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Anexos Bactroy PDF
Anexos Bactroy PDF
ANEXOS 33
MÓDULO 1: DESCRIPCIÓN DE EMPRESA, PRODUCTO Y SERVICIO 34
1.1 Empresa 34
1.2 Producto 34
Módulo 2: PLANEACIÓN ESTRATÉGICA 46
2.1 Información de Mercado 46
2.1.1 Mercado Meta 47
2.1.2 Nicho de Mercado 47
2.1.3 Tamaño del mercado Global 47
2.1.4 Tamaño de mercado Regional 48
2.1.5 Participación Inicial de Mercado 49
2.2 Estado del arte 51
2.2.1 Biofilm en la industria de cárnicos 51
2.2.2. Aplicaciones de bacteriófagos en la industria alimentaria. 52
2.2.3. Producción de bacteriófagos en biorreactores 54
2.3 Factibilidad técnica 55
2.3.1 Elección de bacteriófagos 55
2.4. Especificaciones del producto 57
2.4.1 Instrucciones de uso del producto 57
2.4.1.1. Caso demostrativo: Tina tipo chiller 58
2.4.1.2. Caso demostrativo: Tina tipo Ahumador Fessman. 61
2.4.2. Superficie cubierta por el equipos 62
2.4.3. Vida de anaquel 62
2.3 Diagrama de Flujo 62
2.4 Diagrama de Proceso 63
2.5 Localización de Planta(Laboratorio) 66
2.6 Balance de Materia 68
2.7 Costos Operativos 71
MÓDULO 3: DISEÑO DE OPERACIONES UNITARIAS 72
3.1 Análisis de Operación 72
3.1.1 Cultivo bacteriano 72
3.1.2 Cultivo de bacterifagos 73
3.2.3 Primera microfiltración 73
3.2.4 Ultrafiltración 74
3.2.5 Diafiltración 74
3.2.6 Mezclado 74
3.2.7 Segunda ultrafiltración 74
3.2 Caracterización de Equipo 74
3.3 Estimación de Capacidades 76
3.4 Consulta con Proveedores 77
MÓDULO 4: CONTROL Y ASEGURAMIENTO DE CALIDAD 78
4.1 Normas Nacionales e Internacionales 78
4.1.1 Normas Nacionales 78
4.1.2 Normas Internacionales. 79
4.2 Puntos Críticos de Control 81
4.2.1 Análisis de Modo y Efecto potencial de Falla 81
4.2.1. Estrategias de control 84
4.3 Puntos Críticos de Seguridad 86
4.3.1 Manejo de Riesgo biológico 86
4.3.2. Características generales de la estructura 87
4.3.3. Prevención y reacción a incendios. 87
4.3.4. Otras normas relevantes 88
4.4 Certificaciones y distintivos 88
Referencias 90
A) PROPUESTA PEI
a) Título del proyecto.
Proyecto de diseño y producción de un cóctel de bacteriófagos con aplicación en remoción del biofilm
formado en la industria de producción de carnes frías.
b) Generalidades.
Fundada en 2018 por cuatro Ingenieros Biotecnólogos, MEPS Solutions surge con el objetivo de
ofrecer una respuesta efectiva e innovadora al problema de formación de biofilm en las diversas
industrias alimentarias en México. Nuestro primer producto a diseñar está pensado para industria de
producción y manejo de carnes frías. “Bactroy” es un plaguicida antimicrobiano de tipo sanitizante para
uso sobre superficies en contacto con alimentos. Consiste en una solución de cuatro bacteriófagos
enfocados a la eliminación de cuatro de los principales organismos encontrados en el biofilm formado en
esta industria: Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Pseudomonas fluorescens y Escherichia
coli. Coadyuvando en los protocolos usuales de limpieza, previniendo el alojamiento y crecimiento de
microorganismos patógenos que pueden representar tanto un peligro para los consumidores como
pérdidas económicas. Una característica crucial de nuestro producto es su inocuidad tanto para el
consumidor como con el medio ambiente.
El resto del presupuesto planteado será utilizado para establecer una planta de producción con
capacidad de manejo de aproximadamente 5,450.00 L/año. Se consideran gastos de equipamiento
necesarios para el inicio de operaciones y sostener la tasa de producción, acorde al objetivo de cubrir un
15% del mercado nacional para 2021. Esta proyección fue calculada con base en los niveles de
producción reportados a nivel nacional, y la demanda que podríamos tener.
El lanzamiento de Bactroy, como primer producto de línea, sería un parteaguas que permitirá a
MEPS Solutions incursionar en un mercado de alto potencial a nivel nacional, para luego escalar su
influencia a nivel internacional. Ofreciendo una alternativa económica y tecnológicamente viable para el
problema de control de microorganismos en industrias de alimentos.
c) Responsabilidades.
Dentro del marco de las propuestas innovadoras a este problema, MEPS Solutions propone el
desarrollo de una alternativa basada en bacteriófagos. El producto fruto de esta idea, “Bactroy” está
enfocado a las cuatro cepas de organismos que se encuentran principalmente en el biofilm de plantas de
manejo de carnes frías. Con una operación anual de mil millones de toneladas por año e ingresos de
cerca de $2.24 mil millones de dólares, es un sector altamente productivo y en constante crecimiento en
el país. (Consejo Mexicano de la Carne, 2016)
En el presente documento se hará una descripción detallada del plan para establecer una
producción de producto equivalente a 5,450 L al año. La cantidad de producto necesario para una planta
se calcula de acuerdo a la superficie que entra en contacto con el alimento. La producción planteada
alcanzará a cubrir el 10% de la superficie utilizada para la producción nacional de carne frías
mencionada anteriormente. Si bien las industrias tienden a economizar sus gastos, temas de limpieza y
desinfección son claves para su correcta operación. Por lo que una alternativa como la que ofrece MEPS
Solutions resulta atractiva. La frecuencia de uso de nuestro producto irá acorde a los protocolos de
limpieza previamente dispuestos por la empresa, respetando los turnos y horarios de producción.
Se tiene proyectada un ingreso de $3,270,240.00 MXN Durante el primer año, a partir de ello se planea
aumentar la capacidad de producción en un 50% para el quinto año.
Uno de los beneficios más altos es que con el apoyo del estímulo del PEI para operar en el estado de
Nuevo León, es que se podría consolidar la fórmula bacteriofágica que garantice la eficacia de
funcionamiento de Bactroy. Dado que seremos acompañados y apoyados por una Institución de
Educación Superior o Centro de Investigación, será posible hacer incluso la prueba de concepto para
validar el pronóstico de participación de entrada en el mercado Nacional.
Al medir la respuesta del cliente se obtendrá información y retroalimentación valiosa que pueden tomarse
en cuenta para la mejora tecnológica continua del producto. De antemano se sabe que no todas las
empresas de cárnicos siguen los mismos protocolos de limpieza, y que muy seguramente tendrán que
adaptar sus fases de desinfección para que Bactroy actúe adecuadamente sobre sus superficies de
trabajo.
A partir de los recursos otorgados del fondo PEI se podrán obtener las especificaciones para patentar
nuestra innovación y planificar su consiguiente escalamiento para producción en una planta. A largo
plazo, MEPS Solutions visualiza que este producto sea un escalón para poder continuar expandiéndose
a otros mercados. De la venta de Bactroy se podría invertir en Investigación y Desarrollo para lanzar
formulaciones que sean específicas para biofilms que se forman en otras industrias de alimentos.
El proyecto propuesto consiste en una planta de producción de un agente coadyuvante para la remoción
del biofilm de la industria cárnica. El producto consta de un cóctel de 4 bacteriófagos en solución, cada
uno enfocado al ataque de una especie bacteriana de las más comunes en la estructura del biofilm
formado en la superficie de equipos de la industria cárnica. El producto es aplicado por aspersión a las
superficies de los equipos con alta probabilidad de desarrollar biofilm, que intuitivamente son aquellos
que entran en contacto directo con los productos.
A través del producto propuesto, MEPS Solutions busca disminuir el riesgo de contaminación de carnes
frías causada por la presencia de biofilm en la superficie de los equipos utilizados para su producción;
Nombre: LiMN4L
Orden: Caudovirales
Propiedades: Cadena doble de ADN, lítico
Rango de hospederos: cepas de Listeria monocytogenes 15JO5, CW2, SMAC91, 18AO1, 22BO5,
22BO7, 18GO1, 19CO5, 17AO2, 15AO7, 19EO1, 18FO9, 19CO9, 19EO3, 19DO9, 19DO3, 19EO5,
19CO7, SSM91, 18DO7, 18D05, Listeria ivanovii, Listeria innocua ( Ganegama, 2013).
En 2014 en Dinamarca, 12 personas fallecieron en el país debido a un brote de listeria causado por
fiambres contaminados; las pruebas confirmaron que todos los infectados por Listeria, habían consumido
una salchicha enrollada. En consecuencia se ordenó retirar los productos de esta empresa, por las
graves consecuencias que tuvo la contaminación por tal bacteria (BBC, 2014).
Con lo anterior, se evidencia que la formación de biofilm con bacterias patógenas es un grave riesgo de
salud pública de los consumidores a nivel mundial. Esto debe ser altamente controlado y regulado por los
más altos estándares de calidad de las empresas procesadoras de carnes. De ahí se deriva la
importancia de que los procesos de limpieza y desinfección de superficies y equipos que se encuentren
en contacto con la materia prima, se realicen al terminar el procesamiento; pues es necesario evitar la
desecación, que es el principal factor que impulsa la fuerza de unión de las células y muchas especies
bacterianas.
Por otro lado, una empresa de capacidad baja de procesamiento de carne de res, invierte hasta $2,098
dólares anuales ($42,253.72 MXN) en métodos de sanitización de sus equipos de fabricación, así como
una empresa de capacidad de producción alta, invierte hasta $15,766 dólares anuales (317,527.24 pesos
mexicanos) (Viator, 2015). Algunos de los desinfectantes más utilizados en este tipo de industria son
clorito de sodio acidificado, cloruro de cetilpiridinio, dióxido de cloro, ácido hipocloroso, ácidos orgánicos
y ácido peracético, el costo anual del agente antimicrobiano más caro utilizado en una planta de
capacidad alta de procesamiento de carne de res es de aproximadamente $230,708.00 dólares
(4,646,459.12 MXN) (Viator, 2015). Como puede observarse, los métodos antimicrobianos es la parte
más costosa en la higiene de las plantas de esta industria; un escenario propuesto es la reducción en la
cantidad de productos antimicrobianos adquirida al año y la complementación de los procedimientos de
sanitización y esterilización con Bactroy, que tendría un costo anual de $72,000.00, promoviendo
además, la reducción de costos cubiertos en eventos de emergencia que se presentan, por ejemplo,
cuando es identificada alguna contaminación en el producto o parte del proceso.
En el mercado global de embutidos, vemos que en los últimos años la tendencia ha sido creciente, para
los distintos productos: Jamón, salchichas y carnes frías. Tomando ello como referencia, la proyección
hacia el año 2021 sugiere que el crecimiento anual será del 4%.
De la misma manera, trayendo una visión nacional, se ha incrementado la participación mexicana en el
mercado global. Por lo que se estima un crecimiento anual de 11.35%.
De acuerdo con Mordor Intelligence (2017) los productores más grandes en el mercado global de carne
procesada, están centrando sus estrategias en la expansión hacia regiones en desarrollo en donde
establecen nuevas plantas, y negocian la adquisición o unión de pequeños y medianos fabricantes.
Es claro que la tendencia en cárnicos está siguiendo una buena dirección y eso en consecuencia
beneficia a la industria de la limpieza de equipos y superficies. Ya hay productos que se enfocan en ello,
siguiendo los principios de los productos biocidas. Más la innovación con la que Bactroy mostraría
ventajas competitivas es que su enfoque no sólo es eliminar microorganismos patógenos, sino que
también degradar la matriz del biofilm.
El monitoreo tecnológico implica obtener la información sobre el desarrollo que se está llevando a cabo y
las tecnologías emergentes. También incluye la búsqueda de las normas y regulaciones a la que éstas
deben apegarse.
En este proceso, una variable que no se puede perder de vista es la tecnología cambiante, pues es la
estrategia en la que se basan y cómo es que proyectan los éxitos de un producto. El análisis tecnológico
permite comprender el funcionamiento, diseño y construcción de una propuesta.
Dentro del negocio de productos y servicios para la limpieza de equipos y superficies en industria
alimentaria, hay diferentes métodos utilizados que se basan en la actividad biocida, pero que a su vez
pueden seguir métodos químicos, mecánicos o enzimáticos.
Es preciso mencionar que al hablar de patentes, hasta ahora y también como parte de la competencia
analizada, se tiene que los productos QUACIDE® BF31 y QUACIDE® BF31 EC de Betelgeux obtuvieron
una patente, por lograr la eliminación de biofilms en superficies abiertas y en circuitos. “Su composición
se basa en una mezcla sinérgica de agentes oxidantes, tensioactivos, secuestrantes y biocidas, actúa de
forma eficaz a la hora de desprender biofilms de las superficies, degradar la matriz exopolimérica que
protege a los microorganismos y eliminar estos microorganismos de las instalaciones” (Betelgeux, 2014).
Dentro de la World Intellectual Property organization (WIPO) se encontró una solicitud de patente:
(ES2560262) , titulada : “Bacteriófago o proteína lítica derivada del bacteriófago que es eficaz para el
tratamiento de la biopelícula de Staphylococcus aureus”, solicitada por la empresa Intron Biotechnology,
Inc. Su técnica proponer el uso del bacteriofago SAF-i, la invención también menciona el uso de
proteínas tilicas derivadas de! bacteriófago SAP-1. Si bien su uso no está dirigido para asuntos que
tengan que ver con alimentos, es verdad que se propone su uso en aspectos médicos, por ejemplo en
material quirúrgico o en órganos artificiales. (Yoon, 2016).
De google patents, se encontró la siguiente: US20050175594A1. El claim de ésta dice que se trata de un
método para controlar la contaminación por Listeria en un producto alimenticio, equipo de procesamiento
de alimentos o en contenedores de almacenamiento de alimentos. El fago lítico que se toma es el P100,
designado en la ATCC como no. PTA-4383. Se aplica en una cantidad suficiente, tal que se pueda
reducir la cantidad de Listeria.
En esta invención se prepara un vector de ADN recombinante utilizando el fago virulento P100 que es
específico para Listeria monocytogenes. El vector incluye un sistema genético de ADN que codifica la
expresión de una o más proteínas detectables que no son un producto génico de Listeria
monocytogenes. (Loessner y Carlton, 2008).
También hay artículos de investigación que han propuesto el uso de bacteriófagos con aplicación en la
industria de alimenticia. Gutierrez, Diana , et al. (2016) menciona en su estudio la importancia de cuidar
la inocuidad en el procesamiento de alimentos, ya que en el biofilm puede haber bacterias hospederas.
La matriz de biofilm podría ser una barrera física para el fago, sin embargo algunos fagos poseen
polisacárido depolimerasas, que son enzimas hidrolíticas específicas que pueden usar polisacáridos o
derivados de polisacáridos como sustrato.
Ahora bien, de acuerdo con S. Y.-E. Tan, et. al. (2013), otras estrategias de eliminación de biofilms se
basan en la inhibición de las señales de quorum sensing, la inducción de la separación del biofilm de la
superficie, el bloqueo de las señales reguladoras del biofilm o el tratamiento de superficies para evitar la
adhesión de biofilms.
Es por ello que una de las técnicas más prometedoras para el control de biofilms en la industria es el
empleo de bacteriófagos
Como se observa, los productos comercializados por Intralytix y Phagelux pueden tener un uso muy
similar al propuesto para Bactroy; son utilizados para atacar contaminación bacteriana en superficies de
equipos de producción de alimentos. Los productos además están enfocados a utilizarse durante eventos
de contingencia, en que una cepa bacteriana específica fue detectada.
Por otro lado, Bactroy está diseñado para atacar no solo contaminación específica de una cepa, sino
biofilm formado frecuentemente en las superficies de la industria de producción de carnes frías; los
bacteriófagos fueron seleccionados para atacar las cuatro cepas bacterianas más comunes en la
estructura del biofilm formado en los equipos de esta categoría alimenticia. Los fagos cuentan además
con enzimas que igualmente participan en la degradación de la matriz que le va dando soporte al biofilm
Basados en que los principales objetivos del estímulo de PEI son:
La creación de nuevos productos, procesos o servicios de alto valor agregado, así como la generación,
apropiación y protección de la propiedad intelectual, es necesario enfocarse en el proyecto de
investigación y desarrollo tecnológico, más que en infraestructura de la empresa.
En caso de hacernos acreedores del apoyo de este fondo, habrá una serie de evidencias y reportes que
podrán entregarse periódicamente para demostrar que las actividades van alineadas con los objetivos.
Siguiendo el esquema de maduración tecnológica de CONACYT (2017), los entregables necesarios
podrían seguir esa estructura, mostrada en la Tabla 2.
Figura 1. Organigrama para MEPS solutions. Se incluyen 3 áreas que rigen la organización de la
empresa.
Cabe destacar que hay cuatro puestos directivos, pertenecientes a nosotros, quienes como socios
también asumiremos las responsabilidades participando activamente en la toma de decisiones y manejo
del proyecto.
Pruebas de calidad
Para realizar las cuatro pruebas de calidad, es necesario contar con la estandarización del procedimiento
de cada una, ya que la naturaleza las muestras de nuestro producto puede diferir en gran medida de las
utilizadas en los protocolos que son reportados en la literatura. Además de esto, debe existir un
procedimiento de validación de estas pruebas, para ello puede seguirse el siguiente formato:
Es necesaria información completa específica de cada equipo de fabricación y envasado, que debe
incluir:
Además de lo mencionado, también es necesario mantener calibrados todos los equipos en el área de
producción y el laboratorio de Calidad. Se buscará tercerizar esta actividad, para contar con personas
externas que realicen la actividad; es por ello que, para los equipos de producción, se pretende contratar
los siguientes servicios ofrecidos por el Centro Nacional de Metrología.
Estos servicios cubrirán la calibración de barómetros y flujómetros en las cuatro líneas de producción y
en la de envasado
Recursos materiales
Tabla 3.0 Materia prima utilizada en el proceso
Medio de cultivo 1: BHI Broth [Brain Heart Infusion Broth], 5 kg, RPI.
*Al utilizarse a 37 g/L
Medio de cultivo 2:Medio de cultivo 2: Tryptic Soy Broth (TSB, (Tryptone Soya Broth, CASO
Broth, Soybean
Casein digest Broth, Casein Soya Broth) MERCK.
*Al utilizarse a 30 g/L
Medio de cultivo 3: BHI Broth [Brain Heart Infusion Broth], 5 kg, RPI (botes de 5 kg/Lotes
anuales)
*Al u.tilizarse a 37 g/L
Buffer TMN
Agua desionizada
i) Generalidades
Para darle marcha al proyecto es necesario establecer una planeación estratégica de actividades, con
las que se pueda dar un correcto seguimiento. Así mismo es pertinente establecer criterios de éxito, para
que se logre el cumplimiento de acciones en tiempo y forma.
Como parte de la evaluación de avances y resultados, MEPS propone realizar reportes trimestrales para
notificar a CONACYT los detalles en los que se va avanzando y permanezca sustentada la razón del
apoyo económico.
Tabla 4. Diagrama de Gantt con la Planeación de actividades por etapa para el proyecto de la
empresa.
A continuación se expone el seguimiento de actividades de Meps, para todo el año 2019. En la Tabla 4
se incluyen criterios de éxito, que permitirán ir evaluando si Meps llega a los objetivos o no. Con ese
indicador también es posible notificar a CONACYT los resultados que se están obteniendo.
Tabla 5. Fechas de medición de resultados y criterios de éxitos de las etapas del proyecto Meps
solutions.
Continuo Aseguramiento de
Investigación y hasta 15 la efectividad de
desarrollo 03-ene de agosto Bactroy en
Industrias
14-jun-19
Adquisición de 31-oct Espacio 100%
espacio y equipos habilitado con la
25-ago instalación de
servicios y
equipos
Contratos hechos 13-sep-19
con proveedores y
materia recibida
Adquisición de 20-sep 06-oct en tiempo y con la
materia prima calidad requerida
El proceso de
producción
funciona sin fallas
y cumple con los
Validación 22-sep 07-dic tiempos estimados
por operación
unitaria
Determinación de
condiciones
Estandarización 08-dic 8 de enero óptimas de
2020 operación
No hay vacantes y
Recursos humanos los empleados
13-dic
01-dic 30-dic están capacitados
Primer lote de
Segunda Bactroy sale en el
Producción para ene-20 quincena mercado. Cumple
comercializar de enero con el pronóstico
2020 de ventas
iii) Estructura Organizativa
Los socios y directores de Meps tendremos juntas recurrentes para asegurar la mejora continua en todo
proceso del proyecto y establecer estrategias para sobreponerse a las dificultades que puedan
presentarse durante el desarrollo del proyecto..
Operadores de producción
El trabajo consiste en entrar de lleno al proceso para vigilar y establecer las condiciones óptimas de
producción de Bactroy. Deberá permanecer al tanto de los biorreactores y unidades de filtración
trabajando en perfusión, siempre respetando los turnos. Es necesario apegarse a las especificaciones de
producción y monitorear que ningún equipo falle.
Analistas de calidad
La tarea de quien ocupe esta vacante consiste en proveer un marco de metodología y estandarización a
la Organización y sus Proyectos, en dos importantes ramas: Calidad en Procesos y Calidad de Producto.
Su labor es clave para detectar en forma temprana las causas de los defectos y evitar su propagación.
En este puesto se deben realizar las pruebas de calidad por monofago, y cuando se juntan los cuatro
bacteriofagos también. Elaboración de reportes.
Representante de ventas
Son los agentes que serán capacitados con información científica y técnica sobre el funcionamiento de
Bactroy. Asimismo esta posición de trabajo debe conocer cómo se aplica el producto, para convencer
mediante demostraciones, por qué la industria de cárnicos debería optar por nuestro producto para
complementar sus protocolos de limpieza y desinfección.
g) Presupuesto
h) Control del Programa de trabajo del proyecto
Se hizo un análisis del proceso completo y se determinaron varias posibles fuentes de riesgo que ponen
en peligro la integridad del producto. Para evitarlo se elaboró un plan que se detalla en anexos. La
estrategias se basa, principalmente en la prevención. Los puntos principales son:
Mantenimiento de equipos y material de trabajo. Todos los equipos e instrumental técnico deben
ser correctamente identificados y validados, dando mantenimiento continuo de acuerdo a las
instrucciones del fabricante. El mantenimiento, limpieza, servicio, desinfección y sanitización de
los equipos deberá ser realizado constantemente y registrado adecuadamente.
Procedimiento de Operación Estándar (SOP). Una vez que se hayan identificado las
especificaciones críticas para el proceso se debe llevar a cabo una la elaboración de un SOP. En
él se debe indicar a detalle todas las características de materiales y reactivos utilizados. Existen
varios manuales para la elaboración de estos documentos se utilizarán las recomendaciones
publicadas por la EPA (EPA, 2007)
Así mismo se han elegidas cuatro pruebas de calidad para el análisis de nuestro producto en
fases intermedias e inmediatamente antes del envasado:
a) De potencia. La forma de cuantificar la actividad lítica del producto es mediante protocolos
estandarizados de titulación de bacteriófagos. El método a emplear por MEPS Solutions es el
conteo de unidades formadoras de placa en agar en suspensión y se basa en la infección de
cuatro cultivos saturados, uno por cada cepa hospedera, con diluciones seriadas de la solución
fágica. Los parámetros de calidad durante esta fase se basan en la concentración final esperada
del producto, y por lo tanto se espera obtener un título > 1×109 PFU/mL.
b) Identidad
Esta prueba consiste en hacer uso de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Realizada
con primers específicos de cada una de las cepas seleccionadas. Aquí es importante tomar una
estrategia que incremente la especificidad como variantes de diseño y primers extra que se unan
entre la zona flanqueada.
c) Contenido de endotoxinas
Las cepas productoras gram negativa, producen endotoxinas y Lipopolisacáridos (LPS). Esto se
realiza mediante ensayos de LAL (Lisado de amebocitos de limulus), que consisten en usar
amebocitos provenientes del cangrejo Herradura.
d) Esterilidad
La presencia de microorganismos en las soluciones fágicas podría afectar severamente el
rendimiento del producto final. Es necesario corroborar su ausencia mediante el enriquecimiento
de una muestra de solución fágica con caldo nutritivo.Uno de los principales requisitos es la
garantía de condiciones asépticas. La implementación de sistemas cerrados de cultivo
(automatizados) ha sido sugerida como una estrategia para apegar el proceso a BPM (Sensebé,
2013). Adicionalmente este tipo de producción previene la diseminación de bacterias y
bacteriófagos (patógenos) dentro de las instalaciones, evitando contaminación en pasos
posteriores.
En cuanto a la tecnología a desarrollar se encontraron, en la página del IMPI, dos patentes como
antecedentes para justificar la estrategia de patente que busca MEPS Solutions:
MEPS Solution solicitaría una patente para “Mezcla de cuatro bacteriófagos como coadyuvante en la
remoción de biofilm de superficies en industria alimentaria”. El documento resultante describiría “el
método de producción y aplicación de un coctel de cuatro bacteriófagos específicos para: Listeria
monocytogenes, Staphylococcus aureus, Pseudomonas fluorescens y Escherichia coli. Mediante un
proceso de cultivo en biorreactor se producirán los componentes para la solución a ser asperjada sobre
superficies que tienen contacto con alimentos en industria de producción de alimentos”
B) ANEXOS
MÓDULO 1: DESCRIPCIÓN DE EMPRESA, PRODUCTO Y
SERVICIO
1.1 Empresa
• Nombre comercial
MEPS Solutions
El nombre de la empresa, MEPS Solutions, surge por el acrónimo en inglés de las Sustancias de Matriz
Extracelular Poliméricas. Esta matriz es uno de los componentes más importantes del biofilm y es justo lo
que nuestro producto insignia busca atacar. Funcionando como coadyuvante de una limpieza profunda
de equipos y tuberías en la industria de procesamiento de carnes.
• Logotipo
1.2 Producto
• Nombre del producto
Bactroy. El nombre del producto es un juego entre la palabra bacteriófago y Troya. Haciendo alusión al
famoso artilugio desplegado por los griegos para entrar a la ciudad fortificada, el funcionamiento de
nuestro producto podría ser una analogía a este mito griego.
Como beneficio adicional es un nombre de fácil pronunciación y que puede ser recordado con facilidad
por nuestros clientes.
• Presentación comercial.
Figura 4. Propuesta de vista para el envase de 5L para la formulación de Bactroy. Se incluyen
dimensiones
• Ficha técnica.
• Hoja de seguridad.
2. Identificación de peligros
3. Composición
4. Primeros auxilios
Inhalación: Traslade a la víctima y procure aire limpio. Si no respira,
suministre respiración artificial. La inhalación puede
provocar ligera irritación de mucosas. Consulte a su
médico.
Contacto con los ojos: Enjuagar inmediatamente con abundante aguas durante,
por lo menos, 15 minutos. Asegurarse de aclarar todo el ojo
y el tejido de los párpados. Si tiene lentes de contacto
retirar tras los primeros 5 minutos del enjuague y continúe
con el procedimiento.
7. Manejo y almacenamiento
7.1. Manejo
Use equipo de protección personal adecuado. Asegure ventilación apropiada. Evite
contacto con ojos. No ingerir
7.2. Almacenamiento
Mantenga los contenedores de almacenamiento en un lugar fresco, seco y bien
ventilado. Almacene en interiores.
8. Controles de exposición
Olor No presente
pH 6.05±.05
Inflamabilidad No aplica
Teratogenicidad No reportados
Tanto el sobrante de producto como los envases vacíos deberán eliminarse según la legislación
vigente. Deberá clasificar el residuo y disponer del mismo mediante una empresa autorizada.
Procedimiento de disposición: tratamiento de aguas residuales o disposición de relleno sanitario.
14. Información relativa al transporte
Esta hoja de seguridad cumple con los requisitos establecidos dentro del marco legal de la
NOM-018-STPS-2015
El volumen promedio por persona en el mercado de productos cárnicos y embutidos ascendió a 46.2kg
en 2018.
De acuerdo con la proyección publicada por Statistics hasta el año 2021 (Statistics,2018), se estima que
el crecimiento anual será de 4%, lo cual es favorable para las industrias procesadora de carnes.
Nuestro objetivo a corto plazo, los primeros tres años de operación, es hacer de Bactroy un producto
aplicado en el 10% de la superficie en plantas a nivel nacional. Bactroy tiene un rendimiento de 50m2/L y
un uso recomendado de aplicación de por lo menos de dos veces por semana (Detalle consultar sección
2.4.3.). Con ello, la necesidad de producción sería de cerca de 78,000 L de producto por año.
Para reducir o eliminar estos microorganismos de superficies de contacto con alimentos, se han
utilizado una amplia gama de de procedimientos tanto físicos como químicos. Además de su relativa baja
eficacia contra biofilm vamos a tener algunas desventajas como posible toxicidad y la generación de
resistencia de los patógenos, en el caso de antibióticos. Así se han enfocado esfuerzos en la
investigación y desarrollo de nuevas alternativas. Otro factor de gran peso ha sido el rechazo del
consumidor hacia el uso de químicos sintéticos, ocasionando la búsqueda de alternativas amigables con
el medio ambiente que el cliente perciba como “naturales”. (Giaouris, 2014) Una potencial respuesta que
cumple con las características requeridas son los bacteriófagos.
La búsqueda de nuevas alternativas efectivas, que no dañen los equipos y sean amigables con
el medio ambiente ha llamado la atención hacia soluciones biotecnológicas. Entre ellas se encuentra el
desarrollo de cócteles de bacteriófagos enfocados a la eliminación de algunos de los patógenos más
comunes en las zonas de producción de alimentos. Se han realizado múltiples estudios que avalan la
efectividad de este tipo de estrategia y su funcionamiento contra cerca de 12 especies diferentes (Moye,
2018). Así mismo se encuentran registradas 9 empresas, a nivel global, dedicadas a la producción y
comercialización de productos para industria alimentaria a base de bacteriofagos (Sulakvelidze,
n.d.).Entre ellas existen 11 productos aprobados por la FDA como GRAS (Tabla 1) (Moye, 2018).
Tabla 1. Productos basados en Bacteriófagos aceptados para su uso en industria alimentaria (Adaptado
de Moye, 2018)
Organismo
Producto Compañía Certificaciones Permisos regulatorios
objetivo
FINK TECH
Secure FDA, GRN 724 pending
GmbH E. coli -
Shield E1 as of 19 March 2018
(Alemania)
Passport Food
USDA, FSIS Directive
Finalyse Safety Solutions E. coli O157:H7 -
7120.1
(USA)
Xanthomonas
v.
campestris p
vesicatoria,
AgriPhage - EPA Reg. No. 67986-1
Pseudomonas
Phagelux (China)
syringae
pv. tomato
Los productos mostrados en la Tabla 1 son todos para aplicación directa sobre los alimentos
producidos en la planta. La alternativa propuesta en este trabajo se basa específicamente en el diseño
de un producto para aplicación sobre superficies. Abdulaze, et al. (2008) probó la actividad de una
mezcla de bacteriófagos sobre superficies similares a las utilizadas en industria de productos cárnicos,
encontrando una reducción significativa en la presencia de E. coli 0157:H7.
Otro estudio interesante para este tipo de aplicación fue publicado por Woolston (2013), en él se
describe el uso de bacteriófagos para reducir la contaminación de Salmonella en superficies de vidrio y
acero inoxidable. Los resultados demostraron una reducción significativa en la cantidad de
microorganismo viable tras la aplicación de SalmoFresh y SalmoPro (ambos productos en desarrollo de
Intralytix, Inc.). Al final del mismo artículo se mencionan algunos retos y características, relevantes para
los fines de este trabajo:
● Los fagos líticos, debido a su alta especificidad, van a reducir la carga microbiana de una
sola especie. Por tanto, las estrategias que utilicen estos microorganismos deben ser
consideradas, más que un sustituto, un suplemento a los químicos de amplio espectro
utilizados normalmente.
● Los fagos son altamente sensibles a las concentraciones usuales utilizadas de otros
detergentes y desinfectantes. Por esto el uso de bacteriófagos debe ser coordinado con
el uso de químicos para optimizar el resultado de ambos.
Staphylococcus
La prevalencia de este género de microorganismo en las plantas que procesan carne cruda ha
sido demostrado incluso después de protocolos de limpieza y desinfección. Se ha encontrado que
pueden representar hasta un 34% de los microorganismos en las zonas de manejo de carne cruda. Este
género de bacteria cuenta con cepas patógenas y no patógenas. Estas últimas, si bien no implican un
riesgo de salud inmediato para el consumidor, por la proporción en la que se presentan se sospecha que
pueden tener un papel importante en el enriquecimiento de biofilm multiespecies que favorece la
propagación de microorganismos patógenos (Marouani-Gadri, 2009). Por esto han sido elegidas como
uno de los objetivos en el diseño de Bactroy.
Múltiples bacteriófagos han sido estudiados por su capacidad de reducir la carga de
Staphylococcus en alimentos (Moye, 2018). Sin embargo muchos de estos no han sido caracterizados
por completo y/o no se encuentran disponibles en repositorios públicos para su compra y uso con fines
de lucro. Una notable excepción a esto es el “Bacteriófago de Staphylococcus K”. Su genoma y
características específicas ya han sido estudiadas y reportadas en literatura (O’Flaherty, 2004). Así
mismo se encuentra disponible para compra en el catálogo de ATCC como “Staphylococcus aureus
subsp. Aureus bacteriophage K (ATCC® 19685B1 ™)”.
El uso de este bacteriófago ha sido estudiado in vitro y se ha demostrado que, por lo menos
nueve especies diferentes de Staphylococcus s on susceptibles a infección: S. aureus, S. epidermidis, S.
saprophyticus, S. chromogenes, S. capitis, S. hominis, S. haemolyticus, S. caprae y S. hyicus
(O’Flaherty, 2005). Su aplicación también ha sido estudiada para la remoción de biofilm, encontrando
desde una significativa remoción hasta una completa eliminación dependiendo del tiempo de tratamiento
(Kelly, 2012).
Para la producción de este fago se reporta ampliamente su replicación en cepas de
Staphylococcus aureus, especie patógena del género (O’Flaherty, 2005; Kelly, 2012). Una alternativa
viable es el uso de la especie Staphylococcus xylosus, una cepa utilizada comúnmente en
fermentaciones cárnicas y disponible en ATCC bajo el nombre de “Staphylococcus xylosus Schleifer and
Kloos (ATCC® 12162™)”. Con un nivel de Bioseguridad 1, se demostró que esta especie es altamente
competente para producir un fago que sigue teniendo actividad lítica en cepas de S. aureus a isladas de
diversas fuentes (El, 2014).
Pseudomonas fluorescens
Dentro de los microorganismos que destacan en la formación de Biofilm en la industria de
alimentos, se encuentran las pseudomonas, que son bacterias gramnegativas, cuyo metabolismo es
estrictamente respiratorio. De acuerdo con Law, B.A., et. al. (1977) en entornos industriales, la presencia
de P. fluorescens no es deseable pues es responsable del deterioro del producto debido a la producción
de lipasas y proteasas extracelulares resistentes al calor. Además, son de los organismos de deterioro
más documentados para carnes rojas, pescado y aves de corral por la capacidad que tienen de utilizar
un amplio rango de fuentes de carbono.
Se realizó un estudio sobre la persistencia de bacterias en superficies en contacto con cárnicos;
y la persistencia se logró más fácilmente con una cepa de P. fluorescens que con la cepa H7 de E. coli
O157 (Peneau et al., 2007). Por ende los resultados sugieren que las condiciones que conducen a la
persistencia de P. fluorescens pueden alcanzarse incluso cuando se aplican muy buenas prácticas
higiénicas.
En otro estudio realizado por Wang, et al. (2018) se vio como es la dinámica en la que se forma
el biofilm por Pseudomonas fluorescens relacionada al deterioro de la carne . Los resultados indicaron
que más de 4.5 log CFU / cm2 de P. fluorescens se transfirieron a una superficie de acero inoxidable en
tan sólo el transcurso de 5 h, y la transferencia de bacterias ocurrió incluso después de una exposición
de solo 10 minutos.
Dada esa premisa, se dispuso necesario incluir en el cóctel de bacteriófagos, uno que tuviera
como diana a esta bacteria que si bien no es patógena, contribuye fuertemente a que la matriz de
exopolisacáridos del biofilm perdure y aloje a otros organismos patógenos.
Se propone el fago Φ (phi) S1, (ATCC® 27663B1™), pues de acuerdo con el experimento realizado por
Sillankorva, et al. (2010) se prueba que es eficiente como agente de control del biofilm que forma P.
fluorescens tanto en suspensión como en superficie.
Se obtuvo que el proceso de infección por fagos es dependiente de la temperatura y que la temperatura
óptima de infección es a 26°C. A esta temperatura, el bacteriófago alcanzó una Multiplicidad de Infección
(MOI) de 0.5, dando como consecuencia una reducción de biomasa de alrededor del 85% en ambos
casos.
Si bien se logró probar que el uso del bacteriófago funciona, es preciso recalcar que el estudio se
hizo en condiciones óptimas, que habría que probar si pueden controlarse en la industria; por lo que es
necesario combinar la infección con otros métodos basados en biocidas para alcanzar resultados más
eficaces hacia la degradación total del biofilm. La cepa productora de este bacteriofago puede ser
aislada de tierra, y también se encuentra en la ATCC como Pseudomonas fluorescens Migula (ATCC®
27663™), cuyo nivel de bioseguridad es de 1.
Listeria monocytogenes
La tina tipo chiller es ampliamente utilizada en la industria de producción de embutidos como un
método de enfriamiento rápido tras la cocción inicial de las carnes frías (FYMSA, 2017). Debido a los
altos niveles de humedad constante y alto contenido de restos de materia orgánica puede ser una fuente
de contaminación. Si bien las temperaturas usadas usualmente son menores a los 4°C algunos
microorganismos pueden llegar a sobrevivir a estas condiciones, entrando en fase latente. En la Figura 7.
se resume el protocolo actualmente utilizado para lavar este equipo.
Nuestro producto busca eliminar la carga microbiana que permanece tras los procedimientos y
métodos químicos. Por lo que se sugeriría su aplicación tras el choque térmico realizado con agua
desmineralizada a 50°C, con un tiempo de reposo de 15 minutos. La finalidad del paso posterior, adición
de Vortexx, es mantener el equipo estéril hasta su próximo uso. La alta acidez de Vortex (pH=0.9)
(ECOLAB, 2014), inactivaría los fagos y el enjuague previo al inicio de operaciones asegura la limpieza
completa de ambas soluciones.
Es importante mencionar que estos pasos mencionados son principalmente para el lavado del
interior de la tina del equipo. Hay alguna piezas que no pueden ser sumergidas en las soluciones como
se menciona en el protocolo. Para estas es especialmente útil la aplicación de Bactroy, pues reducirá la
carga microbiana que un lavado manual no pueda retirar.
Figura 7. Procedimiento de lavado y desinfección de tina tipo chiller.
2.4.1.2. Caso demostrativo: Tina tipo Ahumador Fessman.
Hay algunos equipos que tienen un protocolo simplificado de limpieza, ya que cuentan con
sistemas de limpieza automáticos. Tal es el caso de la ahumadora que se está proponiendo en este caso
demostrativo (Fessmann, 2018). Inclusive en la descripción, mostrada en la Figura 7 se especifican
únicamente los pasos necesarios para la limpieza de los paneles donde se colocan los embutidos.
Nuevamente, al igual que en el caso demostrativo anterior, Bactroy no está diseñado para
mantener la esterilidad de los equipos hasta su nuevo uso. Siendo nuestro principal objetivo eliminar
bacterias remanentes tras los lavados principales, se recomienda añadirlo como un paso previo a la
aplicación de Vortexx y reposar 15 minutos. De esta manera se elimina la necesidad de un paso de
enjuague adicional.
mililitro de producto debe ser aplicado por cada gramo de alimento, o de 0.2 mL de producto
Las etapas que se describen a continuación son repetidas por cada uno de los bacteriófagos a
producir, por lo que únicamente se hará la descripción de la fabricación de un bacteriófago individual.
Por medio de una manguera de latex, 950 mL de inóculo son transportados al biorreactor de
cultivo bacteriano (BB-n) el cual contiene 9 L de TB, previamente esterilizado en el interior del
biorreactor. En este punto comienza la etapa de cultivo bacteriano, cuyo propósito es promover una tasa
óptima de reproducción para alcanzar una concentración celular de 20 g de biomasa/L de medio de
cultivo. El crecimiento bacteriano es monitoreado durante todo el cultivo mediante un sensor de densidad
óptica acoplado a la jarra del biorreactor. Una OD600de 0.6 (Agboluaje & Sauvageau, 2018) implica que la
concentración bacteriana deseada ha sido alcanzada, y que la etapa de propagación viral debe dar
inicio, por lo que el volumen entero del BB-n es bombeado al biorreactor de cultivo viral (BF-n), donde se
agrega el inóculo viral.
Los inóculos virales, al igual que los bacterianos, son almacenados a -20°C y son descongelados
solo hasta el momento previo a su adición. La producción de bacteriófagos en condiciones controladas,
trae consigo una serie de aspectos extras a considerar. Variables adicionales a aquellas de una
fermentación bacteriana, tales como la multiplicidad de infección (MOI, por sus siglas en inglés), que
contempla la relación entre número de partículas virales en el inóculo y número de hospederos viables al
momento de la infección, deben ser determinadas de acuerdo al perfil específico de la fermentación
(Agboluaje & Sauvageau, 2018). De acuerdo a estos autores, es recomendable que la inoculación del
cultivo en lote se realice a una MOI de entre 0.001 y 0.01, esto ya que se favorece un título viral mayor y
una cantidad menor de residuos celulares. En los 4 cultivos, la MOI es de 0.01. Con el fin de asegurar la
producción máxima de bacteriófagos, el cultivo viral tiene una duración aproximada de 8 horas, a partir
de su inoculación (Agboluaje & Sauvageau, 2018). Es posible conocer el punto de lisis poblacional
mediante el monitoreo de la OD600 (identificado por su disminución significativa o alto total de su
incremento). Durante ambas etapas de cultivo se monitorean los parámetros de oxígeno disuelto y pH.
Una vez finalizada la etapa de cultivo, comienzan las etapas de separación. Dado que los
bacteriófagos han lisado sus bacterias hospederas y además se encuentran en suspensión en el caldo,
no es necesario incluir un paso de disrupción celular. El primer paso por lo tanto, consiste en la
clarificación del cultivo mediante filtración tangencial. El volumen total del BF-n es bombeado a través de
una manguera de látex, a razón de 13.89 mL/s, hasta la unidad de microfiltración (MF-n), cuya
membrana tiene un tamaño de poro de 0.45 μm. Este punto de corte permite la remoción de residuos de
membrana, pared celular, algunos organelos, así como bacterias que no fueron lisadas (residuos
grandes). El permeado, que contiene la solución estéril de bacteriófagos, avanza a la siguiente
operación, mientras que el retenido de restos celulares . El tiempo total de esta filtración es
aproximadamente 12 minutos.
Tras remover la mayoría de los restos celulares, la solución de bacteriófagos es bombeada
nuevamente a razón de 13.89 mL/s a través de una membrana de ultrafiltración (UF-n) con punto de
corte de 100 kD. El propósito de esta operación es separar proteínas y otras macromoléculas residuales,
provenientes del cultivo celular (residuos pequeños). En esta ocasión, el retenido contiene a los
bacteriófagos de interés (solución concentrada de bacteriófagos), mientras que el permeado acarrea los
residuos pequeños. Considerando que el área total de membrana es la misma en todas las operaciones
de filtración, el tiempo estimado de ultrafiltración es de 20 minutos. Es importante destacar, que los
procesos de micro y ultrafiltración de cada bacteriófago individual se llevan a cabo en el mismo equipo de
filtración, únicamente serán intercambiados los cassettes de filtración de acuerdo a la operación de
separación. Además de remover los residuos pequeños, la ultrafiltración anterior permitió la pérdida de la
mayor parte del volumen de medio de cultivo. En este punto del proceso se realiza una toma de muestra
para llevar cabo el primer control de calidad (CC1), el cual consiste únicamente en las pruebas de
potencia e identidad, descritas en la sección 4.2.1. Una segunda muestra del lote es tomada y tratada
para su preservación a -20 °C (Golec et al., 2 011) para ser utilizada como inóculo en lotes posteriores.
Un lavado con buffer TMN (formulación presentada en la tabla X) mediante diafiltración (DF-n) es
el siguiente paso del proceso. En este caso, un volumen de buffer igual al volumen de líquido perdido
durante la ultrafiltración es añadido. El tamaño de poro de la membrana de diafiltración es de 100 kD y el
proceso completo es realizado en 30 minutos. La etapa de diafiltración tiene como resultado una solución
monofágica con concentración de 4.06×1010 UFP/mL.
Tris 50 mM 100 mM
MgCl2 50 mM
NaCl 100 mM
Las soluciones monofágicas son transportadas en proporción 1:1 (en cuanto a título) a
un tanque de mezclado (MT-1), donde se da la dilución y formulación final con buffer TMN de la
mezcla de los cuatro bacteriófagos. Al final de esta etapa, la concentración de bacteriófagos
individuales es cercana a 1010 UFP/mL. La mezcla es circulada a través de una unidad de
microfiltración (MF-5), con un tamaño de poro de 0.45 μm. El permeado, constituido por la
mezcla estéril de bacteriófagos, es bombeado a un tanque de almacenamiento, donde espera
al proceso manual de llenado de envase. Nuevamente, se toma una muestra, cuya constitución
es la misma del producto final para el segundo punto de control de calidad (CC2), y en esta
ocasión se realizan las cuatro pruebas de control de calidad descritas en la sección 4.2.1. Una
vez que el total de las pruebas han sido aprobadas, el lote es liberado para su venta.
odos los residuos generados, tanto en las fermentaciones, como en las filtraciones, son de
T
naturaleza biológica. Además, ninguna de las cepas bacterianas empleadas es patógena. Por este
motivo, la totalidad de los residuos generados en la línea principal de producción serían secados
mediante calor y vendidos para ser usados como alimento de animales.
El Los criterios de selección están ponderados dando más peso al costo del terreno.
El estado seleccionado fue Nuevo León, principalmente por el impulso que da el gobierno estatal a
desarrollos industriales. Estos apoyos se ven significativamente reflejados en subsidios a pago de
servicios.- Adicionalmente en este estado se encuentra una importante proporción del mercado al que
buscamos dirigir nuestro producto.
Figura 12. Layout del laboratorio.
La fórmula química C H 1.77 O0.49 N 0.24 corresponde a la composición química aproximada de E.
coli (Doran, 2013). En esta reacción, se contempla a la glucosa como fuente de carbono y al amoniaco
como fuente de nitrógeno. Los medios de cultivo usados para las fermentaciones son diferentes para
cada cepa a producir (tabla X), pero todos tienen en común estas fuentes de carbono y nitrógeno.
La ecuación anterior no se encuentra balanceada estequiométricamente, por lo que este es el
primer paso del balance de materia, de tal forma que los coeficientes a-e son usados para plantear el
balanceo:
C 6 H 12 O6 + a O2 + b N H 3 → c CH 1.77 O0.49 N 0.24 + d CO2 + e H 2 O
Pare este caso particular, y de acuerdo a lo reportado por Andersen & von Meyenburg (1980), el
RQ de E. coli, u
sando como fuente de carbono glucosa es RQ= 1.01. Resolviendo el sistema de
ecuaciones se obtiene la siguiente ecuación estequiométricamente balanceada:
Para la primera fase de microfiltración (0.45 μm) se va a tener una separación de los componentes de las
células lisadas. De este peso total se tiene un 75% de residuos pequeños (agua, iones, ácidos nucleicos,
lípidos, entre otros), el 25% se compone de residuos grandes (principalmente células sin lisar y restos de
membrana) (Cooper, 2000). Otras suposiciones son: no hay fugas de ningun tipo, la masa total de
residuos grandes se mantiene en el retenido, la membrana, de acuerdo al proveerdor, tiene una
eficiencia de separación de 95% y se pierde un 5% de agua en el retenido. El balance de materia para
esta etapa se encuentra en la tabla X. A excepción de los bacteriófagos, el resto de los componentes se
presentan en kilogramos.
Tabla X. Balance de materia para la etapa de esterilización de solución monofágica
La tabla X presenta el balance de materia para la etapa de ultrafiltración (100 kD). En este punto las
suposiciones son: no hay fugas de ningun tipo, el total de los residuos pequeños son removidos en el
permeado y los bacteriófagos se mantienen en el retenido. Nuevamente, a excepción de los
bacteriófagos, el resto de las corrientes por especie se encuentran reportadas en kg.
Durante la diafiltración ingresa la misma cantidad de buffer que la cantidad de agua que fue perdida
durante la ultrafiltración. El balance de materia resultante se reporta en la tabla X.
3.1.4 Ultrafiltración
La etapa de ultrafiltración implica una membrana con tamaño de poro de 100 kD. Este
punto de corte permite el filtrado de los residuos más pequeños de la fermentación bacteriana.
Entre estos residuos se encuentra el ADN bacteriano, el cual se ha comprobado que es el
contaminante que se encuentra en mayor cantidad después de la lisis poblacional (Smrekar, et
al., 2011). Al ser un tamaño de poro tan pequeño, los bacteriófagos de interés no atraviesan la
membrana y quedan en el retenido. Esto permite a su vez, que grandes cantidades permeen la
membrana y la solución estéril de bacteriófagos aumente su concentración. Nuevamente, el fenómeno
de transporte predominante es la transferencia de momentum, debida a la diferencia de presiones
generada por la bomba de la unidad de filtración.
3.1.5 Diafiltración
La solución, o torta, que se mantuvo retenida en la membrana es diluida, en esta
ocasión por buffer TMN, cuya composición es la misma que el buffer del producto finalizado. La
adición de este buffer cumple con propósitos (dos de ellos presentados en sección 2.4.3): el
primero de ellos es lavar la solución concentrada de bacteriófagos, al mismo tiempo que son
filtradas residuos pequeños remanentes. Además, de acuerdo a lo observado en otros
productos a base de bacteriófagos (PhageLux, 2015), el buffer TMN brinda un ambiente
propicio que alarga la vida de anaquel del producto. Por último, el NaCl y el MgCl2,
componentes del buffer TMN son moléculas que facilitan la adsorción viral a la superficie
bacteriana (Epstein, 1974). El fenómeno de transporte principal en esta etapa es la
transferencia de momentum. Sin embargo, la transferencia de masa juega también un papel
importante en los procesos de diálisis por membrana, ya que es la diferencia de concentración
la que permite el flujo de especies moleculares a través de la membrana.
3.1.6 Mezclado
Bactroy es un cóctel de 4 bacteriófagos, en concentraciones similares (1010 UFP/mL).
Por este motivo, un proceso de mezclado homogéneo es requerido al final de la línea de
producción de las soluciones monofágicas. El equipo seleccionado para llevar a cabo esta
operación es un tanque, con 4 baffles en su pared interna, y un agitador tipo rushton. El
agitador tipo rushton permite que el proceso de mezclado se lleve a cabo en un régimen de
flujo radial. Además, los baffles evitan que se genere un patrón constante de mezclado. El
fenómeno de transporte predominante en esta operación es la transferencia de momentum.
Esta se da gracias la diferencia de presiones generada por el movimiento del agitador.
La tabla X presenta las condiciones de operación seleccionadas por cada uno de los equipos del
proceso principal.
Tabla # Descripción de las características de cada equipo utilizado durante la producción de Bactroy así
como sus requerimientos adicionales.
3.3 Estimación de Capacidades
Para la estimación de capacidades de nuestra planta se hizo una proyección a partir de
un mercado nacional conocido. Determinando así el total de litros necesarios al año para cubrir
las necesidades de nuestros clientes. Partiendo de esto es importante conocer características
de nuestras cepas productoras tales como rendimiento, tiempo de duplicación, sustrato y
condiciones generales de crecimiento. Una vez que tienes definidos estos factores debes
estudiar, mediante un balance de materia, la cantidad de cultivo que es necesaria para obtener
el producto establecido como meta. Con esta información es posible realizar una planeación de
insumos, adquisición de equipos y gasto energético programado para el posterior análisis de
costos.
Figura #. Algoritmo de diseño para planear los requerimientos para la producción anual de Bactroy.
Unidades de Filtración
Otro de los equipos cruciales para el proceso es la unidad de filtración tangencial, ya que con ella es
posible realizar tanto la microfiltración como la ultrafiltración, cambiando sólo las membranas. También
de marca Sartorius, esta unidad conocida como Sartoflow Study permite procesar hasta 200 L durante 4
horas. Su costo es de $40,000 US ($807,012 MXN).
Se utilizarán también 2 unidades de diafiltración, para las que se consideró la marca EMD Millipore,
cotizada en $2500 U.S. ($51,300 MXN).
Bombas
-Centrífuga
Se cotizó la marca Siemens , ya que esta bomba permite el paso de 98 litros por minuto, y la potencia de
su motor es de 750 W.
-Peristáltica
De la marca Shenchen, se encontró esta opción con un rango de caudal: 0.000166-1330 ml/min, es ideal
para el cuidado durante el transporte de los fagos
Tanque de mezclado
Se buscó uno de capacidad de 200 L , cuesta $19,000 MXN y es de agitación central de acero
inoxidable, la marca que se consideró fue : Hubei Hengfeng Medical and Pharmaceutical Equipment Co.
Tanque de almacenamiento
La capacidad que se requiere es de 400 L, y de la marca Inoximexico se cotizó uno en $22,200 MXN.
Además, el producto final debe tener ausencia de materia extraña (definida como una fuente de
contaminación orgánica o inorgánica).
La FSIS (Food Safety and Inspection Service) emitió una regla final sobre requisitos de
saneamiento para establecimientos oficiales de carnes y aves, donde se muestra el análisis de
riesgos y puntos críticos de control (HACCP).En lo que respecta a productos de limpieza, la
normativa expone que todos los limpiadores y desinfectantes utilizados por las instalaciones de
carne / aves deben ser seguros y efectivos bajo las condiciones de uso. Además las superficies
en contacto con alimentos deben limpiarse y desinfectarse tan frecuente como sea necesario
para prevenir condiciones insalubres y la adulteración del producto
El proceso de producción de Bactroy se basa en procedimientos que han sido puestos a prueba con
anterioridad en productos de Phagelux e Intralytix, para la purificación y concentración de bacteriófagos.
De acuerdo con Phagelux (2015), los puntos críticos de control deben estar enfocados en evaluar
individualmente cada uno de los cuatro bacteriófagos incluidos en el producto. Con este fin, se incluyen
dentro del flujo de producción de Bactroy dos puntos de control para el aseguramiento integral de la
calidad del producto final. El primer punto de control de calidad se encuentra justo antes del proceso de
mezclado de bacteriófagos y los ensayos se realizan a cada solución individual. El segundo punto de
control consiste en los mismos ensayos, realizados al producto finalizado. Las pruebas realizadas son las
siguientes:
e) De potencia
La potencia del producto se refiere a la capacidad de infección y lisado por parte del
bacteriófago. La forma de cuantificar la actividad lítica del producto es mediante protocolos
estandarizados de titulación de bacteriófagos. El método a emplear por MEPS Solutions es el
conteo de unidades formadoras de placa en agar en suspensión y se basa en la infección de
cuatro cultivos saturados, uno por cada cepa hospedera, con diluciones seriadas de la solución
fágica. Cada cultivo infectado es combinado con agar (para alcanzar una concentración final de
2%), y después es vertido sobre cajas Petri que contienen una capa gelificada de agar LB. Una
vez sólido, el cultivo es incubado a 37°C durante una noche (Baer y Kehn-Hall, 2014). Gracias a
esta técnica de cultivo en suspensión es posible observar la formación de placas a causa de la
lisis bacteriana, así como determinar la eficiencia de la infección. Los parámetros de calidad
durante esta fase se basan en la concentración final esperada del producto, y por lo tanto se
espera obtener un título > 1×109 PFU/mL.
f) Identidad
Esta prueba se divide a su vez en dos ensayos diferentes: especificidad de infección y Reacción
en Cadena de la Polimerasa (PCR). implica el uso de tres cepas diferentes del microorganismo
que se quiere combatir (por cada uno de los 4 bacteriófagos utilizados), y enseguida se realiza
una PCR específica que tenga perfiles de referencia predeterminados con los que se pueda
identificar correctamente el bacteriófago de interés. El límite crítico no tiene una notación
numérica, sin embargo,en este punto de control lo que se busca es que en la PCR haya
concordancia con las bandas de los perfiles de referencia.
g) Contenido de endotoxinas
Las cepas productoras gram negativa, producen endotoxinas y Lipopolisacáridos (LPS). Estos
pueden generar reacciones adversas si las concentraciones son elevadas en el producto de
consumo final. Se realizará un análisis de las concentraciones de endotoxinas encontradas en el
producto final diluido.
Esto se realiza mediante ensayos de LAL (Lisado de amebocitos de limulus), que consisten en
usar amebocitos provenientes del cangrejo Herradura; el lisado de amebocitos reacciona con
algunos β-glucanos además de reaccionar con las endotoxinas
Los microorganismos a los que se enfoca Bactroy son: Listeria monocytogenes, Bacillus cereus,
Staphylococcus y Pseudomonas fluorescens; de los cuales la única bacteria gram negativa es P.
fluorescens, y es no patogénica.
Tomando en cuenta las concentraciones de endotoxinas en saliva humana como 1mg/mL
(Leenstra, 1996), podemos hacer un análisis del consumo máximo de endotoxinas que podría
llegar al consumidor si las limpiezas posteriores no se llevarán a cabo correctamente. El límite
crítico para esta fase es de < 25,000 EU/mL.
h) Esterilidad
La presencia de microorganismos, patógenos o no patógenos, en las soluciones fágicas podría
afectar severamente el rendimiento del producto final. Por este motivo, es necesario corroborar
su ausencia mediante el enriquecimiento de una muestra de solución fágica con caldo nutritivo.
Tras 24 horas de incubación a 37°C, un hisopo es usado para esparcir una muestra de la mezcla
en cajas Petri que contienen agar nutritivo. Para acreditar esta prueba, es necesario que no haya
crecimiento de ningún microorganismo en durante 14 días.
Uno de los principales requisitos es la garantía de condiciones asépticas. La implementación de
sistemas cerrados de cultivo (automatizados) ha sido sugerida como una estrategia para apegar
el proceso a BPM (Sensebé, 2013). Adicionalmente este tipo de producción previene la
diseminación de bacterias y bacteriófagos (patógenos) dentro de las instalaciones, evitando
contaminación en pasos posteriores.
Norma Objetivo
CALIDAD ISO 9001-2015 Esta certifica que la empresa tiene un sistema de gestión
de la calidad con lo que de manera continua se verifica
que todos los procesos se lleven a cabo de manera
adecuada en todas las fases de la cadena y que así el
producto resulte óptimo para las necesidades de los
clientes
TIR 2.85 %
TREMA 3
VPN $14,014,539.36
ROI 1.2%
Referencias
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