo. Posee un
segmento de selección (antibiótico) y otro de inserción
de un DNA foráneo
Plasmidos, bacteriofagos,adenovirus, baculovirus, Vector
Plasmido
 El hospedero celular
organismo que sirve para albergar al vector y su
inserto.
E.coli, levadura, celulas humanas, celulas insecto
 Secuencia a insertar INSERTO
segmento de DNA de interés que queremos reproducir
y/o expresar. Ejm. un segmento de genoma, gen,
cDNA, etc.
Fragmento de
DNA para ser
clonado
ORI Amp R.
Las células que
no tienen el
plasmido
mueren en
ORI Amp R. placas con
ampicilina
Vector
Plasmido
+ El vector es
Las células
transformadas
cortado y Transformación de E.coli son las que
Fragmento Plasmido
ligado al Recombinante (CaCl2, electroporación) sobreviven
DNA a ser inserto Cultivadas en placas
clonado Cromosoma
conteniendo ampicilina
Bacteriano

El plasmido
tiene una
replicación
independiente

Multiplicación
celular
 Plasmidos
• Permite insertos menores de 10 kb
• Existen una gran variedad de plasmidos y son la base del desarrollo de los otros
sistemas de clonación
Bacteriofagos
• Permite insertos de 20 – 30 kb
• Lambda es el bacteriofago comúnmente empleado
• Presenta mayor eficiencia en transformar células en comparación a los plasmidos
Cosmidos
• Permite la inserción de 40 Kb
• Los cosmidos combinan los elementos esenciales de un plasmido y un bacteriofago

Bacterial Artificial Chromosomes(BACs)

• BACs permiten la inserción de 300 kbs.
• El factor F de E.coli es capaz de mantener fragmentos largos de DNA.
Yeast Artificial Chromosomes(YACs)
• YACs permiten la inserción de 300-500 kbs.
• YACs : un centromero de levadura con dos telomeros de levadura. Un origen de
replicacion bacteriano marcadores de seleccion.
• YAC plasmidoCromosoma de levadura
Multiple cloning site (Polylinker)
Blue/White Selección
 Librerias genomicas
(Colección de secuencias de
un orgamnismo clonadas a
partir de DNA
Genomico total o de
cromosomas )
Usos secuenciamiento
análisis de secuencias

Librerias de
expresión o de
cDNA
(Colección de secuencias de un
orgamnismo clonadas a partir
de cDNA- copia de mRNA)
Usos análisis de proteínas
Expresión de genes, los vectores
para esta finalidad
tienen que tener un promotor
fuerte de expresión
 Clonación de cromosoma en diferentes clones
a diferentes escalas según su tamaño

33,000 clones BAC por

juego haploide (entre 5-
7X veces el tamaño
completo de DNA)
para cubrir 95-98%
genoma

BAC plásmido secuencia

Separatas páginas párrafos
 Bibliotecas de expresión
Aislación de mRNA
Porque expresar?
Cuando el producto de la secuencia clonada es
una proteína.
 La identificación de un gen en una libreria o
biblioteca requiere de su expresión.
 Para sobreproducir una proteína y purificarla.
 Para estudios in vivo de la proteína.

• La mayoría de mRNAs eucariotes son

poliadenilados en el 3’

5’ cap
AAAAAAAAAAn

• Oligo (dT) pueden enlazarse a poli(A) y

pueden usarse para recuperar mRNA.
Sintesis de cDNA :

Sintesis de la primera hebra:

transcriptasa reversa
Screening por Expresión

Identificación del producto

proteico del gen de interes

1. Actividad de la proteína

2. Empleando un anticuerpo
especifico
 Algunas proteínas recombinantes en
salud humana
• Insulina Diabetis
• Interferón Alfa Cancer
• Interleukinas Cancer
• Factores VIII, IX de coagulación
• Activador tisular del plasminógeno
• Hormona del crecimiento HGH Dwarfism Estatura corta
• Vacunas (anticuerpos y antígenos) Herpes,
Hepatitis B vacuna
Malaria
AIDS
 Animales transgénicos
• Animales que portan genes o secuencias
de DNAexógeno
• Métodos de transferencia de genes
Microinyeccion directa
Mediada por virus
Embrionica stem cells
Transferencia Nuclear
Sperm-mediated gene transfer
Transferencia de genes mediante cromosomas
artificiales
Transgenesis in Mice
Microinjection
Transgenesis in Mice
Retroviral Vector
• Embrionicas stem cells
• • Derivada del embrion en estado de blastocito
• • Dividida in vitro indefinidamente sin diferenciacion
• Pueden ser transfectados con transgenes o con
remosion de genes (knockout)
• Transferencia nuclear
• • Dolly 1997
• • Las células somáticas pueden ser
transfectadas o geneticamente alteradas
antes de la transferencia nuclear
 Diagnóstico Molecular
• Caracterización de mutaciones causales en
genes o marcadores asociados a
enfermedades.
• Diagnóstico en pacientes, prenatal
(microvillosidades coriónicas 8-11 sem,
amniocentesis 12-18 sem), presintomático,
preimplantacional.
• Sirve para determinar la enfermedad:
pronóstico, prevención, tratamiento, terapia,
consejo genético en posibles portadores, etc.
• TECNOLOGIAS DE DIAGNOSTICO
• Tecnologías de diagnostico NO basadas
en NAT
• Tecnologías de diagnostico
basadas en Ácidos nucleicos
(NAT)
PCR: Métodos basados en amplificación
FISH : Métodos basados en hibridación
 La Reacción en Cadena de la Polimerasa
Técnica desarrollada por el Premio Nobel Kary Mullis
Basada en el descubrimiento de la actividad biológica a altas temperaturas de las
DNA polimerasas encontradas en bacterias termófilas.

Kary Mullis 1983

http://www.nobel.se/chemistry/laureates/1993/mullis-
autobio.html
Mullis, K.B. (1990) The unusual origin of the polymerase chain
reaction. Scientific American. 262 (4) 56-65.
 PCR - Aplicaciones

La técnica de PCR es una herramienta esencial dentro de la

biología molecular:

 clonación
 secuenciación
 diagnóstico
 Mutagénesis sitio-dirigida
 Análisis de mutaciones
 Cuantificación de diferencias en expresión génica (RT-
PCR)
 Pruebas de paternidad
 Análisis forense
 Control de calidad a nivel industrial
 PCR cuantitativo : Real Time PCR
Permite conocer la cinética de un PCR eliminando
la necesidad de una competición de un co-
amplificado con el blanco de la muestra.
Mayor robustez del sistema, menos laboriosa,
menos contaminación.
Cuantificación relativa y absoluta
PCR en tiempo real son mas costosas y los
sistemas todavía no alcanzan su desarrollado para
su masificación. Presencia de inhibidores en la
muestra
– El CT está relacionado principalmente por la
cantidad de ADN presente al inicio de la
reacción .
• Los sistemas de fluorescencia para PCR en tiempo real
se pueden categorizar por el agente reportero :

 Sistemas con Agentes intercalantes.

Sistema de deteccion no especifica
 (dsDNA)  SYBR Green
 Sistemas con sondas especificas
 Sondas de hidrólisis (Taq man)
 Molecular Beacons
 Sondas FRET
 Sistemas con estructuras fluorescentes
 Sunrise primers
 Scorpion primer
 Real-Time PCR for Detection and Identification of Plasmodium spp.
Kathy A. Mangold,1,2 Rebecca U. Manson,2 Evelyn S. C. Koay,3,4 Lindsey
Stephens,1
MaryAnn Regner,1 Richard B. Thomson, Jr.,1,2 Lance R. Peterson,1,2
and Karen L. Kaul1,2*
JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, May 2005, p. 2435–2440 Vol. 43, No. 5
Xpert® MTB/RIF assay: development, evaluation and implementation of a new rapid molecular
diagnostic for
tuberculosis and rifampicin resistance. Stephen D Lawn and Mark P Nicol
 Métodos basados en hibridación
• PNA FISH
• Evolución de una sonda de nucleótidos a una sonda de acido nucleico
peptídico PNA es un oligomero sintético que imita la estructura del DNA o
el RNA, la carga negativa del esqueleto azúcar fosfato es remplazada por
una molécula sin carga N-(2 aminoetil) glicina al cual se une la base
nitrogenada por un enlace metilen carbonil
• Son menos susceptibles de inhibición por impurezas en diferentes
muestras clínicas a comparación de los métodos basados en amplificación
• Tecnologías de diagnostico NO
basadas en NAT
• Uso de anticuerpos
• Uso de bacteriofagos (MicroPhage)
• Herramientas de proteomica:
matrix-assisted laser desorption–ionization
time-offlight mass spectrometry (MALDI-
TOF MS)
 SECUENCIAMIENTO DE ADN
• Determinar el ordenamiento de los nucleótidos
en un fragmento de ADN
• Dos Métodos desarrollados a fines de los
70s:
– Método Químico Maxam y Gilbert
– Método Enzimático Sanger de análisis post
reacción
• Ambos basados en la obtención de moléculas con
terminaciones en A, G, C y T; para separar estos
fragmentos en geles de poliacrilamida denaturantes.
Radioactividad
reemplazado a
partir de
1987
Dideoxinucleotidos
marcados
fluorescentemente
 Diciembre 2000
Un consorcio internacional completa el secuenciamiento del genoma de la
primera planta Arabidopsis thaliana de125 Mb.
Febrero 2001
El consorcio HGP publica su borrador en Nature (15 Febrero), y Celera lo
publica en Science (16 Febrero)
Nuevos métodos de secuenciamiento
Pirosecuenciamiento
Secuenciamiento Masivo permite obtener genomas en menor tiempo, se
incrementa el numero de secuencias, se reduce el tamaño de los
fragmentos
MICROARRAYS
 Referencia:
Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al.
Molecular Biology of the Cell. 5th edition.
New York: Garland Science; 2008.
Chapter 8. Manipulating, proteins, DNA
and RNA