Departamento de Ingeniería química

Fundamentos de los procesos biológicos

Laboratorio 1

Construcción de curva de calibración

Integrantes: López Martínez Tatiana de los Ángeles.

Martínez Valle Kenneth Engel.
Montenegro López Cory Abraham.
Narváez Amoretty Stephanie Michelle.
Picado Vanegas Walther Enrique.
Rodríguez Toruño Ángeles Lucia.

Grupo: 4T2Q

Docente: Zoraya del Carmen Pérez Zelaya

Managua, Nicaragua. Viernes 07 de marzo de 2019

 I. Introducción

Un procedimiento analítico muy utilizado en análisis cuantitativo es el llamado de

calibración que implica la construcción de una “curva de calibración”.

Una curva de calibración es la representación gráfica de una señal que se mide en

función de la concentración de un analito. La calibración incluye la selección de un
modelo para estimar los parámetros que permitan determinar la linealidad de esa curva.
y, en consecuencia, la capacidad de un método analítico para obtener resultados que
sean directamente proporcionales a la concentración de un compuesto en una muestra,
dentro de un determinado intervalo de trabajo.
 II. Objetivo General y Especifico
 Cuantificar por medio de la técnica de tubos múltiples la cantidad de células
viables conformadas en colonias para la construcción de curvas de calibración
mediante turbidimetria.
 III. Marco teórico
La etapa de calibración analítica se realiza mediante un modelo de línea recta que
consiste en encontrar la recta de calibrado que mejor ajuste a una serie de “n” puntos
experimentales, donde cada punto se encuentra definido por una variable “x” (variable
independiente, generalmente concentración del analito de interés) y una variable “y”
(variable dependiente, generalmente respuesta instrumental). La recta de calibrado se
encuentra definida por una ordenada al origen (b) y una pendiente (m), mediante la
ecuación y = mx + b .
A partir de la curva de calibración (conjunto de concentraciones que describen el intervalo
en el cual se deberá cuantificar el compuesto por analizar) y a fin de asegurar que la
recta encontrada con los puntos experimentales se ajuste correctamente al modelo
matemático de la ecuación se calculan los valores de la ordenada al origen, la pendiente
y el coeficiente de determinación (r2).
Por tener una buena exactitud y confiabilidad estadística, el método más empleado para
encontrar los parámetros de la curva de calibrado es el método de los mínimos cuadrados
Este método busca la recta del calibrado que haga que la suma de los cuadrados de las
distancias verticales entre cada punto experimental y la recta de calibrado sea mínima o
tienda a cero. A la distancia vertical entre cada punto experimental y la recta de calibrado
se le conoce como residual. En forma gráfica se representa como:

Figura 1. Curva de calibración con un n=5

De acuerdo a este método, las expresiones matemáticas para calcular la pendiente (m)
y la ordenada al origen (b), así como el coeficiente de determinación (r2 ) son:

En la práctica para construir la curva de calibración se utilizan disoluciones que contienen

concentraciones conocidas de analito, llamadas disoluciones patrón o estándar. Los
estándares o disoluciones patrón para construir la recta de calibrado deben ser
preparadas en forma independiente, a partir de una o varias soluciones madre; el número
de puntos a escoger dependerá del uso que se dé a la recta de calibrado. Si bien con
dos puntos se puede construir una curva, estadísticamente se requieren por los menos
tres para que la curva sea confiable; este número se suele aplicar a métodos de rutina
perfectamente establecidos y validados (proceso por el cual se demuestra, por estudios
de laboratorio, que la capacidad del método satisface los requisitos para la aplicación
analítica deseada).
Sin embargo, si el método está en una etapa de desarrollo, el número de puntos mínimo
será de cinco o seis para que la variabilidad sea mínima y el intervalo lineal sea suficiente.
Hay que considerar que un aumento en el número de puntos experimentales implicara
mayor fiabilidad en la recta de calibrado. La verificación del comportamiento de un analito
mediante una curva de calibración requiere un mínimo de cinco puntos para un intervalo
de confianza del 95 % y de ocho puntos para uno del 99 %.
Cabe mencionar que en la práctica es muy importante efectuar la medida del “ blanco”4
Se llaman disoluciones blanco o simplemente blancos a las disoluciones que contienen
todos los reactivos y disolventes usados en el análisis, pero sin el analito. Los blancos
miden la respuesta del procedimiento analítico a las impurezas o especies interferentes
que existan en los reactivos o, simplemente, a las especiales características del
instrumento de medida.
 IV. Procedimiento
1. Preparación de inoculo
 La preparación del inoculo fue realizada por el encargado de laboratorio como una
forma de ahorrar tiempo para que los grupos pudieran hacer sus pruebas con
calma ya que la preparación duraba 5 horas, de modo que cuando se ingresó al
laboratorio se procedió directamente a la determinación de ufc/ml.

2. Determinación de UFC/ml
 se tomaron 6 tubos de ensayo previamente esterilizados, que contenían 9ml de
agua destilada.
 Se tomó una pipeta esterilizada con 1ml de inoculo y se depositó en el primer tubo
de ensayo (10-1) ver figura 2, estos procedimientos se realizaron de la misma
forma para los tubos de 10.2 a 10-6. (cabe destacar que, para cada toma de
muestra en los tubos, se realizaron flameando cada tubo cerca del mechero, a la
vez se ocupó 1 pipeta estéril distinta para cada tubo para evitar la contaminación)
 A partir de cada tubo (10-1 a 10-6), se colocó 1ml de cada muestra en 6 placas
Petri distintas que contenían el medio de cultivo ASHBY modificado y se esparció
en toda la superficie con ayuda de una varilla de vidrio en forma de L (de igual
manera este procedimiento se realizó flameando y cerca del mechero).
 Luego se incubaron cada placa a una temperatura de 37°C y se dejaron incubando
por tres días, para ir a hacer el recuento de colonias el día lunes.
 El proceso de medición de absorbancia no se realizó debido a que el
espectrofotómetro estaba descalibrado.
 V. Resultados
El dia lunes que se realizo la medida de ufc, se noto que en la disolucion 10-1 habian mas
UFC y que a medida que ibamos midiendo los demas tubos de ensayos en el orden ya
estipulado se notaban que habian menos UFC
VI. Conclusión
 VII. Anexos.

Figura 2. Determinacion de UFC/ml